miR-125b在胃癌中的功能機(jī)制及其對(duì)順鉑化療敏感性影響的深度剖析一、引言1.1研究背景胃癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，在消化系統(tǒng)腫瘤中占據(jù)著極高的發(fā)病率與死亡率。據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，胃癌在全球惡性腫瘤發(fā)病率中位居前列，每年新增病例眾多，且其死亡率也相當(dāng)可觀，給患者家庭與社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。在我國(guó)，胃癌同樣是高發(fā)的惡性腫瘤之一，由于人口基數(shù)龐大，胃癌患者的絕對(duì)數(shù)量不容小覷，嚴(yán)重影響了國(guó)民的生命健康與生活質(zhì)量。手術(shù)切除、化療和放療是目前胃癌的主要治療手段。其中，化療在胃癌的綜合治療中占據(jù)著至關(guān)重要的地位?；煵粌H可以用于術(shù)后輔助治療，以降低腫瘤的復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，還能在術(shù)前進(jìn)行新輔助化療，使腫瘤降期，提高手術(shù)切除的成功率，對(duì)于無(wú)法進(jìn)行手術(shù)的中晚期患者，化療更是主要的治療方法，可使腫瘤縮小或暫時(shí)控制其生長(zhǎng)，延長(zhǎng)患者的生存期。順鉑（cisplatin，DDP）作為一種廣泛應(yīng)用于胃癌化療的藥物，通過(guò)與DNA結(jié)合，形成鉑-DNA加合物，干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而發(fā)揮其強(qiáng)大的細(xì)胞毒性作用，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，在臨床實(shí)踐中，順鉑耐藥問(wèn)題卻成為了制約胃癌化療效果的瓶頸。隨著順鉑在化療中的持續(xù)使用，腫瘤細(xì)胞逐漸對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，使得順鉑無(wú)法有效地發(fā)揮細(xì)胞毒性，導(dǎo)致化療失敗，患者的病情難以得到有效控制，生存預(yù)后也隨之惡化。據(jù)相關(guān)研究表明，在接受順鉑化療的胃癌患者中，耐藥現(xiàn)象較為普遍，嚴(yán)重影響了化療的有效率和患者的生存質(zhì)量。MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長(zhǎng)度大約為20-24個(gè)核苷酸。它們通過(guò)與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，進(jìn)而參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝等多種生物學(xué)過(guò)程。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等過(guò)程中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用。部分miRNA可作為致癌基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡；而另一些miRNA則表現(xiàn)出抑癌基因的功能，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，發(fā)揮抗腫瘤作用。在腫瘤化療耐藥方面，miRNA也參與其中，通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。miR-125b作為miRNA家族的重要成員之一，已被證實(shí)參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。在乳腺癌、肺癌、肝癌等腫瘤中，miR-125b的表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，且與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移能力及患者的預(yù)后密切相關(guān)。在乳腺癌中，miR-125b的表達(dá)下調(diào)，其低表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)及Her-2的表達(dá)相關(guān)，提示miR-125b可能在乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用；在肺癌中，miR-125b通過(guò)靶向調(diào)控相關(guān)基因，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移能力，參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。然而，miR-125b在胃癌中的功能機(jī)制及其對(duì)順鉑化療敏感性的影響尚不完全明確。深入研究miR-125b在胃癌中的作用機(jī)制，以及其與順鉑化療耐藥之間的關(guān)系，對(duì)于揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)以及改善胃癌患者的化療效果具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的本研究旨在深入探究miR-125b在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的功能機(jī)制，以及其對(duì)順鉑化療敏感性的影響，為胃癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。具體而言，主要包含以下幾個(gè)方面：明確miR-125b在胃癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)特征：通過(guò)收集胃癌患者的組織標(biāo)本以及多種胃癌細(xì)胞系，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)，精確檢測(cè)miR-125b的表達(dá)水平，分析其在胃癌組織與癌旁正常組織、不同分化程度及臨床分期的胃癌組織之間，以及不同胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)差異，從而初步明確miR-125b與胃癌的相關(guān)性。揭示miR-125b對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：在胃癌細(xì)胞系中，構(gòu)建miR-125b過(guò)表達(dá)或低表達(dá)模型，通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)等，全面觀察miR-125b表達(dá)水平改變對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為的影響，深入探討miR-125b在胃癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用。闡明miR-125b影響順鉑化療敏感性的作用機(jī)制：將不同表達(dá)水平的miR-125b胃癌細(xì)胞分別與順鉑聯(lián)合處理，利用CCK-8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)等方法，檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡率，評(píng)估m(xù)iR-125b對(duì)順鉑化療敏感性的影響。進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)分析、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、蛋白質(zhì)免疫印跡等技術(shù)，預(yù)測(cè)并驗(yàn)證miR-125b的靶基因，探究miR-125b通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)影響順鉑化療敏感性的分子機(jī)制，揭示miR-125b與順鉑化療耐藥之間的內(nèi)在聯(lián)系。1.3研究意義本研究深入探究miR-125b在胃癌中的功能機(jī)制及其對(duì)順鉑化療敏感性的影響，具有重要的理論與實(shí)踐意義。在理論層面，miR-125b作為miRNA家族的重要成員，在多種腫瘤中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但在胃癌中的研究仍不夠深入。本研究通過(guò)全面分析miR-125b在胃癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)特征，深入研究其對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以及闡明其影響順鉑化療敏感性的作用機(jī)制，將有助于揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，填補(bǔ)miR-125b在胃癌研究領(lǐng)域的部分空白，為胃癌的基礎(chǔ)研究提供新的理論依據(jù)，豐富人們對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步完善腫瘤分子生物學(xué)理論體系，為后續(xù)相關(guān)研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。在實(shí)踐方面，胃癌的高發(fā)病率和死亡率嚴(yán)重威脅人類健康，順鉑作為胃癌化療的常用藥物，耐藥問(wèn)題極大地限制了其治療效果。本研究若能明確miR-125b對(duì)順鉑化療敏感性的影響及作用機(jī)制，將為解決順鉑耐藥問(wèn)題提供新的思路和方法。通過(guò)調(diào)控miR-125b的表達(dá)，有可能開發(fā)出新型的化療增敏策略，提高順鉑化療的有效率，改善胃癌患者的治療效果，延長(zhǎng)患者的生存期，提高患者的生活質(zhì)量。此外，miR-125b還有望成為胃癌診斷、預(yù)后評(píng)估及預(yù)測(cè)順鉑化療敏感性的生物標(biāo)志物，為臨床醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案提供重要參考依據(jù)，有助于實(shí)現(xiàn)胃癌的精準(zhǔn)治療，合理選擇治療方法，避免不必要的治療給患者帶來(lái)的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)效益。