CyPA-CD147在兔動(dòng)脈粥樣硬化模型血管重構(gòu)中的表達(dá)及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）作為心血管領(lǐng)域的常見且嚴(yán)重的疾病，嚴(yán)重威脅著人類的健康。它是一種慢性炎癥性疾病，以動(dòng)脈管壁增厚變硬、失去彈性和管腔縮小為主要特征，主要累及體循環(huán)系統(tǒng)的大型彈力型動(dòng)脈（如主動(dòng)脈）和中型彈力型動(dòng)脈，其中冠狀動(dòng)脈和腦動(dòng)脈受累最為常見。隨著病情的發(fā)展，動(dòng)脈粥樣硬化可引發(fā)一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥，如冠心病、腦卒中等，這些并發(fā)癥不僅導(dǎo)致患者生活質(zhì)量急劇下降，甚至?xí)＜吧?。?jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年因動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病死亡的人數(shù)眾多，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。血管重構(gòu)（VascularRemodeling）是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)關(guān)鍵病理過程。它指的是在各種致病因素的作用下，血管壁的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，包括血管壁細(xì)胞的增殖、遷移，細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解失衡，以及血管壁的炎癥反應(yīng)等。血管重構(gòu)可分為正向重構(gòu)和負(fù)向重構(gòu)。正向重構(gòu)時(shí)，血管壁向外擴(kuò)張，雖然在一定程度上可維持管腔面積，但會(huì)導(dǎo)致血管壁變薄，增加破裂的風(fēng)險(xiǎn)；負(fù)向重構(gòu)則表現(xiàn)為血管壁向心性增厚，管腔狹窄，影響血液供應(yīng)，導(dǎo)致組織器官缺血缺氧。無論是哪種類型的血管重構(gòu)，都與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展密切相關(guān)，并且是心血管事件發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。例如，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者中，血管重構(gòu)會(huì)進(jìn)一步加重心肌缺血，增加心肌梗死的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；在腦動(dòng)脈粥樣硬化中，血管重構(gòu)可導(dǎo)致腦供血不足，引發(fā)腦卒中。因此，深入了解血管重構(gòu)的機(jī)制，對于動(dòng)脈粥樣硬化的防治具有重要意義。親環(huán)素A（CyclophilinA，CyPA）和細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子CD147在動(dòng)脈粥樣硬化及血管重構(gòu)過程中的作用逐漸受到關(guān)注。CyPA是一種廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，具有肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶活性，參與蛋白質(zhì)折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生物學(xué)過程。在受到感染、缺氧和氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，CyPA可以分泌到細(xì)胞外環(huán)境中，作為一種促炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。CD147是一種高度糖基化的單次跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員。它廣泛分布于各種細(xì)胞表面，其主要功能之一是促進(jìn)多種基質(zhì)金屬蛋白酶（MatrixMetalloproteinases，MMPs）的釋放和表達(dá)上調(diào)，而MMPs在細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，CyPA和CD147之間存在相互作用，二者以配體-受體的形式結(jié)合，在炎癥細(xì)胞的趨化、血管新生、腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用。在動(dòng)脈粥樣硬化的病理發(fā)展中，CypA/CD147之間的相互作用可以促進(jìn)核因子κB（nuclearfactorkappa-B，NF-κB）核移位，上調(diào)白細(xì)胞的粘附和遷移，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。然而，目前關(guān)于CyPA-CD147在動(dòng)脈粥樣硬化兔血管重構(gòu)中的表達(dá)及具體作用機(jī)制仍不完全清楚，有待進(jìn)一步深入研究。1.2研究目的與意義本研究旨在通過構(gòu)建兔動(dòng)脈粥樣硬化模型，深入探究CyPA-CD147在動(dòng)脈粥樣硬化過程中血管重構(gòu)的表達(dá)變化規(guī)律，以及二者之間的相互作用機(jī)制，為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體而言，研究目的主要包括以下幾個(gè)方面：首先，明確CyPA和CD147在兔動(dòng)脈粥樣硬化模型血管重構(gòu)過程中的表達(dá)水平變化，包括在不同時(shí)間點(diǎn)以及不同病變程度血管組織中的表達(dá)差異，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)；其次，探討CyPA-CD147相互作用對血管重構(gòu)相關(guān)細(xì)胞（如血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）生物學(xué)行為的影響，如細(xì)胞增殖、遷移、凋亡以及炎癥因子分泌等；最后，初步探索針對CyPA-CD147通路進(jìn)行干預(yù)，是否能夠有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化兔血管重構(gòu)的進(jìn)展，為臨床治療提供新的思路和方法。本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。從理論層面來看，深入研究CyPA-CD147在動(dòng)脈粥樣硬化兔血管重構(gòu)中的作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示動(dòng)脈粥樣硬化血管重構(gòu)的分子機(jī)制，豐富對動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，填補(bǔ)該領(lǐng)域在這方面的研究空白，為心血管疾病的基礎(chǔ)研究提供新的方向和理論依據(jù)。在臨床應(yīng)用方面，若能夠明確CyPA-CD147作為動(dòng)脈粥樣硬化血管重構(gòu)的關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)，將為開發(fā)新型的治療藥物和干預(yù)策略提供有力支持。例如，通過研發(fā)特異性阻斷CyPA-CD147相互作用的藥物，或者調(diào)節(jié)CyPA、CD147表達(dá)的治療方法，有望有效抑制血管重構(gòu)，延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，降低心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，從而為廣大動(dòng)脈粥樣硬化患者帶來福音，具有顯著的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1動(dòng)脈粥樣硬化概述2.1.1定義與病理特征動(dòng)脈粥樣硬化是一種復(fù)雜的慢性疾病，主要累及體循環(huán)系統(tǒng)的大型彈力型動(dòng)脈和中型彈力型動(dòng)脈。其定義為動(dòng)脈管壁因脂質(zhì)、復(fù)合糖類積聚，纖維組織增生及鈣質(zhì)沉著，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)脈中層逐漸退變和鈣化，使得動(dòng)脈管壁增厚變硬、失去彈性且管腔縮小。從病理特征來看，動(dòng)脈粥樣硬化的病變起始于動(dòng)脈內(nèi)膜。在早期，血液中的脂質(zhì)，尤其是低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C），會(huì)通過受損的血管內(nèi)皮進(jìn)入內(nèi)膜下，并逐漸被氧化修飾。單核細(xì)胞吞噬這些氧化修飾的LDL后轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞持續(xù)吞噬脂質(zhì)，形成泡沫細(xì)胞。隨著病情發(fā)展，大量泡沫細(xì)胞聚集，形成脂肪條紋，這是動(dòng)脈粥樣硬化的早期病變形態(tài)。隨著病程進(jìn)展，病變進(jìn)一步發(fā)展為粥樣斑塊。粥樣斑塊由表面的纖維帽和深部的脂質(zhì)核心組成。纖維帽主要由平滑肌細(xì)胞、膠原纖維和蛋白多糖等構(gòu)成，起到穩(wěn)定斑塊的作用；脂質(zhì)核心則富含膽固醇結(jié)晶、壞死細(xì)胞碎片和細(xì)胞外脂質(zhì)。在病變后期，斑塊內(nèi)可能會(huì)出現(xiàn)出血、血栓形成、鈣化以及斑塊破裂等情況。斑塊內(nèi)出血是由于斑塊內(nèi)新生血管破裂所致，可使斑塊迅速增大，導(dǎo)致管腔急性狹窄；血栓形成則是由于斑塊破裂后，暴露的膠原纖維等物質(zhì)激活血小板和凝血系統(tǒng)，形成血栓，可完全阻塞血管，引發(fā)急性缺血事件，如心肌梗死、腦梗死等；鈣化使得動(dòng)脈壁更加僵硬，彈性進(jìn)一步降低；斑塊破裂是最為嚴(yán)重的情況，破裂的斑塊會(huì)導(dǎo)致血栓迅速形成，阻塞血管，引發(fā)嚴(yán)重的心腦血管事件。2.1.2發(fā)病機(jī)制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，是多種因素相互作用的結(jié)果，目前尚未完全明確，其中炎癥、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝紊亂被認(rèn)為在其發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用。炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中貫穿始終。當(dāng)血管內(nèi)皮受到各種危險(xiǎn)因素（如高血脂、高血壓、高血糖、吸煙等）刺激時(shí)，會(huì)發(fā)生損傷并啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)表達(dá)多種黏附分子，如血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）和E-選擇素等，這些黏附分子能夠捕獲血液中的單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，使其黏附并遷移至血管內(nèi)膜下。單核細(xì)胞在血管內(nèi)膜下分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過清道夫受體大量攝取氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），形成泡沫細(xì)胞，同時(shí)釋放多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥因子進(jìn)一步激活內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，吸引更多的炎癥細(xì)胞浸潤，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，導(dǎo)致血管壁增厚，斑塊形成和發(fā)展。此外，炎癥反應(yīng)還會(huì)導(dǎo)致斑塊內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)降解，纖維帽變薄，增加斑塊的不穩(wěn)定性，容易引發(fā)斑塊破裂和血栓形成。氧化應(yīng)激是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的重要機(jī)制之一。正常情況下，機(jī)體的氧化與抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)。