miR-9在鼻咽癌進(jìn)程中的多維度調(diào)控機(jī)制與潛在應(yīng)用研究一、引言1.1研究背景與意義鼻咽癌（NasopharyngealCarcinoma，NPC）是一種發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤，在我國南方地區(qū)發(fā)病率較高，如廣東、廣西、福建等地，因此又被稱為“廣東癌”。鼻咽癌的發(fā)病具有明顯的種族聚集性和家族遺傳性，男性發(fā)病率約為女性的2-3倍，40-50歲為高發(fā)年齡段。其病因復(fù)雜，目前認(rèn)為與EB病毒感染、化學(xué)致癌因素、環(huán)境因素以及遺傳因素等密切相關(guān)。鼻咽癌對患者的健康危害極大。腫瘤具有局部破壞性，隨著腫瘤生長至一定大小，會向周圍生長破壞，引起患者涕血、耳鳴、頭痛、神經(jīng)破壞等痛苦癥狀。腫瘤向周圍結(jié)構(gòu)生長，可壓迫神經(jīng)，造成視力障礙、語言障礙、進(jìn)餐障礙等神經(jīng)性表現(xiàn)。若發(fā)生轉(zhuǎn)移，不同轉(zhuǎn)移部位會出現(xiàn)不同癥狀，如骨轉(zhuǎn)移造成的疼痛，給患者帶來極大痛苦。鼻咽癌的治療方法主要包括放射治療、外科手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、免疫和生物治療等，盡管在治療方面取得了一些進(jìn)展，但其5年生存率仍然較低，局部復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是危及鼻咽癌患者生命的主要原因，給患者及家屬帶來了沉重的心理和經(jīng)濟(jì)壓力。因此，深入研究鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和方法，對于改善鼻咽癌患者的預(yù)后具有重要的臨床意義。近年來，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，微小RNA（microRNA，miRNA）在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用受到了廣泛關(guān)注。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長度約為21-25個核苷酸，通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝等多種生物學(xué)過程。已有研究表明，miRNA表達(dá)失調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，其可作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用，有望成為腫瘤診斷、治療和預(yù)后評估的新型生物標(biāo)志物和潛在靶點(diǎn)。miR-9作為一種重要的miRNA，在多種人體腫瘤組織中呈現(xiàn)異常表達(dá)。例如，在乳腺癌、胃癌、卵巢癌等腫瘤中，miR-9表達(dá)下調(diào)；而在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中，miR-9表達(dá)上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-9在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，miR-9在鼻咽癌中的作用及機(jī)制尚未完全明確。有研究人員通過基因芯片技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，miR-9在人鼻咽癌組織標(biāo)本上表達(dá)下調(diào)，但也有部分研究結(jié)果與之矛盾，如預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-9在人鼻咽癌細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)，而在鼻咽癌組織標(biāo)本上表達(dá)卻上調(diào)。同時，關(guān)于miR-9對鼻咽癌細(xì)胞增殖、腫瘤干細(xì)胞“干性”、EMT和轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用及機(jī)制的研究也存在諸多爭議。明確miR-9對鼻咽癌增殖、腫瘤干細(xì)胞“干性”、EMT和轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用及機(jī)制，不僅有助于深入揭示鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制，為鼻咽癌的早期診斷、預(yù)后評估提供新的生物標(biāo)志物，還能為開發(fā)基于miR-9的靶向治療策略提供理論依據(jù)，具有重要的科學(xué)研究價值和臨床應(yīng)用前景。1.2鼻咽癌概述鼻咽癌是一種源于鼻咽部黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率存在明顯的地域差異。我國屬于鼻咽癌高發(fā)國家，尤其在廣東、廣西、福建、湖南等南方地區(qū)，發(fā)病率居高不下，其中廣東地區(qū)發(fā)病率最高，因此被稱為“廣東癌”。據(jù)統(tǒng)計，在這些高發(fā)地區(qū)，鼻咽癌的發(fā)病率可達(dá)10-30/10萬，而在其他地區(qū)，發(fā)病率相對較低，約為1-3/10萬。男性發(fā)病率約為女性的2-3倍，40-50歲為高發(fā)年齡段。鼻咽癌的發(fā)病是多種因素共同作用的結(jié)果。EB病毒（Epstein-Barrvirus）感染是鼻咽癌發(fā)生的重要危險因素之一，幾乎所有的鼻咽癌組織中都能檢測到EB病毒的DNA和相關(guān)蛋白表達(dá)。EB病毒可通過多種機(jī)制影響鼻咽上皮細(xì)胞的生物學(xué)行為，如促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化等?；瘜W(xué)致癌因素也不容忽視，環(huán)境中的亞硝胺類化合物、多環(huán)芳烴類化合物等具有較強(qiáng)的致癌性。腌制食品中常含有較高含量的亞硝胺，長期食用此類食物會增加鼻咽癌的發(fā)病風(fēng)險。遺傳因素在鼻咽癌的發(fā)病中也起著關(guān)鍵作用，鼻咽癌具有明顯的種族聚集性和家族遺傳性。研究表明，某些基因的突變或多態(tài)性與鼻咽癌的易感性密切相關(guān)，如HLA基因、p53基因、Rb基因等。鼻咽癌的癥狀多樣，早期癥狀可能不明顯，容易被忽視。常見的早期癥狀包括涕血、耳鳴、聽力下降、鼻塞等。隨著病情進(jìn)展，腫瘤向周圍組織浸潤，可出現(xiàn)頭痛、面部麻木、復(fù)視、視力下降等癥狀。約60%的患者在初診時可發(fā)現(xiàn)頸部淋巴結(jié)腫大，這是因?yàn)楸茄什康牧馨徒M織豐富，癌細(xì)胞容易通過淋巴轉(zhuǎn)移至頸部淋巴結(jié)。如果鼻咽癌發(fā)展到晚期，癌細(xì)胞可轉(zhuǎn)移至全身各個部位，如骨、肺、肝等，導(dǎo)致相應(yīng)器官功能受損，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存時間。目前，鼻咽癌的治療方法主要包括放射治療、外科手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、免疫和生物治療等。放射治療是鼻咽癌的首選治療方法，大多數(shù)鼻咽癌對放射治療具有中度敏感性。早期鼻咽癌通過單純放射治療，5年生存率可達(dá)80%左右。然而，對于局部晚期或轉(zhuǎn)移性鼻咽癌，單純放療效果往往不理想，需要結(jié)合化學(xué)藥物治療，以提高治療效果。化學(xué)藥物治療主要采用順鉑、氟尿嘧啶等化療藥物，通過靜脈注射或口服的方式給藥，可殺死癌細(xì)胞或抑制癌細(xì)胞的生長。外科手術(shù)治療適用于少數(shù)對放療不敏感或放療后復(fù)發(fā)的患者，手術(shù)方式包括鼻咽癌切除術(shù)、頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)等。近年來，免疫和生物治療作為新興的治療方法，為鼻咽癌的治療帶來了新的希望。免疫治療通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來殺傷癌細(xì)胞，如免疫檢查點(diǎn)抑制劑已在鼻咽癌的治療中取得了一定的療效。生物治療則包括靶向治療、基因治療等，通過針對癌細(xì)胞的特定分子靶點(diǎn)進(jìn)行治療，具有較高的特異性和療效。盡管鼻咽癌的治療取得了一定的進(jìn)展，但局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍然是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，因此，深入研究鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和方法，具有重要的臨床意義。1.3miR-9簡介miR-9是一種高度保守的微小RNA，在人體多種組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，其序列在不同物種間具有較高的同源性。成熟的miR-9序列長度約為22個核苷酸，其編碼基因位于人類基因組的多個位點(diǎn)，如1號染色體、5號染色體和15號染色體等，這些不同位點(diǎn)編碼的miR-9在功能上可能存在一定差異。miR-9具有廣泛的生物學(xué)功能，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、神經(jīng)功能調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著重要作用。在胚胎發(fā)育過程中，miR-9參與調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化，對神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育至關(guān)重要。研究表明，miR-9通過靶向抑制特定基因的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，影響神經(jīng)環(huán)路的形成。在細(xì)胞分化方面，miR-9能夠調(diào)控多種細(xì)胞類型的分化進(jìn)程，如在肌肉細(xì)胞分化過程中，miR-9可通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，影響肌肉特異性基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控肌肉細(xì)胞的分化。在腫瘤研究領(lǐng)域，miR-9的表達(dá)失調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其作用具有復(fù)雜性，既可以作為癌基因促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，也可以作為抑癌基因抑制腫瘤生長，具體取決于腫瘤的類型和微環(huán)境。在乳腺癌中，miR-9表達(dá)下調(diào)，其通過靶向抑制癌基因的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抑癌基因的作用。而在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中，miR-9表達(dá)上調(diào)，通過激活相關(guān)信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，表現(xiàn)為癌基因的功能。在鼻咽癌中，miR-9的表達(dá)情況存在爭議。部分研究表明，miR-9在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，且其低表達(dá)與鼻咽癌的惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)。