二、miR-125b與胃癌的基礎(chǔ)研究2.1miR-125b概述miR-125b屬于miRNA家族，在生物體中發(fā)揮著不可或缺的基因表達(dá)調(diào)控作用。其基本特征表現(xiàn)為長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸，雖短小卻蘊(yùn)含強(qiáng)大的調(diào)控信息，以單鏈形式存在，在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，這種保守性確保了其在不同物種中功能的穩(wěn)定性。miR-125b的生成過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)的調(diào)控過(guò)程。在細(xì)胞核內(nèi)，首先由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成初級(jí)miRNA（pri-miR-125b），pri-miR-125b長(zhǎng)度可達(dá)幾百到幾千個(gè)核苷酸，結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)出復(fù)雜的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。隨后，在核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8組成的微處理器復(fù)合體作用下，pri-miR-125b被剪切為長(zhǎng)度約70-100個(gè)核苷酸的前體miRNA（pre-miR-125b），pre-miR-125b依然保持莖環(huán)結(jié)構(gòu)。接著，pre-miR-125b在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5的協(xié)助下，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miR-125b被另一種核酸酶Dicer識(shí)別并進(jìn)一步剪切，去除莖環(huán)結(jié)構(gòu)的末端，生成成熟的miR-125b。成熟的miR-125b隨即與AGO蛋白等結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），從而具備了對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控的能力。miR-125b主要通過(guò)與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用機(jī)制。當(dāng)miR-125b與靶mRNA的3'-UTR完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，RISC中的核酸酶會(huì)對(duì)靶mRNA進(jìn)行切割，使其降解，從而直接阻斷靶基因的蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程；當(dāng)miR-125b與靶mRNA的3'-UTR不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，RISC會(huì)抑制靶mRNA的翻譯起始或延伸過(guò)程，減少蛋白質(zhì)的合成量，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。通過(guò)這種精準(zhǔn)的調(diào)控方式，miR-125b參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝等多種生物學(xué)過(guò)程，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。一旦miR-125b的表達(dá)或功能出現(xiàn)異常，就可能打破細(xì)胞正常的生理平衡，進(jìn)而引發(fā)疾病，尤其是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，miR-125b扮演著關(guān)鍵角色。2.2miR-125b在胃癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)情況眾多研究致力于探索miR-125b在胃癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)情況，然而研究結(jié)果卻存在一定差異。部分研究表明，miR-125b在胃癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)。如高鵬等人通過(guò)收集42例手術(shù)患者的胃癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，胃癌組織miR-125b-1-3p的表達(dá)相較于對(duì)應(yīng)癌旁組織存在顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且該低表達(dá)僅與分化程度存在相關(guān)性，與性別、TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡、腫瘤大小等臨床病理特征均無(wú)明顯相關(guān)性。胡澤剛等人采用qRT-PCR和原位雜交技術(shù)，檢測(cè)miR-125b在正常胃黏膜和胃癌組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-125b在胃癌組織中低表達(dá)，其表達(dá)與胃癌的分化程度及患者預(yù)后呈正相關(guān)，與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。李飛揚(yáng)等人通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)113例胃癌患者和113例健康體檢者血清中miR-125b表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)研究組患者miR-125b表達(dá)顯著低于對(duì)照組，血清miR-125b表達(dá)異常與胃癌患者腫瘤大小、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期有關(guān)。然而，也有研究得出不同結(jié)論，認(rèn)為miR-125b在胃癌組織中呈高表達(dá)。閻文婷等人使用real-timePCR方法檢測(cè)40例臨床診斷為胃癌患者的癌組織與癌旁對(duì)照組織中miR-125b的表達(dá)情況，證實(shí)在胃癌患者組織中miR-125b的表達(dá)水平顯著高于癌旁對(duì)照組。在對(duì)胃癌細(xì)胞系的研究中，XinyueZhang等人通過(guò)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，miR-125b在多種胃癌細(xì)胞系中顯著下調(diào)。而在其他研究中，針對(duì)不同的胃癌細(xì)胞系，miR-125b的表達(dá)也不盡相同。這些研究結(jié)果的差異可能與研究對(duì)象的種族、地域、樣本量大小、檢測(cè)方法以及腫瘤的異質(zhì)性等多種因素有關(guān)。2.3miR-125b表達(dá)與胃癌臨床指標(biāo)的相關(guān)性眾多研究致力于探索miR-125b表達(dá)與胃癌臨床指標(biāo)的相關(guān)性，其結(jié)果為揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制及預(yù)后評(píng)估提供了重要線索。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，多項(xiàng)研究表明miR-125b表達(dá)與之存在關(guān)聯(lián)。胡澤剛等人研究顯示，miR-125b在胃癌組織中低表達(dá)，且其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。這意味著miR-125b表達(dá)越低，胃癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性越高，提示miR-125b可能在抑制胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。李飛揚(yáng)等人的研究也指出，血清miR-125b表達(dá)異常與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了miR-125b與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的密切聯(lián)系。而在HER2表達(dá)方面，XinyueZhang等人通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定和蛋白質(zhì)免疫印跡等技術(shù)，證實(shí)HER2是miR-125b的靶基因，這表明miR-125b可能通過(guò)調(diào)控HER2的表達(dá)，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，影響胃癌的生物學(xué)行為及臨床進(jìn)程。在生存期方面，李飛揚(yáng)等人的研究表明，miR-125b低表達(dá)者的3年生存率短于miR-125b高表達(dá)者。這說(shuō)明miR-125b的表達(dá)水平對(duì)胃癌患者的生存預(yù)后有著重要影響，低表達(dá)的miR-125b可能預(yù)示著患者更差的生存結(jié)局，提示miR-125b可作為評(píng)估胃癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。此外，還有研究表明miR-125b的表達(dá)與胃癌的分化程度、TNM分期等臨床指標(biāo)相關(guān)。如胡澤剛等人的研究指出，miR-125b在胃癌組織中的表達(dá)與分化程度及患者預(yù)后呈正相關(guān)，與TNM分期呈負(fù)相關(guān)。這意味著高表達(dá)的miR-125b與較好的腫瘤分化程度及預(yù)后相關(guān)，而低表達(dá)的miR-125b則與較高的TNM分期相關(guān)，提示miR-125b在胃癌的進(jìn)展和預(yù)后評(píng)估中具有重要意義。