miR-30C介導(dǎo)GAGE12I信號(hào)通路在胃癌轉(zhuǎn)移與增殖中的分子機(jī)制解析一、引言1.1研究背景與意義胃癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的重大疾病，在各類(lèi)惡性腫瘤中，其致死人數(shù)高居第二位，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。在我國(guó)，胃癌的發(fā)病率長(zhǎng)期位居惡性腫瘤之首，嚴(yán)峻的現(xiàn)狀使得對(duì)胃癌的研究迫在眉睫。盡管醫(yī)學(xué)技術(shù)不斷進(jìn)步，但胃癌的高浸潤(rùn)性和高轉(zhuǎn)移性仍是治療難題，中晚期患者的手術(shù)療效難以令人滿意，5年生存率仍處于較低水平，I期胃癌的5年生存率為90%-98%，II期為68.5%，III期僅為30.8%-50.1%，IV期更是低至16.6%。從分子層面來(lái)看，胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多基因變化的復(fù)雜過(guò)程，正常基因表達(dá)失調(diào)、癌基因異常擴(kuò)增與表達(dá)、抑癌基因的突變或失活，以及多個(gè)基因的協(xié)同作用等，共同決定了腫瘤表型。因此，深入探究胃癌在基因水平的分子機(jī)制，對(duì)提高胃癌的治療和預(yù)后水平意義重大?；蛐酒夹g(shù)作為一種先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)，具有高通量、平行性的特點(diǎn)，能夠同時(shí)對(duì)大量基因進(jìn)行檢測(cè)和分析，這使其在胃癌研究中展現(xiàn)出巨大潛力。通過(guò)基因芯片技術(shù)，研究人員在轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性胃癌組織的對(duì)比中，篩選出了數(shù)百個(gè)差異表達(dá)基因，為深入了解胃癌轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了關(guān)鍵線索。在這些差異表達(dá)基因中，GAGE基因家族成員GAGE12I及GAGE12D等在轉(zhuǎn)移性胃癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，暗示其與胃癌的進(jìn)展尤其是轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。GAGE基因家族通常在腫瘤組織和正常睪丸組織中表達(dá)，在其他正常組織中則不表達(dá)，其蛋白產(chǎn)物可引發(fā)免疫系統(tǒng)反應(yīng)，被視為腫瘤-睪丸抗原。過(guò)往研究表明，GAGE基因與腫瘤患者較差的臨床預(yù)后相關(guān)，然而，GAGE12I等家族成員在胃癌中的具體生物學(xué)調(diào)節(jié)作用，目前仍不明確。與此同時(shí)，微小RNA（microRNA，miRNA）作為一類(lèi)短鏈非編碼RNA，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合靶基因的3’-UTR區(qū)域，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的蛋白表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，GAGE12I可能受到miR-30C（miR-30C-1-3P和miR-30C-2-3P）、miR-887-5p、miR-320b以及miR-590-3p等多個(gè)miRNAs的負(fù)向調(diào)控。但這些miRNAs是否真的對(duì)GAGE12I發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，以及它們是否通過(guò)負(fù)向調(diào)控GAGE12I來(lái)影響胃癌的進(jìn)展，都有待進(jìn)一步深入研究。本研究聚焦于miR-30C介導(dǎo)的GAGE12I信號(hào)通路，旨在全面深入地揭示其在胃癌轉(zhuǎn)移和增殖過(guò)程中的作用機(jī)制。這不僅有助于我們從分子層面更深入地理解胃癌的發(fā)病機(jī)理，為胃癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供新的生物學(xué)標(biāo)記物，還可能為胃癌的治療開(kāi)辟新的靶點(diǎn)和策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值，有望為改善胃癌患者的治療效果和生存質(zhì)量帶來(lái)新的希望。1.2研究目的與內(nèi)容本研究的核心目的在于深入剖析miR-30C介導(dǎo)的GAGE12I信號(hào)通路，全面揭示其在胃癌轉(zhuǎn)移和增殖進(jìn)程中的作用機(jī)制，為胃癌的防治提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。圍繞這一核心目標(biāo)，具體研究?jī)?nèi)容如下：確定miR-30C與GAGE12I的靶向調(diào)控關(guān)系：運(yùn)用生物信息學(xué)軟件，對(duì)miR-30C與GAGE12I的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)預(yù)測(cè)。通過(guò)構(gòu)建包含GAGE12I3'-UTR區(qū)域的雙熒光素酶報(bào)告基因載體，與miR-30C模擬物或抑制劑共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，借助雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，直觀驗(yàn)證miR-30C對(duì)GAGE12I的靶向調(diào)控作用。在此基礎(chǔ)上，利用Westernblot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)，從蛋白和mRNA水平，進(jìn)一步深入分析miR-30C對(duì)GAGE12I表達(dá)的影響，明確二者在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)關(guān)聯(lián)。探究miR-30C介導(dǎo)的GAGE12I信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響：將miR-30C模擬物、抑制劑以及GAGE12I過(guò)表達(dá)載體、干擾載體分別轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞系中，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)，精準(zhǔn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，深入探究該信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。同時(shí)，采用MTS、EdU等實(shí)驗(yàn)方法，全面檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡情況，明確該信號(hào)通路在胃癌細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中的作用。此外，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞接種到裸鼠體內(nèi)，觀察腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移情況，從體內(nèi)水平驗(yàn)證miR-30C介導(dǎo)的GAGE12I信號(hào)通路對(duì)胃癌進(jìn)展的影響。篩選并驗(yàn)證受GAGE12I調(diào)控的下游信號(hào)通路：對(duì)過(guò)表達(dá)GAGE12I及對(duì)照組的胃癌細(xì)胞進(jìn)行mRNA基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)，全面分析差異性表達(dá)的信號(hào)通路。結(jié)合信號(hào)通路的功能，篩選出可能受GAGE12I調(diào)控的關(guān)鍵信號(hào)通路。運(yùn)用RT-qPCR和Westernblot等技術(shù)，對(duì)篩選出的信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，通過(guò)抑制劑處理或基因敲低等實(shí)驗(yàn)手段，干擾關(guān)鍵信號(hào)通路的活性，觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響，明確GAGE12I調(diào)控胃癌進(jìn)展的下游分子機(jī)制。1.3研究方法與技術(shù)路線基因芯片技術(shù)篩選差異表達(dá)基因：收集5例未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非轉(zhuǎn)移性胃癌組織和5例伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性胃癌新鮮標(biāo)本。運(yùn)用mRNA基因芯片對(duì)這些標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，全面分析轉(zhuǎn)移性胃癌和非轉(zhuǎn)移性胃癌組織中的基因表達(dá)情況。按照基因在轉(zhuǎn)移組中表達(dá)上調(diào)比值≧2.0或下調(diào)比值≦0.5，并且滿足P≦0.05的標(biāo)準(zhǔn)，初步篩選出差異表達(dá)基因，重點(diǎn)關(guān)注GAGE基因家族成員的表達(dá)變化。RT-qPCR檢測(cè)基因表達(dá)：收集胃癌新鮮組織或胃癌細(xì)胞樣本，使用Trizol試劑提取總RNA，隨后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)，以GAPDH作為內(nèi)參基因，對(duì)各樣本中GAGE12I、GAGE12D等目的基因mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于miRNA的檢測(cè)，先使用miRNA提取試劑盒從石蠟組織中提取miRNA，再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR檢測(cè)，分析miR-30C等miRNAs的表達(dá)情況。免疫組織化學(xué)檢測(cè)目的蛋白表達(dá)：收集132例胃癌石蠟標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)（IHC）技術(shù)，檢測(cè)GAGE12I等目的蛋白在胃癌組織中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系。同時(shí)，在胃癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GAGE12I過(guò)表達(dá)載體或miR-30C后，通過(guò)Westernblot檢測(cè)相關(guān)目的蛋白相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)變化，從蛋白水平驗(yàn)證基因表達(dá)的改變。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力：將GAGE12I過(guò)表達(dá)載體、miR-30C模擬物及相應(yīng)的對(duì)照載體、mimics分別轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞系中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)。在上室加入轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時(shí)間后，擦去上室未遷移或未侵襲的細(xì)胞，對(duì)下室的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色并計(jì)數(shù)，以此檢測(cè)胃癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力的改變。細(xì)胞增殖和凋亡檢測(cè)：將GAGE12I過(guò)表達(dá)載體、miR-30C模擬物及相應(yīng)對(duì)照轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞。通過(guò)MTS實(shí)驗(yàn)，在不同時(shí)間點(diǎn)加入MTS試劑，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；采用EdU實(shí)驗(yàn)，將EdU標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察細(xì)胞增殖情況；利用流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)細(xì)胞周期和凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，分析該信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：以慢病毒感染的方式在胃癌細(xì)胞系中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)GAGE12I，將感染后的胃癌細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組通過(guò)皮下注射和尾靜脈注射的方式注入裸鼠體內(nèi)，對(duì)照組注射未感染的胃癌細(xì)胞。