而另有研究結(jié)果顯示，miR-9在鼻咽癌組織中表達(dá)上調(diào)。這種差異可能與研究樣本的來源、實(shí)驗(yàn)方法以及腫瘤的異質(zhì)性等因素有關(guān)。目前，關(guān)于miR-9在鼻咽癌中的作用機(jī)制尚未完全明確，研究發(fā)現(xiàn)miR-9可能通過靶向調(diào)控多個基因和信號通路，參與鼻咽癌的增殖、腫瘤干細(xì)胞“干性”維持、EMT和轉(zhuǎn)移等過程。例如，有研究報道m(xù)iR-9能夠靶向抑制RAB6B基因，影響細(xì)胞周期，從而調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞的增殖。此外，miR-9還可能通過調(diào)節(jié)E-cadherin、N-cadherin等與EMT相關(guān)的蛋白表達(dá)，影響鼻咽癌細(xì)胞的EMT過程和轉(zhuǎn)移能力。但這些研究結(jié)果仍需進(jìn)一步深入探討和驗(yàn)證，以全面揭示miR-9在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。二、miR-9對鼻咽癌增殖的調(diào)控作用及機(jī)制2.1miR-9在鼻咽癌增殖中的表達(dá)水平差異為深入探究miR-9在鼻咽癌增殖過程中的作用，首先需要明確其在鼻咽癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平差異。研究人員收集了大量的人鼻咽癌組織標(biāo)本及對應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本，同時選取了多種鼻咽癌細(xì)胞系以及正常鼻咽上皮細(xì)胞系。運(yùn)用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)，對這些標(biāo)本和細(xì)胞系中的miR-9表達(dá)水平進(jìn)行了精確檢測。在人鼻咽癌組織標(biāo)本中，通過嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)miR-9的表達(dá)水平相較于癌旁正常組織呈現(xiàn)出顯著上調(diào)的趨勢。對50例鼻咽癌組織標(biāo)本和30例癌旁正常組織標(biāo)本的檢測結(jié)果顯示，鼻咽癌組織中miR-9的相對表達(dá)量平均為癌旁正常組織的3.5倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這一結(jié)果表明，miR-9在鼻咽癌組織中的表達(dá)異常升高，可能在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。在鼻咽癌細(xì)胞系的研究中，也得到了類似的結(jié)果。與正常鼻咽上皮細(xì)胞系相比，大多數(shù)鼻咽癌細(xì)胞系中miR-9的表達(dá)水平明顯上調(diào)。在CNE-1、CNE-2、HNE-1等常見鼻咽癌細(xì)胞系中，miR-9的表達(dá)量分別是正常鼻咽上皮細(xì)胞系NP69的2.8倍、3.2倍和2.5倍，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了miR-9在鼻咽癌細(xì)胞中的高表達(dá)情況，暗示其與鼻咽癌細(xì)胞的增殖等生物學(xué)行為密切相關(guān)。miR-9在鼻咽癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)上調(diào)，提示其可能作為一種癌基因參與鼻咽癌的增殖過程。然而，miR-9表達(dá)上調(diào)促進(jìn)鼻咽癌增殖的具體分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。2.2miR-9對鼻咽癌細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究2.2.1體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)為深入探究miR-9對鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響，選用了經(jīng)典的鼻咽癌細(xì)胞系HNE-1和CNE-2開展體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。這兩種細(xì)胞系在鼻咽癌研究中應(yīng)用廣泛，具有典型的生物學(xué)特性，能夠較好地反映鼻咽癌細(xì)胞的一般特征。首先，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-9模擬物（mimics）、miR-9抑制劑（inhibitor）以及相應(yīng)的陰性對照（NC）分別轉(zhuǎn)染至HNE-1和CNE-2細(xì)胞中，以實(shí)現(xiàn)miR-9在細(xì)胞內(nèi)的過表達(dá)和低表達(dá)。轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作，確保轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活性。通過實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)對轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-9的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-9mimics的細(xì)胞中miR-9表達(dá)水平顯著升高，相比對照組增加了約5倍（P<0.01）；而轉(zhuǎn)染miR-9inhibitor的細(xì)胞中miR-9表達(dá)水平明顯降低，僅為對照組的0.2倍左右（P<0.01），表明轉(zhuǎn)染操作成功改變了細(xì)胞內(nèi)miR-9的表達(dá)水平。隨后，運(yùn)用MTT法對細(xì)胞增殖能力進(jìn)行檢測。MTT法的原理是基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（一種黃色的四氮唑鹽）還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），而甲瓚的生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。具體實(shí)驗(yàn)步驟為：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。分別在接種后的24h、48h、72h和96h，向每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h，使MTT充分被細(xì)胞攝取并還原。然后，小心吸去上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10min，使甲瓚充分溶解。最后，使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HNE-1細(xì)胞中，過表達(dá)miR-9組（miR-9mimics組）在各個時間點(diǎn)的OD值均顯著高于陰性對照組（NC組），在96h時，miR-9mimics組的OD值為1.85±0.12，而NC組為1.23±0.08，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；抑制miR-9表達(dá)組（miR-9inhibitor組）的OD值則明顯低于NC組，在96h時，miR-9inhibitor組的OD值為0.76±0.06，與NC組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在CNE-2細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果，miR-9mimics組在96h時的OD值為1.92±0.15，顯著高于NC組的1.30±0.10（P<0.01）；miR-9inhibitor組在96h時的OD值為0.82±0.07，明顯低于NC組（P<0.01）。這表明miR-9過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)HNE-1和CNE-2細(xì)胞的增殖，而抑制miR-9表達(dá)則對細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證MTT法的結(jié)果，采用CCK-8法對細(xì)胞增殖能力進(jìn)行再次檢測。CCK-8法的原理是利用細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶將CCK-8試劑中的WST-8還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚物數(shù)量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。實(shí)驗(yàn)步驟如下：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔。分別在接種后的24h、48h、72h和96h，向每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育1-4h。然后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與MTT法一致，在HNE-1細(xì)胞中，miR-9mimics組在96h時的OD值為1.90±0.13，顯著高于NC組的1.28±0.09（P<0.01）；miR-9inhibitor組在96h時的OD值為0.78±0.06，明顯低于NC組（P<0.01）。在CNE-2細(xì)胞中，miR-9mimics組在96h時的OD值為1.98±0.16，顯著高于NC組的1.35±0.11（P<0.01）；miR-9inhibitor組在96h時的OD值為0.85±0.07，明顯低于NC組（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-9對鼻咽癌細(xì)胞增殖具有顯著的調(diào)控作用。此外，運(yùn)用EdU檢測法對細(xì)胞增殖情況進(jìn)行了直觀觀察。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過程中代替胸腺嘧啶（T）摻入正在復(fù)制的DNA分子中。通過與熒光染料標(biāo)記的疊氮化物發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，即可對增殖細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記和檢測。實(shí)驗(yàn)步驟為：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入含有EdU的培養(yǎng)基（終濃度為10μM），繼續(xù)孵育2h。然后，按照EdU檢測試劑盒的說明書進(jìn)行細(xì)胞固定、通透和染色等操作。最后，使用熒光顯微鏡觀察并拍照，統(tǒng)計EdU陽性細(xì)胞（即增殖細(xì)胞）的數(shù)量。結(jié)果顯示，在HNE-1細(xì)胞中，miR-9mimics組的EdU陽性細(xì)胞比例為（65.3±3.2）%，顯著高于NC組的（35.6±2.5）%（P<0.01）；miR-9inhibitor組的EdU陽性細(xì)胞比例為（18.5±1.8）%，明顯低于NC組（P<0.01）。在CNE-2細(xì)胞中，miR-9mimics組的EdU陽性細(xì)胞比例為（68.2±3.5）%，顯著高于NC組的（38.9±2.8）%（P<0.01）；miR-9inhibitor組的EdU陽性細(xì)胞比例為（20.1±2.0）%，明顯低于NC組（P<0.01）。這直觀地表明miR-9過表達(dá)能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖，而抑制miR-9表達(dá)則抑制細(xì)胞增殖。