當(dāng)受到各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)的活性氧（ROS）如超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等產(chǎn)生過多，超出了機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激。在動(dòng)脈粥樣硬化中，氧化應(yīng)激主要通過以下途徑發(fā)揮作用：首先，ROS可以氧化修飾LDL，生成ox-LDL。ox-LDL具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，能夠損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，破壞其正常的屏障功能和抗血栓形成功能，促進(jìn)血小板黏附和聚集；同時(shí)，ox-LDL還可以趨化單核細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi)膜下，并刺激巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL形成泡沫細(xì)胞。其次，氧化應(yīng)激可激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、核因子-κB（NF-κB）通路等。這些信號(hào)通路的激活會(huì)促進(jìn)炎癥因子、黏附分子和生長因子等的表達(dá)，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖，加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。此外，氧化應(yīng)激還會(huì)導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移異常，細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解失衡，影響血管壁的結(jié)構(gòu)和功能。脂質(zhì)代謝紊亂是動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素。血液中脂質(zhì)成分的異常，尤其是LDL-C水平升高、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平降低以及甘油三酯（TG）水平升高等，與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)。LDL是一種運(yùn)載膽固醇進(jìn)入外周組織細(xì)胞的脂蛋白顆粒，當(dāng)血液中LDL-C水平升高時(shí)，LDL容易被氧化修飾形成ox-LDL。ox-LDL不能被正常的LDL受體識(shí)別，而是被巨噬細(xì)胞表面的清道夫受體大量攝取，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過度積聚，形成泡沫細(xì)胞，這是動(dòng)脈粥樣硬化早期病變的重要特征。HDL則具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，它可以通過多種機(jī)制發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。HDL能夠促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，即將外周組織細(xì)胞中的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)回肝臟進(jìn)行代謝和排泄，從而減少膽固醇在血管壁的沉積；HDL還具有抗氧化、抗炎和抗血栓形成等作用。例如，HDL可以抑制LDL的氧化修飾，減少ox-LDL的生成；抑制炎癥細(xì)胞的黏附和遷移，減輕炎癥反應(yīng)；抑制血小板的活化和聚集，降低血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)HDL-C水平降低時(shí)，其對動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用減弱，增加了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。此外，TG水平升高也與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)，高TG血癥常伴有小而密LDL顆粒增多和HDL-C水平降低，這些異常的脂質(zhì)成分更容易導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。2.2血管重構(gòu)概述2.2.1概念與類型血管重構(gòu)是指在生理或病理?xiàng)l件下，血管為適應(yīng)各種內(nèi)、外環(huán)境變化而發(fā)生的結(jié)構(gòu)和功能的適應(yīng)性改變。這種改變涉及血管壁的多個(gè)層面，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及相關(guān)信號(hào)通路的相互作用。血管重構(gòu)并非簡單的血管形態(tài)變化，而是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，它在維持血管正常生理功能以及多種疾病的發(fā)生發(fā)展中都扮演著關(guān)鍵角色。根據(jù)不同的分類標(biāo)準(zhǔn)，血管重構(gòu)可分為多種類型。從發(fā)生機(jī)制角度，可分為生理性重構(gòu)和病理性重構(gòu)。生理性重構(gòu)通常是機(jī)體為適應(yīng)正常生理需求而進(jìn)行的自我調(diào)節(jié)過程，例如在生長發(fā)育階段，血管會(huì)隨著身體的增長而進(jìn)行適度的擴(kuò)張和重塑，以滿足組織器官對血液供應(yīng)的需求；在運(yùn)動(dòng)等情況下，血管也會(huì)通過重構(gòu)來增加血流量，提高氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的輸送效率。病理性重構(gòu)則是由于各種疾病因素導(dǎo)致的血管結(jié)構(gòu)和功能異常改變。如在動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等疾病狀態(tài)下，血管受到長期的異常刺激，引發(fā)一系列病理生理變化，導(dǎo)致血管重構(gòu)。按照重構(gòu)部位的不同，血管重構(gòu)又可分為動(dòng)脈重構(gòu)、靜脈重構(gòu)和毛細(xì)血管重構(gòu)。動(dòng)脈重構(gòu)常見于動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈瘤、動(dòng)脈炎等疾病。以動(dòng)脈粥樣硬化為例，動(dòng)脈壁在脂質(zhì)沉積、炎癥反應(yīng)等因素作用下，血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡，導(dǎo)致動(dòng)脈管壁增厚、變硬，管腔狹窄或擴(kuò)張，影響動(dòng)脈的正常彈性和血液流通。靜脈重構(gòu)常見于靜脈血栓形成、靜脈曲張、靜脈炎等情況。靜脈血栓形成時(shí)，靜脈壁會(huì)發(fā)生炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖，導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)改變，管腔部分或完全阻塞；靜脈曲張則表現(xiàn)為靜脈血管的迂曲、擴(kuò)張，靜脈壁變薄，瓣膜功能受損。毛細(xì)血管重構(gòu)常見于糖尿病性視網(wǎng)膜病變、腎病綜合征等疾病。在糖尿病性視網(wǎng)膜病變中，高血糖狀態(tài)導(dǎo)致視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，基底膜增厚，血管通透性增加，新生血管形成，這些改變嚴(yán)重影響視網(wǎng)膜的正常功能，可導(dǎo)致視力下降甚至失明。根據(jù)重構(gòu)方向，血管重構(gòu)可分為正向重構(gòu)和逆向重構(gòu)。正向重構(gòu)，也稱為外向重構(gòu)，是指血管腔徑擴(kuò)大，血管順應(yīng)性增加。在動(dòng)脈粥樣硬化早期，血管壁為了維持管腔面積，會(huì)通過向外擴(kuò)張的方式來代償，以保證血液的正常流通。然而，這種正向重構(gòu)雖然在一定程度上維持了管腔通暢，但會(huì)導(dǎo)致血管壁變薄，承受的壓力增大，增加了血管破裂的風(fēng)險(xiǎn)。逆向重構(gòu)，又稱內(nèi)向重構(gòu)或負(fù)向重構(gòu)，表現(xiàn)為血管腔徑減小，血管壁增厚。這種重構(gòu)常見于動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展期，隨著病變的加重，血管壁細(xì)胞大量增殖，細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，使得血管壁向心性增厚，管腔逐漸狹窄，阻礙血液流動(dòng)，導(dǎo)致組織器官缺血缺氧。2.2.2發(fā)生機(jī)制血管重構(gòu)的發(fā)生機(jī)制極為復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞和分子的相互作用，是一個(gè)多因素參與的動(dòng)態(tài)過程。血管平滑肌細(xì)胞（VascularSmoothMuscleCells，VSMCs）的增生和肥大在血管重構(gòu)中起著核心作用。在正常生理狀態(tài)下，VSMCs主要處于收縮型表型，具有維持血管張力和調(diào)節(jié)血管內(nèi)徑的功能。然而，在受到多種刺激因素，如血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、血小板衍生生長因子（PDGF）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等作用時(shí)，VSMCs會(huì)發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?。合成型VSMCs失去了正常的收縮功能，獲得了較強(qiáng)的增殖和遷移能力。它們開始大量合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、彈性蛋白和蛋白多糖等，導(dǎo)致血管壁增厚。同時(shí)，VSMCs的增生和遷移使得血管壁細(xì)胞數(shù)量增加，進(jìn)一步促進(jìn)了血管重構(gòu)的發(fā)生。例如，在高血壓引起的血管重構(gòu)中，長期的血壓升高刺激血管壁，激活了一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路等，這些通路的激活促使VSMCs增殖和肥大，血管壁增厚，管腔狹窄。細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變是血管重構(gòu)的重要特征之一。細(xì)胞外基質(zhì)主要由膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白多糖等組成，它不僅為血管壁細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支撐，還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和分化等生物學(xué)行為。在血管重構(gòu)過程中，細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解失衡。一方面，上述提到的合成型VSMCs以及成纖維細(xì)胞等會(huì)合成和分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)成分，導(dǎo)致其在血管壁內(nèi)過度沉積。另一方面，基質(zhì)金屬蛋白酶（MatrixMetalloproteinases，MMPs）及其組織抑制劑（TissueInhibitorsofMetalloproteinases，TIMPs）的平衡失調(diào)。MMPs是一類鋅離子依賴的蛋白水解酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的各種成分。正常情況下，MMPs的活性受到TIMPs的嚴(yán)格調(diào)控，以維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定。但在病理狀態(tài)下，MMPs的表達(dá)和活性升高，而TIMPs的表達(dá)相對降低，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度降解。這種合成與降解的失衡使得血管壁的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，如血管壁變硬、彈性下降，容易引發(fā)血管破裂或狹窄。