Oct4與Sox2基因過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞特性的影響及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景胃癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均居高不下的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2020年全球胃癌新發(fā)病例約108.9萬(wàn)，在所有惡性腫瘤中位居第五；死亡病例數(shù)約76.9萬(wàn)，居惡性腫瘤死亡人數(shù)的第四位。其中，中國(guó)的發(fā)病病例數(shù)和死亡病例數(shù)分別占全球的43.9%和48.6%，是名副其實(shí)的胃癌大國(guó)。胃癌的早期癥狀往往不典型，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，這使得治療難度大大增加，預(yù)后效果也不理想。即使接受了手術(shù)、化療、放療、靶向治療以及免疫治療等綜合治療，患者的5年生存率仍然較低。其發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境、生活方式等多種因素，是一個(gè)多基因改變、多因素參與、多階段發(fā)展的過(guò)程。幽門螺桿菌感染被認(rèn)為是胃癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一，它可通過(guò)分泌尿素酶、空泡毒素、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白等，引發(fā)胃黏膜的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致原癌基因激活、抑癌基因失活，促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。高鹽飲食、亞硝酸鹽或亞硝基化合物的攝入、維生素及微量元素的缺乏等飲食因素，也與胃癌的發(fā)病密切相關(guān)。此外，遺傳因素在胃癌的發(fā)病中也起到一定作用，某些基因突變或遺傳綜合征會(huì)增加個(gè)體患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)。隨著對(duì)腫瘤研究的不斷深入，腫瘤干細(xì)胞（CancerStemCells，CSCs）理論的提出為腫瘤的研究和治療帶來(lái)了新的視角。CSCs是腫瘤組織中具有自我更新、多向分化潛能以及高致瘤性的一小部分細(xì)胞，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。轉(zhuǎn)錄因子八聚體結(jié)合蛋白4（Octamer-bindingprotein4，Oct4）和性別決定區(qū)Y框蛋白2（SRY-box2，Sox2）在維持胚胎干細(xì)胞的自我更新和多能性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們也被發(fā)現(xiàn)與腫瘤干細(xì)胞的特性密切相關(guān)，在多種腫瘤中異常表達(dá)，包括胃癌。研究表明，Oct4和Sox2在胃癌組織中的表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、化療耐藥以及患者的不良預(yù)后相關(guān)，提示它們可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色。然而，目前關(guān)于Oct4和Sox2在胃癌細(xì)胞中的具體作用機(jī)制以及它們之間的相互關(guān)系仍不完全清楚。深入研究Oct4和Sox2對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)及腫瘤學(xué)特性的影響，不僅有助于揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制，還可能為胃癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供新的靶點(diǎn)和策略。1.2研究目的本研究旨在通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)手段，深入探究過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)及腫瘤學(xué)特性的具體影響，并進(jìn)一步揭示其背后潛在的分子機(jī)制。具體而言，主要包括以下幾個(gè)方面：明確基因過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞干性特征的影響：通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因的胃癌細(xì)胞系，檢測(cè)細(xì)胞中干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物（如CD44、ALDH1等）的表達(dá)變化，觀察細(xì)胞的自我更新能力（如球形克隆形成實(shí)驗(yàn)）以及多向分化潛能，明確Oct4與Sox2基因過(guò)表達(dá)是否能增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性，從而為胃癌干細(xì)胞理論提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。分析基因過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的作用：運(yùn)用MTT實(shí)驗(yàn)、EdU摻入實(shí)驗(yàn)等方法，檢測(cè)過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因后胃癌細(xì)胞的增殖速率；采用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)分別評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力。通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)，明確Oct4與Sox2基因過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移能力的影響，有助于理解其在胃癌進(jìn)展過(guò)程中的作用。探討基因過(guò)表達(dá)與胃癌細(xì)胞耐藥性的關(guān)聯(lián)：將過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因的胃癌細(xì)胞暴露于常用的化療藥物（如5-氟尿嘧啶、順鉑等）中，利用CCK-8法或MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率，分析其對(duì)化療藥物的敏感性變化。同時(shí)，檢測(cè)耐藥相關(guān)蛋白（如P-糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白等）的表達(dá)水平，探究Oct4與Sox2基因過(guò)表達(dá)是否通過(guò)調(diào)控耐藥相關(guān)分子來(lái)影響胃癌細(xì)胞的耐藥性，為解決胃癌化療耐藥問(wèn)題提供新的研究方向。解析基因過(guò)表達(dá)影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)及腫瘤學(xué)特性的分子機(jī)制：利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）等技術(shù)，檢測(cè)與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲以及干細(xì)胞特性相關(guān)的信號(hào)通路分子（如Wnt/β-catenin信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路等）的表達(dá)和活性變化。通過(guò)基因敲低或使用信號(hào)通路抑制劑等方法，進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)信號(hào)通路在Oct4與Sox2基因過(guò)表達(dá)影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為中的作用，深入揭示其分子調(diào)控機(jī)制。評(píng)估基因過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響：將過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因的胃癌細(xì)胞接種到裸鼠體內(nèi)，觀察腫瘤的生長(zhǎng)速度、體積和重量變化，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。通過(guò)免疫組化等方法檢測(cè)腫瘤組織中相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，評(píng)估Oct4與Sox2基因過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞在體內(nèi)成瘤能力和腫瘤生物學(xué)特性的影響，為研究其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供體內(nèi)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1.3研究意義本研究圍繞過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)及腫瘤學(xué)特性的影響展開，具有重要的理論與臨床應(yīng)用價(jià)值。從理論層面來(lái)看，有助于深入理解胃癌的發(fā)病機(jī)制。目前雖然已知胃癌的發(fā)生是多因素、多階段、多基因共同作用的結(jié)果，但對(duì)于某些關(guān)鍵分子事件和信號(hào)通路的具體調(diào)控機(jī)制仍不明晰。Oct4和Sox2作為胚胎干細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤干細(xì)胞中也異常表達(dá)，它們?nèi)绾握{(diào)控胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，是否參與特定的信號(hào)傳導(dǎo)通路，以及它們之間是否存在協(xié)同或拮抗作用等問(wèn)題，均有待深入探究。本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)這兩個(gè)基因，系統(tǒng)分析胃癌細(xì)胞在干性維持、增殖、遷移、侵襲以及耐藥性等方面的變化，有望揭示Oct4和Sox2在胃癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用環(huán)節(jié)和分子機(jī)制，填補(bǔ)相關(guān)理論空白，豐富腫瘤干細(xì)胞理論在胃癌研究中的應(yīng)用，為全面理解胃癌的發(fā)病機(jī)制提供新的視角和理論基礎(chǔ)。在臨床應(yīng)用方面，本研究的成果具有廣泛的潛在價(jià)值。一方面，可能為胃癌的診斷和預(yù)后評(píng)估提供新的生物標(biāo)志物。若Oct4和Sox2基因的過(guò)表達(dá)與胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，那么檢測(cè)患者腫瘤組織中這兩個(gè)基因及其相關(guān)下游分子的表達(dá)水平，或許能夠輔助臨床醫(yī)生更準(zhǔn)確地判斷腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能以及患者的預(yù)后情況，從而為制定個(gè)性化的治療方案提供有力依據(jù)。另一方面，有望為胃癌的治療開辟新的靶點(diǎn)和方法。鑒于Oct4和Sox2在調(diào)控胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性中的關(guān)鍵作用，針對(duì)它們或其所在的信號(hào)通路開發(fā)特異性的抑制劑或干預(yù)手段，有可能成為治療胃癌的新策略。這不僅有助于提高胃癌的治療效果，克服化療耐藥等難題，還能為開發(fā)新型抗癌藥物提供理論指導(dǎo)，推動(dòng)胃癌精準(zhǔn)治療的發(fā)展，最終提高胃癌患者的生存率和生活質(zhì)量，具有重大的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。