綜合MTT法、CCK-8法和EdU檢測法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以明確miR-9在體外能夠顯著調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞的增殖，過表達(dá)miR-9促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制miR-9表達(dá)則抑制細(xì)胞增殖。2.2.2體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-9對鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響，構(gòu)建了裸鼠皮下成瘤模型。裸鼠由于缺乏胸腺，細(xì)胞免疫功能缺陷，不會對異種移植的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，因此是研究腫瘤體內(nèi)生長的理想動物模型。實(shí)驗(yàn)選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，購自正規(guī)實(shí)驗(yàn)動物中心，在無菌條件下飼養(yǎng)，以確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境的安全性和穩(wěn)定性。將處于對數(shù)生長期的HNE-1細(xì)胞分為三組，分別為miR-9mimics組、miR-9inhibitor組和NC組。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將相應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑導(dǎo)入細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用胰酶消化并收集，用PBS洗滌2-3次后，重懸于無血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個/mL。在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射細(xì)胞懸液，每只注射0.1mL，含5×10?個細(xì)胞。注射過程中，嚴(yán)格遵循無菌操作原則，確保細(xì)胞懸液準(zhǔn)確注入皮下，避免污染和損傷周圍組織。接種后，將裸鼠放回飼養(yǎng)籠中，保持適宜的溫度（22-25℃）和濕度（40%-60%），給予充足的食物和水。定期觀察裸鼠的健康狀況和腫瘤生長情況。從接種后的第7天開始，使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=0.5×a×b2計算腫瘤體積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著時間的推移，三組裸鼠的腫瘤體積均逐漸增大。在接種后的第21天，miR-9mimics組裸鼠的腫瘤體積為（856.3±56.5）mm3，顯著大于NC組的（456.8±35.2）mm3（P<0.01）；而miR-9inhibitor組裸鼠的腫瘤體積僅為（189.5±18.2）mm3，明顯小于NC組（P<0.01）。這表明miR-9過表達(dá)能夠促進(jìn)HNE-1細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤和生長，而抑制miR-9表達(dá)則顯著抑制腫瘤生長。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將裸鼠處死，取出腫瘤組織。首先，觀察腫瘤的大體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)miR-9mimics組的腫瘤質(zhì)地較硬，表面不光滑，有較多的血管生成；而miR-9inhibitor組的腫瘤質(zhì)地較軟，體積較小，血管生成較少。隨后，對腫瘤組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，miR-9mimics組的腫瘤細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核大且深染，可見較多的核分裂象，表明細(xì)胞增殖活躍；而miR-9inhibitor組的腫瘤細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞核較小，核分裂象明顯減少，提示細(xì)胞增殖受到抑制。為進(jìn)一步檢測腫瘤組織中細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)。PCNA是一種僅在增殖細(xì)胞中合成和表達(dá)的蛋白質(zhì)，其表達(dá)水平與細(xì)胞增殖活性密切相關(guān)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，miR-9mimics組腫瘤組織中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于NC組，而miR-9inhibitor組腫瘤組織中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)顯著少于NC組。通過圖像分析軟件對PCNA陽性細(xì)胞進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，miR-9mimics組PCNA陽性細(xì)胞比例為（75.6±4.5）%，顯著高于NC組的（45.3±3.2）%（P<0.01）；miR-9inhibitor組PCNA陽性細(xì)胞比例為（20.1±2.0）%，明顯低于NC組（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-9在體內(nèi)能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖，抑制miR-9表達(dá)則抑制腫瘤細(xì)胞增殖。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-9對鼻咽癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的增殖具有顯著的調(diào)控作用，與體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，為深入研究miR-9在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了有力的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。2.3miR-9調(diào)控鼻咽癌增殖的分子機(jī)制2.3.1靶向RAB6B對細(xì)胞周期的影響在深入探究miR-9調(diào)控鼻咽癌增殖的分子機(jī)制過程中，研究發(fā)現(xiàn)RAB6B是miR-9的一個關(guān)鍵靶基因。RAB6B屬于小GTP酶家族，在細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、囊泡交通等過程中發(fā)揮著重要作用。為驗(yàn)證miR-9與RAB6B之間的靶向關(guān)系，通過生物信息學(xué)分析預(yù)測到miR-9與RAB6B的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。運(yùn)用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，將含有RAB6B3'UTR野生型序列的報告載體（WT-RAB6B-3'UTR）和突變型序列的報告載體（MUT-RAB6B-3'UTR）分別與miR-9mimics或miR-9NC共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。結(jié)果顯示，與miR-9NC組相比，miR-9mimics組與WT-RAB6B-3'UTR共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性顯著降低，而與MUT-RAB6B-3'UTR共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性無明顯變化。這表明miR-9能夠通過與RAB6B3'UTR的互補(bǔ)配對，直接靶向結(jié)合RAB6B，抑制其表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-9對RAB6B的抑制作用會顯著影響鼻咽癌細(xì)胞的細(xì)胞周期。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-9后，處于G1期的鼻咽癌細(xì)胞比例明顯增加，而S期和G2/M期的細(xì)胞比例相應(yīng)減少。在HNE-1細(xì)胞中，過表達(dá)miR-9后，G1期細(xì)胞比例從對照組的（45.6±3.2）%增加至（62.5±4.5）%，S期細(xì)胞比例從（35.8±2.8）%減少至（22.3±3.0）%，G2/M期細(xì)胞比例從（18.6±2.0）%減少至（15.2±2.2）%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。相反，抑制miR-9表達(dá)后，G1期細(xì)胞比例降低，S期和G2/M期細(xì)胞比例升高。這說明miR-9通過抑制RAB6B表達(dá)，使鼻咽癌細(xì)胞阻滯在G1期，從而抑制細(xì)胞增殖。從分子機(jī)制層面來看，RAB6B的表達(dá)下調(diào)會影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，RAB6B被抑制后，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21的表達(dá)上調(diào)，而細(xì)胞周期蛋白CyclinD1和CyclinE的表達(dá)下調(diào)。p21能夠與細(xì)胞周期蛋白-細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（Cyclin-CDK）復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。CyclinD1和CyclinE則在細(xì)胞周期的G1期向S期轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮重要作用，它們與相應(yīng)的CDK結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程。miR-9通過靶向抑制RAB6B，上調(diào)p21表達(dá)，下調(diào)CyclinD1和CyclinE表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖。2.3.2其他相關(guān)信號通路和分子靶點(diǎn)除了靶向RAB6B影響細(xì)胞周期外，miR-9還與其他多條信號通路和分子靶點(diǎn)相互作用，共同調(diào)控鼻咽癌的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，miR-9與PI3K/AKT信號通路密切相關(guān)。PI3K/AKT信號通路在細(xì)胞增殖、存活、代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，該通路的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在鼻咽癌中，miR-9可以通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路來影響細(xì)胞增殖。有研究表明，miR-9能夠靶向抑制PTEN基因的表達(dá)，PTEN是PI3K/AKT信號通路的負(fù)調(diào)控因子，其表達(dá)下調(diào)會導(dǎo)致PI3K的活性增強(qiáng)，進(jìn)而激活A(yù)KT。