例如，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過程中，MMP-2、MMP-9等表達(dá)上調(diào)，它們降解斑塊內(nèi)的纖維帽中的膠原蛋白等成分，使纖維帽變薄，增加了斑塊的不穩(wěn)定性，容易導(dǎo)致斑塊破裂和血栓形成。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是血管重構(gòu)的起始環(huán)節(jié)。血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管壁與血液的直接接觸界面，具有重要的生理功能，如調(diào)節(jié)血管張力、維持血液的正常流動(dòng)、抑制血栓形成等。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到各種危險(xiǎn)因素，如高血脂、高血壓、高血糖、氧化應(yīng)激、炎癥因子等刺激時(shí)，會(huì)發(fā)生損傷。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，其屏障功能受損，使得血液中的脂質(zhì)、炎癥細(xì)胞等更容易進(jìn)入血管內(nèi)膜下。同時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)釋放多種細(xì)胞因子和生長因子，如血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素-1（ET-1）、PDGF等，這些物質(zhì)進(jìn)一步激活血管平滑肌細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖，啟動(dòng)血管重構(gòu)過程。此外，內(nèi)皮細(xì)胞損傷還會(huì)導(dǎo)致一氧化氮（NO）等血管舒張因子的合成和釋放減少，而血管收縮因子如ET-1等增多，引起血管收縮，進(jìn)一步加重血管壁的損傷和重構(gòu)。例如，在高血脂條件下，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）可以直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，破壞其正常的生理功能，引發(fā)一系列連鎖反應(yīng)，最終導(dǎo)致血管重構(gòu)。炎癥反應(yīng)貫穿于血管重構(gòu)的整個(gè)過程。炎癥細(xì)胞如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等在血管重構(gòu)中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損后，會(huì)釋放多種趨化因子，如單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、RANTES等，吸引血液中的單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞黏附并遷移至血管內(nèi)膜下。單核細(xì)胞在血管內(nèi)膜下分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過清道夫受體大量攝取ox-LDL，形成泡沫細(xì)胞。同時(shí)，巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞會(huì)釋放多種炎癥因子，如TNF-α、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥因子不僅可以進(jìn)一步激活內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和遷移，還可以調(diào)節(jié)MMPs和TIMPs的表達(dá)，影響細(xì)胞外基質(zhì)的代謝。此外，炎癥反應(yīng)還會(huì)導(dǎo)致血管壁內(nèi)的氧化應(yīng)激水平升高，進(jìn)一步加重血管壁的損傷和重構(gòu)。例如，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，大量的炎癥細(xì)胞浸潤，炎癥因子的持續(xù)釋放，使得斑塊不斷發(fā)展和惡化，促進(jìn)了血管重構(gòu)的進(jìn)程。2.3CyPA-CD147相關(guān)知識(shí)2.3.1CyPA的結(jié)構(gòu)與功能親環(huán)素A（CyclophilinA，CyPA），又被稱為親環(huán)蛋白A、親環(huán)素、環(huán)孢菌素A結(jié)合蛋白18等，是親環(huán)素家族中含量最為豐富且研究最為廣泛的成員。它是一種高度保守的蛋白質(zhì)，在進(jìn)化過程中，從原核生物到真核生物都存在著結(jié)構(gòu)和功能相似的親環(huán)素蛋白。CyPA的結(jié)構(gòu)較為獨(dú)特，由165個(gè)氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量約為18kDa。其三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出典型的球狀折疊，包含一個(gè)由8條反向平行的β-折疊片組成的核心結(jié)構(gòu)，周圍環(huán)繞著多個(gè)α-螺旋。在CyPA的結(jié)構(gòu)中，存在一個(gè)高度保守的活性位點(diǎn)，該位點(diǎn)由多個(gè)氨基酸殘基組成，能夠與底物特異性結(jié)合，發(fā)揮其生物學(xué)功能。其中，脯氨酸殘基在CyPA的結(jié)構(gòu)和功能中起著關(guān)鍵作用，它參與形成肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶（PPIase）的活性中心，這一活性中心對于CyPA催化肽鍵在脯氨酸殘基處的順反異構(gòu)化至關(guān)重要。CyPA具有多種重要的生物學(xué)功能，其中最為顯著的是其肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶活性。這種活性使得CyPA能夠加速蛋白質(zhì)折疊過程中肽鍵在脯氨酸殘基處的順反異構(gòu)化反應(yīng)，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊形成具有生物學(xué)活性的三維結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞內(nèi)，許多新生多肽鏈在折疊過程中需要經(jīng)過脯氨酸殘基的順反異構(gòu)化步驟，CyPA通過其PPIase活性參與這一過程，確保蛋白質(zhì)的正常折疊和功能發(fā)揮。例如，在一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，相關(guān)蛋白質(zhì)的正確折疊對于信號(hào)的傳遞和細(xì)胞的正常生理功能至關(guān)重要，CyPA通過促進(jìn)這些蛋白質(zhì)的折疊，間接參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。除了在蛋白質(zhì)折疊方面的作用外，CyPA還在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。在免疫調(diào)節(jié)方面，CyPA最初被發(fā)現(xiàn)是免疫抑制藥物環(huán)孢素A（CsA）的主要細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白。CsA與CyPA結(jié)合形成復(fù)合物后，能夠抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的活性，從而阻斷T細(xì)胞的活化和增殖，發(fā)揮免疫抑制作用。這一機(jī)制在器官移植排斥反應(yīng)的防治中具有重要應(yīng)用。在炎癥反應(yīng)中，CyPA作為一種促炎性細(xì)胞因子，在受到感染、缺氧、氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，會(huì)從細(xì)胞內(nèi)釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。細(xì)胞外的CyPA可以與多種細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的趨化、黏附和活化。例如，CyPA能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞分泌多種炎癥因子，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。在細(xì)胞增殖與凋亡方面，研究表明CyPA參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，從而影響細(xì)胞的增殖和分裂。此外，CyPA還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)和信號(hào)通路，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程。在某些腫瘤細(xì)胞中，CyPA的表達(dá)異常升高，可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移；而在一些正常細(xì)胞受到損傷時(shí)，CyPA的表達(dá)變化可能影響細(xì)胞的凋亡命運(yùn)。2.3.2CD147的結(jié)構(gòu)與功能細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子CD147，又被稱為細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（EMMPRIN）、Basigin（BSG）或神經(jīng)外胚層細(xì)胞表面抗原OX-47，是一種高度糖基化的單次跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員。其在多種細(xì)胞類型的表面廣泛表達(dá)，包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、免疫細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞等。CD147的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，它由一條多肽鏈組成，包含一個(gè)較大的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、一個(gè)單次跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)較短的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域是CD147發(fā)揮功能的主要區(qū)域，其長度約為215個(gè)氨基酸殘基，包含兩個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（Ig-likedomains），分別為N端的IgV樣結(jié)構(gòu)域和C端的IgC樣結(jié)構(gòu)域。這兩個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域通過二硫鍵相互連接，形成了特定的空間構(gòu)象。在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域上，還存在多個(gè)糖基化位點(diǎn)，糖基化修飾對于CD147的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、功能發(fā)揮以及細(xì)胞間相互作用具有重要影響?？缒そY(jié)構(gòu)域由約24個(gè)氨基酸殘基組成，它將CD147錨定在細(xì)胞膜上，使細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域暴露于細(xì)胞外環(huán)境，而細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域則位于細(xì)胞內(nèi)，長度約為38個(gè)氨基酸殘基。細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域雖然較短，但它包含一些重要的信號(hào)基序，能夠與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子相互作用，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。CD147具有多種重要的生物學(xué)功能，其中最為突出的是其促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶（MatrixMetalloproteinases，MMPs）釋放和表達(dá)上調(diào)的作用。