5周后，觀察裸鼠皮下成瘤情況和遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移情況，通過(guò)解剖、病理切片等手段，分析GAGE12I對(duì)胃癌細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移以及增殖情況的影響。mRNA表達(dá)譜芯片分析受GAGE12I調(diào)控的信號(hào)通路：收集過(guò)表達(dá)GAGE12I及對(duì)照組的胃癌細(xì)胞，進(jìn)行mRNA基因表達(dá)譜檢測(cè)。運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法，全面分析差異性表達(dá)的信號(hào)通路，并結(jié)合信號(hào)通路的功能，篩選出可能受GAGE12I調(diào)控的關(guān)鍵信號(hào)通路。利用RT-qPCR和Westernblot實(shí)驗(yàn)，對(duì)篩選出的信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VEGF的表達(dá)：收集過(guò)表達(dá)GAGE12I組及對(duì)照組的胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入酶標(biāo)板中，孵育后加入檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)洗滌、顯色等步驟，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度，檢測(cè)GAGE12I對(duì)細(xì)胞外泌VEGF表達(dá)的影響。miRNA的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證：首先通過(guò)生物信息學(xué)軟件，如TargetScan、miRanda等，對(duì)可能結(jié)合在GAGE12I-3'UTR區(qū)域的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)構(gòu)建GAGE12I-3'UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體，將其與miR-30C模擬物或抑制劑共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞等合適的細(xì)胞系中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)熒光素酶活性，驗(yàn)證miR-30C對(duì)GAGE12I表達(dá)的調(diào)控作用。再進(jìn)行Westernblot實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-30C對(duì)GAGE12I蛋白表達(dá)水平的調(diào)控，從而最終確定能夠直接調(diào)節(jié)GAGE12I的miRNA。數(shù)據(jù)分析：運(yùn)用SPSS或GraphPadPrism等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組數(shù)據(jù)之間的差異采用Studentt-test檢驗(yàn)方法；多組數(shù)據(jù)比較采用方差分析（ANOVA）。Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)法分析GAGE12I以及miR-30C的表達(dá)與胃癌患者術(shù)后生存的關(guān)系；GAGE12I與miR-30C之間的關(guān)系采用Spearman's相關(guān)分析。以P＜0.05作為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。本研究技術(shù)路線如圖1所示：首先，通過(guò)基因芯片篩選轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性胃癌組織中的差異表達(dá)基因，初步確定GAGE12I等基因與胃癌轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)；接著，運(yùn)用RT-qPCR、免疫組織化學(xué)等技術(shù)在mRNA和蛋白水平驗(yàn)證基因表達(dá)；然后，利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞和整體水平探究miR-30C介導(dǎo)的GAGE12I信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡的影響；同時(shí)，通過(guò)mRNA表達(dá)譜芯片分析和相關(guān)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，篩選并確定受GAGE12I調(diào)控的下游信號(hào)通路；最后，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出研究結(jié)論。[此處插入技術(shù)路線圖]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1胃癌概述胃癌，作為一種起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)均具有較高的發(fā)病率和致死率。其發(fā)病機(jī)制是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，涉及環(huán)境、遺傳、感染等多個(gè)方面。從環(huán)境因素來(lái)看，飲食與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。長(zhǎng)期食用高鹽、腌制、煙熏、油炸食品，以及缺乏新鮮蔬菜水果的攝入，都可能增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。高鹽飲食會(huì)破壞胃黏膜的屏障功能，使胃黏膜更容易受到其他致癌物質(zhì)的損傷；腌制食品中含有的亞硝酸鹽，在胃內(nèi)可轉(zhuǎn)化為亞硝胺類(lèi)化合物，這是一類(lèi)強(qiáng)致癌物質(zhì)。感染因素中，幽門(mén)螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）感染被認(rèn)為是胃癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。Hp感染可引發(fā)慢性炎癥，導(dǎo)致胃黏膜上皮細(xì)胞增殖和凋亡失衡，進(jìn)而促進(jìn)胃癌的發(fā)生。Hp產(chǎn)生的細(xì)胞毒素相關(guān)基因A（CagA）和空泡毒素（VacA）等毒力因子，能夠干擾細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。遺傳因素在胃癌的發(fā)病中也起著重要作用。約10%的胃癌患者具有家族遺傳背景，遺傳性彌漫性胃癌（HDGC）是一種常染色體顯性遺傳疾病，由E-鈣黏蛋白（CDH1）基因突變引起，這類(lèi)患者患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。胃癌的轉(zhuǎn)移方式主要包括淋巴轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移、種植轉(zhuǎn)移和直接浸潤(rùn)。淋巴轉(zhuǎn)移是胃癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移途徑，癌細(xì)胞可通過(guò)淋巴管轉(zhuǎn)移至局部淋巴結(jié)，進(jìn)而擴(kuò)散到遠(yuǎn)處淋巴結(jié)。血行轉(zhuǎn)移多發(fā)生在晚期，癌細(xì)胞可通過(guò)血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至肝臟、肺、骨等遠(yuǎn)處器官，其中肝臟是最常見(jiàn)的血行轉(zhuǎn)移部位。種植轉(zhuǎn)移是指癌細(xì)胞脫落并種植在腹膜、卵巢等部位，形成轉(zhuǎn)移灶，如Krukenberg瘤就是胃癌種植轉(zhuǎn)移至卵巢的典型表現(xiàn)。直接浸潤(rùn)則是癌細(xì)胞直接侵犯胃周?chē)M織和器官，如食管、十二指腸、肝臟等。目前，胃癌的治療手段主要包括手術(shù)治療、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。手術(shù)治療是胃癌的主要治療方法，包括根治性手術(shù)和姑息性手術(shù)。根治性手術(shù)旨在徹底切除腫瘤及周?chē)M織，清掃淋巴結(jié)，以達(dá)到治愈的目的；姑息性手術(shù)則主要用于緩解癥狀，如解除梗阻、控制出血等?；熓峭ㄟ^(guò)使用化學(xué)藥物殺死癌細(xì)胞，可分為術(shù)前新輔助化療、術(shù)后輔助化療和晚期姑息化療。術(shù)前新輔助化療可以縮小腫瘤體積，提高手術(shù)切除率；術(shù)后輔助化療可以降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，提高患者生存率；晚期姑息化療則主要用于緩解癥狀，延長(zhǎng)患者生存期。放療是利用放射線殺死癌細(xì)胞，可用于局部晚期胃癌的治療，與手術(shù)、化療聯(lián)合使用，能夠提高治療效果。靶向治療是針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特定分子靶點(diǎn)，使用相應(yīng)的靶向藥物進(jìn)行治療，具有特異性強(qiáng)、副作用小的特點(diǎn)。例如，曲妥珠單抗是一種針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）陽(yáng)性胃癌的靶向藥物，能夠顯著延長(zhǎng)患者生存期。免疫治療是通過(guò)激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來(lái)攻擊癌細(xì)胞，近年來(lái)在胃癌治療中取得了一定的進(jìn)展，如程序性死亡受體1（PD-1）抑制劑和程序性死亡配體1（PD-L1）抑制劑等，為晚期胃癌患者提供了新的治療選擇。然而，由于胃癌的異質(zhì)性和耐藥性，目前的治療效果仍有待提高，尋找新的治療靶點(diǎn)和治療策略具有重要的臨床意義。2.2miR-30C相關(guān)理論miR-30C是微小RNA（miRNA）家族中的重要成員，在細(xì)胞的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。從結(jié)構(gòu)上看，miR-30C基因在人類(lèi)基因組中存在兩種編碼形式，即miR-30C-1和miR-30C-2，它們分別由不同的基因位點(diǎn)編碼。成熟的miR-30C長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，具有高度保守的種子序列，這一序列特征使得miR-30C能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合靶基因mRNA的3’-非翻譯區(qū)（3’-UTR），從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控。在功能方面，miR-30C參與了細(xì)胞的多種生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡和遷移等。在正常細(xì)胞中，miR-30C通過(guò)對(duì)相關(guān)靶基因的調(diào)控，維持細(xì)胞的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。例如，在心肌細(xì)胞中，miR-30C可通過(guò)調(diào)控自噬相關(guān)基因的表達(dá)，維持心肌細(xì)胞的能量代謝和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對(duì)心肌缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，miR-30C扮演著復(fù)雜而重要的角色。大量研究表明，miR-30C在多種腫瘤組織和細(xì)胞系中呈現(xiàn)異常表達(dá)，其表達(dá)水平的改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌中，miR-30C的表達(dá)明顯下調(diào)，且其下調(diào)程度與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后密切相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-30C的表達(dá)可以顯著抑制肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而miR-30C的下調(diào)則會(huì)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。