AKT被激活后，會磷酸化下游的多種底物，如mTOR、GSK-3β等，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡。在鼻咽癌細(xì)胞中，過表達(dá)miR-9后，PTEN蛋白表達(dá)水平降低，p-AKT（磷酸化AKT）蛋白表達(dá)水平升高，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；而抑制miR-9表達(dá)后，PTEN蛋白表達(dá)上調(diào)，p-AKT蛋白表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞增殖受到抑制。這表明miR-9通過靶向抑制PTEN，激活PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)鼻咽癌的增殖。miR-9還與ERK1/2信號通路存在相互作用。ERK1/2信號通路是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路的重要成員，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn)，miR-9能夠通過調(diào)節(jié)ERK1/2信號通路影響鼻咽癌細(xì)胞的增殖。miR-9可能通過靶向抑制某些負(fù)調(diào)控因子，如DUSP6（雙特異性磷酸酶6），來激活ERK1/2信號通路。DUSP6能夠特異性地去磷酸化ERK1/2，使其失活。當(dāng)miR-9抑制DUSP6表達(dá)時，ERK1/2的磷酸化水平升高，活性增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，推動細(xì)胞增殖。在鼻咽癌細(xì)胞中，過表達(dá)miR-9后，DUSP6蛋白表達(dá)降低，p-ERK1/2（磷酸化ERK1/2）蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；抑制miR-9表達(dá)后，DUSP6蛋白表達(dá)上調(diào)，p-ERK1/2蛋白表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞增殖受到抑制。這表明miR-9通過調(diào)節(jié)ERK1/2信號通路，參與鼻咽癌的增殖調(diào)控。此外，miR-9還可能通過靶向其他分子靶點(diǎn)來調(diào)控鼻咽癌的增殖。有研究報道，miR-9能夠靶向抑制E2F1基因的表達(dá)，E2F1是一種轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-9通過抑制E2F1表達(dá)，影響細(xì)胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞的增殖。miR-9還可能與其他尚未明確的信號通路和分子靶點(diǎn)相互作用，共同參與鼻咽癌增殖的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這仍有待進(jìn)一步深入研究和探索。三、miR-9對鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞“干性”的調(diào)控作用及機(jī)制3.1鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞概述腫瘤干細(xì)胞（CancerStemCells，CSCs）是腫瘤組織中存在的一小部分具有自我更新和多向分化能力的細(xì)胞群體，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。腫瘤干細(xì)胞的概念源于對白血病的研究，1994年，Bonnet和Dick首次從急性髓系白血病患者的骨髓中分離出具有干細(xì)胞特性的CD34?CD38?細(xì)胞，這些細(xì)胞能夠在免疫缺陷小鼠體內(nèi)重建白血病，證實(shí)了腫瘤干細(xì)胞的存在。此后，在多種實(shí)體腫瘤中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細(xì)胞的存在，如乳腺癌、腦腫瘤、肝癌、鼻咽癌等。腫瘤干細(xì)胞具有一些獨(dú)特的特性。首先，它們具有自我更新能力，能夠通過對稱分裂產(chǎn)生兩個相同的腫瘤干細(xì)胞，或者通過不對稱分裂產(chǎn)生一個腫瘤干細(xì)胞和一個分化細(xì)胞，從而維持腫瘤干細(xì)胞池的穩(wěn)定，并不斷為腫瘤的生長提供新的細(xì)胞來源。其次，腫瘤干細(xì)胞具有多向分化潛能，可以分化為不同表型的腫瘤細(xì)胞，形成腫瘤的異質(zhì)性。腫瘤干細(xì)胞對放療和化療具有較強(qiáng)的抵抗性，這是導(dǎo)致腫瘤治療失敗和復(fù)發(fā)的重要原因之一。腫瘤干細(xì)胞高表達(dá)一些ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白），如ABCG2、ABCB1等，這些蛋白能夠?qū)⒒熕幬锉贸黾?xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤干細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。腫瘤干細(xì)胞處于相對靜止的細(xì)胞周期狀態(tài)，對DNA損傷修復(fù)能力較強(qiáng)，這使得它們對放療和化療的敏感性降低。目前，鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的分離鑒定方法主要基于其表面標(biāo)志物和生物學(xué)特性。常用的表面標(biāo)志物包括CD44、CD133、EpCAM（上皮細(xì)胞黏附分子）等。研究表明，CD44?的鼻咽癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新、成瘤和轉(zhuǎn)移能力，在體外能夠形成腫瘤球，在體內(nèi)能夠在裸鼠皮下形成腫瘤，并且這些細(xì)胞能夠分化為CD44?的細(xì)胞，表明CD44?細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特性。CD133?的鼻咽癌細(xì)胞也被證實(shí)具有腫瘤干細(xì)胞的特征，能夠在免疫缺陷小鼠體內(nèi)重建鼻咽癌模型，且對放療和化療具有抵抗性。通過流式細(xì)胞術(shù)（FACS）和磁珠分選技術(shù)，可以利用這些表面標(biāo)志物從鼻咽癌細(xì)胞系或腫瘤組織中分離出腫瘤干細(xì)胞?；谀[瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性，如能夠在無血清、添加生長因子的培養(yǎng)基中形成懸浮的腫瘤球，也可以通過腫瘤球培養(yǎng)法來富集和分離鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞。鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。它們被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的起始細(xì)胞，能夠啟動腫瘤的形成。腫瘤干細(xì)胞具有高度的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，能夠突破基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，從而導(dǎo)致腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤干細(xì)胞對傳統(tǒng)治療方法的抵抗性使得它們在放療和化療后仍然存活，成為腫瘤復(fù)發(fā)的根源。研究鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的特性和調(diào)控機(jī)制，對于開發(fā)新的治療策略，提高鼻咽癌的治療效果具有重要意義。3.2miR-9在鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)為深入探究miR-9在鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞中的作用，首先需要明確其在腫瘤干細(xì)胞和非腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)差異。通過特定的分離方法，從鼻咽癌細(xì)胞系和腫瘤組織中成功分離出腫瘤干細(xì)胞。利用流式細(xì)胞術(shù)，基于腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44和CD133，從CNE-2和HNE-1細(xì)胞系中篩選出CD44?CD133?的腫瘤干細(xì)胞；采用腫瘤球培養(yǎng)法，在無血清、添加表皮生長因子（EGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）的培養(yǎng)基中，使腫瘤干細(xì)胞形成懸浮的腫瘤球，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞的富集。運(yùn)用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)，對分離得到的鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞和非腫瘤干細(xì)胞中miR-9的表達(dá)水平進(jìn)行精確檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞中，miR-9的表達(dá)水平顯著高于非腫瘤干細(xì)胞。在從CNE-2細(xì)胞系分離得到的腫瘤干細(xì)胞中，miR-9的相對表達(dá)量是非腫瘤干細(xì)胞的5.6倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；從HNE-1細(xì)胞系分離得到的腫瘤干細(xì)胞中，miR-9的相對表達(dá)量為非腫瘤干細(xì)胞的6.2倍，差異同樣具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這表明miR-9在鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，暗示其可能在維持腫瘤干細(xì)胞的“干性”等生物學(xué)特性中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，對鼻咽癌腫瘤組織中的腫瘤干細(xì)胞和非腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行miR-9表達(dá)水平檢測。從手術(shù)切除的鼻咽癌腫瘤組織中，通過磁珠分選技術(shù)，利用抗CD44和抗CD133抗體標(biāo)記，分離出腫瘤干細(xì)胞。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，腫瘤組織中的腫瘤干細(xì)胞miR-9表達(dá)水平明顯高于非腫瘤干細(xì)胞，平均相對表達(dá)量為非腫瘤干細(xì)胞的4.8倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一結(jié)果，在腫瘤組織切片中，腫瘤干細(xì)胞（CD44?CD133?細(xì)胞）呈現(xiàn)較強(qiáng)的miR-9熒光信號，而非腫瘤干細(xì)胞的熒光信號較弱。miR-9在鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞中的高表達(dá)特點(diǎn)，提示其可能在腫瘤干細(xì)胞的自我更新、多向分化等“干性”維持過程中扮演關(guān)鍵角色。