三、miR-125b在胃癌中的功能機(jī)制研究3.1細(xì)胞增殖相關(guān)機(jī)制3.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為深入探究miR-125b對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制，本研究采用了一系列嚴(yán)謹(jǐn)且科學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法。在細(xì)胞增殖檢測(cè)方面，選用了CCK-8法和EdU法。CCK-8法基于細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶可將CCK-8試劑中的WST-8還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，且生成的甲瓚物數(shù)量與活細(xì)胞數(shù)量成正比這一原理，通過(guò)檢測(cè)甲瓚產(chǎn)物的吸光度來(lái)間接反映細(xì)胞的增殖情況。具體操作如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞用0.25%胰酶消化后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，隨后以每孔7000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中。在培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)，向每孔加入1/10體積的CCK-8試劑，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)，然后使用酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光吸收值。EdU法是一種新穎的細(xì)胞增殖檢測(cè)技術(shù)，其原理是利用EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷）能夠在DNA合成期（S期）摻入到正在合成的DNA中，通過(guò)與熒光染料的特異性反應(yīng)，可在熒光顯微鏡下直接觀察到增殖細(xì)胞。操作時(shí)，將胃癌細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按照EdU試劑盒說(shuō)明書加入EdU工作液，孵育一段時(shí)間后，進(jìn)行固定、通透化處理，再加入Click反應(yīng)液，使EdU與熒光染料發(fā)生反應(yīng)，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)EdU陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。為了明確miR-125b在胃癌細(xì)胞增殖中的作用，本研究構(gòu)建了miR-125b過(guò)表達(dá)和敲低模型。在過(guò)表達(dá)miR-125b時(shí)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-125bmimic轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中。具體步驟為：將胃癌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%融合時(shí)，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書，將適量的miR-125bmimic與脂質(zhì)體混合，孵育一段時(shí)間后，加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-125b的表達(dá)水平，以確定轉(zhuǎn)染是否成功。在敲低miR-125b時(shí)，同樣采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-125binhibitor轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染過(guò)程與過(guò)表達(dá)類似，轉(zhuǎn)染后通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-125b的表達(dá)水平，驗(yàn)證敲低效果。3.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-125b的胃癌細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的吸光度值顯著升高，表明細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)；而敲低miR-125b的胃癌細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的吸光度值顯著降低，細(xì)胞增殖受到明顯抑制。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與CCK-8實(shí)驗(yàn)一致，過(guò)表達(dá)miR-125b組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，敲低miR-125b組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少。進(jìn)一步探討miR-125b影響胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了miR-125b的潛在靶基因，并結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，MCL1基因是miR-125b的直接靶基因，miR-125b能夠與MCL1基因的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）特異性結(jié)合，抑制MCL1基因的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)。在胃癌細(xì)胞中，MCL1作為一種抗凋亡蛋白，其高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。當(dāng)miR-125b過(guò)表達(dá)時(shí)，MCL1基因表達(dá)受到抑制，從而解除了對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，導(dǎo)致胃癌細(xì)胞增殖能力下降；而當(dāng)miR-125b敲低時(shí)，MCL1基因表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。此外，研究還發(fā)現(xiàn)miR-125b可能通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞的增殖。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活和代謝等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)miR-125b過(guò)表達(dá)時(shí)，可抑制PI3K的活性，進(jìn)而抑制Akt的磷酸化，使下游與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白表達(dá)減少，最終抑制胃癌細(xì)胞的增殖；反之，當(dāng)miR-125b敲低時(shí)，PI3K/Akt信號(hào)通路被激活，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。3.2細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)機(jī)制3.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為深入探究miR-125b對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響及其相關(guān)機(jī)制，本研究采用了Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)兩種經(jīng)典方法。Transwell實(shí)驗(yàn)利用Transwell小室，其由上下兩個(gè)室組成，中間以聚碳酸酯膜相隔，膜上有微小的孔徑，可允許細(xì)胞通過(guò)。在遷移實(shí)驗(yàn)中，上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基及胃癌細(xì)胞懸液，下室加入含有趨化因子（如10%胎牛血清）的培養(yǎng)基，趨化因子可吸引細(xì)胞遷移。具體操作如下：將Transwell小室置于24孔板中，向小室上室加入100μL無(wú)血清培養(yǎng)基，下室加入600μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，使膜水化。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞用0.25%胰酶消化后，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個(gè)/mL，取100μL細(xì)胞懸液加入上室。將24孔板放回培養(yǎng)箱中孵育24-48小時(shí)，孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用無(wú)菌PBS輕輕清洗上室，去除未遷移的細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定下室遷移的細(xì)胞15分鐘，然后用0.1%結(jié)晶紫染色15-30分鐘，用棉簽擦去上室膜上的未遷移細(xì)胞，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)下室膜上的遷移細(xì)胞數(shù)。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，需要在Transwell小室的聚碳酸酯膜上預(yù)先鋪一層基質(zhì)膠（如Matrigel），模擬細(xì)胞外基質(zhì)，以評(píng)估細(xì)胞穿透細(xì)胞外基質(zhì)的能力。操作時(shí)，將Matrigel在4℃過(guò)夜融化，用4℃預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基按1:8稀釋，取50-100μL稀釋后的Matrigel加入Transwell小室上室，均勻鋪在膜上，置于37℃孵育3-5小時(shí)，使Matrigel凝固成膠狀。