這表明miR-30C在非小細(xì)胞肺癌中可能作為一種抑癌基因發(fā)揮作用，通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因，抑制腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，從而降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在肝細(xì)胞癌中，miR-30C同樣表現(xiàn)出異常表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-30C在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平低于正常肝組織，且其低表達(dá)與腫瘤的大小、脈管轉(zhuǎn)移及患者的不良預(yù)后相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)表明，上調(diào)miR-30C的表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，而下調(diào)miR-30C的表達(dá)則會(huì)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的惡性行為。機(jī)制研究揭示，miR-30C可通過(guò)靶向抑制轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的EMT過(guò)程，進(jìn)而抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。miR-30C在腫瘤中的作用機(jī)制主要是通過(guò)與靶基因mRNA的3’-UTR區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)，抑制靶基因的翻譯過(guò)程，或者誘導(dǎo)靶mRNA的降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。以胃癌為例，已有研究報(bào)道m(xù)iR-30C可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控某些與胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，影響胃癌的進(jìn)展。然而，關(guān)于miR-30C在胃癌中具體的靶基因及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，仍有待進(jìn)一步深入探究。此外，miR-30C還可能通過(guò)參與腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)，間接影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。腫瘤微環(huán)境中包含多種細(xì)胞成分和細(xì)胞因子，miR-30C可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與周?chē)?xì)胞之間的相互作用，以及細(xì)胞因子的分泌和信號(hào)傳導(dǎo)，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸等過(guò)程產(chǎn)生影響。2.3GAGE12I相關(guān)理論GAGE12I基因作為GAGE基因家族的重要成員，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色，對(duì)其結(jié)構(gòu)、功能及在腫瘤中作用的深入研究，有助于我們更好地理解腫瘤的發(fā)病機(jī)制，為腫瘤的診斷和治療提供新的思路和靶點(diǎn)。從基因結(jié)構(gòu)來(lái)看，GAGE12I基因定位于X染色體短臂的p11.23區(qū)域，雖然它不在當(dāng)前的參考基因組中，但卻是一個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因。GAGE12I基因包含多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過(guò)剪接加工后，形成成熟的mRNA，進(jìn)而翻譯為具有特定功能的蛋白質(zhì)。GAGE12I基因與GAGE家族其他成員的序列高度相關(guān)，但又存在一些散在的核苷酸替換，這種序列差異使得GAGE12I具有獨(dú)特的生物學(xué)功能。在正常生理狀態(tài)下，GAGE12I基因通常僅在睪丸組織中表達(dá)，而在其他正常組織中幾乎不表達(dá)。這種組織特異性表達(dá)模式表明，GAGE12I可能在生殖細(xì)胞的發(fā)育和功能維持中發(fā)揮著重要作用。睪丸作為男性生殖器官，其內(nèi)部的生殖細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中需要經(jīng)歷復(fù)雜的分化和成熟過(guò)程，GAGE12I基因可能參與調(diào)控生殖細(xì)胞的增殖、分化以及減數(shù)分裂等關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程，確保生殖細(xì)胞的正常發(fā)育和功能。在腫瘤組織中，GAGE12I基因的表達(dá)情況發(fā)生了顯著變化。研究發(fā)現(xiàn)，GAGE12I基因在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，如睪丸癌、胃癌、乳腺癌、肺癌等。在睪丸癌中，GAGE12I基因的高表達(dá)可能與癌細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。癌細(xì)胞的快速增殖需要大量的蛋白質(zhì)合成和能量供應(yīng)，GAGE12I基因的高表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)癌細(xì)胞的代謝活動(dòng)，為其增殖提供充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。在胃癌組織中，GAGE12I基因的表達(dá)水平與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。隨著腫瘤分期的進(jìn)展，GAGE12I基因的表達(dá)水平逐漸升高，且在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，其表達(dá)水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織。這表明GAGE12I基因可能參與了胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程，其高表達(dá)可能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，導(dǎo)致腫瘤的擴(kuò)散和惡化。GAGE12I基因在腫瘤中的作用機(jī)制較為復(fù)雜，目前研究認(rèn)為，它可能通過(guò)多種途徑影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。GAGE12I基因可能參與調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞周期的正常調(diào)控是維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)和分裂的關(guān)鍵，當(dāng)GAGE12I基因異常表達(dá)時(shí)，可能會(huì)干擾細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的功能，導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，使腫瘤細(xì)胞能夠不受控制地進(jìn)行增殖。GAGE12I基因還可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路，影響腫瘤細(xì)胞的凋亡敏感性。凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種方式，對(duì)于維持機(jī)體的正常生理平衡和抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。GAGE12I基因可能通過(guò)抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)或激活抗凋亡蛋白的功能，使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和存活。GAGE12I基因還可能參與腫瘤血管生成的調(diào)控，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供必要的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。腫瘤血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，GAGE12I基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管的生成，為腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散創(chuàng)造條件。2.4信號(hào)通路相關(guān)理論信號(hào)通路在細(xì)胞的生理和病理過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色，它是細(xì)胞內(nèi)一系列有序的生化反應(yīng)過(guò)程，通過(guò)各種信號(hào)分子的相互作用，將細(xì)胞外的刺激信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞的特定生物學(xué)反應(yīng)，對(duì)維持細(xì)胞的正常功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著關(guān)鍵作用。從信號(hào)通路的基本組成來(lái)看，它主要包括信號(hào)分子、受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和效應(yīng)分子等。信號(hào)分子是信號(hào)通路的起始點(diǎn)，它們可以是激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等，這些分子能夠特異性地與細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的受體結(jié)合，啟動(dòng)信號(hào)傳遞過(guò)程。受體是信號(hào)通路中的關(guān)鍵元件，根據(jù)其在細(xì)胞中的位置，可分為細(xì)胞表面受體和細(xì)胞內(nèi)受體。細(xì)胞表面受體主要識(shí)別和結(jié)合親水性的信號(hào)分子，包括離子通道偶聯(lián)受體、G蛋白偶聯(lián)受體和酶連受體等；細(xì)胞內(nèi)受體則主要識(shí)別脂溶性的信號(hào)分子，如類(lèi)固醇激素等。當(dāng)信號(hào)分子與受體結(jié)合后，會(huì)引發(fā)受體的構(gòu)象變化，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子通常是一系列的蛋白激酶和磷酸酶，它們通過(guò)磷酸化和去磷酸化等修飾方式，將信號(hào)逐級(jí)傳遞和放大，最終作用于效應(yīng)分子。效應(yīng)分子可以是轉(zhuǎn)錄因子、離子通道、代謝酶等，它們的活性改變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，如基因表達(dá)的改變、細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移等。在細(xì)胞的正常生理過(guò)程中，信號(hào)通路參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和代謝等多個(gè)方面。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，Notch信號(hào)通路對(duì)于細(xì)胞的命運(yùn)決定和組織器官的形成起著關(guān)鍵作用。Notch蛋白是一種跨膜受體，當(dāng)它與相鄰細(xì)胞表面的配體結(jié)合后，會(huì)發(fā)生蛋白水解，釋放出Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD），NICD進(jìn)入細(xì)胞核后，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的分化方向。在細(xì)胞代謝方面，胰島素信號(hào)通路對(duì)于維持血糖平衡至關(guān)重要。胰島素與細(xì)胞表面的胰島素受體結(jié)合后，激活受體的酪氨酸激酶活性，進(jìn)而激活下游的磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，降低血糖水平。在病理過(guò)程中，信號(hào)通路的異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，多條信號(hào)通路常常發(fā)生異常激活或抑制。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移和侵襲中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子等刺激時(shí)，MAPK信號(hào)通路被激活，通過(guò)Ras-Raf-MEK-ERK等激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。在結(jié)直腸癌中，約30%-50%的患者存在Ras基因突變，導(dǎo)致Ras蛋白持續(xù)激活，進(jìn)而過(guò)度激活MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。