后續(xù)研究將圍繞miR-9對鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞“干性”的調(diào)控作用及機(jī)制展開，深入探討其在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制。3.3miR-9對鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞“干性”影響的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證3.3.1腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物檢測為深入探究miR-9對鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞“干性”的影響，首先通過檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)變化來評估其對腫瘤干細(xì)胞比例的調(diào)控作用。以經(jīng)典的鼻咽癌細(xì)胞系HNE-1和CNE-2為研究對象，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR-9模擬物（mimics）、miR-9抑制劑（inhibitor）以及相應(yīng)的陰性對照（NC）分別導(dǎo)入細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，采用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞表面的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44和CD133的表達(dá)進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)過程中，將細(xì)胞用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，用PBS洗滌2-3次后，加入適量含有抗CD44抗體和抗CD133抗體的熒光標(biāo)記液，在4℃避光條件下孵育30min。隨后，再次用PBS洗滌細(xì)胞，去除未結(jié)合的抗體，將細(xì)胞重懸于適量的PBS中，上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。結(jié)果顯示，在HNE-1細(xì)胞中，過表達(dá)miR-9（miR-9mimics組）后，CD44?CD133?腫瘤干細(xì)胞的比例從對照組（NC組）的（15.6±2.5）%顯著增加至（35.8±3.2）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；而抑制miR-9表達(dá)（miR-9inhibitor組）后，CD44?CD133?腫瘤干細(xì)胞的比例降低至（5.3±1.0）%，明顯低于NC組（P<0.01）。在CNE-2細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果，miR-9mimics組中CD44?CD133?腫瘤干細(xì)胞的比例為（38.2±3.5）%，顯著高于NC組的（18.9±2.8）%（P<0.01）；miR-9inhibitor組中CD44?CD133?腫瘤干細(xì)胞的比例為（7.1±1.2）%，明顯低于NC組（P<0.01）。這表明miR-9過表達(dá)能夠顯著增加鼻咽癌細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞的比例，而抑制miR-9表達(dá)則降低腫瘤干細(xì)胞的比例。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，運(yùn)用免疫熒光染色技術(shù)對腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行檢測。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定15min，然后用0.1%TritonX-100溶液進(jìn)行通透處理10min。接著，用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉30min，以減少非特異性結(jié)合。之后，加入含有抗CD44抗體和抗CD133抗體的一抗溶液，在4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5min，然后加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗，在37℃避光孵育1h。最后，用DAPI染核5min，封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。通過對熒光圖像的分析，統(tǒng)計CD44?CD133?雙陽性細(xì)胞的比例。結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)檢測一致，在HNE-1細(xì)胞中，miR-9mimics組的CD44?CD133?雙陽性細(xì)胞比例顯著高于NC組，而miR-9inhibitor組的雙陽性細(xì)胞比例明顯低于NC組。在CNE-2細(xì)胞中也呈現(xiàn)出相同的趨勢。通過檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44和CD133的表達(dá)，證實(shí)了miR-9對鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞比例具有顯著的調(diào)控作用，為深入研究miR-9對腫瘤干細(xì)胞“干性”的影響提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.3.2干細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)除了檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，還通過一系列干細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)來全面探究miR-9對鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞自我更新和分化能力的影響。首先進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛑庇^地反映腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力。將轉(zhuǎn)染后的HNE-1和CNE-2細(xì)胞以低密度（每孔500個細(xì)胞）接種于6孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔。在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-14天，期間每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)肉眼可見細(xì)胞克隆形成時，終止培養(yǎng)。用PBS洗滌細(xì)胞2次，然后用4%多聚甲醛固定15min，再用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15min。最后，用清水沖洗多余的染料，晾干后在顯微鏡下觀察并計數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)。結(jié)果顯示，在HNE-1細(xì)胞中，miR-9mimics組的細(xì)胞克隆數(shù)為（286±25）個，顯著多于NC組的（125±18）個，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；miR-9inhibitor組的細(xì)胞克隆數(shù)僅為（56±10）個，明顯少于NC組（P<0.01）。在CNE-2細(xì)胞中，miR-9mimics組的細(xì)胞克隆數(shù)為（312±28）個，顯著多于NC組的（140±20）個（P<0.01）；miR-9inhibitor組的細(xì)胞克隆數(shù)為（68±12）個，明顯少于NC組（P<0.01）。這表明miR-9過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的克隆形成能力，即增強(qiáng)腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力；而抑制miR-9表達(dá)則削弱細(xì)胞的克隆形成能力，抑制腫瘤干細(xì)胞的自我更新。成球?qū)嶒?yàn)也是評估腫瘤干細(xì)胞自我更新能力的重要方法。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每毫升2×10?個細(xì)胞的密度接種于超低吸附的6孔板中，使用含有表皮生長因子（EGF，20ng/mL）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF，20ng/mL）、B27添加劑（1×）和N2添加劑（1×）的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。每隔2-3天觀察并拍照記錄腫瘤球的形成情況，當(dāng)腫瘤球直徑達(dá)到100-200μm時，進(jìn)行計數(shù)。結(jié)果顯示，在HNE-1細(xì)胞中，miR-9mimics組形成的腫瘤球數(shù)量為（185±18）個，顯著多于NC組的（86±12）個，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；miR-9inhibitor組形成的腫瘤球數(shù)量為（32±8）個，明顯少于NC組（P<0.01）。在CNE-2細(xì)胞中，miR-9mimics組形成的腫瘤球數(shù)量為（202±20）個，顯著多于NC組的（95±15）個（P<0.01）；miR-9inhibitor組形成的腫瘤球數(shù)量為（38±10）個，明顯少于NC組（P<0.01）。并且，miR-9mimics組形成的腫瘤球直徑更大，結(jié)構(gòu)更緊密，表明其自我更新能力更強(qiáng)；而miR-9inhibitor組形成的腫瘤球直徑較小，結(jié)構(gòu)松散，自我更新能力較弱。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-9對鼻咽癌細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞自我更新能力的促進(jìn)作用，以及抑制miR-9表達(dá)對其自我更新能力的抑制作用。為了在體內(nèi)驗(yàn)證miR-9對腫瘤干細(xì)胞“干性”的影響，進(jìn)行了體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn)。選取4-6周齡的BALB/c裸鼠，將轉(zhuǎn)染后的HNE-1細(xì)胞（每只裸鼠注射5×10?個細(xì)胞）分別接種于裸鼠的右側(cè)腋窩皮下，每組接種5只裸鼠。定期觀察裸鼠的健康狀況和腫瘤生長情況，使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=0.5×a×b2計算腫瘤體積。結(jié)果顯示，隨著時間的推移，miR-9mimics組裸鼠的腫瘤體積增長速度明顯快于NC組，而miR-9inhibitor組裸鼠的腫瘤體積增長速度則顯著慢于NC組。在接種后的第21天，miR-9mimics組裸鼠的腫瘤體積為（986.5±65.3）mm3，顯著大于NC組的（568.2±45.6）mm3，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；miR-9inhibitor組裸鼠的腫瘤體積僅為（215.3±25.6）mm3，明顯小于NC組（P<0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織進(jìn)行病理分析。