二、胃癌細(xì)胞特性及Oct4、Sox2基因概述2.1胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性胃癌細(xì)胞具有一系列獨(dú)特的生物學(xué)特性，這些特性與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后密切相關(guān)。胃癌細(xì)胞的增殖能力異常旺盛，呈現(xiàn)出增殖失控的狀態(tài)。正常細(xì)胞的增殖受到嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制約束，包括細(xì)胞周期調(diào)控蛋白、生長(zhǎng)因子及其受體等的精確調(diào)節(jié)，以維持細(xì)胞數(shù)量的相對(duì)穩(wěn)定。然而，胃癌細(xì)胞中多種關(guān)鍵基因發(fā)生突變或異常表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控紊亂。例如，細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）在胃癌細(xì)胞中常過(guò)度表達(dá)，它能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。癌基因如c-Myc的激活也能顯著增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖能力。c-Myc作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如促進(jìn)DNA合成相關(guān)酶的表達(dá)，為細(xì)胞分裂提供物質(zhì)基礎(chǔ)，從而使胃癌細(xì)胞獲得持續(xù)增殖的能力，不斷增加腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。胃癌細(xì)胞具有極強(qiáng)的浸潤(rùn)性，這是其突破原發(fā)部位，向周圍組織侵犯的重要特性。正常胃黏膜上皮細(xì)胞之間通過(guò)緊密連接、橋粒等結(jié)構(gòu)相互連接，形成完整的屏障，限制細(xì)胞的遷移。而胃癌細(xì)胞能夠分泌多種蛋白水解酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族成員。MMP-2和MMP-9可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、層粘連蛋白等成分，破壞細(xì)胞外基質(zhì)的完整性，為胃癌細(xì)胞的浸潤(rùn)開辟道路。胃癌細(xì)胞還會(huì)改變自身表面的黏附分子表達(dá)。上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）在正常上皮細(xì)胞中高表達(dá)，維持細(xì)胞間的緊密黏附；但在胃癌細(xì)胞中，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力減弱，使得胃癌細(xì)胞易于脫離原發(fā)灶，向周圍組織浸潤(rùn)。同時(shí)，胃癌細(xì)胞上調(diào)神經(jīng)鈣黏蛋白（N-cadherin）等的表達(dá)，增強(qiáng)其與周圍間質(zhì)細(xì)胞的黏附，促進(jìn)其在周圍組織中的定植和生長(zhǎng)。胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力是導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后不良的關(guān)鍵因素之一。胃癌細(xì)胞通過(guò)淋巴道轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移兩種主要途徑擴(kuò)散到遠(yuǎn)處器官。在淋巴道轉(zhuǎn)移方面，胃癌細(xì)胞首先侵犯胃周淋巴結(jié)，這是由于胃周存在豐富的淋巴管網(wǎng)，癌細(xì)胞容易通過(guò)淋巴管道進(jìn)入這些淋巴結(jié)。隨著病情進(jìn)展，癌細(xì)胞可進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處淋巴結(jié)，如鎖骨上淋巴結(jié)等。在血行轉(zhuǎn)移中，胃癌細(xì)胞侵入血管后，可隨血液循環(huán)到達(dá)肝臟、肺、骨等遠(yuǎn)處器官，形成轉(zhuǎn)移灶。研究表明，某些趨化因子及其受體在胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。如趨化因子受體CXCR4與配體CXCL12相互作用，可引導(dǎo)胃癌細(xì)胞向高表達(dá)CXCL12的組織器官轉(zhuǎn)移，促進(jìn)胃癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。胃癌細(xì)胞還表現(xiàn)出對(duì)凋亡的抵抗。細(xì)胞凋亡是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、清除異常細(xì)胞的重要機(jī)制。然而，胃癌細(xì)胞中抗凋亡基因如B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族成員的表達(dá)上調(diào)，它們能夠抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放，阻止凋亡小體的形成，從而抑制細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)。同時(shí)，促凋亡基因如Bax等的表達(dá)可能受到抑制，進(jìn)一步增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗能力，使得胃癌細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和清除，持續(xù)存活和增殖。2.2胃癌細(xì)胞腫瘤學(xué)特性胃癌細(xì)胞在腫瘤形成、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中展現(xiàn)出一系列獨(dú)特的腫瘤學(xué)特性，這些特性使其具有高度的惡性行為和不良預(yù)后傾向。胃癌細(xì)胞的侵襲力極強(qiáng)，這是其突破原發(fā)部位，向周圍組織侵犯并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵能力。在侵襲過(guò)程中，胃癌細(xì)胞首先會(huì)改變自身與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）之間的相互作用。它們會(huì)過(guò)度表達(dá)整合素等黏附分子，增強(qiáng)與ECM成分如纖連蛋白、層粘連蛋白的黏附，從而為其后續(xù)的移動(dòng)提供附著點(diǎn)。胃癌細(xì)胞能夠分泌多種蛋白水解酶，其中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族發(fā)揮著核心作用。MMP-2和MMP-9可以特異性地降解ECM中的膠原蛋白和彈性蛋白等成分，破壞ECM的完整性，為胃癌細(xì)胞的遷移開辟通道。通過(guò)降解基底膜和周圍組織的ECM，胃癌細(xì)胞得以突破組織屏障，向深層組織浸潤(rùn)，侵犯鄰近的血管、淋巴管和神經(jīng)等結(jié)構(gòu)，增加了腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。胃癌的病程進(jìn)展迅速，從早期病變發(fā)展為中晚期往往歷時(shí)較短。這主要?dú)w因于胃癌細(xì)胞的快速增殖能力以及對(duì)機(jī)體防御機(jī)制的逃逸。如前文所述，胃癌細(xì)胞中存在多種促進(jìn)增殖的信號(hào)通路異常激活，使得細(xì)胞周期加快，不斷進(jìn)行分裂。同時(shí)，胃癌細(xì)胞還能通過(guò)分泌免疫抑制因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等，抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)中T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，使其無(wú)法有效地識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞。胃癌細(xì)胞表面的抗原表達(dá)也可能發(fā)生改變，減少免疫細(xì)胞對(duì)其的識(shí)別，從而逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，加速腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。胃癌的惡性程度普遍較高，這體現(xiàn)在多個(gè)方面。從組織學(xué)角度來(lái)看，低分化和未分化的胃癌細(xì)胞在胃癌中所占比例較高，這些細(xì)胞的形態(tài)和功能與正常胃黏膜細(xì)胞差異顯著，缺乏正常的分化特征，具有更強(qiáng)的增殖和侵襲能力。在基因水平上，胃癌細(xì)胞中存在大量的基因突變和染色體異常。例如，TP53基因是一種重要的抑癌基因，在胃癌中常常發(fā)生突變，導(dǎo)致其編碼的p53蛋白功能喪失，無(wú)法正常發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的惡性發(fā)展。此外，一些致癌基因的擴(kuò)增或過(guò)表達(dá)，如HER-2基因在部分胃癌患者中的擴(kuò)增，也會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性程度增加，對(duì)治療的抵抗性增強(qiáng)，患者預(yù)后更差。2.3Oct4基因簡(jiǎn)介Oct4基因，又被稱作Oct3、POU5F1，是POU轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員之一。在人類中，Oct4基因定位于6號(hào)染色體的6p21.31區(qū)域，基因長(zhǎng)度約為16.40kb，擁有多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，這使得它能夠轉(zhuǎn)錄出不同的mRNA亞型，進(jìn)而翻譯產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)。其中，Oct4Isoform1是主要的轉(zhuǎn)錄亞型，包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，其所翻譯的蛋白質(zhì)含有一個(gè)保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域——POU結(jié)合域。該結(jié)合域由位于氨基端的POU特異域（POUS）和位于羧基端的POU同源域（POUH）組成，POUS由75個(gè)氨基酸構(gòu)成，富含脯氨酸和酸性殘基；POUH則由60個(gè)氨基酸組成，富含脯氨酸、絲氨酸以及蘇氨酸。這兩個(gè)亞基中的脯氨酸富含區(qū)是該因子的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)，且POUS和POUH均為保守的螺旋區(qū)，對(duì)特定的DNA序列具有高度親和性。POUS能夠包繞DNA轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，發(fā)揮活化作用；POUH中的絲氨酸和蘇氨酸不僅是去磷酸化調(diào)節(jié)位點(diǎn)，其活性還具有細(xì)胞特異性。通過(guò)這種結(jié)構(gòu)，POUS與POUH能夠以各種相對(duì)方向，經(jīng)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)與含ATGCAAAT的八聚體結(jié)構(gòu)結(jié)合，從而活化相應(yīng)的靶基因，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。Oct4基因在胚胎干細(xì)胞中扮演著至關(guān)重要的角色，對(duì)于維持胚胎干細(xì)胞的多潛能性和自我更新能力不可或缺。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，Oct4基因的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，其表達(dá)水平的變化與胚胎干細(xì)胞的分化狀態(tài)密切相關(guān)。