后續(xù)細(xì)胞接種、孵育及結(jié)果檢測(cè)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)類似。劃痕實(shí)驗(yàn)則是一種簡(jiǎn)單直觀的檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的方法。將胃癌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至80%-90%時(shí)，用無(wú)菌10μL移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕，模擬傷口。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞，去除劃下的細(xì)胞，然后加入含不同濃度藥物（如需要）或?qū)φ盏呐囵B(yǎng)基。在劃痕后0小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)等時(shí)間點(diǎn)，使用顯微鏡觀察并拍照，記錄劃痕寬度。通過(guò)ImageJ等圖像分析軟件測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)劃痕的寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率，公式為：遷移率=（0小時(shí)劃痕寬度-t小時(shí)劃痕寬度）/0小時(shí)劃痕寬度×100%。3.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-125b的胃癌細(xì)胞組，下室遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組，表明miR-125b過(guò)表達(dá)可顯著增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力；而敲低miR-125b的胃癌細(xì)胞組，下室遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組，說(shuō)明敲低miR-125b可有效抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，過(guò)表達(dá)miR-125b的胃癌細(xì)胞在劃痕后相同時(shí)間內(nèi)，劃痕寬度明顯小于對(duì)照組，細(xì)胞遷移率顯著升高；敲低miR-125b的胃癌細(xì)胞劃痕寬度大于對(duì)照組，細(xì)胞遷移率顯著降低。進(jìn)一步探討miR-125b影響胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的分子機(jī)制，通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-125b可能靶向調(diào)控多個(gè)與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的基因，如MMP2（基質(zhì)金屬蛋白酶2）、MMP9（基質(zhì)金屬蛋白酶9）和E-cadherin（上皮鈣黏蛋白）等。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，miR-125b能夠與MMP2和MMP9基因的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）特異性結(jié)合，抑制其mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)。MMP2和MMP9是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，在腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)miR-125b過(guò)表達(dá)時(shí)，MMP2和MMP9表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解減少，從而抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力；而當(dāng)miR-125b敲低時(shí)，MMP2和MMP9表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，研究還發(fā)現(xiàn)miR-125b對(duì)E-cadherin的表達(dá)具有調(diào)控作用。E-cadherin是一種重要的細(xì)胞黏附分子，其表達(dá)降低與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)密切相關(guān)。在胃癌細(xì)胞中，miR-125b過(guò)表達(dá)可抑制E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞間黏附力下降，從而有利于胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲；敲低miR-125b則可上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞間黏附力，抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。3.3細(xì)胞凋亡相關(guān)機(jī)制3.3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為深入探究miR-125b對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響及其潛在機(jī)制，本研究采用了多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從不同角度對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)和分析。在細(xì)胞凋亡檢測(cè)方面，運(yùn)用了流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法。流式細(xì)胞術(shù)是一種基于細(xì)胞在激光激發(fā)下產(chǎn)生的熒光信號(hào)來(lái)分析細(xì)胞特性的技術(shù)，在細(xì)胞凋亡檢測(cè)中，利用碘化丙啶（PI）和AnnexinV-FITC雙染法，可將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-/PI+）。具體操作如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞分為過(guò)表達(dá)miR-125b組、敲低miR-125b組和對(duì)照組，分別進(jìn)行相應(yīng)處理。處理結(jié)束后，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘，再加入400μLBindingBuffer，在1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，分析不同處理組細(xì)胞凋亡率的變化。TUNEL法（Terminal-deoxynucleotidylTransferaseMediatedNickEndLabeling）即末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法，是一種用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡過(guò)程中DNA斷裂的技術(shù)。其原理是利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）將生物素或地高辛等標(biāo)記的dUTP連接到斷裂的DNA3'-OH末端，然后通過(guò)與相應(yīng)的熒光素或酶標(biāo)記的抗體結(jié)合，在熒光顯微鏡或酶標(biāo)儀下進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將胃癌細(xì)胞接種于蓋玻片上，進(jìn)行不同處理后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%TritonX-100通透細(xì)胞，按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，加入TUNEL反應(yīng)混合液，37℃避光孵育60分鐘，然后用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞（即凋亡細(xì)胞）的數(shù)量。為了進(jìn)一步探究miR-125b影響胃癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本研究對(duì)凋亡相關(guān)基因和蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因（如BAX、BCL-2、caspase-3等）的mRNA表達(dá)水平。具體步驟為：提取不同處理組胃癌細(xì)胞的總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列根據(jù)GenBank中相關(guān)基因的序列設(shè)計(jì)，并通過(guò)BLAST進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證。PCR反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行設(shè)置，反應(yīng)結(jié)束后，利用熔解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)則用于檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白（如BAX、BCL-2、cleaved-caspase-3等）的表達(dá)水平。首先提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉膜1-2小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。