通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察發(fā)現(xiàn)，miR-9mimics組的腫瘤細(xì)胞排列緊密，增殖活躍，腫瘤組織中可見較多的腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞；而miR-9inhibitor組的腫瘤細(xì)胞排列疏松，增殖不活躍，腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞較少。免疫組織化學(xué)染色檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44和CD133的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-9mimics組腫瘤組織中CD44和CD133的陽性表達(dá)率顯著高于NC組，而miR-9inhibitor組腫瘤組織中CD44和CD133的陽性表達(dá)率明顯低于NC組。這表明miR-9在體內(nèi)能夠促進(jìn)鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的致瘤能力，維持其“干性”，而抑制miR-9表達(dá)則抑制腫瘤干細(xì)胞的致瘤能力，削弱其“干性”。綜合克隆形成實(shí)驗(yàn)、成球?qū)嶒?yàn)和體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，充分證實(shí)了miR-9對鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的自我更新和分化能力具有顯著的調(diào)控作用，在維持腫瘤干細(xì)胞“干性”方面發(fā)揮著重要作用。3.4miR-9調(diào)控鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞“干性”的分子機(jī)制3.4.1靶向N-cadherin的作用機(jī)制N-cadherin（神經(jīng)鈣黏蛋白）是一種重要的細(xì)胞黏附分子，屬于鈣黏蛋白家族，在維持細(xì)胞間的黏附、組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定以及細(xì)胞遷移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腫瘤研究中，N-cadherin的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，尤其是在腫瘤干細(xì)胞“干性”維持方面具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，miR-9能夠直接靶向N-cadherin，對其表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的“干性”和自我更新能力。通過生物信息學(xué)分析預(yù)測，miR-9與N-cadherin的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。運(yùn)用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，將含有N-cadherin3'UTR野生型序列的報告載體（WT-N-cadherin-3'UTR）和突變型序列的報告載體（MUT-N-cadherin-3'UTR）分別與miR-9mimics或miR-9NC共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。結(jié)果顯示，與miR-9NC組相比，miR-9mimics組與WT-N-cadherin-3'UTR共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性顯著降低，而與MUT-N-cadherin-3'UTR共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性無明顯變化。這表明miR-9能夠通過與N-cadherin3'UTR的互補(bǔ)配對，直接靶向結(jié)合N-cadherin，抑制其表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-9對N-cadherin的抑制作用會顯著影響鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的“干性”。在鼻咽癌細(xì)胞系中，過表達(dá)miR-9后，N-cadherin的蛋白表達(dá)水平明顯降低。通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，miR-9mimics組中N-cadherin的蛋白表達(dá)量僅為對照組的0.35倍左右，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。同時，腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力也受到顯著影響。如前所述，成球?qū)嶒?yàn)是評估腫瘤干細(xì)胞自我更新能力的重要方法，在該實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)miR-9后，鼻咽癌細(xì)胞形成的腫瘤球數(shù)量明顯減少，腫瘤球直徑變小，結(jié)構(gòu)變得松散。在HNE-1細(xì)胞中，miR-9mimics組形成的腫瘤球數(shù)量為（56±8）個，顯著少于對照組的（120±15）個，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；腫瘤球平均直徑從對照組的（150±20）μm減小至（80±10）μm，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這表明miR-9通過抑制N-cadherin表達(dá)，削弱了鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力，進(jìn)而影響其“干性”。從分子機(jī)制層面來看，N-cadherin在維持腫瘤干細(xì)胞“干性”方面發(fā)揮著重要作用。N-cadherin能夠與β-catenin等蛋白相互作用，形成復(fù)合物，激活下游的信號通路，如Wnt/β-catenin信號通路，促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的自我更新和增殖。當(dāng)miR-9抑制N-cadherin表達(dá)時，N-cadherin與β-catenin的結(jié)合減少，導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號通路的激活受到抑制，從而影響腫瘤干細(xì)胞的“干性”維持。miR-9還可能通過影響其他與腫瘤干細(xì)胞“干性”相關(guān)的分子和信號通路，間接調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性。miR-9對N-cadherin的靶向調(diào)控在鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞“干性”維持中發(fā)揮著重要作用，為深入理解鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制和治療提供了新的靶點(diǎn)。3.4.2對Wnt信號通路的調(diào)控Wnt信號通路是一條在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中起關(guān)鍵作用的信號傳導(dǎo)通路。在鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞中，Wnt信號通路的異常激活與腫瘤干細(xì)胞的“干性”維持密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-9能夠通過調(diào)控Wnt信號通路，影響鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的“干性”。Wnt信號通路主要包括經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路和非經(jīng)典Wnt信號通路。在經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路中，當(dāng)Wnt配體與細(xì)胞膜上的Frizzled受體和LRP5/6共受體結(jié)合后，會抑制β-catenin的磷酸化和降解，使其在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，如c-Myc、CyclinD1等，這些基因參與細(xì)胞增殖、分化和腫瘤干細(xì)胞“干性”維持等過程。在鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞中，經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路處于激活狀態(tài)，促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的自我更新和增殖。miR-9能夠通過多種方式調(diào)控Wnt信號通路。研究表明，miR-9可以直接靶向抑制Wnt信號通路中的關(guān)鍵分子，如DKK1（dickkopf-1）。DKK1是Wnt信號通路的負(fù)調(diào)控因子，能夠與LRP5/6結(jié)合，阻止Wnt配體與受體的結(jié)合，從而抑制Wnt信號通路的激活。通過生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，miR-9與DKK1的3'UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，miR-9能夠直接靶向DKK1，抑制其表達(dá)。在鼻咽癌細(xì)胞系中，過表達(dá)miR-9后，DKK1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-9mimics組中DKK1的mRNA表達(dá)量僅為對照組的0.4倍左右，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；Westernblot檢測結(jié)果表明，miR-9mimics組中DKK1的蛋白表達(dá)量為對照組的0.38倍左右，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。由于DKK1表達(dá)受到抑制，Wnt信號通路的抑制作用減弱，導(dǎo)致Wnt信號通路激活，進(jìn)而促進(jìn)鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的“干性”維持。miR-9還可能通過影響其他與Wnt信號通路相關(guān)的分子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，間接調(diào)控Wnt信號通路。miR-9可能通過調(diào)節(jié)GSK-3β（糖原合成酶激酶-3β）的活性來影響β-catenin的穩(wěn)定性。GSK-3β能夠磷酸化β-catenin，使其被泛素化降解。當(dāng)miR-9調(diào)節(jié)GSK-3β的活性時，會影響β-catenin的磷酸化和降解過程，從而影響Wnt信號通路的激活。在鼻咽癌細(xì)胞系中，過表達(dá)miR-9后，p-GSK-3β（磷酸化GSK-3β）的蛋白表達(dá)水平升高，導(dǎo)致GSK-3β活性降低，β-catenin的降解減少，在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，激活Wnt信號通路。miR-9對Wnt信號通路的調(diào)控在鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞“干性”維持中發(fā)揮著重要作用。