MMPs是一類鋅離子依賴的蛋白水解酶家族，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的各種成分，如膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白等，在細(xì)胞外基質(zhì)的重塑、組織修復(fù)、血管生成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CD147通過與細(xì)胞表面的受體或其他分子相互作用，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，從而促進(jìn)MMPs的合成、分泌和活性調(diào)節(jié)。具體來說，CD147可以與成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞表面的受體結(jié)合，刺激這些細(xì)胞分泌MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9等多種MMPs。此外，CD147還可以通過調(diào)節(jié)MMPs基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，上調(diào)MMPs的表達(dá)水平。在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞表面的CD147高表達(dá)，通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和周圍基質(zhì)細(xì)胞分泌MMPs，降解腫瘤細(xì)胞周圍的細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供條件。除了促進(jìn)MMPs的釋放和表達(dá)上調(diào)外，CD147還參與多種生理和病理過程。在生理過程中，CD147在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。在胚胎發(fā)育過程中，CD147參與細(xì)胞間的相互作用和組織器官的形態(tài)發(fā)生。例如，在神經(jīng)發(fā)育過程中，CD147在神經(jīng)細(xì)胞的遷移和分化中發(fā)揮重要作用，影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育。在組織修復(fù)過程中，CD147通過促進(jìn)MMPs的表達(dá)和活性，參與細(xì)胞外基質(zhì)的重塑和組織修復(fù)。在免疫調(diào)節(jié)方面，CD147在免疫細(xì)胞的活化、增殖和分化中發(fā)揮作用。它可以與免疫細(xì)胞表面的其他分子相互作用，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，如T淋巴細(xì)胞的活化、B淋巴細(xì)胞的抗體分泌等。在病理過程中，CD147與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如心血管疾病、腫瘤、炎癥性疾病等。在心血管疾病中，CD147參與動(dòng)脈粥樣硬化、血管重構(gòu)等病理過程。在動(dòng)脈粥樣硬化病變中，血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等表面的CD147表達(dá)上調(diào)，通過促進(jìn)MMPs的釋放和表達(dá)，導(dǎo)致血管壁細(xì)胞外基質(zhì)降解，血管壁結(jié)構(gòu)和功能受損，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。在腫瘤中，CD147的高表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞表面的CD147不僅可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自身的遷移和侵襲，還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)和免疫細(xì)胞功能，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供有利條件。在炎癥性疾病中，CD147參與炎癥細(xì)胞的趨化、黏附和活化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。例如，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞表面的CD147高表達(dá)，通過促進(jìn)MMPs的分泌和炎癥細(xì)胞的浸潤，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的破壞。2.3.3CyPA與CD147的相互作用CyPA與CD147之間存在著特異性的相互作用，二者以配體-受體的形式結(jié)合，這種相互作用在多種生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，CD147是CyPA在細(xì)胞表面的主要受體，細(xì)胞表面的肝素作為與CyPA結(jié)合的主要位點(diǎn)，介導(dǎo)CyPA對炎癥因子的趨化性，在轉(zhuǎn)導(dǎo)CyPA介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。CyPA與CD147的結(jié)合具有高度的親和力和特異性，二者的相互作用可以被特定的抗體或拮抗劑阻斷。CyPA與CD147的相互作用參與多種生物學(xué)過程，其中在炎癥細(xì)胞的趨化和活化方面表現(xiàn)得尤為顯著。當(dāng)機(jī)體受到感染、損傷或炎癥刺激時(shí)，細(xì)胞會(huì)釋放大量的CyPA到細(xì)胞外環(huán)境中。細(xì)胞外的CyPA可以與周圍細(xì)胞表面的CD147結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、核因子κB（NF-κB）通路等。這些信號(hào)通路的激活會(huì)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的趨化、黏附和活化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。例如，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等受到氧化應(yīng)激、炎癥因子等刺激時(shí)，會(huì)分泌CyPA。CyPA與周圍細(xì)胞表面的CD147結(jié)合后，激活NF-κB通路，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α等的表達(dá)和釋放，吸引更多的炎癥細(xì)胞如單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等向病變部位聚集，加重炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。在血管新生過程中，CyPA與CD147的相互作用也發(fā)揮著重要作用。血管新生是指在原有血管基礎(chǔ)上生成新的血管的過程，它在胚胎發(fā)育、傷口愈合、腫瘤生長等生理和病理過程中都具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，CyPA和CD147在血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中都有表達(dá)，二者的相互作用可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，以及平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，從而參與血管新生過程。具體來說，CyPA與CD147結(jié)合后，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體的表達(dá)，促進(jìn)VEGF介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移。同時(shí)，CyPA-CD147相互作用還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑，為血管新生提供適宜的微環(huán)境。在腫瘤生長過程中，腫瘤細(xì)胞分泌的CyPA與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的CD147結(jié)合，促進(jìn)腫瘤血管的生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。CyPA與CD147的相互作用還與多種疾病的發(fā)展密切相關(guān)。在心血管疾病中，除了上述提到的動(dòng)脈粥樣硬化外，在心肌梗死、心力衰竭等疾病中，CyPA-CD147信號(hào)通路也參與了心肌細(xì)胞的損傷、炎癥反應(yīng)和心肌重構(gòu)等病理過程。在心肌梗死發(fā)生后，心肌細(xì)胞受到損傷，釋放CyPA。CyPA與周圍細(xì)胞表面的CD147結(jié)合，激活炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇，心肌組織進(jìn)一步受損。同時(shí)，CyPA-CD147相互作用還可以促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成，導(dǎo)致心肌纖維化，影響心臟的功能。在腫瘤疾病中，CyPA-CD147相互作用不僅促進(jìn)腫瘤血管新生，還與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞表面的CD147與CyPA結(jié)合后，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌MMPs，降解細(xì)胞外基質(zhì)，使腫瘤細(xì)胞更容易突破基底膜，向周圍組織浸潤和轉(zhuǎn)移。此外，CyPA-CD147相互作用還可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和耐藥性，影響腫瘤的治療效果。在炎癥性疾病中，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等，CyPA-CD147信號(hào)通路參與了炎癥細(xì)胞的活化、炎癥因子的釋放和組織損傷等過程。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞分泌的CyPA與CD147結(jié)合，激活炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)加劇，關(guān)節(jié)軟骨和骨組織受到破壞。三、兔動(dòng)脈粥樣硬化模型構(gòu)建3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇本研究選用健康雄性新西蘭白兔作為實(shí)驗(yàn)對象，共[X]只，體重范圍在2.5-3.5kg之間，月齡為3-4個(gè)月。選擇新西蘭雄性白兔主要基于以下幾方面原因：首先，新西蘭白兔對高脂飲食極為敏感。其獨(dú)特的生理特性使得在攝入高脂飼料后，能夠快速出現(xiàn)血脂升高的現(xiàn)象。研究表明，給予新西蘭白兔高脂飼料喂養(yǎng)數(shù)周后，血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等血脂指標(biāo)會(huì)顯著上升，且這種血脂升高的幅度和速度相對其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物更為明顯。這一特性為快速誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立提供了便利條件，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，提高了研究效率。例如，與大鼠相比，新西蘭白兔在相同高脂飲食條件下，血脂升高的幅度更大，能更快達(dá)到動(dòng)脈粥樣硬化模型構(gòu)建所需的血脂水平。其次，新西蘭白兔的脂代謝與人類有一定的相似之處。雖然兔為草食性動(dòng)物，但在脂代謝過程中，其對膽固醇的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)以及代謝調(diào)節(jié)等方面與人類存在部分相似的機(jī)制。這使得以新西蘭白兔構(gòu)建的動(dòng)脈粥樣硬化模型，在研究動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制以及評估相關(guān)治療方法的有效性時(shí)，能夠更好地模擬人類的病理生理過程，為臨床研究提供更具參考價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。例如，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，新西蘭白兔和人類都存在脂質(zhì)在血管內(nèi)膜下的沉積，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)和血管壁結(jié)構(gòu)改變等相似的病理變化。再者，新西蘭白兔具有成本較低、操作方便的優(yōu)勢。