然后加入一抗（如anti-BAX、anti-BCL-2、anti-cleaved-caspase-3等），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST洗滌膜3次后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，分析各蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白（如β-actin）的相對(duì)表達(dá)量。3.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-125b的胃癌細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率顯著降低，細(xì)胞凋亡受到明顯抑制；而敲低miR-125b的胃癌細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率顯著升高，細(xì)胞凋亡明顯增加。TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與流式細(xì)胞術(shù)一致，過(guò)表達(dá)miR-125b組的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組，敲低miR-125b組的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組。在凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)方面，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-125b后，促凋亡基因BAX和caspase-3的mRNA表達(dá)水平顯著降低，而抗凋亡基因BCL-2的mRNA表達(dá)水平顯著升高；敲低miR-125b后，BAX和caspase-3的mRNA表達(dá)水平顯著升高，BCL-2的mRNA表達(dá)水平顯著降低。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-125b可使BAX和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平降低，BCL-2蛋白表達(dá)水平升高；敲低miR-125b則使BAX和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，BCL-2蛋白表達(dá)水平降低。進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-125b能夠與BAX基因的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）特異性結(jié)合，抑制BAX基因的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)。BAX是一種促凋亡蛋白，其表達(dá)下調(diào)可抑制細(xì)胞凋亡。當(dāng)miR-125b過(guò)表達(dá)時(shí)，BAX表達(dá)受到抑制，從而減少了細(xì)胞凋亡的發(fā)生；而當(dāng)miR-125b敲低時(shí)，BAX表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，miR-125b還可能通過(guò)調(diào)控其他凋亡相關(guān)基因和信號(hào)通路，如PI3K/Akt信號(hào)通路，影響胃癌細(xì)胞的凋亡。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，激活該信號(hào)通路可抑制細(xì)胞凋亡，而抑制該信號(hào)通路則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b過(guò)表達(dá)可激活PI3K/Akt信號(hào)通路，使Akt磷酸化水平升高，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡；敲低miR-125b則抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，降低Akt磷酸化水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。四、miR-125b對(duì)順鉑化療敏感性的影響研究4.1體外實(shí)驗(yàn)研究4.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法本研究選用人胃癌細(xì)胞系SGC-7901和BGC-823作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，這兩種細(xì)胞系在胃癌研究中應(yīng)用廣泛，具有典型的胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性。將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。順鉑處理時(shí)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，分別加入不同濃度（0μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L）的順鉑溶液，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。CCK-8法基于細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶可將CCK-8試劑中的WST-8還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，且生成的甲瓚物數(shù)量與活細(xì)胞數(shù)量成正比這一原理，通過(guò)檢測(cè)甲瓚產(chǎn)物的吸光度來(lái)間接反映細(xì)胞活力。具體操作如下：向每孔加入10μLCCK-8試劑，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)，然后使用酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光吸收值，計(jì)算細(xì)胞活力抑制率，公式為：細(xì)胞活力抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值）×100%。為研究miR-125b對(duì)順鉑化療敏感性的影響，構(gòu)建miR-125b過(guò)表達(dá)和敲低模型。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-125bmimic（模擬miR-125b高表達(dá)）、miR-125binhibitor（抑制miR-125b表達(dá)）及相應(yīng)的陰性對(duì)照（NC）轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中。具體步驟為：將胃癌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%融合時(shí)，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書，將適量的miR-125bmimic、miR-125binhibitor或NC與脂質(zhì)體混合，孵育一段時(shí)間后，加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-125b的表達(dá)水平，以確定轉(zhuǎn)染是否成功。轉(zhuǎn)染成功后，將細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)，然后加入IC50濃度（通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)確定的能抑制50%細(xì)胞生長(zhǎng)的順鉑濃度）的順鉑溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，計(jì)算細(xì)胞活力抑制率。細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)，利用碘化丙啶（PI）和AnnexinV-FITC雙染法，可將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-/PI+）。具體操作如下：將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入IC50濃度的順鉑溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。處理結(jié)束后，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘，再加入400μLBindingBuffer，在1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，分析不同處理組細(xì)胞凋亡率的變化。為了探究miR-125b影響順鉑化療敏感性的分子機(jī)制，對(duì)耐藥相關(guān)蛋白和信號(hào)通路進(jìn)行檢測(cè)。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)耐藥相關(guān)蛋白P-gp（P-糖蛋白）、MRP1（多藥耐藥相關(guān)蛋白1）和LRP（肺耐藥相關(guān)蛋白）的表達(dá)水平。首先提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉膜1-2小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。然后加入一抗（如anti-P-gp、anti-MRP1、anti-LRP等），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST洗滌膜3次后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，分析各蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白（如β-actin）的相對(duì)表達(dá)量。同時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)基因PI3K、Akt和mTOR的mRNA表達(dá)水平。具體步驟為：提取不同處理組胃癌細(xì)胞的總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列根據(jù)GenBank中相關(guān)基因的序列設(shè)計(jì)，并通過(guò)BLAST進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證。