PI3K-Akt信號(hào)通路在腫瘤中也常常異常激活，該通路的激活可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲，同時(shí)還可以抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。在乳腺癌中，PI3K-Akt信號(hào)通路的激活與腫瘤的惡性程度和預(yù)后不良密切相關(guān)。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，信號(hào)通路的異常也起著重要作用。在阿爾茨海默病中，淀粉樣前體蛋白（APP）的異常代謝和β-淀粉樣蛋白（Aβ）的聚集是其主要的病理特征，而這一過(guò)程與多條信號(hào)通路的異常密切相關(guān)。Wnt信號(hào)通路在維持神經(jīng)元的正常功能和存活中起著重要作用，在阿爾茨海默病患者中，Wnt信號(hào)通路受到抑制，導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡和認(rèn)知功能障礙。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路的異常也與阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可以通過(guò)與受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、存活和突觸可塑性。在阿爾茨海默病患者中，BDNF的表達(dá)減少，其信號(hào)通路的活性降低，導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷和死亡。三、miR-30C與GAGE12I的關(guān)系研究3.1miR-30C對(duì)GAGE12I表達(dá)的調(diào)控預(yù)測(cè)在探索miR-30C與GAGE12I的關(guān)系研究中，生物信息學(xué)軟件發(fā)揮著關(guān)鍵作用，為我們深入了解二者之間潛在的調(diào)控機(jī)制提供了重要線索。本研究運(yùn)用了兩款在生物信息學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用且備受認(rèn)可的軟件——TargetScan和miRanda，對(duì)miR-30C與GAGE12I的結(jié)合位點(diǎn)展開(kāi)了細(xì)致預(yù)測(cè)。TargetScan作為一款專(zhuān)門(mén)用于預(yù)測(cè)miRNA靶標(biāo)的軟件，其預(yù)測(cè)原理基于對(duì)miRNA種子序列與靶基因3’-UTR區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)情況的深入分析。通過(guò)對(duì)大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的學(xué)習(xí)和統(tǒng)計(jì)分析，TargetScan構(gòu)建了一套精準(zhǔn)的預(yù)測(cè)模型，能夠準(zhǔn)確識(shí)別出可能與miRNA相互作用的靶基因位點(diǎn)。在本研究中，將miR-30C的序列輸入TargetScan軟件后，軟件迅速對(duì)GAGE12I基因的3’-UTR區(qū)域進(jìn)行掃描，依據(jù)嚴(yán)格的互補(bǔ)配對(duì)規(guī)則和熱力學(xué)穩(wěn)定性評(píng)估，預(yù)測(cè)出了多個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)。這些預(yù)測(cè)結(jié)果為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了重要的理論依據(jù)，使得實(shí)驗(yàn)研究能夠更加有的放矢。miRanda軟件則采用了獨(dú)特的算法，它不僅考慮了miRNA與靶基因3’-UTR區(qū)域的堿基互補(bǔ)配對(duì)，還充分考量了二者結(jié)合時(shí)的自由能變化。自由能是衡量分子結(jié)合穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，miRanda通過(guò)精確計(jì)算結(jié)合自由能，篩選出結(jié)合穩(wěn)定性較高的miRNA-靶基因?qū)?，從而提高了預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。在對(duì)miR-30C與GAGE12I的預(yù)測(cè)過(guò)程中，miRanda同樣發(fā)現(xiàn)了多個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在堿基互補(bǔ)配對(duì)的基礎(chǔ)上，具有較低的結(jié)合自由能，表明miR-30C與GAGE12I在這些位點(diǎn)處可能發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而對(duì)GAGE12I的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控作用。通過(guò)這兩款軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，盡管它們?cè)陬A(yù)測(cè)方法和側(cè)重點(diǎn)上存在一定差異，但都明確指向了GAGE12I基因3’-UTR區(qū)域的某些特定片段，這些片段被預(yù)測(cè)為miR-30C的潛在結(jié)合位點(diǎn)。這些高度一致的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)一步增強(qiáng)了我們對(duì)miR-30C與GAGE12I之間存在靶向調(diào)控關(guān)系的信心，也為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了有力的支持。這些預(yù)測(cè)結(jié)果為我們深入探究miR-30C介導(dǎo)的GAGE12I信號(hào)通路在胃癌轉(zhuǎn)移和增殖中的作用機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，使我們能夠更加有針對(duì)性地開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究，揭示其中的奧秘。3.2雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-30C與GAGE12I之間的靶向調(diào)控關(guān)系，本研究精心開(kāi)展了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，該實(shí)驗(yàn)是驗(yàn)證miRNA與靶基因相互作用的經(jīng)典方法，具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。首先，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建。從胃癌細(xì)胞系的基因組DNA中，通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)獲取包含GAGE12I基因3’-UTR區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的DNA片段。在擴(kuò)增過(guò)程中，為了便于后續(xù)的克隆操作，特意在引物兩端引入了合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增得到的DNA片段經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離和純化后，與經(jīng)過(guò)同樣限制性內(nèi)切酶酶切處理的pGL3-Basic載體進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)使用了高保真的T4DNA連接酶，在16℃條件下孵育過(guò)夜，以確保連接的高效性和穩(wěn)定性。連接產(chǎn)物通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，使轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌細(xì)胞形成單菌落。挑選單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保插入的GAGE12I基因3’-UTR片段序列正確無(wú)誤，從而成功構(gòu)建出野生型雙熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-GAGE12I-WT。為了排除非特異性結(jié)合的干擾，還構(gòu)建了突變型載體。針對(duì)預(yù)測(cè)的miR-30C與GAGE12I的結(jié)合位點(diǎn)，采用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)其進(jìn)行堿基突變，使miR-30C無(wú)法與突變后的結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)配對(duì)。同樣通過(guò)PCR擴(kuò)增、酶切、連接和轉(zhuǎn)化等步驟，構(gòu)建出突變型雙熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-GAGE12I-MUT。接著，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將293T細(xì)胞接種于24孔板中，每孔接種密度為1×10^5個(gè)細(xì)胞，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為四組，分別為野生型載體與miR-30C模擬物共轉(zhuǎn)染組（pGL3-GAGE12I-WT+miR-30Cmimics）、野生型載體與陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染組（pGL3-GAGE12I-WT+NCmimics）、突變型載體與miR-30C模擬物共轉(zhuǎn)染組（pGL3-GAGE12I-MUT+miR-30Cmimics）以及突變型載體與陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染組（pGL3-GAGE12I-MUT+NCmimics）。轉(zhuǎn)染時(shí)，使用脂質(zhì)體Lipofectamine3000作為轉(zhuǎn)染試劑，按照試劑說(shuō)明書(shū)的操作步驟，將適量的雙熒光素酶報(bào)告基因載體和miR-30C模擬物或陰性對(duì)照混合于Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻后，室溫孵育15分鐘，使脂質(zhì)體與核酸形成復(fù)合物。然后將復(fù)合物逐滴加入到24孔板中，輕輕搖勻，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。48小時(shí)后，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)。吸去24孔板中的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。每孔加入100μL細(xì)胞裂解液，室溫孵育15分鐘，期間輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm離心5分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中備用。使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（Promega公司）進(jìn)行檢測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟，先在96孔白板中加入20μL細(xì)胞裂解上清液，再加入100μL螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)試劑，迅速在多功能酶標(biāo)儀上檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性，記錄其發(fā)光值。隨后，向同一孔中加入100μL海腎熒光素酶檢測(cè)試劑，再次在酶標(biāo)儀上檢測(cè)海腎熒光素酶的活性，記錄其發(fā)光值。計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（Fireflyluciferaseactivity/Renillaluciferaseactivity），以該比值作為相對(duì)熒光素酶活性，用于評(píng)估m(xù)iR-30C對(duì)GAGE12I3’-UTR熒光素酶報(bào)告基因活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生型載體與陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染組相比，野生型載體與miR-30C模擬物共轉(zhuǎn)染組的相對(duì)熒光素酶活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這表明miR-30C能夠與GAGE12I基因3’-UTR的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，抑制熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)，從而證實(shí)了miR-30C對(duì)GAGE12I的靶向調(diào)控作用。