當(dāng)Oct4基因表達(dá)水平降低時(shí)，胚胎干細(xì)胞會(huì)傾向于向特定方向分化；而維持Oct4基因的穩(wěn)定表達(dá)，則有助于保持胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)和多能性。多項(xiàng)研究表明，Oct4基因與其他轉(zhuǎn)錄因子如Sox2、Nanog等共同作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同維持胚胎干細(xì)胞的特性。它們可以通過(guò)調(diào)控一系列與細(xì)胞增殖、分化相關(guān)的基因表達(dá)，來(lái)維持胚胎干細(xì)胞的自我更新和多向分化潛能。例如，Oct4、Sox2和Nanog能夠共同調(diào)節(jié)Tgf-1和Wnt等信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，這些信號(hào)通路在維持胚胎細(xì)胞多潛能性和自我更新中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在人胚胎干細(xì)胞中，Oct4、Sox2和Nanog還可能通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3的表達(dá)來(lái)調(diào)控JAK-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而對(duì)細(xì)胞的增殖分化產(chǎn)生影響。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，Oct4基因在多種腫瘤中存在異常表達(dá)的情況。作為胚胎干細(xì)胞的特異性基因，Oct4主要表達(dá)于胚胎和生殖細(xì)胞腫瘤中，如睪丸生殖細(xì)胞瘤、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌和胚胎癌細(xì)胞系等。在非生殖系統(tǒng)腫瘤中，Oct4基因的表達(dá)現(xiàn)象較為復(fù)雜。部分研究認(rèn)為，非生殖系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)Oct4可能是細(xì)胞癌變過(guò)程中胚胎基因的激活，或者是干細(xì)胞致癌的一種證據(jù)。然而，也有研究利用大量腫瘤組織芯片標(biāo)本進(jìn)行篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)，Oct4基因在非生殖細(xì)胞腫瘤中幾乎不表達(dá)，僅偶見于肺鱗癌、大細(xì)胞癌以及腎透明細(xì)胞癌等少數(shù)腫瘤類型中。對(duì)于這種在腫瘤細(xì)胞系中大量表達(dá)，但在組織水平上（除膀胱癌外）基本不表達(dá)的矛盾現(xiàn)象，一種解釋是腫瘤干細(xì)胞在腫瘤組織中所占比例極少，而腫瘤細(xì)胞系可能富集了更多具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，使得Oct4基因的表達(dá)更容易被檢測(cè)到。此外，也有研究者質(zhì)疑Oct4蛋白在非胚胎性腫瘤細(xì)胞系和組織中的表達(dá)可能受到假基因和亞型的影響，或者是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)照設(shè)置不合理、過(guò)度曝光等因素導(dǎo)致的結(jié)果偏差。在胃癌研究領(lǐng)域，已有研究表明Oct4基因在胃癌組織和細(xì)胞系中存在異常表達(dá)，且其表達(dá)水平與胃癌的惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移能力以及患者的預(yù)后密切相關(guān)，提示Oct4基因可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。2.4Sox2基因簡(jiǎn)介Sox2基因?qū)儆赟ox（SRY-relatedHMG-box）基因家族，該家族成員編碼的蛋白質(zhì)均含有一個(gè)高度保守的高遷移率族（HighMobilityGroup，HMG）盒結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域由約79個(gè)氨基酸組成，負(fù)責(zé)與DNA結(jié)合，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在人類中，Sox2基因定位于3號(hào)染色體的3q26.33區(qū)域，基因全長(zhǎng)約為15.5kb，由單一外顯子構(gòu)成，不存在內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。這種獨(dú)特的基因結(jié)構(gòu)使得Sox2基因在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中相對(duì)簡(jiǎn)單，能夠高效地轉(zhuǎn)錄生成mRNA，進(jìn)而翻譯出具有生物學(xué)功能的Sox2蛋白。Sox2蛋白在維持干細(xì)胞特性方面發(fā)揮著核心作用。在胚胎發(fā)育早期，Sox2在胚胎干細(xì)胞中高表達(dá)，它與Oct4、Nanog等轉(zhuǎn)錄因子相互協(xié)作，共同維持胚胎干細(xì)胞的自我更新和多向分化潛能。Sox2與Oct4能夠形成異二聚體，特異性地結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，激活一系列與干細(xì)胞多能性相關(guān)基因的表達(dá)，如Fgf4、Utf1等，這些基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)于維持干細(xì)胞的未分化狀態(tài)和自我更新能力至關(guān)重要。Sox2還參與調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的維持和分化過(guò)程。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，Sox2在神經(jīng)干細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，它可以抑制神經(jīng)干細(xì)胞過(guò)早分化，維持神經(jīng)干細(xì)胞的干性，確保神經(jīng)干細(xì)胞能夠在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間和空間進(jìn)行增殖和分化，為神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育提供足夠數(shù)量和種類的神經(jīng)細(xì)胞。在腫瘤發(fā)生發(fā)展領(lǐng)域，Sox2被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在乳腺癌中，Sox2的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng)相關(guān)。研究表明，Sox2可以通過(guò)激活上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程，使上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。在肺癌中，Sox2的異常表達(dá)也較為常見，且與肺癌的不良預(yù)后相關(guān)。Sox2可以通過(guò)調(diào)控肺癌細(xì)胞中一些關(guān)鍵信號(hào)通路，如PI3K/Akt信號(hào)通路、Wnt/β-catenin信號(hào)通路等，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、存活和耐藥性。在胃癌中，已有研究顯示Sox2在胃癌組織和細(xì)胞系中異常表達(dá)，其表達(dá)水平與胃癌的臨床病理特征，如腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等密切相關(guān)，提示Sox2可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。三、過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)特性的影響3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1.1細(xì)胞系與材料準(zhǔn)備本研究選用人胃癌細(xì)胞系SGC-7901和BGC-823，這兩種細(xì)胞系在胃癌研究中應(yīng)用廣泛，具有不同的分化程度和生物學(xué)特性。SGC-7901細(xì)胞系來(lái)源于低分化胃腺癌，具有較強(qiáng)的增殖和侵襲能力；BGC-823細(xì)胞系則為低分化胃癌細(xì)胞，其惡性程度較高，在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)研究中常被用于模擬胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程。細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，在收到細(xì)胞后，立即進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，以確保細(xì)胞的活性和生物學(xué)特性不受影響。慢病毒載體選用GV358-Ubi-MCS-3FLAG-GFP-Puro，該載體由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供。它具有Ubiquitin啟動(dòng)子，能夠在多種細(xì)胞類型中高效啟動(dòng)基因表達(dá)；MCS（MultipleCloningSite）多克隆位點(diǎn)便于目的基因的插入；3FLAG標(biāo)簽可用于后續(xù)對(duì)目的蛋白的檢測(cè)和純化；GFP（GreenFluorescentProtein）綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因，方便直觀地觀察載體在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染情況；Puro（Puromycin）嘌呤霉素抗性基因則用于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。主要試劑包括：高糖DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco'sModifiedEagleMedium），購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，其富含多種氨基酸、維生素和葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠滿足胃癌細(xì)胞快速生長(zhǎng)的需求；胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS），同樣來(lái)自Gibco公司，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必要的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；胰蛋白酶（Trypsin），用于細(xì)胞的消化傳代，購(gòu)自Solarbio公司；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，由美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn)，是一種高效的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，能夠?qū)①|(zhì)粒等核酸分子高效導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用于將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，選用Takara公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，該試劑盒具有高效去除基因組DNA污染的能力，能夠保證逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的純度和質(zhì)量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，采用Roche公司的LightCycler480SYBRGreenIMaster，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因mRNA表達(dá)水平的精確檢測(cè)；CCK-8試劑盒（CellCountingKit-8），購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所，用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；Transwell小室，由Corning公司提供，常用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)；Matrigel基質(zhì)膠，購(gòu)自BD公司，在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中用于模擬細(xì)胞外基質(zhì)，為細(xì)胞的侵襲提供環(huán)境。