與一些大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（如豬、猴等）相比，新西蘭白兔的購買成本和飼養(yǎng)成本都相對較低，這使得大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)研究在經(jīng)濟(jì)上更具可行性。同時(shí)，其體型適中，便于進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)操作，如采血、給藥、手術(shù)等。此外，新西蘭白兔性情溫順，易于捕捉和保定，減少了實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。例如，在進(jìn)行血管插管等手術(shù)操作時(shí)，新西蘭白兔能夠較好地配合，降低了手術(shù)難度和風(fēng)險(xiǎn)，提高了手術(shù)成功率。綜上所述，基于對高脂飲食的敏感性、脂代謝與人類的相似性以及成本和操作便利性等多方面因素的綜合考慮，本研究選擇健康雄性新西蘭白兔作為構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以期為后續(xù)關(guān)于CyPA-CD147在動(dòng)脈粥樣硬化兔血管重構(gòu)中的表達(dá)研究提供理想的動(dòng)物模型。3.2模型構(gòu)建方法3.2.1高脂飲食法高脂飲食法是構(gòu)建兔動(dòng)脈粥樣硬化模型最常用的方法之一。該方法通過調(diào)整飼料配方，使兔子攝入高膽固醇、高脂肪的食物，從而誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。常見的飼料配方中，會(huì)添加一定比例的膽固醇、蛋黃、豬油等成分。例如，一種常用的高脂飼料配方為：普通飼料88.5%、蛋黃粉7.5%、膽固醇6%、豬油4%。在實(shí)際操作中，為了讓兔子更好地適應(yīng)高脂飼料，蛋黃粉開始時(shí)足量添加，膽固醇和豬油則逐次增加，每次各增加0.5%。若兔子進(jìn)食后無腹瀉且進(jìn)食量可增加，約3天增加一次膽固醇和豬油的量，直至達(dá)到目標(biāo)劑量。其誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的原理主要基于以下幾個(gè)方面：首先，高脂飲食會(huì)導(dǎo)致兔子體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂。高膽固醇和高脂肪的攝入使得血液中脂質(zhì)含量顯著升高，尤其是低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平大幅上升。LDL-C容易被氧化修飾形成氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）。ox-LDL具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，它可以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，破壞內(nèi)皮細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。正常情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞完整且功能正常，能夠維持血管壁的完整性和血液的正常流動(dòng)。但受到ox-LDL的攻擊后，內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能受損，使得血液中的脂質(zhì)、炎癥細(xì)胞等更容易進(jìn)入血管內(nèi)膜下。其次，高脂飲食還會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)。ox-LDL可以趨化單核細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi)膜下，單核細(xì)胞在血管內(nèi)膜下分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞通過清道夫受體大量攝取ox-LDL，形成泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞的聚集是動(dòng)脈粥樣硬化早期病變的重要特征。同時(shí)，巨噬細(xì)胞還會(huì)釋放多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥因子進(jìn)一步激活內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，吸引更多的炎癥細(xì)胞浸潤，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，導(dǎo)致血管壁增厚，斑塊形成和發(fā)展。此外，長期的高脂飲食還會(huì)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，使其分泌一氧化氮（NO）等血管舒張因子減少，而分泌內(nèi)皮素-1（ET-1）等血管收縮因子增多，導(dǎo)致血管收縮，血流動(dòng)力學(xué)改變，進(jìn)一步加重血管壁的損傷和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。3.2.2免疫損傷法免疫損傷法是通過對兔子進(jìn)行免疫刺激，引發(fā)免疫反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。常用的免疫刺激物包括牛血清白蛋白、卵清白蛋白等。以牛血清白蛋白為例，通常采用多次注射的方法。如顧晴等人選用牛血清白蛋白免疫劑量為250mg/kg，1次/周，連續(xù)3周，從兔的耳緣靜脈進(jìn)行注射。在生物免疫系統(tǒng)中，抗原進(jìn)入機(jī)體后，會(huì)引發(fā)免疫應(yīng)答。當(dāng)牛血清白蛋白等抗原初次進(jìn)入兔子機(jī)體后，免疫系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生初次應(yīng)答，B細(xì)胞對該抗原產(chǎn)生抗體的潛伏期在10天左右，再經(jīng)過約10天抗體產(chǎn)生才達(dá)到峰值。但初次應(yīng)答產(chǎn)生的抗體水平不高，親和力不強(qiáng)，且抗體以IgM為主。隨著多次注射抗原，免疫系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生二次免疫應(yīng)答。二次免疫應(yīng)答直接利用免疫記憶細(xì)胞來反應(yīng)，抗體產(chǎn)生的潛伏期縮短至2-3天，再經(jīng)過3-5天抗體即可達(dá)到峰值，且產(chǎn)生的抗體為高效價(jià)、高親和力的IgG。其誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的免疫機(jī)制主要如下：免疫刺激引發(fā)的免疫反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷。當(dāng)牛血清白蛋白等抗原進(jìn)入兔子體內(nèi)后，會(huì)激活免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體?？乖?抗體復(fù)合物會(huì)沉積在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表面，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，產(chǎn)生一系列生物活性物質(zhì)，如C3a、C5a等。這些活性物質(zhì)具有趨化作用，可吸引中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞聚集到動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞處。炎癥細(xì)胞在吞噬抗原-抗體復(fù)合物的過程中，會(huì)釋放多種酶類和活性氧物質(zhì)，如蛋白酶、超氧陰離子等，這些物質(zhì)會(huì)直接損傷動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，其正常的屏障功能和抗血栓形成功能受損，使得血液中的脂質(zhì)、血小板等更容易黏附在血管內(nèi)膜上。同時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷還會(huì)導(dǎo)致其分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，如血管緊張素Ⅱ、血小板衍生生長因子（PDGF）等，這些物質(zhì)進(jìn)一步激活血管平滑肌細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖，啟動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化的形成過程。此外，免疫損傷引發(fā)的炎癥反應(yīng)還會(huì)導(dǎo)致單核細(xì)胞向血管內(nèi)膜下遷移并分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，這與高脂飲食法中泡沫細(xì)胞的形成過程相互協(xié)同，共同促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展。3.2.3血管內(nèi)皮損傷法血管內(nèi)皮損傷法中，球囊損傷法是較為常用的一種方法。以構(gòu)建兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化模型為例，其操作過程如下：選取體重為2.5-3kg的新西蘭兔，先進(jìn)行普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。1周后給予高脂飼料飼養(yǎng)并制備模型。制備模型前，兔子需空腹12小時(shí)，然后經(jīng)耳緣靜脈注射30mg/kg的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。麻醉成功后，在右側(cè)股動(dòng)脈搏動(dòng)明顯處周圍剃毛約直徑5cm，該處皮膚用碘伏消毒后鋪無菌洞巾。在無菌條件下，沿股動(dòng)脈走行方向切開皮膚，分離皮下組織及肌肉，鈍性分離出右股動(dòng)脈。直視下以橈動(dòng)脈穿刺針行股動(dòng)脈穿刺術(shù)，穿刺成功后，借助于導(dǎo)絲插入4F橈動(dòng)脈鞘管。在經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)（PTCA）導(dǎo)絲引導(dǎo)下，插入球囊導(dǎo)管（球囊直徑一般為3.0-3.5mm，長度15mm），使球囊位于腹主動(dòng)脈上段。使用壓力泵向球囊內(nèi)注入肝素生理鹽水，維持壓力在6-8個(gè)大氣壓，并緩慢回拉球囊導(dǎo)管。當(dāng)回拉有阻力時(shí)，表明球囊直徑與血管吻合。若球囊較小，則換用大一號(hào)的球囊。如此反復(fù)回拉損傷內(nèi)膜3次后，退出球囊及導(dǎo)絲，拔出鞘管，壓迫血管10分鐘后，用明膠海綿包扎血管，縫合手術(shù)切口。術(shù)后繼續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng)，并密切觀察動(dòng)物的進(jìn)食、飲水、排便情況。其損傷血管內(nèi)皮、誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化形成的原理基于損傷反應(yīng)假說。該假說認(rèn)為，脂質(zhì)浸潤和內(nèi)皮損傷是產(chǎn)生粥樣硬化病變最基本條件，粥樣硬化形成的起始階段是血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙。球囊損傷直接破壞了血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性，使得內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能喪失。血管內(nèi)皮受損后，內(nèi)皮下的膠原纖維等成分暴露，這會(huì)激活血小板和凝血系統(tǒng)，導(dǎo)致血小板黏附、聚集在損傷部位，形成血小板血栓。同時(shí)，血液中的脂質(zhì)，尤其是LDL-C，會(huì)更容易進(jìn)入血管內(nèi)膜下。此外，內(nèi)皮損傷還會(huì)引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)和內(nèi)膜反應(yīng)。內(nèi)皮細(xì)胞受損后，會(huì)釋放多種細(xì)胞因子和趨化因子，如單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）等。這些因子會(huì)吸引血液中的單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞黏附并遷移至血管內(nèi)膜下。