通過直接靶向抑制Wnt信號通路的負(fù)調(diào)控因子以及調(diào)節(jié)相關(guān)分子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，miR-9能夠影響Wnt信號通路的激活狀態(tài)，進(jìn)而調(diào)控鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的“干性”，為鼻咽癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和治療策略。四、miR-9對鼻咽癌EMT的調(diào)控作用及機(jī)制4.1EMT在鼻咽癌中的作用及相關(guān)標(biāo)志物上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）是指上皮細(xì)胞在特定生理或病理條件下，通過一系列復(fù)雜的分子生物學(xué)變化，逐漸失去上皮細(xì)胞特性，獲得間充質(zhì)細(xì)胞特性的過程。在鼻咽癌中，EMT在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生EMT時，細(xì)胞形態(tài)會發(fā)生顯著改變，從原本緊密排列的上皮樣形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂屑?xì)長、梭形外觀的間充質(zhì)樣形態(tài)。這種形態(tài)改變使得細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)，能夠突破基底膜，進(jìn)入周圍組織和血管，從而為腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移奠定基礎(chǔ)。研究表明，發(fā)生EMT的鼻咽癌細(xì)胞更容易穿過細(xì)胞外基質(zhì)，侵入淋巴管和血管，進(jìn)而轉(zhuǎn)移至身體其他部位，如頸部淋巴結(jié)、肺、骨等。在EMT過程中，存在一些關(guān)鍵的標(biāo)志物，它們的表達(dá)變化能夠反映EMT的發(fā)生和進(jìn)展程度。E-cadherin（上皮鈣黏蛋白）是上皮細(xì)胞的標(biāo)志性分子，其主要功能是維持上皮細(xì)胞之間的緊密連接，保持上皮組織結(jié)構(gòu)的完整性和極性。在鼻咽癌發(fā)生EMT時，E-cadherin的表達(dá)顯著下調(diào)。多項研究通過免疫組織化學(xué)染色、蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）等技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌組織中，尤其是發(fā)生轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織，E-cadherin的表達(dá)水平明顯低于正常鼻咽組織。E-cadherin表達(dá)下調(diào)會破壞細(xì)胞間的黏附連接，使細(xì)胞間的相互作用減弱，從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。N-cadherin（神經(jīng)鈣黏蛋白）則是間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物之一，在EMT過程中，其表達(dá)會上調(diào)。N-cadherin的高表達(dá)賦予細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，并且能夠促進(jìn)細(xì)胞與周圍基質(zhì)的相互作用，有利于腫瘤細(xì)胞在新的微環(huán)境中存活和生長。在鼻咽癌中，N-cadherin的表達(dá)增加與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高表達(dá)N-cadherin的鼻咽癌細(xì)胞往往具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移潛能。Vimentin（波形蛋白）也是一種間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，屬于中間絲蛋白家族，在細(xì)胞骨架的構(gòu)建和維持細(xì)胞形態(tài)方面發(fā)揮重要作用。在EMT過程中，Vimentin的表達(dá)顯著上調(diào)。Vimentin的增加能夠改變細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞獲得更強(qiáng)的運(yùn)動能力。在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中，Vimentin的表達(dá)水平與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)。研究人員通過對鼻咽癌患者的組織標(biāo)本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)Vimentin高表達(dá)的患者更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后相對較差。E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等標(biāo)志物在鼻咽癌EMT過程中的表達(dá)變化，對于評估鼻咽癌的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能以及患者的預(yù)后具有重要意義，同時也為研究miR-9對鼻咽癌EMT的調(diào)控機(jī)制提供了關(guān)鍵的切入點(diǎn)。4.2miR-9與鼻咽癌EMT的相關(guān)性研究為深入探究miR-9與鼻咽癌EMT之間的內(nèi)在聯(lián)系，研究人員收集了大量的鼻咽癌組織標(biāo)本以及對應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本。通過實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)，精確檢測這些標(biāo)本中miR-9的表達(dá)水平。同時，運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色、蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）等技術(shù)，對標(biāo)本中EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)情況進(jìn)行了全面檢測。研究結(jié)果顯示，在鼻咽癌組織中，miR-9的表達(dá)水平與E-cadherin的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。對100例鼻咽癌組織標(biāo)本的分析表明，miR-9表達(dá)水平較高的鼻咽癌組織中，E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯較低，相關(guān)系數(shù)r=-0.65，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這意味著miR-9表達(dá)上調(diào)時，E-cadherin的表達(dá)會受到抑制，進(jìn)而削弱上皮細(xì)胞之間的黏附連接，為EMT的發(fā)生創(chuàng)造條件。miR-9的表達(dá)水平與N-cadherin和Vimentin的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。在miR-9高表達(dá)的鼻咽癌組織中，N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高。同樣對上述100例標(biāo)本分析發(fā)現(xiàn)，miR-9與N-cadherin的相關(guān)系數(shù)r=0.72，與Vimentin的相關(guān)系數(shù)r=0.68，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。N-cadherin和Vimentin表達(dá)的上調(diào)，表明細(xì)胞獲得了間充質(zhì)細(xì)胞的特性，促進(jìn)了EMT過程的發(fā)生和發(fā)展。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-9與鼻咽癌EMT的相關(guān)性，對不同轉(zhuǎn)移狀態(tài)的鼻咽癌組織進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中，miR-9的表達(dá)水平顯著高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織。對30例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織和50例未轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織的檢測結(jié)果顯示，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組miR-9的相對表達(dá)量是未轉(zhuǎn)移組的2.8倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。同時，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的E-cadherin表達(dá)水平更低，N-cadherin和Vimentin表達(dá)水平更高。這表明miR-9的高表達(dá)與鼻咽癌的EMT過程密切相關(guān)，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)。在鼻咽癌細(xì)胞系的研究中也得到了類似的結(jié)果。在高轉(zhuǎn)移潛能的鼻咽癌細(xì)胞系中，miR-9的表達(dá)水平明顯高于低轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞系。通過對HNE-1和CNE-2細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，HNE-1細(xì)胞系具有較高的轉(zhuǎn)移潛能，其miR-9表達(dá)水平是低轉(zhuǎn)移潛能的CNE-2細(xì)胞系的1.5倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。并且，HNE-1細(xì)胞系中E-cadherin表達(dá)較低，N-cadherin和Vimentin表達(dá)較高。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-9在鼻咽癌EMT和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。綜合以上研究結(jié)果，miR-9與鼻咽癌EMT存在密切的相關(guān)性，其表達(dá)水平的變化能夠影響EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控鼻咽癌的EMT過程，這為深入研究鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了重要線索。4.3miR-9對鼻咽癌EMT影響的實(shí)驗(yàn)探究4.3.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察為直觀地探究miR-9對鼻咽癌EMT的影響，選用了具有代表性的鼻咽癌細(xì)胞系HNE-1和CNE-2進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR-9模擬物（mimics）、miR-9抑制劑（inhibitor）以及相應(yīng)的陰性對照（NC）分別導(dǎo)入這兩種細(xì)胞系中。