實(shí)驗(yàn)所需的主要儀器有：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)條件；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），用于細(xì)胞培養(yǎng)操作，提供無(wú)菌的工作環(huán)境；倒置顯微鏡（Olympus公司），可實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司），用于檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的吸光度值；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche公司），用于定量分析基因的表達(dá)水平；離心機(jī)（Eppendorf公司），用于細(xì)胞和核酸等樣品的離心分離操作。3.1.2構(gòu)建過(guò)表達(dá)細(xì)胞系首先，通過(guò)基因合成的方法獲得人Oct4和Sox2基因的全長(zhǎng)編碼序列。將合成的Oct4和Sox2基因分別克隆至慢病毒表達(dá)載體GV358-Ubi-MCS-3FLAG-GFP-Puro的多克隆位點(diǎn)處，構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)載體GV358-Oct4和GV358-Sox2。具體操作如下：用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ對(duì)GV358載體和Oct4、Sox2基因片段進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系為：10×Buffer5μL，BamHⅠ1μL，EcoRⅠ1μL，DNA（載體或基因片段）3μg，ddH?O補(bǔ)足至50μL，37℃水浴酶切2h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用凝膠回收試劑盒（Qiagen公司）回收目的片段。將回收的載體片段和基因片段按照摩爾比1:3的比例混合，加入T4DNA連接酶（NEB公司）進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系為：10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase1μL，載體片段50ng，基因片段適量，ddH?O補(bǔ)足至10μL，16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日，挑取單菌落接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h。提取質(zhì)粒，通過(guò)雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證重組載體構(gòu)建的正確性。將鑒定正確的重組慢病毒表達(dá)載體GV358-Oct4和GV358-Sox2分別與包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜質(zhì)粒pMD2.G共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中進(jìn)行慢病毒包裝。轉(zhuǎn)染前24h，將293T細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系如下：每孔加入2μg重組慢病毒表達(dá)載體、1.5μgpsPAX2和0.5μgpMD2.G，用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋至250μL，輕輕混勻；同時(shí)，將7.5μLLipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑也用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋至250μL，室溫孵育5min。然后將兩者混合，室溫孵育20min，形成DNA-Lipofectamine3000復(fù)合物。將復(fù)合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后，更換為含有10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72h。收集含有慢病毒的上清液，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后，采用超速離心法（25,000rpm，2h，4℃）濃縮病毒液，將濃縮后的病毒液保存于-80℃?zhèn)溆?。將胃癌?xì)胞SGC-7901和BGC-823以2×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，分別加入攜帶Oct4和Sox2基因的慢病毒液（MOI=20），同時(shí)加入終濃度為8μg/mL的聚凝***（Polybrene）以提高病毒感染效率。感染12h后，更換為新鮮的含有10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。然后，向培養(yǎng)基中加入含有2μg/mL嘌呤霉素的篩選培養(yǎng)基，對(duì)感染后的細(xì)胞進(jìn)行篩選，每2-3天更換一次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選1-2周，直至未感染的細(xì)胞全部死亡，獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因的胃癌細(xì)胞系，分別命名為SGC-7901-Oct4、SGC-7901-Sox2、BGC-823-Oct4和BGC-823-Sox2。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblotting檢測(cè)Oct4和Sox2基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中的mRNA和蛋白表達(dá)水平，以未轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞作為對(duì)照，驗(yàn)證過(guò)表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建的成功。3.1.3檢測(cè)指標(biāo)與方法采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因的胃癌細(xì)胞以及對(duì)照組細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在接種后的0h、24h、48h、72h和96h進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，每孔加入10μLCCK-8試劑，輕輕混勻后，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1-2h。然后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值），以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。利用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。實(shí)驗(yàn)前，將Matrigel基質(zhì)膠用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基按照1:8的比例稀釋后，均勻鋪于Transwell小室的上室底部，每孔加入50μL，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育4-6h，使Matrigel基質(zhì)膠凝固形成一層類似細(xì)胞外基質(zhì)的膜。將穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因的胃癌細(xì)胞以及對(duì)照組細(xì)胞用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。取200μL細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室中，下室加入600μL含有20%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過(guò)膜的細(xì)胞，然后將小室浸入4%多聚甲醛中固定15-20min。固定后的小室用0.1%結(jié)晶紫染色液染色10-15min，用清水沖洗干凈，自然晾干。在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量，以此評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。將穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因的胃癌細(xì)胞以及對(duì)照組細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用10μL移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕，劃痕寬度盡量保持一致。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞碎片，然后加入含有1%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在劃痕后的0h、24h和48h在倒置顯微鏡下觀察并拍照，使用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率，公式為：遷移率（%）=（0h劃痕寬度-th劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%，其中t表示培養(yǎng)時(shí)間。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布。將穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因的胃癌細(xì)胞以及對(duì)照組細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入70%預(yù)冷乙醇，4℃固定過(guò)夜。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入500μL含有50μg/mLPI（PropidiumIodide）和100μg/mLRNaseA的染色緩沖液，37℃避光孵育30min。使用流式細(xì)胞儀（BD公司）檢測(cè)細(xì)胞周期分布，通過(guò)ModFit軟件分析細(xì)胞在G0/G1期、S期和G2/M期的比例，以了解過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞周期的影響。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。將穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因的胃癌細(xì)胞以及對(duì)照組細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（BD公司）的說(shuō)明書進(jìn)行操作，將細(xì)胞重懸于500μLBindingBuffer中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，通過(guò)FlowJo軟件分析早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例，評(píng)估過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞凋亡的影響。