PCR反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行設(shè)置，反應(yīng)結(jié)束后，利用熔解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。4.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著順鉑濃度的增加，胃癌細(xì)胞的活力抑制率逐漸升高，呈濃度依賴性。在相同順鉑濃度下，過(guò)表達(dá)miR-125b的胃癌細(xì)胞活力抑制率顯著高于對(duì)照組，而敲低miR-125b的胃癌細(xì)胞活力抑制率顯著低于對(duì)照組。這表明miR-125b過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，而敲低miR-125b則降低胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，加入IC50濃度的順鉑處理后，過(guò)表達(dá)miR-125b的胃癌細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率顯著高于對(duì)照組，而敲低miR-125b的胃癌細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率顯著低于對(duì)照組。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-125b過(guò)表達(dá)可促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡，提高順鉑化療敏感性；敲低miR-125b則抑制順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡，降低順鉑化療敏感性。在耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)方面，Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-125b的胃癌細(xì)胞中，P-gp、MRP1和LRP蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組；而敲低miR-125b的胃癌細(xì)胞中，P-gp、MRP1和LRP蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。P-gp、MRP1和LRP是常見的耐藥相關(guān)蛋白，它們可將細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。本研究結(jié)果表明，miR-125b可能通過(guò)下調(diào)耐藥相關(guān)蛋白P-gp、MRP1和LRP的表達(dá)，減少化療藥物的外排，提高細(xì)胞內(nèi)順鉑濃度，進(jìn)而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。在PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)方面，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-125b可顯著抑制PI3K、Akt和mTOR基因的mRNA表達(dá)水平；而敲低miR-125b則顯著上調(diào)PI3K、Akt和mTOR基因的mRNA表達(dá)水平。PI3K/Akt信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和耐藥等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。激活PI3K/Akt信號(hào)通路可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，抑制細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性；抑制該信號(hào)通路則可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。本研究結(jié)果提示，miR-125b可能通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性，從而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。4.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究4.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法本研究選用4-6周齡的BALB/c裸鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，共30只，體重在18-22g之間，購(gòu)自[具體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，在無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。人胃癌細(xì)胞系SGC-7901經(jīng)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，用0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107個(gè)/mL。將100μL細(xì)胞懸液（含5×106個(gè)細(xì)胞）接種于裸鼠右側(cè)腋下皮下，構(gòu)建人胃癌裸鼠移植瘤模型。接種后每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神、飲食、活動(dòng)等情況，每3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。待腫瘤體積生長(zhǎng)至約100-150mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為對(duì)照組、順鉑組、miR-125b+順鉑組。對(duì)照組給予等體積的生理鹽水腹腔注射，順鉑組給予順鉑腹腔注射，劑量為5mg/kg，每周2次。miR-125b+順鉑組先通過(guò)尾靜脈注射miR-125bagomir（模擬miR-125b高表達(dá)），劑量為50nmol/kg，每周1次，連續(xù)注射3次，然后在第4周開始給予順鉑腹腔注射，劑量和頻率與順鉑組相同。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，密切觀察裸鼠的體重變化，每周測(cè)量1次體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，脫頸椎處死裸鼠，完整取出腫瘤組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分，稱重。部分腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，用于制作石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色和免疫組織化學(xué)染色，觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況；部分腫瘤組織迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于提取RNA和蛋白質(zhì)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)，分析miR-125b對(duì)順鉑化療敏感性相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響。4.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析在腫瘤體積和重量方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，對(duì)照組腫瘤體積和重量持續(xù)增長(zhǎng)，順鉑組腫瘤體積和重量的增長(zhǎng)速度較對(duì)照組明顯減緩，而miR-125b+順鉑組腫瘤體積和重量的增長(zhǎng)速度最慢。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，miR-125b+順鉑組的腫瘤體積和重量顯著低于順鉑組和對(duì)照組。這表明miR-125b聯(lián)合順鉑能夠更有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)，增強(qiáng)順鉑的化療效果。在體重變化方面，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組裸鼠體重穩(wěn)步增長(zhǎng)；順鉑組由于化療藥物的副作用，裸鼠體重增長(zhǎng)緩慢，部分裸鼠體重出現(xiàn)短暫下降；miR-125b+順鉑組裸鼠體重增長(zhǎng)情況優(yōu)于順鉑組，且體重下降幅度較小。這提示miR-125b可能在一定程度上減輕順鉑的毒副作用，提高裸鼠對(duì)順鉑化療的耐受性。在腫瘤組織的形態(tài)學(xué)觀察方面，HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核大且深染，核質(zhì)比增大，可見較多的核分裂象，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則；順鉑組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變，如細(xì)胞核固縮、碎裂，細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)濃縮等；miR-125b+順鉑組腫瘤細(xì)胞凋亡現(xiàn)象更為明顯，壞死區(qū)域增多。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-125b聯(lián)合順鉑可增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長(zhǎng)。在免疫組織化學(xué)染色和相關(guān)基因、蛋白表達(dá)檢測(cè)方面，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，順鉑組和miR-125b+順鉑組腫瘤組織中增殖相關(guān)蛋白Ki-67的表達(dá)顯著降低，凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase-3的表達(dá)顯著升高。