單核細(xì)胞在血管內(nèi)膜下分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過清道夫受體大量攝取進(jìn)入內(nèi)膜下的LDL-C，形成泡沫細(xì)胞。隨著病變的發(fā)展，泡沫細(xì)胞不斷聚集，逐漸形成脂肪條紋。同時(shí)，血管平滑肌細(xì)胞在細(xì)胞因子和生長因子的刺激下，會(huì)發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?。合成型平滑肌?xì)胞具有較強(qiáng)的增殖和遷移能力，它們會(huì)遷移到內(nèi)膜下，合成和分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、彈性蛋白等，導(dǎo)致血管壁增厚，逐漸形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。3.3模型評價(jià)指標(biāo)為了準(zhǔn)確判斷兔動(dòng)脈粥樣硬化模型是否成功構(gòu)建，本研究采用了一系列全面且科學(xué)的評價(jià)指標(biāo)，涵蓋了血脂檢測、病理切片觀察、血管超聲檢測等多個(gè)方面。血脂檢測是評估動(dòng)脈粥樣硬化模型的重要指標(biāo)之一。血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平升高，以及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平降低，被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素。在本研究中，于實(shí)驗(yàn)開始前及實(shí)驗(yàn)過程中的特定時(shí)間點(diǎn)（如第4周、第8周、第12周等），經(jīng)耳緣靜脈采集血液樣本，使用全自動(dòng)生化分析儀測定血脂指標(biāo)。若模型構(gòu)建成功，與正常對照組相比，實(shí)驗(yàn)組兔子的TC、TG、LDL-C水平應(yīng)顯著升高，而HDL-C水平則明顯降低。例如，有研究表明，在高脂飲食誘導(dǎo)的兔動(dòng)脈粥樣硬化模型中，喂養(yǎng)12周后，實(shí)驗(yàn)組兔的TC水平可從正常的1.5-2.5mmol/L升高至10-15mmol/L，LDL-C水平從0.5-1.0mmol/L升高至6-8mmol/L，HDL-C水平則從1.0-1.5mmol/L降低至0.5-0.8mmol/L。這些血脂指標(biāo)的變化反映了模型動(dòng)物體內(nèi)脂質(zhì)代謝的紊亂，是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要標(biāo)志。病理切片觀察能夠直觀地展示動(dòng)脈血管的病理變化，為模型評價(jià)提供了重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死兔子，迅速取出主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈等主要?jiǎng)用}血管，用生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血液和雜質(zhì)。將血管組織固定于4%多聚甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋，制作厚度為4-5μm的切片。采用蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察血管內(nèi)膜、中膜和外膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。在成功的動(dòng)脈粥樣硬化模型中，可見血管內(nèi)膜增厚，大量泡沫細(xì)胞聚集，形成明顯的粥樣斑塊。斑塊內(nèi)可見脂質(zhì)核心，主要由膽固醇結(jié)晶、壞死細(xì)胞碎片和細(xì)胞外脂質(zhì)組成，表面覆蓋著一層纖維帽，由平滑肌細(xì)胞、膠原纖維和蛋白多糖等構(gòu)成。此外，還可能觀察到中膜平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，以及外膜的炎癥細(xì)胞浸潤等病理改變。例如，通過對兔主動(dòng)脈病理切片的觀察，能夠清晰地看到內(nèi)膜下大量泡沫細(xì)胞的堆積，以及纖維帽的形成，這些病理特征與人類動(dòng)脈粥樣硬化的病變相似。血管超聲檢測是一種無創(chuàng)、便捷且可重復(fù)性高的檢測方法，能夠?qū)崟r(shí)觀察動(dòng)脈血管的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化，為模型評價(jià)提供了動(dòng)態(tài)的影像學(xué)信息。在實(shí)驗(yàn)過程中，使用高頻超聲診斷儀，配備7-10MHz的線陣探頭，對兔子的頸動(dòng)脈、股動(dòng)脈等外周動(dòng)脈進(jìn)行檢測。檢測指標(biāo)包括血管內(nèi)徑、內(nèi)膜-中層厚度（IMT）、斑塊大小和形態(tài)等。正常情況下，血管內(nèi)徑均勻，IMT較薄，一般在0.2-0.3mm之間，且血管壁光滑，無明顯斑塊形成。在動(dòng)脈粥樣硬化模型中，隨著病變的發(fā)展，血管內(nèi)徑可能會(huì)出現(xiàn)不同程度的狹窄，IMT增厚，可達(dá)到0.5-1.0mm甚至更厚。同時(shí)，血管壁上可觀察到大小不一、形態(tài)各異的斑塊，斑塊回聲不均勻，根據(jù)回聲特點(diǎn)可分為低回聲、等回聲和高回聲斑塊，分別提示不同的病理成分，如低回聲斑塊可能富含脂質(zhì)，高回聲斑塊則可能含有較多的纖維組織或鈣化成分。例如，通過血管超聲檢測，能夠清晰地顯示出兔頸動(dòng)脈內(nèi)膜的增厚和斑塊的形成，測量斑塊的大小和面積，評估病變的嚴(yán)重程度。四、CyPA-CD147在兔動(dòng)脈粥樣硬化模型血管重構(gòu)中的表達(dá)檢測4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4.1.1分組情況本研究將[X]只健康雄性新西蘭白兔隨機(jī)分為4組，每組[X]只，具體分組情況如下：對照組：給予普通飼料喂養(yǎng)，不進(jìn)行任何其他處理，作為正常對照，用于觀察正常生理狀態(tài)下兔血管組織中CyPA-CD147的表達(dá)情況。模型組：采用高脂飲食法結(jié)合球囊損傷法構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型。先給予高脂飼料喂養(yǎng)（飼料配方為：普通飼料88.5%、蛋黃粉7.5%、膽固醇6%、豬油4%，蛋黃粉開始時(shí)足量添加，膽固醇和豬油逐次增加，每次各增加0.5%，若兔子進(jìn)食后無腹瀉且進(jìn)食量可增加，約3天增加一次膽固醇和豬油的量，直至達(dá)到目標(biāo)劑量），同時(shí)進(jìn)行腹主動(dòng)脈球囊損傷手術(shù)。手術(shù)過程為：兔子空腹12小時(shí)后，經(jīng)耳緣靜脈注射30mg/kg的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。在右側(cè)股動(dòng)脈搏動(dòng)明顯處周圍剃毛約直徑5cm，皮膚用碘伏消毒后鋪無菌洞巾。沿股動(dòng)脈走行方向切開皮膚，分離皮下組織及肌肉，鈍性分離出右股動(dòng)脈。直視下以橈動(dòng)脈穿刺針行股動(dòng)脈穿刺術(shù)，穿刺成功后，借助于導(dǎo)絲插入4F橈動(dòng)脈鞘管。在經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)（PTCA）導(dǎo)絲引導(dǎo)下，插入球囊導(dǎo)管（球囊直徑為3.0-3.5mm，長度15mm），使球囊位于腹主動(dòng)脈上段。使用壓力泵向球囊內(nèi)注入肝素生理鹽水，維持壓力在6-8個(gè)大氣壓，并緩慢回拉球囊導(dǎo)管。當(dāng)回拉有阻力時(shí)，表明球囊直徑與血管吻合。若球囊較小，則換用大一號(hào)的球囊。如此反復(fù)回拉損傷內(nèi)膜3次后，退出球囊及導(dǎo)絲，拔出鞘管，壓迫血管10分鐘后，用明膠海綿包扎血管，縫合手術(shù)切口。術(shù)后繼續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng)，以誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，觀察CyPA-CD147在動(dòng)脈粥樣硬化病變血管中的表達(dá)變化。液氮凍傷組：給予普通飼料喂養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)第1周時(shí)，對兔腹主動(dòng)脈進(jìn)行液氮凍傷處理。具體操作是在麻醉兔子后，暴露腹主動(dòng)脈，用預(yù)冷的液氮棉簽接觸腹主動(dòng)脈表面，持續(xù)[X]秒，造成血管內(nèi)皮損傷。隨后繼續(xù)正常飼養(yǎng)，觀察該損傷方式下兔血管組織中CyPA-CD147的表達(dá)情況。高脂飲食組：單純給予高脂飼料喂養(yǎng)（飼料配方同模型組），不進(jìn)行其他血管損傷操作，用于研究單純高脂飲食對兔血管組織中CyPA-CD147表達(dá)的影響。通過設(shè)置不同的處理組，旨在全面探究CyPA-CD147在不同因素誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化血管重構(gòu)過程中的表達(dá)變化，為深入研究其作用機(jī)制提供豐富的數(shù)據(jù)支持。4.1.2樣本采集血清采集：在實(shí)驗(yàn)開始第0周和第13周時(shí)，分別經(jīng)兔耳緣靜脈采集血液樣本3-5ml。采集后的血液樣本室溫靜置30-60分鐘，待血液凝固后，以3000-4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心10-15分鐘，分離上層血清。將血清轉(zhuǎn)移至無菌EP管中，保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)檢測血清中CyPA和CD147的表達(dá)水平。血清中CyPA和CD147的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法，該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。ELISA試劑盒選用市場上成熟的產(chǎn)品，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。首先，將血清樣本和標(biāo)準(zhǔn)品加入已包被特異性抗體的微孔板中，37℃溫育一定時(shí)間，使樣本中的CyPA或CD147與抗體充分結(jié)合。然后，洗滌微孔板，去除未結(jié)合的物質(zhì)。接著，加入酶標(biāo)記的二抗，37℃溫育，使二抗與結(jié)合在微孔板上的CyPA或CD147特異性結(jié)合。再次洗滌后，加入底物顯色劑，在酶的催化下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)。最后，用酶標(biāo)儀在特定波長下測定吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出血清中CyPA和CD147的濃度。血管組織采集：在術(shù)后13周，將兔子用過量戊巴比妥鈉經(jīng)耳緣靜脈注射進(jìn)行安樂死。迅速取出主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈等主要血管組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血液和雜質(zhì)。將血管組織分成兩部分，一部分用于免疫組織化學(xué)染色，將血管組織固定于4%多聚甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋，制作厚度為4-5μm的切片。免疫組織化學(xué)染色可直觀地觀察CyPA和CD147在血管組織中的定位和表達(dá)情況。染色過程中，先將切片脫蠟至水，然后進(jìn)行抗原修復(fù)。用正常山羊血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)后，加入一抗（抗CyPA抗體或抗CD147抗體），4℃孵育過夜。次日，洗滌切片，加入相應(yīng)的二抗，37℃孵育30-60分鐘。最后，用DAB顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明后封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，分析CyPA和CD147的陽性表達(dá)部位和強(qiáng)度。另一部分血管組織用于蛋白免疫印跡（WesternBlot）檢測，將血管組織剪碎后，加入適量的蛋白裂解液，冰上裂解30-60分鐘。然后，4℃、12000-14000轉(zhuǎn)/分鐘離心15-20分鐘，取上清液測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1-2小時(shí)。封閉后，加入一抗（抗CyPA抗體或抗CD147抗體），4℃孵育過夜。次日，洗滌PVDF膜，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。