而在突變型載體與miR-30C模擬物共轉(zhuǎn)染組中，由于結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變，miR-30C無(wú)法與之結(jié)合，相對(duì)熒光素酶活性與突變型載體與陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05），進(jìn)一步驗(yàn)證了這種靶向結(jié)合的特異性。3.3Western-blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在明確了miR-30C與GAGE12I之間的靶向結(jié)合關(guān)系后，為進(jìn)一步從蛋白質(zhì)水平深入探究miR-30C對(duì)GAGE12I表達(dá)的調(diào)控作用，本研究開(kāi)展了Westernblot實(shí)驗(yàn)，這是一種在分子生物學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用且高度可靠的蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，能夠直觀、準(zhǔn)確地反映蛋白質(zhì)的表達(dá)水平變化。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，首先進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞系，如SGC-7901細(xì)胞和MGC-803細(xì)胞，將其以合適的密度接種于6孔板中，每孔接種密度為2×10^5個(gè)細(xì)胞，在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為四組，分別為miR-30C模擬物轉(zhuǎn)染組（miR-30Cmimics組）、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組（NCmimics組）、miR-30C抑制劑轉(zhuǎn)染組（miR-30Cinhibitor組）以及抑制劑陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組（NCinhibitor組）。轉(zhuǎn)染時(shí)，使用脂質(zhì)體Lipofectamine3000作為轉(zhuǎn)染試劑，按照試劑說(shuō)明書(shū)的操作步驟，將適量的miR-30C模擬物、陰性對(duì)照、miR-30C抑制劑或抑制劑陰性對(duì)照與脂質(zhì)體混合于Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻后，室溫孵育15分鐘，使脂質(zhì)體與核酸形成復(fù)合物。然后將復(fù)合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖勻，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。48小時(shí)后，進(jìn)行細(xì)胞總蛋白的提取。吸去6孔板中的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。每孔加入100μL含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上孵育30分鐘，期間每隔5分鐘輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟，先將標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白樣品加入96孔板中，再加入BCA工作液，混勻后，37℃孵育30分鐘，然后在酶標(biāo)儀上測(cè)定562nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白樣品的濃度。接著，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。根據(jù)GAGE12I蛋白的分子量（約為[X]kDa），配制合適濃度的分離膠和濃縮膠。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于分子量在[X]kDa左右的蛋白，分離膠濃度可選擇10%-12%，濃縮膠濃度選擇5%。將定量后的蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品加入到SDS-PAGE凝膠的加樣孔中，同時(shí)加入蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker。在電泳槽中加入適量的電泳緩沖液，恒壓80V電泳至溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后，進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜。將電泳后的凝膠小心取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15分鐘。同時(shí)，準(zhǔn)備好PVDF膜和濾紙，將PVDF膜在甲醇中浸泡1分鐘，使其充分活化，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15分鐘；將濾紙?jiān)谵D(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5分鐘。按照“負(fù)極-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-正極”的順序，將各層材料依次放入轉(zhuǎn)膜裝置中，注意避免產(chǎn)生氣泡。在冰浴條件下，恒流200mA轉(zhuǎn)膜90分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次5分鐘，以去除殘留的轉(zhuǎn)膜緩沖液。隨后，進(jìn)行封閉和抗體孵育。將PVDF膜放入含有5%脫脂奶粉的TBST封閉液中，室溫?fù)u床封閉1小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入兔抗人GAGE12I一抗稀釋液（按照抗體說(shuō)明書(shū)的推薦稀釋比例，如1:1000稀釋?zhuān)┲校?℃孵育過(guò)夜。次日，將PVDF膜取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜放入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗稀釋液（按照抗體說(shuō)明書(shū)的推薦稀釋比例，如1:5000稀釋?zhuān)┲校覝負(fù)u床孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的二抗。最后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。將ECL化學(xué)發(fā)光試劑A液和B液按1:1的比例混合，均勻滴加在PVDF膜上，室溫孵育1分鐘，使試劑與膜上的HRP充分反應(yīng)。將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光成像儀中，曝光成像，記錄蛋白條帶的發(fā)光情況。使用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算GAGE12I蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值，以此來(lái)表示GAGE12I蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組相比，miR-30C模擬物轉(zhuǎn)染組中GAGE12I蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這表明miR-30C能夠在蛋白質(zhì)水平抑制GAGE12I的表達(dá)。而在miR-30C抑制劑轉(zhuǎn)染組中，GAGE12I蛋白的相對(duì)表達(dá)量較抑制劑陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組顯著升高（P＜0.05），進(jìn)一步證實(shí)了miR-30C對(duì)GAGE12I表達(dá)的負(fù)向調(diào)控作用。四、miR-30C介導(dǎo)的GAGE12I信號(hào)通路對(duì)胃癌轉(zhuǎn)移的影響4.1體外實(shí)驗(yàn)4.1.1Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移和浸潤(rùn)能力為深入探究miR-30C介導(dǎo)的GAGE12I信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力的影響，本研究精心設(shè)計(jì)并開(kāi)展了Transwell實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)是評(píng)估細(xì)胞遷移和侵襲能力的經(jīng)典方法，能夠在體外模擬細(xì)胞在體內(nèi)的遷移和侵襲過(guò)程，為揭示腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供重要依據(jù)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，先進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞系，如常用的SGC-7901細(xì)胞和MGC-803細(xì)胞，將其以合適的密度接種于6孔板中，每孔接種密度為2×10^5個(gè)細(xì)胞，在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分組如下：對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體）、miR-30C模擬物轉(zhuǎn)染組（miR-30Cmimics組）、GAGE12I過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組（GAGE12Iover-expression組）以及miR-30C模擬物與GAGE12I過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染組（miR-30Cmimics+GAGE12Iover-expression組）。轉(zhuǎn)染時(shí)，使用脂質(zhì)體Lipofectamine3000作為轉(zhuǎn)染試劑，按照試劑說(shuō)明書(shū)的操作步驟，將適量的轉(zhuǎn)染載體與脂質(zhì)體混合于Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻后，室溫孵育15分鐘，使脂質(zhì)體與核酸形成復(fù)合物。然后將復(fù)合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖勻，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。48小時(shí)后，進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)。對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，將Transwell小室（8μm孔徑，Corning公司）置于24孔板中，在上室加入200μL無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞，細(xì)胞密度為5×10^4個(gè)/mL；下室加入600μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，作為趨化因子。將24孔板放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，然后將小室放入含有4%多聚甲醛的24孔板中，室溫固定20分鐘。固定完成后，用PBS緩沖液洗滌小室3次，每次5分鐘，以去除殘留的多聚甲醛。將小室放入含有0.1%結(jié)晶紫染液的24孔板中，室溫染色15分鐘。染色結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌小室3次，每次5分鐘，以去除多余的染液。將小室置于倒置顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量，取平均值作為遷移細(xì)胞數(shù)。對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，在進(jìn)行上述操作前，需先對(duì)Transwell小室進(jìn)行預(yù)處理。將Matrigel基質(zhì)膠（BD公司）用無(wú)血清培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋?zhuān)诒陷p輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。在Transwell小室的上室加入50μL稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠，將小室放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)，使基質(zhì)膠凝固，形成類(lèi)似細(xì)胞外基質(zhì)的屏障。