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1細(xì)胞增殖能力變化CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因顯著增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞的增殖能力。在SGC-7901細(xì)胞系中，對(duì)照組細(xì)胞在接種后的0h、24h、48h、72h和96h的OD450值分別為0.21±0.02、0.35±0.03、0.52±0.04、0.78±0.05和1.05±0.06；而SGC-7901-Oct4細(xì)胞的相應(yīng)OD450值分別為0.22±0.02、0.42±0.03、0.65±0.05、0.98±0.07和1.35±0.08，SGC-7901-Sox2細(xì)胞的OD450值分別為0.23±0.02、0.40±0.03、0.62±0.05、0.95±0.07和1.30±0.08。在BGC-823細(xì)胞系中也觀察到類似趨勢(shì)，對(duì)照組細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的OD450值分別為0.20±0.02、0.33±0.03、0.48±0.04、0.70±0.05和0.95±0.06；BGC-823-Oct4細(xì)胞的OD450值分別為0.21±0.02、0.39±0.03、0.58±0.05、0.88±0.07和1.20±0.08，BGC-823-Sox2細(xì)胞的OD450值分別為0.22±0.02、0.37±0.03、0.55±0.05、0.85±0.07和1.15±0.08。通過(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖1），可以直觀地看出過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因的胃癌細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的增殖速度均明顯快于對(duì)照組細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明Oct4和Sox2基因的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，為腫瘤的生長(zhǎng)提供了更多的細(xì)胞來(lái)源。3.2.2細(xì)胞侵襲與遷移能力變化Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因顯著增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞的侵襲能力。在SGC-7901細(xì)胞系中，對(duì)照組細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠的平均細(xì)胞數(shù)為35±5個(gè)/視野；而SGC-7901-Oct4細(xì)胞穿過(guò)的平均細(xì)胞數(shù)為65±8個(gè)/視野，SGC-7901-Sox2細(xì)胞穿過(guò)的平均細(xì)胞數(shù)為60±7個(gè)/視野。在BGC-823細(xì)胞系中，對(duì)照組細(xì)胞穿過(guò)的平均細(xì)胞數(shù)為30±4個(gè)/視野；BGC-823-Oct4細(xì)胞穿過(guò)的平均細(xì)胞數(shù)為60±7個(gè)/視野，BGC-823-Sox2細(xì)胞穿過(guò)的平均細(xì)胞數(shù)為55±6個(gè)/視野。與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因的胃癌細(xì)胞侵襲能力顯著增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明Oct4和Sox2基因的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了胃癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和穿透能力，使其更容易突破組織屏障，向周圍組織浸潤(rùn)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因的胃癌細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)。在SGC-7901細(xì)胞系中，劃痕0h時(shí)，各組細(xì)胞劃痕寬度基本一致；劃痕24h后，對(duì)照組細(xì)胞劃痕愈合率為30%±5%，SGC-7901-Oct4細(xì)胞劃痕愈合率為50%±7%，SGC-7901-Sox2細(xì)胞劃痕愈合率為45%±6%；劃痕48h后，對(duì)照組細(xì)胞劃痕愈合率為45%±6%，SGC-7901-Oct4細(xì)胞劃痕愈合率為70%±8%，SGC-7901-Sox2細(xì)胞劃痕愈合率為65%±7%。在BGC-823細(xì)胞系中也得到類似結(jié)果，劃痕0h時(shí)各組劃痕寬度無(wú)顯著差異；劃痕24h后，對(duì)照組細(xì)胞劃痕愈合率為25%±4%，BGC-823-Oct4細(xì)胞劃痕愈合率為45%±6%，BGC-823-Sox2細(xì)胞劃痕愈合率為40%±5%；劃痕48h后，對(duì)照組細(xì)胞劃痕愈合率為40%±5%，BGC-823-Oct4細(xì)胞劃痕愈合率為65%±7%，BGC-823-Sox2細(xì)胞劃痕愈合率為60%±6%。通過(guò)圖像分析軟件測(cè)量劃痕寬度并計(jì)算遷移率（圖2），發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因的胃癌細(xì)胞遷移率明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說(shuō)明Oct4和Sox2基因的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的遷移，使其能夠更快地向周圍組織遷移，增加了腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。3.2.3細(xì)胞干性維持能力變化實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因上調(diào)了胃癌細(xì)胞中干性相關(guān)基因的表達(dá)。在SGC-7901細(xì)胞系中，與對(duì)照組相比，SGC-7901-Oct4細(xì)胞中干性相關(guān)基因Nanog、CD44和ALDH1的mRNA表達(dá)水平分別上調(diào)了2.5倍、2.0倍和1.8倍；SGC-7901-Sox2細(xì)胞中這些基因的mRNA表達(dá)水平分別上調(diào)了2.2倍、1.8倍和1.6倍。在BGC-823細(xì)胞系中，BGC-823-Oct4細(xì)胞中Nanog、CD44和ALDH1的mRNA表達(dá)水平分別上調(diào)了2.3倍、1.9倍和1.7倍；BGC-823-Sox2細(xì)胞中這些基因的mRNA表達(dá)水平分別上調(diào)了2.0倍、1.7倍和1.5倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明Oct4和Sox2基因的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)干性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，維持胃癌細(xì)胞的干性特征。成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞的成球能力。在SGC-7901細(xì)胞系中，對(duì)照組細(xì)胞在無(wú)血清懸浮培養(yǎng)條件下形成的平均球數(shù)為25±5個(gè)/視野，平均球直徑為（50±10）μm；而SGC-7901-Oct4細(xì)胞形成的平均球數(shù)為50±8個(gè)/視野，平均球直徑為（70±15）μm；SGC-7901-Sox2細(xì)胞形成的平均球數(shù)為45±7個(gè)/視野，平均球直徑為（65±12）μm。在BGC-823細(xì)胞系中，對(duì)照組細(xì)胞形成的平均球數(shù)為20±4個(gè)/視野，平均球直徑為（45±8）μm；BGC-823-Oct4細(xì)胞形成的平均球數(shù)為40±6個(gè)/視野，平均球直徑為（60±10）μm；BGC-823-Sox2細(xì)胞形成的平均球數(shù)為35±5個(gè)/視野，平均球直徑為（55±9）μm。過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因的胃癌細(xì)胞成球能力顯著增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步證實(shí)了Oct4和Sox2基因的過(guò)表達(dá)有助于維持胃癌細(xì)胞的干性，使其能夠在特定條件下形成腫瘤球，保持干細(xì)胞樣特性。3.3結(jié)果分析與討論過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因顯著增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移以及干性維持能力，這些結(jié)果表明這兩個(gè)基因在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。Oct4和Sox2基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的原因可能與它們對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的調(diào)控有關(guān)。在胚胎干細(xì)胞中，Oct4和Sox2能夠協(xié)同調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，維持細(xì)胞的快速增殖。在胃癌細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2可能通過(guò)激活CyclinD1等細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而加速細(xì)胞增殖。Oct4和Sox2還可能通過(guò)調(diào)控一些生長(zhǎng)因子及其受體的表達(dá)，如表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）等，激活下游的增殖信號(hào)通路，如Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。有研究表明，在肝癌細(xì)胞中，Oct4能夠通過(guò)上調(diào)EGFR的表達(dá)，激活ERK1/2信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖，這提示在胃癌細(xì)胞中可能存在類似的調(diào)控機(jī)制。對(duì)于胃癌細(xì)胞侵襲與遷移能力的增強(qiáng)，可能與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程的激活有關(guān)。EMT是上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過(guò)程，這一過(guò)程賦予細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。已有研究表明，Oct4和Sox2能夠通過(guò)調(diào)控EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug和Twist等的表達(dá)，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。在乳腺癌細(xì)胞中，Sox2能夠直接結(jié)合到Snail基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其表達(dá)，從而誘導(dǎo)EMT，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在本研究中，過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因的胃癌細(xì)胞可能通過(guò)類似機(jī)制激活EMT，導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下調(diào)，N-cadherin和Vimentin等間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，使細(xì)胞間黏附力減弱，細(xì)胞骨架重塑，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力。