最后，用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照，分析CyPA和CD147蛋白的表達(dá)水平。4.2檢測方法4.2.1血清中CyPA和CD147水平檢測本研究采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清中CyPA和CD147的含量。ELISA法是一種基于抗原-抗體特異性結(jié)合原理的免疫檢測技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究中各種生物分子的定量檢測。其基本原理為：首先將特異性抗體包被在固相載體（如聚苯乙烯微孔板）表面，形成固相抗體。加入待檢測的血清樣本后，樣本中的CyPA或CD147會(huì)與固相抗體特異性結(jié)合。然后加入酶標(biāo)記的二抗，二抗與結(jié)合在固相抗體上的CyPA或CD147特異性結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。經(jīng)過徹底洗滌，去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入底物顯色劑。在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)，顏色的深淺與樣本中CyPA或CD147的含量呈正相關(guān)。最后，使用酶標(biāo)儀在特定波長下測定吸光度值，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計(jì)算出血清中CyPA和CD147的濃度。具體操作步驟如下：準(zhǔn)備工作：從冰箱中取出ELISA試劑盒，平衡至室溫（約20-25℃）。將所需的試劑（如標(biāo)準(zhǔn)品、樣本稀釋液、酶標(biāo)試劑、顯色劑、終止液等）從試劑盒中取出，恢復(fù)至室溫。同時(shí)，準(zhǔn)備好移液器、酶標(biāo)板、洗板機(jī)、酶標(biāo)儀等實(shí)驗(yàn)儀器，并確保儀器處于正常工作狀態(tài)。標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品，按照試劑盒說明書中的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法，在小試管中進(jìn)行系列稀釋，制備不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。例如，將原倍標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋成5個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，分別為高、中、低濃度以及兩個(gè)中間濃度，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。加樣：在酶標(biāo)包被板上分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣品孔?？瞻讓φ湛撞患訕悠芳懊笜?biāo)試劑，其余各步操作相同。在標(biāo)準(zhǔn)孔中準(zhǔn)確加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每孔50μl。在待測樣品孔中，先加入40μl樣品稀釋液，然后再加入10μl待測血清樣本，輕輕晃動(dòng)混勻，使樣品與稀釋液充分混合。加樣時(shí)應(yīng)將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量避免觸及孔壁，以減少誤差。溫育：用封板膜將酶標(biāo)板封好，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育30-60分鐘。溫育過程中，抗原-抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去孔內(nèi)液體，甩干。每孔加滿洗滌液，靜置30-60秒后棄去，如此重復(fù)洗滌5-6次。洗滌的目的是去除未結(jié)合的抗原、抗體及其他雜質(zhì)，減少非特異性反應(yīng)，提高檢測的準(zhǔn)確性。若使用洗板機(jī)，應(yīng)按照洗板機(jī)的操作規(guī)程進(jìn)行洗滌，設(shè)置合適的洗滌次數(shù)和洗滌時(shí)間，確保洗滌充分。加酶：每孔加入50μl酶標(biāo)試劑，空白孔除外。酶標(biāo)試劑中的酶標(biāo)記二抗能夠與免疫復(fù)合物特異性結(jié)合，為后續(xù)的顯色反應(yīng)提供催化作用。加酶時(shí)應(yīng)注意避免產(chǎn)生氣泡，確保酶標(biāo)試劑均勻加入各孔。溫育：再次用封板膜封板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育30-60分鐘，使酶標(biāo)二抗與免疫復(fù)合物充分結(jié)合。洗滌：重復(fù)步驟5的洗滌操作，確保徹底去除未結(jié)合的酶標(biāo)試劑。顯色：每孔先加入50μl顯色劑A，再加入50μl顯色劑B，輕輕震蕩混勻，避免產(chǎn)生氣泡。然后將酶標(biāo)板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中避光顯色15-20分鐘。在酶的催化下，顯色劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生有色產(chǎn)物，顏色的深淺與樣本中CyPA或CD147的含量成正比。終止：每孔加入50μl終止液，終止反應(yīng)。此時(shí)，溶液的顏色會(huì)立即發(fā)生變化，如從藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。終止液的作用是停止酶的催化反應(yīng)，使顯色反應(yīng)終止，以便準(zhǔn)確測定吸光度值。測定：以空白空調(diào)零，使用酶標(biāo)儀在特定波長（如450nm）下依次測量各孔的吸光度（OD）值。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘內(nèi)進(jìn)行，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。將測得的標(biāo)準(zhǔn)品OD值和待測樣品OD值記錄下來，用于后續(xù)的數(shù)據(jù)處理和分析。通過以上ELISA檢測方法，能夠準(zhǔn)確測定血清中CyPA和CD147的含量，為研究CyPA-CD147在兔動(dòng)脈粥樣硬化模型血管重構(gòu)中的作用提供重要的數(shù)據(jù)支持。4.2.2血管組織中CyPA和CD147表達(dá)檢測本研究采用免疫組織化學(xué)染色和Westernblot兩種方法檢測血管組織中CyPA和CD147的表達(dá)情況。這兩種方法從不同層面揭示了CyPA和CD147在血管組織中的表達(dá)水平和分布特征，為深入探究其在動(dòng)脈粥樣硬化血管重構(gòu)中的作用機(jī)制提供了重要依據(jù)。免疫組織化學(xué)染色是一種利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（如DAB、蘇木精等）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（如CyPA、CD147）的定位、定性及相對定量分析的技術(shù)。其具體操作步驟如下：組織固定與石蠟包埋：將采集的血管組織立即放入4%多聚甲醛溶液中固定，固定時(shí)間一般為12-24小時(shí)，以保持組織細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性，防止抗原降解。固定后的組織經(jīng)過脫水、透明等處理后，進(jìn)行石蠟包埋。石蠟包埋能夠使組織變硬，便于后續(xù)的切片制作。切片制備：使用切片機(jī)將石蠟包埋的組織切成厚度為4-5μm的切片。切片時(shí)應(yīng)保持切片的完整性和平整度，避免出現(xiàn)褶皺或破損。將切好的切片裱貼在載玻片上，60℃烤箱烤片1-2小時(shí)，使切片牢固附著在載玻片上。脫蠟至水：將載玻片放入二甲苯中浸泡10-15分鐘，進(jìn)行脫蠟處理，重復(fù)2-3次，以徹底去除石蠟。然后依次將載玻片放入不同濃度的乙醇溶液（如100%、95%、85%、75%）中進(jìn)行梯度水化，每個(gè)濃度浸泡3-5分鐘，使組織重新回到含水狀態(tài)。抗原修復(fù)：由于在組織固定和石蠟包埋過程中，抗原表位可能被封閉，因此需要進(jìn)行抗原修復(fù)。常用的抗原修復(fù)方法有高溫高壓法、微波修復(fù)法、酶消化法等。本研究采用高溫高壓法，將載玻片放入盛有抗原修復(fù)液（如檸檬酸鹽緩沖液）的修復(fù)盒中，置于高壓鍋中，加熱至沸騰后保持2-3分鐘，然后自然冷卻?？乖迯?fù)能夠暴露抗原表位，增強(qiáng)抗原與抗體的結(jié)合能力。封閉：將載玻片從抗原修復(fù)液中取出，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。然后在切片上滴加正常山羊血清，室溫孵育15-30分鐘，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景染色。一抗孵育：傾去正常山羊血清，不洗，直接在切片上滴加適量的一抗（抗CyPA抗體或抗CD147抗體）。一抗的稀釋度根據(jù)抗體說明書進(jìn)行調(diào)整，一般為1:100-1:500。將切片放入濕盒中，4℃孵育過夜。在孵育過程中，一抗與組織細(xì)胞內(nèi)的CyPA或CD147特異性結(jié)合。二抗孵育：次日，從冰箱中取出切片，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。然后在切片上滴加相應(yīng)的二抗（如羊抗兔IgG-HRP），室溫孵育30-60分鐘。二抗能夠與一抗特異性結(jié)合，形成抗原-抗體-二抗復(fù)合物。顯色：用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。然后在切片上滴加DAB顯色劑，室溫顯色3-10分鐘。在HRP酶的催化下，DAB發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生棕色沉淀，從而使抗原所在部位顯色。顯色過程中應(yīng)在顯微鏡下觀察，根據(jù)顯色情況控制顯色時(shí)間，避免顯色過深或過淺。復(fù)染：顯色結(jié)束后，用蒸餾水沖洗切片，終止顯色反應(yīng)。然后用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，染色時(shí)間一般為3-5分鐘。蘇木精能夠?qū)⒓?xì)胞核染成藍(lán)色，與DAB顯色的棕色形成鮮明對比，便于觀察。復(fù)染后，用鹽酸酒精分化液分化1-2秒，然后用自來水沖洗返藍(lán)。脫水、透明與封片：將切片依次放入不同濃度的乙醇溶液（如75%、85%、95%、100%）中進(jìn)行梯度脫水，每個(gè)濃度浸泡3-5分鐘。然后將切片放入二甲苯中透明2-3次，每次5-10分鐘。最后，在切片上滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片，進(jìn)行封片。封片后的切片可以長期保存，并在顯微鏡下觀察。結(jié)果觀察與分析：將封片后的切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，CyPA和CD147陽性表達(dá)部位呈現(xiàn)棕色，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色。觀察并記錄陽性染色的部位、強(qiáng)度和分布情況?？刹捎脠D像分析軟件（如Image-ProPlus）對陽性染色區(qū)域進(jìn)行定量分析，計(jì)算陽性面積百分比或平均光密度值，以評估CyPA和CD147在血管組織中的表達(dá)水平。Westernblot是一種用于檢測蛋白質(zhì)表達(dá)水平的常用技術(shù)，它結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和免疫印跡的高特異性，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行定性和半定量分析。其具體操作步驟如下：組織勻漿與蛋白提?。簩⒉杉难芙M織剪碎，放入預(yù)冷的勻漿器中，加入適量的蛋白裂解液（如RIPA裂解液，含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）。在冰上充分勻漿，使組織細(xì)胞破碎，釋放出蛋白質(zhì)。然后將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000-14000轉(zhuǎn)/分鐘離心15-20分鐘，取上清液即為總蛋白提取物。蛋白定量：采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白提取物的濃度。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，首先制備不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，然后將蛋白提取物和標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液分別加入96孔板中，加入BCA工作液，37℃孵育30-60分鐘。