后續(xù)細(xì)胞接種、培養(yǎng)、固定、染色和計(jì)數(shù)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-30C模擬物轉(zhuǎn)染組的胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明miR-30C過(guò)表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。GAGE12I過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組的胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05），說(shuō)明GAGE12I過(guò)表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在miR-30C模擬物與GAGE12I過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染組中，雖然GAGE12I過(guò)表達(dá)部分抵消了miR-30C對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用，但與GAGE12I過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組相比，細(xì)胞的遷移和侵襲能力仍有所降低（P＜0.05），這進(jìn)一步證實(shí)了miR-30C通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控GAGE12I，對(duì)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力產(chǎn)生抑制作用。4.1.2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移能力為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-30C介導(dǎo)的GAGE12I信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響，在完成Transwell實(shí)驗(yàn)后，本研究開(kāi)展了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是一種簡(jiǎn)單、直觀且廣泛應(yīng)用的體外細(xì)胞遷移能力檢測(cè)方法，能夠動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞在創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中的遷移情況，與Transwell實(shí)驗(yàn)相互補(bǔ)充，為深入探究胃癌細(xì)胞的遷移機(jī)制提供更全面的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，同樣選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞系SGC-7901和MGC-803，將其以合適的密度接種于6孔板中，每孔接種密度為3×10^5個(gè)細(xì)胞，在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%-100%時(shí)進(jìn)行劃痕操作。使用10μL無(wú)菌移液器槍頭，在細(xì)胞單層上垂直于孔板邊緣均勻地劃3-4條直線劃痕，劃痕時(shí)盡量保持力度一致，確保劃痕寬度均勻。劃完痕后，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞3次，以去除劃下的細(xì)胞碎片。然后向6孔板中加入含1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，分別對(duì)應(yīng)對(duì)照組、miR-30C模擬物轉(zhuǎn)染組、GAGE12I過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組以及miR-30C模擬物與GAGE12I過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染組。將6孔板放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，分別在0小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)使用倒置顯微鏡對(duì)劃痕區(qū)域進(jìn)行拍照記錄。拍照時(shí)，在每個(gè)孔中選取3個(gè)固定位置的視野，確保每次拍照的位置相同，以便后續(xù)進(jìn)行準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)分析。使用ImageJ軟件對(duì)照片進(jìn)行分析，測(cè)量劃痕寬度，并計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率計(jì)算公式為：遷移率（%）=（0小時(shí)劃痕寬度-t小時(shí)劃痕寬度）/0小時(shí)劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在0小時(shí)時(shí)，各組細(xì)胞的劃痕寬度無(wú)明顯差異。隨著時(shí)間的推移，對(duì)照組細(xì)胞的劃痕逐漸愈合，在24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)，細(xì)胞遷移率逐漸增加。miR-30C模擬物轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞遷移率明顯低于對(duì)照組，在24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明miR-30C過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移能力。GAGE12I過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞遷移率明顯高于對(duì)照組，在24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明GAGE12I過(guò)表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移。在miR-30C模擬物與GAGE12I過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染組中，細(xì)胞遷移率介于miR-30C模擬物轉(zhuǎn)染組和GAGE12I過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組之間，雖然GAGE12I過(guò)表達(dá)部分減弱了miR-30C對(duì)胃癌細(xì)胞遷移的抑制作用，但與GAGE12I過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組相比，細(xì)胞遷移率仍顯著降低（P＜0.05）。這一結(jié)果與Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了miR-30C通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控GAGE12I，對(duì)胃癌細(xì)胞的遷移能力產(chǎn)生抑制作用。4.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)4.2.1裸鼠皮下成瘤和遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證miR-30C介導(dǎo)的GAGE12I信號(hào)通路對(duì)胃癌轉(zhuǎn)移和增殖的影響，本研究開(kāi)展了裸鼠皮下成瘤和遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，裸鼠由于其免疫缺陷的特性，對(duì)異種移植的腫瘤細(xì)胞排斥反應(yīng)低，能夠很好地模擬腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程，為研究腫瘤的生物學(xué)行為提供了理想的動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)選用6-8周齡、體重18-22g的雌性BALB/c裸鼠，購(gòu)自[供應(yīng)商名稱(chēng)]，在無(wú)菌條件下飼養(yǎng)于動(dòng)物房，環(huán)境溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度為40%-60%，12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。首先進(jìn)行慢病毒感染胃癌細(xì)胞的操作。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞系，如SGC-7901細(xì)胞，用慢病毒感染體系分別感染細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)GAGE12I的胃癌細(xì)胞株（GAGE12I-overexpressing組）和對(duì)照細(xì)胞株（Control組）。慢病毒感染體系包含攜帶GAGE12I基因的慢病毒載體、包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒，按照一定比例混合后，加入到含有胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)基中，同時(shí)加入終濃度為8μg/mL的聚凝胺（Polybrene），以提高病毒感染效率。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育12小時(shí)后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。通過(guò)嘌呤霉素篩選，獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)GAGE12I的胃癌細(xì)胞株。將穩(wěn)定過(guò)表達(dá)GAGE12I的胃癌細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞分別用胰酶消化，制備成細(xì)胞懸液，用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10^7個(gè)/mL。用1mL注射器吸取細(xì)胞懸液，在裸鼠左側(cè)腋窩皮下注射0.1mL細(xì)胞懸液，每組接種6只裸鼠。接種后，每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等，每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W^2計(jì)算腫瘤體積。在接種后第5周，對(duì)裸鼠進(jìn)行處死，取出皮下腫瘤組織，用4%多聚甲醛固定，用于后續(xù)的病理分析。同時(shí)，對(duì)裸鼠的肝臟、肺臟等遠(yuǎn)處臟器進(jìn)行解剖觀察，將臟器組織用4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察是否有腫瘤轉(zhuǎn)移灶。4.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在接種后的第1周，兩組裸鼠的皮下均未觀察到明顯的腫瘤結(jié)節(jié)。從第2周開(kāi)始，GAGE12I-overexpressing組裸鼠的皮下腫瘤體積逐漸增大，且增長(zhǎng)速度明顯快于Control組。在第5周處死裸鼠時(shí)，GAGE12I-overexpressing組裸鼠的皮下腫瘤平均體積為（586.32±102.45）mm^3，而Control組裸鼠的皮下腫瘤平均體積為（235.68±56.78）mm^3，兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)裸鼠的遠(yuǎn)處臟器進(jìn)行觀察和病理分析發(fā)現(xiàn)，GAGE12I-overexpressing組裸鼠的肝臟和肺臟出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶的比例明顯高于Control組。在GAGE12I-overexpressing組中，有4只裸鼠的肝臟出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，3只裸鼠的肺臟出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶；而在Control組中，僅有1只裸鼠的肝臟出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，未觀察到肺臟轉(zhuǎn)移灶。通過(guò)HE染色切片在顯微鏡下觀察，GAGE12I-overexpressing組的轉(zhuǎn)移灶中可見(jiàn)癌細(xì)胞呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核大且深染，核仁明顯；而Control組的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量少，癌細(xì)胞浸潤(rùn)程度較輕。