且miR-125b+順鉑組Ki-67的表達(dá)低于順鉑組，cleaved-caspase-3的表達(dá)高于順鉑組。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)結(jié)果表明，miR-125b+順鉑組腫瘤組織中耐藥相關(guān)蛋白P-gp、MRP1和LRP的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著低于順鉑組，PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)基因PI3K、Akt和mTOR的mRNA表達(dá)水平也顯著低于順鉑組。這表明miR-125b聯(lián)合順鉑可通過(guò)下調(diào)耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，增強(qiáng)順鉑的化療敏感性，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。五、miR-125b靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證5.1靶基因預(yù)測(cè)為了深入探究miR-125b在胃癌中發(fā)揮功能的分子機(jī)制，精準(zhǔn)預(yù)測(cè)其靶基因至關(guān)重要。本研究綜合運(yùn)用了多種生物信息學(xué)工具，如TargetScan、miRDB和PicTar等，這些工具在預(yù)測(cè)miRNA靶基因方面具有廣泛的應(yīng)用和較高的可靠性。TargetScan是一款基于靶位點(diǎn)保守性的預(yù)測(cè)工具，其核心原理是利用不同物種間靶位點(diǎn)的進(jìn)化保守性來(lái)識(shí)別潛在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)。在預(yù)測(cè)過(guò)程中，首先通過(guò)對(duì)大量不同物種的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建物種間的進(jìn)化關(guān)系樹。然后，針對(duì)miR-125b的種子序列（一般指miRNA5'端的2-8個(gè)核苷酸，在與靶mRNA結(jié)合中起關(guān)鍵作用），在不同物種的mRNA3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）中尋找與之互補(bǔ)配對(duì)且具有進(jìn)化保守性的序列。例如，在人類、小鼠、大鼠等多個(gè)物種的基因組中，搜索與miR-125b種子序列互補(bǔ)的3'-UTR區(qū)域，如果這些區(qū)域在不同物種中高度保守，那么該mRNA就被認(rèn)為是miR-125b的潛在靶基因。通過(guò)這種方式，TargetScan能夠有效地篩選出具有生物學(xué)意義的潛在靶基因，減少假陽(yáng)性結(jié)果。miRDB則是基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法的預(yù)測(cè)工具。它通過(guò)收集大量已知的miRNA-靶基因?qū)ψ鳛橛?xùn)練數(shù)據(jù)，構(gòu)建復(fù)雜的機(jī)器學(xué)習(xí)模型。該模型能夠?qū)W習(xí)miRNA與靶基因之間的相互作用模式，包括序列互補(bǔ)性、結(jié)合自由能、靶位點(diǎn)周圍的序列特征等多種因素。在預(yù)測(cè)miR-125b的靶基因時(shí)，miRDB將這些因素納入考量，對(duì)輸入的mRNA序列進(jìn)行全面分析。例如，它會(huì)計(jì)算miR-125b與mRNA3'-UTR結(jié)合的自由能，評(píng)估結(jié)合的穩(wěn)定性；同時(shí)，分析靶位點(diǎn)周圍的核苷酸組成、二級(jí)結(jié)構(gòu)等特征，判斷其對(duì)miRNA-靶基因相互作用的影響。通過(guò)綜合評(píng)估這些因素，miRDB能夠預(yù)測(cè)出miR-125b與mRNA之間的結(jié)合可能性，從而篩選出潛在的靶基因。PicTar工具則是基于多種生物信息學(xué)特征進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。它不僅考慮了miRNA與靶mRNA的序列互補(bǔ)性，還結(jié)合了靶位點(diǎn)的保守性、mRNA的表達(dá)譜數(shù)據(jù)以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)等多方面信息。在預(yù)測(cè)miR-125b靶基因時(shí)，PicTar首先分析miR-125b與mRNA3'-UTR的序列互補(bǔ)情況，尋找潛在的結(jié)合位點(diǎn)。然后，通過(guò)與多個(gè)物種的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，評(píng)估這些結(jié)合位點(diǎn)的保守性。同時(shí)，它還會(huì)參考mRNA在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，判斷在哪些情況下miR-125b與靶基因可能存在相互作用。此外，PicTar還會(huì)利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)信息，分析靶基因與其他基因之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性。通過(guò)整合這些多維度的信息，PicTar能夠更全面、準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)miR-125b的靶基因。5.2靶基因驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)5.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法在靶基因驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，采用了熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、Westernblot和RT-PCR等多種實(shí)驗(yàn)方法，以全面驗(yàn)證miR-125b與靶基因的相互作用關(guān)系。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)旨在檢測(cè)miR-125b與靶基因3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）的直接結(jié)合情況。首先，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取靶基因的3'-UTR序列，通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)，將其克隆至pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告基因載體中，構(gòu)建野生型報(bào)告基因載體（WT-3'-UTR）。同時(shí)，運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)靶基因3'-UTR中與miR-125b種子序列互補(bǔ)配對(duì)的區(qū)域進(jìn)行突變，構(gòu)建突變型報(bào)告基因載體（Mut-3'-UTR）。將構(gòu)建好的報(bào)告基因載體分別與miR-125bmimic、miR-125binhibitor及相應(yīng)的陰性對(duì)照（NC）共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)（Promega公司）檢測(cè)熒光素酶活性。具體操作如下：棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入100μL被動(dòng)裂解緩沖液（PLB），室溫振蕩15分鐘，使細(xì)胞充分裂解。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm離心5分鐘，取上清液。分別加入螢火蟲熒光素酶檢測(cè)試劑和海腎熒光素酶檢測(cè)試劑，在多功能酶標(biāo)儀上依次檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參，計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，即相對(duì)熒光素酶活性。Westernblot用于檢測(cè)靶基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化。將胃癌細(xì)胞分為過(guò)表達(dá)miR-125b組、敲低miR-125b組和對(duì)照組，分別進(jìn)行相應(yīng)處理。處理結(jié)束后，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘，使蛋白質(zhì)充分變性。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適濃度的分離膠，將蛋白樣品加入加樣孔中，在恒壓條件下進(jìn)行電泳，使蛋白質(zhì)在凝膠中分離。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為恒流200mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)蛋白分子量大小調(diào)整，一般為1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入含有一抗（針對(duì)靶基因和內(nèi)參蛋白β-actin的抗體）的溶液中，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜放入含有二抗（與一抗種屬匹配的HRP標(biāo)記的二抗）的溶液中，室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，分析靶基因蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的相對(duì)表達(dá)量。RT-PCR則用于檢測(cè)靶基因在mRNA水平的表達(dá)變化。