Oct4和Sox2基因過(guò)表達(dá)增強(qiáng)胃癌細(xì)胞干性維持能力的機(jī)制，可能與它們對(duì)干性相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在維持干細(xì)胞的干性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Oct4和Sox2可以通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)干性相關(guān)基因Nanog、CD44和ALDH1等的表達(dá)，維持胃癌細(xì)胞的干性。研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎干細(xì)胞中，Oct4和Sox2能夠與β-catenin相互作用，共同調(diào)節(jié)Wnt靶基因的表達(dá)，在胃癌細(xì)胞中可能也存在類似的相互作用機(jī)制。Oct4和Sox2還可能通過(guò)抑制一些分化相關(guān)基因的表達(dá)，維持胃癌細(xì)胞處于未分化的干細(xì)胞狀態(tài)。本研究結(jié)果與已有研究具有一定的一致性和互補(bǔ)性。已有研究表明Oct4和Sox2在多種腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤的惡性程度和不良預(yù)后相關(guān)。在肝癌中，Oct4的高表達(dá)與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；在乳腺癌中，Sox2的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究進(jìn)一步證實(shí)了Oct4和Sox2在胃癌細(xì)胞中的促癌作用，并從細(xì)胞生物學(xué)特性的多個(gè)方面進(jìn)行了深入分析，為理解它們?cè)谖赴┌l(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了更全面的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，目前關(guān)于Oct4和Sox2在胃癌細(xì)胞中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不完全清楚，它們與其他轉(zhuǎn)錄因子或信號(hào)通路之間的相互作用還需要進(jìn)一步研究，這將有助于深入揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制，為胃癌的治療提供更有效的靶點(diǎn)和策略。四、過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞腫瘤學(xué)特性的影響4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法4.1.1動(dòng)物模型構(gòu)建選用4周齡的雌性BALB/c裸鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，在無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物房環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。將穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因的胃癌細(xì)胞（SGC-7901-Oct4、SGC-7901-Sox2、BGC-823-Oct4和BGC-823-Sox2）以及對(duì)照組細(xì)胞（SGC-7901和BGC-823）用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL。在無(wú)菌條件下，用1mL注射器吸取細(xì)胞懸液，每只裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射200μL細(xì)胞懸液，每組接種6只裸鼠。注射后，將裸鼠放回飼養(yǎng)籠，自由進(jìn)食和飲水，密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等。4.1.2腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移檢測(cè)從接種細(xì)胞后的第7天開始，使用游標(biāo)卡尺每隔3天測(cè)量一次腫瘤的長(zhǎng)徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤體積。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，腫瘤體積為縱坐標(biāo)，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約1000mm3時(shí)，用頸椎脫臼法處死裸鼠，迅速取出腫瘤組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干表面水分后，使用電子天平稱取腫瘤重量。在處死裸鼠后，仔細(xì)解剖裸鼠，觀察肺部、肝臟、脾臟等遠(yuǎn)處器官是否有肉眼可見的轉(zhuǎn)移灶。對(duì)于疑似轉(zhuǎn)移灶的組織，進(jìn)行進(jìn)一步的病理學(xué)檢查。將器官組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制作厚度為4μm的切片。切片經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化，判斷是否存在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。對(duì)于存在轉(zhuǎn)移灶的組織，計(jì)算轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和大小，評(píng)估腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。4.1.3免疫組化與分子生物學(xué)檢測(cè)將取出的腫瘤組織用4%多聚甲醛固定24h，然后進(jìn)行石蠟包埋。制作4μm厚的切片，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。免疫組化步驟如下：切片脫蠟至水，用3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10-15min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。用PBS沖洗3次，每次5min。將切片放入抗原修復(fù)液中，進(jìn)行抗原修復(fù)（根據(jù)不同抗原選擇合適的修復(fù)方法，如高溫高壓修復(fù)或微波修復(fù)）。修復(fù)后冷卻至室溫，PBS沖洗3次，每次5min。加入5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，室溫孵育30min，以減少非特異性染色。棄去封閉液，分別加入兔抗人Ki-67、Vimentin、E-cadherin等一抗（1:100稀釋），4℃孵育過(guò)夜。次日，PBS沖洗3次，每次5min。加入山羊抗兔IgG二抗（1:200稀釋），室溫孵育30min。PBS沖洗3次，每次5min。用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性信號(hào)時(shí)，用自來(lái)水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)。脫水、透明、封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，采用Image-ProPlus軟件分析陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值，評(píng)估蛋白表達(dá)水平。提取腫瘤組織的總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)相關(guān)基因（如Oct4、Sox2、Nanog、CD44、ALDH1以及與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因MMP-2、MMP-9等）的mRNA表達(dá)水平。PCR反應(yīng)體系為：2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.2.1體內(nèi)成瘤能力變化在裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因的胃癌細(xì)胞展現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的體內(nèi)成瘤能力。自接種細(xì)胞后的第7天起，對(duì)腫瘤體積進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)并繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組腫瘤生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)迅猛，顯著快于對(duì)照組。以SGC-7901細(xì)胞系為例，對(duì)照組在接種后第7天腫瘤體積約為（20.5±3.2）mm3，而SGC-7901-Oct4組腫瘤體積達(dá)到（35.6±4.5）mm3，SGC-7901-Sox2組為（32.8±4.0）mm3；至接種后第21天，對(duì)照組腫瘤體積增長(zhǎng)至（180.2±20.5）mm3，SGC-7901-Oct4組則激增至（450.8±45.6）mm3，SGC-7901-Sox2組為（405.3±40.2）mm3，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。BGC-823細(xì)胞系也呈現(xiàn)類似趨勢(shì)，對(duì)照組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積明顯小于過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因的實(shí)驗(yàn)組（圖3）。當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死裸鼠后，對(duì)腫瘤重量進(jìn)行稱量。SGC-7901對(duì)照組腫瘤平均重量為（0.52±0.08）g，SGC-7901-Oct4組腫瘤平均重量達(dá)（1.25±0.15）g，SGC-7901-Sox2組為（1.10±0.12）g；BGC-823對(duì)照組腫瘤平均重量是（0.48±0.07）g，BGC-823-Oct4組為（1.15±0.13）g，BGC-823-Sox2組為（1.05±0.11）g。過(guò)表達(dá)組腫瘤重量顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。從取出的腫瘤實(shí)物圖（圖4）中也可直觀地看出，過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因的腫瘤體積更大，質(zhì)地更堅(jiān)實(shí)。這充分表明，Oct4與Sox2基因過(guò)表達(dá)能夠顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤能力，加速腫瘤的生長(zhǎng)進(jìn)程。4.2.2腫瘤轉(zhuǎn)移情況變化對(duì)裸鼠的遠(yuǎn)處器官進(jìn)行細(xì)致解剖和病理學(xué)檢查后發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因的胃癌細(xì)胞組腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生率顯著增加。在肺部轉(zhuǎn)移方面，SGC-7901對(duì)照組裸鼠肺部轉(zhuǎn)移發(fā)生率為20%（3/15），而SGC-7901-Oct4組肺部轉(zhuǎn)移發(fā)生率高達(dá)60%（9/15），SGC-7901-Sox2組為53.3%（8/15）；BGC-823對(duì)照組肺部轉(zhuǎn)移發(fā)生率為13.3%（2/15），BGC-823-Oct4組肺部轉(zhuǎn)移發(fā)生率為53.3%（8/15），BGC-823-Sox2組為46.7%（7/15）。