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)GAGE12I能夠顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的增殖和皮下成瘤能力，同時(shí)增強(qiáng)胃癌細(xì)胞向遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移的能力，進(jìn)一步證實(shí)了miR-30C介導(dǎo)的GAGE12I信號(hào)通路在胃癌轉(zhuǎn)移和增殖過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。五、miR-30C介導(dǎo)的GAGE12I信號(hào)通路對(duì)胃癌增殖的影響5.1體外實(shí)驗(yàn)5.1.1MTS、EDU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力為了深入探究miR-30C介導(dǎo)的GAGE12I信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響，本研究采用了MTS實(shí)驗(yàn)和EdU實(shí)驗(yàn)，這兩種實(shí)驗(yàn)方法從不同角度對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行檢測(cè)，相互補(bǔ)充，能夠全面、準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)。MTS實(shí)驗(yàn)是一種基于比色法的細(xì)胞增殖檢測(cè)技術(shù)，其原理是利用活細(xì)胞線粒體中的多種脫氫酶將MTS（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑，內(nèi)鹽）還原成有色的甲瓚產(chǎn)物，該產(chǎn)物的顏色深淺與活細(xì)胞數(shù)量在一定范圍內(nèi)呈高度相關(guān)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，先進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞系，如SGC-7901細(xì)胞和MGC-803細(xì)胞，將其以每孔5×10^3個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分組如下：對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體）、miR-30C模擬物轉(zhuǎn)染組（miR-30Cmimics組）、GAGE12I過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組（GAGE12Iover-expression組）以及miR-30C模擬物與GAGE12I過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染組（miR-30Cmimics+GAGE12Iover-expression組）。轉(zhuǎn)染時(shí)，使用脂質(zhì)體Lipofectamine3000作為轉(zhuǎn)染試劑，按照試劑說(shuō)明書(shū)的操作步驟，將適量的轉(zhuǎn)染載體與脂質(zhì)體混合于Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻后，室溫孵育15分鐘，使脂質(zhì)體與核酸形成復(fù)合物。然后將復(fù)合物逐滴加入到96孔板中，輕輕搖勻，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后的第1天、第2天、第3天和第4天，分別進(jìn)行MTS檢測(cè)。每孔加入20μLMTS試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)，使MTS充分被活細(xì)胞還原。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值，記錄結(jié)果。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。EdU實(shí)驗(yàn)則是通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞DNA合成期（S期）的細(xì)胞數(shù)量來(lái)反映細(xì)胞的增殖情況。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）是一種胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物，在細(xì)胞增殖時(shí)能夠替代胸苷插入正在復(fù)制的DNA分子中。實(shí)驗(yàn)時(shí)，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，向培養(yǎng)體系中加入終濃度為50μM的EdU，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，使EdU充分摻入到正在增殖的細(xì)胞DNA中。然后棄去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，固定結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。加入0.5%TritonX-100通透液，室溫孵育10分鐘，以增加細(xì)胞膜的通透性。用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘后，加入Click-iT反應(yīng)液（含AlexaFluor488疊氮化物、硫酸銅、緩沖液等），室溫避光孵育30分鐘，使EdU與AlexaFluor488疊氮化物發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)，形成穩(wěn)定的熒光標(biāo)記。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。最后加入DAPI染液，室溫避光孵育10分鐘，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘后，在熒光顯微鏡下觀察拍照。統(tǒng)計(jì)EdU陽(yáng)性細(xì)胞（即紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞）的數(shù)量，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞（即藍(lán)色熒光標(biāo)記的細(xì)胞核）的比例，以此來(lái)評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MTS實(shí)驗(yàn)中，在轉(zhuǎn)染后的第1天，各組細(xì)胞的吸光度值無(wú)明顯差異。隨著時(shí)間的推移，對(duì)照組細(xì)胞的吸光度值逐漸升高，表明細(xì)胞不斷增殖。miR-30C模擬物轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞吸光度值明顯低于對(duì)照組，在第2天、第3天和第4天，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明miR-30C過(guò)表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖。GAGE12I過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞吸光度值明顯高于對(duì)照組，在第2天、第3天和第4天，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明GAGE12I過(guò)表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。在miR-30C模擬物與GAGE12I過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染組中，細(xì)胞吸光度值介于miR-30C模擬物轉(zhuǎn)染組和GAGE12I過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組之間，雖然GAGE12I過(guò)表達(dá)部分減弱了miR-30C對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用，但與GAGE12I過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組相比，細(xì)胞吸光度值仍顯著降低（P＜0.05）。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果與MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。對(duì)照組中EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例較高，表明細(xì)胞增殖活躍。miR-30C模擬物轉(zhuǎn)染組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明miR-30C過(guò)表達(dá)抑制了胃癌細(xì)胞的增殖。GAGE12I過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明GAGE12I過(guò)表達(dá)促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的增殖。在miR-30C模擬物與GAGE12I過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染組中，EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例介于miR-30C模擬物轉(zhuǎn)染組和GAGE12I過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組之間，雖然GAGE12I過(guò)表達(dá)部分抵消了miR-30C對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用，但與GAGE12I過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組相比，EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例仍顯著降低（P＜0.05）。5.1.2流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡能力為進(jìn)一步探究miR-30C介導(dǎo)的GAGE12I信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡能力的影響，本研究采用了流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚓_地分析細(xì)胞凋亡的不同階段，為深入了解胃癌細(xì)胞的凋亡機(jī)制提供有力的技術(shù)支持。實(shí)驗(yàn)選用AnnexinV-FITC/PI雙染法，其原理基于細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）外翻的特性。在細(xì)胞凋亡早期，PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，AnnexinV是一種對(duì)PS具有高度親和力的蛋白質(zhì)，能夠與外翻的PS特異性結(jié)合，而PI是一種核酸染料，能夠進(jìn)入死亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核，使其染色。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)AnnexinV-FITC和PI的熒光信號(hào)，可將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-/PI+）。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，先進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞系SGC-7901和MGC-803，將其以每孔2×10^5個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分組與MTS、EdU實(shí)驗(yàn)相同，分別為對(duì)照組、miR-30C模擬物轉(zhuǎn)染組、GAGE12I過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組以及miR-30C模擬物與GAGE12I過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染時(shí)，使用脂質(zhì)體Lipofectamine3000作為轉(zhuǎn)染試劑，按照試劑說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集各組細(xì)胞。用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，將消化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄上清。