使用酶標(biāo)儀在562nm波長下測定吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白提取物的濃度。根據(jù)蛋白濃度，將蛋白提取物調(diào)整至合適的濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。SDS-PAGE電泳：根據(jù)蛋白分子量大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠進(jìn)行凝膠制備。將調(diào)整好濃度的蛋白樣品與上樣緩沖液（含SDS、β-巰基乙醇、溴酚藍(lán)等）混合，煮沸變性5-10分鐘，使蛋白質(zhì)完全變性并帶上負(fù)電荷。然后將變性后的蛋白樣品加入凝膠加樣孔中，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在電泳緩沖液中進(jìn)行電泳，先在80V電壓下電泳30-40分鐘，使蛋白樣品進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120-150V，繼續(xù)電泳1-2小時(shí)，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳過程中，蛋白質(zhì)根據(jù)分子量大小在凝膠中分離成不同的條帶。轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，將凝膠從電泳槽中取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15-20分鐘。同時(shí)，準(zhǔn)備好PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）和濾紙，將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其活化，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡。按照“濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙”的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，確保各層之間無氣泡。將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜儀中，在冰浴條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，一般采用恒流200-300mA轉(zhuǎn)膜1-2小時(shí)，使凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜從轉(zhuǎn)膜裝置中取出，用TBST緩沖液（含Tris、NaCl、Tween-20）沖洗3次，每次5分鐘。然后將PVDF膜放入含有5%脫脂牛奶的TBST緩沖液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。一抗孵育：傾去封閉液，不洗，直接將PVDF膜放入含有一抗（抗CyPA抗體或抗CD147抗體）的TBST緩沖液中，一抗的稀釋度根據(jù)抗體說明書進(jìn)行調(diào)整，一般為1:1000-1:5000。將PVDF膜放入搖床上，4℃孵育過夜。在孵育過程中，一抗與PVDF膜上的CyPA或CD147特異性結(jié)合。二抗孵育：次日，從冰箱中取出PVDF膜，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10-15分鐘。然后將PVDF膜放入含有相應(yīng)二抗（如羊抗兔IgG-HRP）的TBST緩沖液中，二抗的稀釋度一般為1:5000-1:10000。室溫孵育1-2小時(shí)，使二抗與一抗特異性結(jié)合，形成抗原-抗體-二抗復(fù)合物。顯色：用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10-15分鐘。然后在暗室中，將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光試劑（如ECL發(fā)光液）中孵育1-2分鐘，使HRP酶催化發(fā)光試劑產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。將PVDF膜取出，用濾紙吸干多余的發(fā)光試劑，放入凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光、拍照。結(jié)果分析：通過凝膠成像系統(tǒng)獲取的圖像，使用圖像分析軟件（如ImageJ）對蛋白條帶進(jìn)行分析。以β-actin等內(nèi)參蛋白作為對照，計(jì)算CyPA和CD147蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值，以該比值表示CyPA和CD147的相對表達(dá)水平。比較不同組之間CyPA和CD147的相對表達(dá)水平，分析其在動(dòng)脈粥樣硬化血管重構(gòu)過程中的表達(dá)變化情況。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果在血清中CyPA和CD147水平檢測方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在第0周時(shí)，對照組、模型組、液氮凍傷組、高脂飲食組兔血清中CyPA和CD147水平無顯著差異。到第13周時(shí)，模型組、液氮凍傷組、高脂飲食組血CyPA與CD147水平較同時(shí)期對照組均明顯升高（P＜0.05），尤以模型組為甚。具體數(shù)據(jù)為，對照組血清CyPA水平為（X1±SD1）ng/mL，CD147水平為（Y1±SD2）ng/mL；模型組血清CyPA水平升高至（X2±SD3）ng/mL，CD147水平升高至（Y2±SD4）ng/mL；液氮凍傷組血清CyPA水平為（X3±SD5）ng/mL，CD147水平為（Y3±SD6）ng/mL；高脂飲食組血清CyPA水平為（X4±SD7）ng/mL，CD147水平為（Y4±SD8）ng/mL。這表明在動(dòng)脈粥樣硬化模型構(gòu)建及相關(guān)損傷因素作用下，血清中CyPA和CD147水平顯著上升，且模型組由于同時(shí)采用高脂飲食和球囊損傷法，其升高幅度更為明顯，暗示CyPA和CD147可能參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程。血管組織中CyPA和CD147表達(dá)檢測結(jié)果如下：免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，對照組血管組織中CyPA和CD147僅有微弱表達(dá)，主要分布在內(nèi)皮細(xì)胞和少量平滑肌細(xì)胞中。除對照組外，其余3組均可見內(nèi)膜增生，模型組還可見典型AS斑塊形成。在模型組、液氮凍傷組和高脂飲食組中，斑塊內(nèi)及增生內(nèi)膜均可見CyPA及CD147的明顯表達(dá)。CyPA陽性染色主要位于巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，在斑塊的脂質(zhì)核心周圍的巨噬細(xì)胞中表達(dá)尤為強(qiáng)烈。CD147陽性染色主要分布在細(xì)胞膜上，在增生的內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及浸潤的炎癥細(xì)胞表面均有較高表達(dá)。通過圖像分析軟件對陽性染色區(qū)域進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示模型組、液氮凍傷組、高脂飲食組血管組織中CyPA和CD147的陽性面積百分比和平均光密度值較對照組均明顯增大（P＜0.05），且模型組的增加幅度最大。Westernblot檢測結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果一致。以β-actin為內(nèi)參，分析CyPA和CD147蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值，結(jié)果顯示模型組、液氮凍傷組、高脂飲食組血管組織中CyPA和CD147的相對表達(dá)水平較對照組均顯著升高（P＜0.05）。具體數(shù)據(jù)為，對照組CyPA相對表達(dá)水平為（A1±SD9），CD147相對表達(dá)水平為（B1±SD10）；模型組CyPA相對表達(dá)水平升高至（A2±SD11），CD147相對表達(dá)水平升高至（B2±SD12）；液氮凍傷組CyPA相對表達(dá)水平為（A3±SD13），CD147相對表達(dá)水平為（B3±SD14）；高脂飲食組CyPA相對表達(dá)水平為（A4±SD15），CD147相對表達(dá)水平為（B4±SD16）。這進(jìn)一步證實(shí)了在動(dòng)脈粥樣硬化血管重構(gòu)過程中，血管組織中CyPA和CD147的表達(dá)明顯上調(diào)，且模型組的上調(diào)程度最為顯著，提示CyPA-CD147在動(dòng)脈粥樣硬化血管重構(gòu)中可能發(fā)揮著重要作用。五、CyPA-CD147對兔動(dòng)脈粥樣硬化模型血管重構(gòu)的影響及機(jī)制探討5.1對血管重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)的影響通過對兔動(dòng)脈粥樣硬化模型血管組織的檢測分析，深入探究了CyPA-CD147表達(dá)變化與血管重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，CyPA-CD147的表達(dá)變化與血管最小管腔直徑、管腔面積、內(nèi)膜面積、中膜面積等指標(biāo)的改變存在顯著相關(guān)性。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組、液氮凍傷組、高脂飲食組最小管腔直徑及管腔面積較對照組均明顯減?。≒＜0.05），內(nèi)膜面積、中膜面積、最大內(nèi)膜厚度、管腔狹窄度較對照組明顯增大（P＜0.05）。這表明在動(dòng)脈粥樣硬化模型及相關(guān)損傷因素作用下，血管發(fā)生了明顯的重構(gòu)，管腔出現(xiàn)狹窄，內(nèi)膜和中膜增厚。進(jìn)一步分析CyPA-CD147的表達(dá)與這些指標(biāo)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CyPA-CD147表達(dá)水平越高，血管最小管腔直徑和管腔面積減小越明顯，內(nèi)膜面積、中膜面積、最大內(nèi)膜厚度和管腔狹窄度增大越顯著。例如，模型組由于同時(shí)采用高脂飲食和球囊損傷法，CyPA-CD147表達(dá)水平升高最為明顯，其血管最小管腔直徑和管腔面積減小幅度最大，內(nèi)膜面積、中膜面積、最大內(nèi)膜厚度和管腔狹窄度增大幅度也最大。這提示CyPA-CD147可能通過某種機(jī)制促進(jìn)了血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，導(dǎo)致內(nèi)膜和中膜增厚，管腔狹窄，從而參與了動(dòng)脈粥樣硬化血管重構(gòu)過程。從細(xì)胞生物學(xué)角度來看，CyPA-CD147相互作用可能通過多種途徑影響血管重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)。一方面，CyPA作為一種促炎性細(xì)胞因子，與CD147結(jié)合后，可激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、核因子κB（NF-κB）通路等。這些信號(hào)通路的激活會(huì)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的趨化、黏附和活化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。炎癥細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子和生長因子，如血小板衍生生長因子（PDGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）等，可刺激血管平滑肌細(xì)胞從收縮型表型轉(zhuǎn)化為合成型表型。合成型平滑肌細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖和遷移能力，它們大量合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、彈性蛋白等，導(dǎo)致內(nèi)膜和中膜增厚，管腔面積減小。另一方面，CD147作為CyPA的受體，其高表達(dá)可促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的釋放和表達(dá)上調(diào)。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)