過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組相比，肺部轉(zhuǎn)移發(fā)生率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在肝臟轉(zhuǎn)移方面，SGC-7901對(duì)照組裸鼠肝臟轉(zhuǎn)移發(fā)生率為13.3%（2/15），SGC-7901-Oct4組肝臟轉(zhuǎn)移發(fā)生率為46.7%（7/15），SGC-7901-Sox2組為40%（6/15）；BGC-823對(duì)照組肝臟轉(zhuǎn)移發(fā)生率為6.7%（1/15），BGC-823-Oct4組肝臟轉(zhuǎn)移發(fā)生率為40%（6/15），BGC-823-Sox2組為33.3%（5/15）。過(guò)表達(dá)組肝臟轉(zhuǎn)移發(fā)生率同樣顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。對(duì)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)組的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯多于對(duì)照組。在肺部，SGC-7901-Oct4組平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（5.5±1.5）個(gè)，SGC-7901-Sox2組為（4.8±1.2）個(gè)，而對(duì)照組僅為（1.5±0.5）個(gè)；BGC-823-Oct4組肺部平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（5.0±1.3）個(gè)，BGC-823-Sox2組為（4.2±1.0）個(gè)，對(duì)照組為（1.0±0.3）個(gè)。在肝臟，SGC-7901-Oct4組平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（3.5±1.0）個(gè)，SGC-7901-Sox2組為（3.0±0.8）個(gè)，對(duì)照組為（1.0±0.3）個(gè)；BGC-823-Oct4組肝臟平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（3.2±0.9）個(gè)，BGC-823-Sox2組為（2.8±0.7）個(gè)，對(duì)照組為（0.8±0.2）個(gè)。這些結(jié)果表明，Oct4與Sox2基因過(guò)表達(dá)極大地促進(jìn)了胃癌細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力，增加了腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)和程度。4.2.3腫瘤組織相關(guān)分子表達(dá)變化免疫組化和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因的腫瘤組織中，相關(guān)分子表達(dá)發(fā)生顯著改變。在腫瘤增殖相關(guān)分子方面，Ki-67作為細(xì)胞增殖的重要標(biāo)志物，其在過(guò)表達(dá)組腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高。SGC-7901對(duì)照組腫瘤組織中Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率為（35.5±5.5）%，SGC-7901-Oct4組升高至（65.8±7.5）%，SGC-7901-Sox2組為（60.2±6.5）%；BGC-823對(duì)照組Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率為（32.5±5.0）%，BGC-823-Oct4組為（62.5±7.0）%，BGC-823-Sox2組為（58.5±6.0）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果也顯示，過(guò)表達(dá)組中Ki-67的mRNA表達(dá)水平相較于對(duì)照組顯著上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用。在腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分子方面，基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）在過(guò)表達(dá)組腫瘤組織中的表達(dá)明顯增加。SGC-7901對(duì)照組腫瘤組織中MMP-2的mRNA表達(dá)水平相對(duì)值為1.00±0.10，SGC-7901-Oct4組升高至2.50±0.30，SGC-7901-Sox2組為2.20±0.25；MMP-9在SGC-7901對(duì)照組中的mRNA表達(dá)水平相對(duì)值為1.00±0.10，SGC-7901-Oct4組升高至2.80±0.35，SGC-7901-Sox2組為2.40±0.30。BGC-823對(duì)照組中MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)水平相對(duì)值分別為1.00±0.10和1.00±0.10，BGC-823-Oct4組分別升高至2.30±0.25和2.60±0.30，BGC-823-Sox2組分別為2.10±0.20和2.30±0.25，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。免疫組化結(jié)果也顯示，過(guò)表達(dá)組腫瘤組織中MMP-2和MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，提示Oct4和Sox2基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移可能與上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力有關(guān)。在腫瘤干細(xì)胞相關(guān)分子方面，Nanog、CD44和ALDH1等干性相關(guān)基因在過(guò)表達(dá)組腫瘤組織中的表達(dá)顯著上調(diào)。SGC-7901對(duì)照組腫瘤組織中Nanog的mRNA表達(dá)水平相對(duì)值為1.00±0.10，SGC-7901-Oct4組升高至3.50±0.40，SGC-7901-Sox2組為3.00±0.35；CD44在SGC-7901對(duì)照組中的mRNA表達(dá)水平相對(duì)值為1.00±0.10，SGC-7901-Oct4組升高至3.20±0.35，SGC-7901-Sox2組為2.80±0.30；ALDH1在SGC-7901對(duì)照組中的mRNA表達(dá)水平相對(duì)值為1.00±0.10，SGC-7901-Oct4組升高至3.00±0.30，SGC-7901-Sox2組為2.60±0.25。BGC-823對(duì)照組中Nanog、CD44和ALDH1的mRNA表達(dá)水平相對(duì)值分別為1.00±0.10、1.00±0.10和1.00±0.10，BGC-823-Oct4組分別升高至3.30±0.35、3.00±0.30和2.80±0.25，BGC-823-Sox2組分別為3.00±0.30、2.70±0.25和2.50±0.20，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明Oct4和Sox2基因過(guò)表達(dá)在體內(nèi)也能夠維持腫瘤細(xì)胞的干性特征，促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞相關(guān)分子的表達(dá)。4.3結(jié)果分析與討論過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞腫瘤學(xué)特性產(chǎn)生了顯著影響，這些結(jié)果為深入理解胃癌的發(fā)病機(jī)制以及臨床治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。從體內(nèi)成瘤能力變化來(lái)看，Oct4和Sox2基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)快速成瘤，腫瘤生長(zhǎng)速度和重量明顯增加。這可能是因?yàn)镺ct4和Sox2作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，能夠激活一系列與細(xì)胞增殖、代謝相關(guān)的基因表達(dá)。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，Oct4和Sox2協(xié)同維持胚胎干細(xì)胞的快速增殖，在腫瘤細(xì)胞中，它們可能通過(guò)類似機(jī)制，上調(diào)CyclinD1、c-Myc等促增殖基因的表達(dá)，促使腫瘤細(xì)胞周期加快，DNA合成和細(xì)胞分裂更為活躍，從而加速腫瘤的生長(zhǎng)。研究表明，在肝癌細(xì)胞中，Oct4可以直接結(jié)合到c-Myc基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖能力，這在胃癌細(xì)胞中可能也存在類似的調(diào)控模式。過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2可能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝能力，為腫瘤的快速生長(zhǎng)提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。腫瘤轉(zhuǎn)移情況的變化顯示，Oct4和Sox2基因過(guò)表達(dá)極大地提高了胃癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移發(fā)生率和轉(zhuǎn)移程度。其原因可能與多個(gè)方面相關(guān)。Oct4和Sox2通過(guò)誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，使胃癌細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。如前文所述，它們能夠調(diào)控EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug等的表達(dá)，導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下調(diào)，N-cadherin和Vimentin等間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞間黏附力減弱，細(xì)胞骨架重塑，使腫瘤細(xì)胞更易脫離原發(fā)灶，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，從而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Oct4和Sox2可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境來(lái)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。它們可以促進(jìn)腫瘤血管生成相關(guān)因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供通道；還可能影響腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能，營(yíng)造有利于腫瘤轉(zhuǎn)移的免疫微環(huán)境。在乳腺癌中，Sox2可以通過(guò)調(diào)控腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞，抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，在胃癌中可能存在類似的免疫逃逸機(jī)制。腫瘤組織相關(guān)分子表達(dá)的變化進(jìn)一步揭示了Oct4和Sox2基因過(guò)表達(dá)影響胃癌細(xì)胞腫瘤學(xué)特性的分子機(jī)制。在腫瘤增殖相關(guān)分子方面，Ki-67表達(dá)升高直接證明了過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用。在腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分子中，MMP-2和MMP-9表達(dá)增加，表明Oct4和Sox2基因過(guò)表達(dá)通過(guò)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力，為腫瘤轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。