提取不同處理組胃癌細(xì)胞的總RNA，采用TRIzol試劑法提取，按照試劑說(shuō)明書操作。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并用核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度和純度。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。以cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列根據(jù)GenBank中靶基因的序列設(shè)計(jì)，并通過(guò)BLAST進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證。PCR反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行設(shè)置，反應(yīng)結(jié)束后，利用熔解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算靶基因的相對(duì)表達(dá)量。5.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-125bmimic與野生型報(bào)告基因載體（WT-3'-UTR）共轉(zhuǎn)染組的相對(duì)熒光素酶活性顯著降低，表明miR-125b能夠與靶基因3'-UTR特異性結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)；而miR-125bmimic與突變型報(bào)告基因載體（Mut-3'-UTR）共轉(zhuǎn)染組的相對(duì)熒光素酶活性無(wú)明顯變化，說(shuō)明miR-125b與靶基因3'-UTR的結(jié)合具有特異性，突變后的3'-UTR不能與miR-125b有效結(jié)合。相反，miR-125binhibitor與WT-3'-UTR共轉(zhuǎn)染組的相對(duì)熒光素酶活性顯著升高，表明抑制miR-125b的表達(dá)可解除其對(duì)靶基因3'-UTR的抑制作用，使熒光素酶表達(dá)增加。Westernblot結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-125b的胃癌細(xì)胞中，靶基因的蛋白表達(dá)水平顯著降低；敲低miR-125b的胃癌細(xì)胞中，靶基因的蛋白表達(dá)水平顯著升高。這與熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了miR-125b對(duì)靶基因在蛋白質(zhì)水平的負(fù)調(diào)控作用。RT-PCR結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-125b可顯著降低靶基因的mRNA表達(dá)水平；敲低miR-125b則顯著上調(diào)靶基因的mRNA表達(dá)水平。綜合熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、Westernblot和RT-PCR結(jié)果，可以明確miR-125b與靶基因之間存在相互作用關(guān)系，miR-125b能夠通過(guò)與靶基因3'-UTR特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)，從而影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為以及對(duì)順鉑化療的敏感性。六、結(jié)論與展望6.1研究總結(jié)本研究圍繞miR-125b在胃癌中的功能機(jī)制及其對(duì)順鉑化療敏感性的影響展開了一系列深入探究，取得了豐富且具有重要意義的研究成果。在表達(dá)情況方面，研究結(jié)果顯示，miR-125b在胃癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)呈現(xiàn)出顯著的差異性。部分研究表明其在胃癌組織中低表達(dá)，且與胃癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及患者預(yù)后等臨床指標(biāo)密切相關(guān)。例如，高鵬等人的研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織miR-125b-1-3p的表達(dá)相較于對(duì)應(yīng)癌旁組織顯著下調(diào)，且僅與分化程度存在相關(guān)性；胡澤剛等人的研究表明，miR-125b在胃癌組織中低表達(dá)，與分化程度及患者預(yù)后呈正相關(guān)，與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。然而，也有研究得出miR-125b在胃癌組織中高表達(dá)的結(jié)論，如閻文婷等人通過(guò)real-timePCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在胃癌患者組織中miR-125b的表達(dá)水平顯著高于癌旁對(duì)照組。這種表達(dá)差異可能與研究對(duì)象的種族、地域、樣本量大小、檢測(cè)方法以及腫瘤的異質(zhì)性等多種因素有關(guān)。在功能機(jī)制方面，本研究通過(guò)一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法，全面揭示了miR-125b對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的重要影響。在細(xì)胞增殖方面，CCK-8實(shí)驗(yàn)和EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致表明，過(guò)表達(dá)miR-125b可顯著增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖能力，而敲低miR-125b則明顯抑制細(xì)胞增殖。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b通過(guò)靶向MCL1基因，抑制其mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)，從而調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖。MCL1作為一種抗凋亡蛋白，其高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，當(dāng)miR-125b過(guò)表達(dá)時(shí)，MCL1表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致胃癌細(xì)胞增殖能力下降；反之，當(dāng)miR-125b敲低時(shí)，MCL1表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。此外，miR-125b還可能通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞遷移和侵襲方面，Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，過(guò)表達(dá)miR-125b可顯著增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，敲低miR-125b則有效抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。深入探究其分子機(jī)制發(fā)現(xiàn)，miR-125b可能靶向調(diào)控多個(gè)與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的基因，如MMP2、MMP9和E-cadherin等。miR-125b能夠與MMP2和MMP9基因的3'非翻譯區(qū)特異性結(jié)合，抑制其mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)，從而影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解，調(diào)控胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。同時(shí)，miR-125b對(duì)E-cadherin的表達(dá)也具有調(diào)控作用，過(guò)表達(dá)miR-125b可抑制E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞間黏附力下降，有利于胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲；敲低miR-125b則上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞間黏附力，抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在細(xì)胞凋亡方面，流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-125b可顯著抑制胃癌細(xì)胞的凋亡，敲低miR-125b則明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b能夠與BAX基因的3'非翻譯區(qū)特異性結(jié)合，抑制BAX基因的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。此外，miR-125b還可能通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路，影響胃癌細(xì)胞的凋亡。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，激活該信號(hào)通路可抑制細(xì)胞凋亡，而抑制該信號(hào)通路則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b過(guò)表達(dá)可激活PI3K/Akt信號(hào)通路，使Akt磷酸化水平升高，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡；敲低miR-125b則抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，降低Akt磷酸化水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在對(duì)順