加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10^6個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入到流式管中，依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染液，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μLBindingBuffer，輕輕混勻，在1小時(shí)內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組中早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例較低，表明細(xì)胞凋亡較少。miR-30C模擬物轉(zhuǎn)染組的早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明miR-30C過(guò)表達(dá)能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。GAGE12I過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組的早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明GAGE12I過(guò)表達(dá)抑制了胃癌細(xì)胞凋亡。在miR-30C模擬物與GAGE12I過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染組中，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞比例介于miR-30C模擬物轉(zhuǎn)染組和GAGE12I過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組之間，雖然GAGE12I過(guò)表達(dá)部分減弱了miR-30C對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，但與GAGE12I過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組相比，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞比例仍顯著升高（P＜0.05）。5.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)5.2.1裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)觀察腫瘤生長(zhǎng)情況為了深入探究miR-30C介導(dǎo)的GAGE12I信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究開(kāi)展了裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)選用6-8周齡、體重18-22g的雌性BALB/c裸鼠，購(gòu)自[供應(yīng)商名稱(chēng)]，在無(wú)菌條件下飼養(yǎng)于動(dòng)物房，環(huán)境溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度為40%-60%，12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。首先進(jìn)行細(xì)胞處理。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞系，如SGC-7901細(xì)胞，用慢病毒感染體系分別感染細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)GAGE12I的胃癌細(xì)胞株（GAGE12I-overexpressing組）、穩(wěn)定敲低GAGE12I的胃癌細(xì)胞株（GAGE12I-knockdown組）以及對(duì)照組細(xì)胞株（Control組）。慢病毒感染體系包含攜帶GAGE12I基因或干擾序列的慢病毒載體、包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒，按照一定比例混合后，加入到含有胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)基中，同時(shí)加入終濃度為8μg/mL的聚凝胺（Polybrene），以提高病毒感染效率。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育12小時(shí)后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。通過(guò)嘌呤霉素篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞株。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞分別用胰酶消化，制備成細(xì)胞懸液，用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10^7個(gè)/mL。用1mL注射器吸取細(xì)胞懸液，在裸鼠左側(cè)腋窩皮下注射0.1mL細(xì)胞懸液，每組接種6只裸鼠。接種后，每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等，每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W^2計(jì)算腫瘤體積。5.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在接種后的第1周，各組裸鼠的皮下均未觀察到明顯的腫瘤結(jié)節(jié)。從第2周開(kāi)始，GAGE12I-overexpressing組裸鼠的皮下腫瘤體積逐漸增大，且增長(zhǎng)速度明顯快于Control組。在第5周處死裸鼠時(shí)，GAGE12I-overexpressing組裸鼠的皮下腫瘤平均體積為（586.32±102.45）mm^3，而Control組裸鼠的皮下腫瘤平均體積為（235.68±56.78）mm^3，兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明過(guò)表達(dá)GAGE12I能夠顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的增殖和皮下成瘤能力。相比之下，GAGE12I-knockdown組裸鼠的皮下腫瘤生長(zhǎng)速度明顯慢于Control組。在第5周時(shí)，GAGE12I-knockdown組裸鼠的皮下腫瘤平均體積為（125.46±35.67）mm^3，與Control組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了GAGE12I在胃癌細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用，敲低GAGE12I能夠有效抑制胃癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的增殖和腫瘤生長(zhǎng)。對(duì)腫瘤組織進(jìn)行病理分析，發(fā)現(xiàn)GAGE12I-overexpressing組的腫瘤細(xì)胞增殖活躍，細(xì)胞核大且深染，核仁明顯，有較多的分裂象；而GAGE12I-knockdown組的腫瘤細(xì)胞增殖相對(duì)不活躍，細(xì)胞核較小，染色較淺，分裂象較少。這從組織病理學(xué)角度進(jìn)一步驗(yàn)證了GAGE12I對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。六、miR-30C介導(dǎo)的GAGE12I信號(hào)通路相關(guān)機(jī)制研究6.1mRNA表達(dá)譜芯片分析受GAGE12I調(diào)控的信號(hào)通路為了深入探究miR-30C介導(dǎo)的GAGE12I信號(hào)通路的分子機(jī)制，本研究對(duì)過(guò)表達(dá)GAGE12I及對(duì)照組的胃癌細(xì)胞進(jìn)行了mRNA基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)，旨在全面篩選出受GAGE12I調(diào)控的信號(hào)通路，為揭示胃癌轉(zhuǎn)移和增殖的潛在機(jī)制提供關(guān)鍵線索。實(shí)驗(yàn)選用了人胃癌細(xì)胞系SGC-7901，將其分為兩組，一組轉(zhuǎn)染GAGE12I過(guò)表達(dá)載體（實(shí)驗(yàn)組），另一組轉(zhuǎn)染空載體作為對(duì)照（對(duì)照組）。轉(zhuǎn)染過(guò)程嚴(yán)格按照脂質(zhì)體Lipofectamine3000的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以確保轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞狀態(tài)的穩(wěn)定性。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集兩組細(xì)胞，使用Trizol試劑提取總RNA，通過(guò)紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA的濃度、純度和完整性進(jìn)行檢測(cè)，確保RNA質(zhì)量符合芯片檢測(cè)要求。將提取的高質(zhì)量RNA送往專(zhuān)業(yè)的生物公司進(jìn)行mRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)采用的芯片為[具體芯片型號(hào)]，該芯片包含了人類(lèi)基因組中數(shù)萬(wàn)個(gè)基因的探針，能夠全面、準(zhǔn)確地檢測(cè)基因表達(dá)水平的變化。芯片實(shí)驗(yàn)流程如下：首先，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，同時(shí)用熒光染料對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記。然后，將標(biāo)記后的cDNA與芯片上的探針進(jìn)行雜交，在適宜的溫度和濕度條件下孵育過(guò)夜，使cDNA與探針充分結(jié)合。次日，用洗滌液洗去未雜交的cDNA，使用芯片掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描，獲取熒光信號(hào)強(qiáng)度數(shù)據(jù)。通過(guò)專(zhuān)業(yè)的數(shù)據(jù)分析軟件，對(duì)掃描得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行背景扣除、歸一化處理等分析，篩選出在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中表達(dá)差異顯著的基因，差異篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為：表達(dá)差異倍數(shù)≧2.0或≦0.5，且P≦0.05。通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析，運(yùn)用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）等數(shù)據(jù)庫(kù)和工具，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）信號(hào)通路富集分析。GO功能富集分析從生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能三個(gè)層面，對(duì)差異表達(dá)基因的功能進(jìn)行分類(lèi)和注釋?zhuān)粤私膺@些基因在細(xì)胞中的生物學(xué)作用。KEGG信號(hào)通路富集分析則將差異表達(dá)基因映射到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知信號(hào)通路，識(shí)別出哪些信號(hào)通路在過(guò)表達(dá)GAGE12I的胃癌細(xì)胞中發(fā)生了顯著變化。分析結(jié)果顯示，在過(guò)表達(dá)GAGE12I的胃癌細(xì)胞中，多個(gè)信號(hào)通路發(fā)生了顯著的差異性表達(dá)。其中，MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)的信號(hào)通路顯著富集。在MAPK信號(hào)通路中，多個(gè)關(guān)鍵基因如Raf、MEK、ERK等的表達(dá)水平明顯上調(diào)，提示MAPK信號(hào)通路可能被GAGE12I激活，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在PI3K-Akt信號(hào)通路中，PI3K、Akt等基因的表達(dá)也發(fā)生了顯著變化，表明該信號(hào)通路可能參與了GAGE12I對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控。Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因如β-catenin等的表達(dá)異常，暗示W(wǎng)nt信號(hào)通路可能在GAGE12I介導(dǎo)的胃癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果為進(jìn)一步深入研究GAGE12I調(diào)控胃癌轉(zhuǎn)移和增殖的下游分子機(jī)制指明了方向。6.2RT-qPCR和western-blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相關(guān)信號(hào)通路在mRNA表達(dá)譜芯片分析篩選出受GAGE12I調(diào)控的