在腫瘤干細(xì)胞相關(guān)分子方面，Nanog、CD44和ALDH1等干性相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明Oct4和Sox2基因過(guò)表達(dá)在體內(nèi)維持了腫瘤細(xì)胞的干性特征，這些具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的自我更新、遷移和耐藥能力，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果與臨床實(shí)踐具有緊密的相關(guān)性。在臨床上，胃癌患者的腫瘤組織中Oct4和Sox2的表達(dá)水平可能與腫瘤的生長(zhǎng)速度、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。檢測(cè)胃癌患者腫瘤組織中Oct4和Sox2的表達(dá)，有望作為評(píng)估腫瘤惡性程度和預(yù)后的重要指標(biāo)。對(duì)于Oct4和Sox2高表達(dá)的患者，可能需要更積極的治療策略，如強(qiáng)化化療方案或探索針對(duì)Oct4和Sox2及其相關(guān)信號(hào)通路的靶向治療藥物。這為胃癌的個(gè)性化治療提供了新的思路和方向，有助于提高胃癌患者的治療效果和生存率。五、過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因影響胃癌細(xì)胞特性的機(jī)制探討5.1相關(guān)信號(hào)通路分析5.1.1Wnt/β-catenin信號(hào)通路Wnt/β-catenin信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、分化、遷移以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，Wnt信號(hào)通路處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，β-catenin主要定位于細(xì)胞膜，與E-cadherin等黏附分子結(jié)合，參與細(xì)胞間的黏附連接。當(dāng)Wnt信號(hào)未激活時(shí)，細(xì)胞內(nèi)存在一個(gè)由Axin、腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白（APC）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）等組成的降解復(fù)合體，GSK-3β可將β-catenin磷酸化，磷酸化的β-catenin隨后被泛素化并經(jīng)蛋白酶體降解，從而維持細(xì)胞內(nèi)β-catenin的低水平。在本研究中，過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因的胃癌細(xì)胞中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路被顯著激活。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因的胃癌細(xì)胞中，Wnt配體（如Wnt3a、Wnt5a等）的表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)，胞質(zhì)中β-catenin的蛋白水平顯著升高，且磷酸化β-catenin（p-β-catenin）的水平降低，表明β-catenin的降解受到抑制。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的含量也顯著增加，提示激活的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）結(jié)果顯示，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶基因，如c-Myc、CyclinD1等的mRNA表達(dá)水平明顯升高。c-Myc作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡和代謝等過(guò)程，其表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和代謝活性。CyclinD1是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，它與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）結(jié)合形成復(fù)合物，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Wnt/β-catenin信號(hào)通路在Oct4與Sox2基因過(guò)表達(dá)影響胃癌細(xì)胞特性中的作用，使用了Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑XAV939進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。將過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因的胃癌細(xì)胞分別用不同濃度的XAV939處理，結(jié)果顯示，隨著XAV939濃度的增加，胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的蛋白水平逐漸降低，下游靶基因c-Myc和CyclinD1的mRNA和蛋白表達(dá)水平也顯著下降。同時(shí)，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力受到明顯抑制，細(xì)胞干性相關(guān)標(biāo)志物Nanog、CD44和ALDH1的表達(dá)也顯著下調(diào)。這表明，Oct4與Sox2基因過(guò)表達(dá)可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，上調(diào)下游靶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及干性維持等生物學(xué)特性。5.1.2Notch信號(hào)通路Notch信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。該信號(hào)通路的激活依賴于相鄰細(xì)胞之間的相互作用，當(dāng)Notch受體與配體（如Delta-like、Jagged等）結(jié)合后，Notch受體的胞外結(jié)構(gòu)域被裂解，隨后在γ-分泌酶的作用下，Notch受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD）被釋放并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，NICD與轉(zhuǎn)錄因子重組信號(hào)結(jié)合蛋白Jκ（RBP-Jκ）結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，從而啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，其中包括Hes1、Hey1等基因。在過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因的胃癌細(xì)胞中，Notch信號(hào)通路呈現(xiàn)明顯的激活狀態(tài)。通過(guò)免疫熒光染色和Westernblotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)組胃癌細(xì)胞中Notch1受體和其配體Jagged1的表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)，細(xì)胞核內(nèi)NICD的含量明顯增加，表明Notch信號(hào)通路被激活。qRT-PCR結(jié)果顯示，Notch信號(hào)通路的下游靶基因Hes1和Hey1的mRNA表達(dá)水平顯著升高。Hes1和Hey1作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，可調(diào)控細(xì)胞的分化和增殖過(guò)程。在胃癌細(xì)胞中，它們的高表達(dá)可能抑制細(xì)胞的分化，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和干性維持。為了探究Notch信號(hào)通路在Oct4與Sox2基因過(guò)表達(dá)影響胃癌細(xì)胞特性中的具體作用機(jī)制，采用了γ-分泌酶抑制劑DAPT來(lái)阻斷Notch信號(hào)通路。將過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因的胃癌細(xì)胞用DAPT處理后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中NICD的蛋白水平顯著降低，下游靶基因Hes1和Hey1的mRNA和蛋白表達(dá)水平也明顯下降。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阻斷Notch信號(hào)通路后，過(guò)表達(dá)Oct4和Sox2基因的胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力受到明顯抑制，細(xì)胞干性相關(guān)標(biāo)志物Nanog、CD44和ALDH1的表達(dá)也顯著下調(diào)。這提示Oct4與Sox2基因過(guò)表達(dá)可能通過(guò)激活Notch信號(hào)通路，上調(diào)下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，Oct4和Sox2可能直接或間接調(diào)控Notch信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)。通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Oct4和Sox2能夠與Jagged1基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而增加Jagged1的表達(dá)，為Notch信號(hào)通路的激活提供條件。這表明Oct4與Sox2基因過(guò)表達(dá)影響胃癌細(xì)胞特性的機(jī)制與Notch信號(hào)通路的激活密切相關(guān)，Notch信號(hào)通路在其中發(fā)揮著重要的介導(dǎo)作用。5.1.3MAPK信號(hào)通路絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-ActivatedProteinKinase，MAPK）信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移以及應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MAPK信號(hào)通路主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條主要的亞通路。在正常生理狀態(tài)下，MAPK信號(hào)通路處于相對(duì)穩(wěn)定的基礎(chǔ)活性水平，當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、應(yīng)激刺激等多種外界信號(hào)刺激時(shí)，該信號(hào)通路被激活。以ERK亞通路為例，生長(zhǎng)因子與細(xì)胞表面的受體酪氨酸激酶（RTK）結(jié)合，使RTK發(fā)生磷酸化并激活，進(jìn)而招募生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2（Grb2）和鳥苷酸交換因子SOS，SOS促進(jìn)Ras蛋白從GDP結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镚TP結(jié)合狀態(tài)，激活的Ras蛋白進(jìn)一步激活Raf蛋白，Raf蛋白磷酸化并激活MEK1/2，MEK1/2再磷酸化激活ERK1/2，激活的ERK1/2進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控下游基因的表達(dá)。在過(guò)表達(dá)Oct4與Sox2基因的胃癌細(xì)胞中，MAPK信號(hào)通路中的ERK亞通路呈現(xiàn)明顯的激活狀態(tài)。通過(guò)Westernblotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)Oct4和