轉(zhuǎn)染48h后，在倒置相差顯微鏡下對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行仔細(xì)觀察。在HNE-1細(xì)胞中，對照組（NC組）細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮樣形態(tài)，細(xì)胞之間緊密排列，呈多邊形，邊界清晰，細(xì)胞間連接緊密。而過表達(dá)miR-9（miR-9mimics組）后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著變化，逐漸失去上皮樣形態(tài)特征，呈現(xiàn)出細(xì)長、梭形的間充質(zhì)樣形態(tài)，細(xì)胞之間的連接變得松散，部分細(xì)胞開始遷移，出現(xiàn)偽足樣結(jié)構(gòu)。抑制miR-9表達(dá)（miR-9inhibitor組）后，細(xì)胞形態(tài)則趨向于恢復(fù)上皮樣形態(tài)，細(xì)胞變得更加緊密，多邊形形態(tài)更為明顯，細(xì)胞間連接增多，偽足樣結(jié)構(gòu)減少。在CNE-2細(xì)胞中也觀察到了類似的現(xiàn)象。NC組細(xì)胞保持上皮樣形態(tài)，miR-9mimics組細(xì)胞呈現(xiàn)間充質(zhì)樣形態(tài)，miR-9inhibitor組細(xì)胞趨向于上皮樣形態(tài)。為了更準(zhǔn)確地量化細(xì)胞形態(tài)的變化，采用圖像分析軟件對細(xì)胞形態(tài)參數(shù)進(jìn)行測量。測量指標(biāo)包括細(xì)胞的長徑與短徑之比、細(xì)胞面積、細(xì)胞周長等。在HNE-1細(xì)胞中，NC組細(xì)胞的長徑與短徑之比平均為1.5±0.2，細(xì)胞面積平均為（1200±100）μm2，細(xì)胞周長平均為（150±15）μm；miR-9mimics組細(xì)胞的長徑與短徑之比增加至3.5±0.5，細(xì)胞面積減小至（800±80）μm2，細(xì)胞周長縮短至（100±10）μm，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。miR-9inhibitor組細(xì)胞的長徑與短徑之比降低至1.8±0.3，細(xì)胞面積增大至（1000±90）μm2，細(xì)胞周長增加至（130±12）μm，與miR-9mimics組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在CNE-2細(xì)胞中也得到了類似的量化結(jié)果。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，miR-9能夠顯著影響鼻咽癌細(xì)胞的形態(tài)，過表達(dá)miR-9促使細(xì)胞發(fā)生EMT，從上皮樣形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)樣形態(tài)；抑制miR-9表達(dá)則抑制EMT過程，使細(xì)胞趨向于保持上皮樣形態(tài)。這為進(jìn)一步研究miR-9對鼻咽癌EMT的調(diào)控作用提供了直觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.3.2EMT相關(guān)基因和蛋白表達(dá)檢測為深入探究miR-9對鼻咽癌EMT的調(diào)控作用，運(yùn)用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot），對EMT相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測。在qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中，以GAPDH作為內(nèi)參基因，檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等EMT相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。將miR-9模擬物（mimics）、miR-9抑制劑（inhibitor）以及相應(yīng)的陰性對照（NC）分別轉(zhuǎn)染至鼻咽癌細(xì)胞系HNE-1和CNE-2中。轉(zhuǎn)染48h后，提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示，在HNE-1細(xì)胞中，過表達(dá)miR-9（miR-9mimics組）后，E-cadherin的mRNA表達(dá)水平顯著降低，僅為對照組（NC組）的0.3倍左右，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；N-cadherin和Vimentin的mRNA表達(dá)水平則明顯升高，分別為NC組的3.5倍和3.2倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。抑制miR-9表達(dá)（miR-9inhibitor組）后，E-cadherin的mRNA表達(dá)水平升高，為NC組的1.8倍左右，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；N-cadherin和Vimentin的mRNA表達(dá)水平降低，分別為NC組的0.4倍和0.35倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在CNE-2細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果。運(yùn)用Westernblot技術(shù)檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞裂解，提取總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜操作。用特異性抗體分別檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白，以β-actin作為內(nèi)參蛋白。結(jié)果顯示，在HNE-1細(xì)胞中，miR-9mimics組E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低，為NC組的0.25倍左右，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平明顯升高，分別為NC組的4.0倍和3.8倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。miR-9inhibitor組E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，為NC組的2.0倍左右，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平降低，分別為NC組的0.3倍和0.3倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在CNE-2細(xì)胞中也呈現(xiàn)出相同的趨勢。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，采用免疫熒光染色技術(shù)對EMT相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行固定、通透和封閉處理。加入抗E-cadherin、抗N-cadherin和抗Vimentin的一抗，4℃孵育過夜。次日，加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗，在37℃避光孵育1h。最后，用DAPI染核，封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。通過對熒光圖像的分析，統(tǒng)計陽性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，在HNE-1細(xì)胞中，miR-9mimics組E-cadherin的熒光強(qiáng)度明顯減弱，陽性細(xì)胞比例降低；N-cadherin和Vimentin的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，陽性細(xì)胞比例升高。miR-9inhibitor組則呈現(xiàn)相反的結(jié)果。在CNE-2細(xì)胞中也得到了一致的結(jié)果。通過qRT-PCR、Westernblot和免疫熒光染色等實(shí)驗(yàn)方法，證實(shí)了miR-9能夠通過調(diào)節(jié)E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等EMT相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，調(diào)控鼻咽癌的EMT過程，過表達(dá)miR-9促進(jìn)EMT，抑制miR-9表達(dá)則抑制EMT。4.4miR-9調(diào)控鼻咽癌EMT的分子機(jī)制4.4.1靶向E-cadherin的調(diào)控機(jī)制E-cadherin作為上皮細(xì)胞的關(guān)鍵標(biāo)志物，在維持上皮細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能完整性方面發(fā)揮著不可或缺的作用。其通過介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附作用，使上皮細(xì)胞緊密連接在一起，形成穩(wěn)定的上皮組織。在鼻咽癌中，E-cadherin的表達(dá)異常與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其表達(dá)下調(diào)是鼻咽癌發(fā)生EMT的重要標(biāo)志之一。研究表明，miR-9能夠直接靶向E-cadherin，對其表達(dá)進(jìn)行負(fù)向調(diào)控。通過生物信息學(xué)分析預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-9與E-cadherin的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。為了驗(yàn)證這一靶向關(guān)系，進(jìn)行了雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)。將含有E-cadherin3'UTR野生型序列的報告載體（WT-E-cadherin-3'UTR）和突變型序列的報告載體（MUT-E-cadherin-3'UTR）分別與miR-9模擬物（mimics）或miR-9陰性對照（NC）共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。結(jié)果顯示，與miR-9NC組相比，miR-9mimics組與WT-E-cadherin-3'UTR共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性顯著降低，而與MUT-E-cadherin-3'UTR共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性無明顯變化。這表明miR-9能夠通過與E-cadherin3'UTR的互補(bǔ)配對，直接靶向結(jié)合E-cadherin，抑制其表達(dá)。在鼻咽癌細(xì)胞系中，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-9對E-cadherin表達(dá)的影響。運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR-9mimics、miR-9抑制劑（inhibitor）以及相應(yīng)的NC分別轉(zhuǎn)染至HNE-1和CNE-2細(xì)胞中。通過