B7-H3基因免疫聯(lián)合沉默Id-1基因治療惡性黑色素瘤：機(jī)制、療效與展望一、引言1.1研究背景惡性黑色素瘤（malignantmelanoma，MM）是一種起源于黑色素細(xì)胞的高度侵襲性腫瘤，是人類第五大常見腫瘤，在皮膚癌相關(guān)死亡中占據(jù)首要地位。近年來，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)顯著上升趨勢，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)美國癌癥協(xié)會數(shù)據(jù)顯示，僅2023年美國就新增約10.8萬例黑色素瘤患者，死亡人數(shù)超7000人。在亞洲，雖然發(fā)病率相對較低，但增長速度不容小覷，如中國，過去幾十年間黑色素瘤發(fā)病率以每年3%-5%的速度遞增。早期黑色素瘤（原位癌和Ⅰ期）通過手術(shù)切除，根治率可達(dá)90%以上。然而，約75%的患者確診時已處于中晚期（Ⅱ、Ⅲ期和Ⅳ期），此時腫瘤常已發(fā)生淋巴或血液轉(zhuǎn)移，根治難度極大。Ⅲ期和Ⅳ期患者5年生存率僅為60%左右，晚期患者中位生存期甚至不足1年。傳統(tǒng)治療手段，如手術(shù)、化療和放療，雖在一定程度上控制病情，但難以徹底清除腫瘤細(xì)胞，復(fù)發(fā)率高。近年來興起的免疫治療和靶向治療，雖顯著改善部分患者預(yù)后，但仍面臨耐藥、免疫逃逸等問題，整體療效不盡人意。腫瘤是多因素、多環(huán)節(jié)、多階段的復(fù)雜疾病，單一治療難以根除?；蛑委熥鳛樾屡d領(lǐng)域，通過改變腫瘤細(xì)胞或機(jī)體免疫細(xì)胞基因，調(diào)節(jié)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸相關(guān)信號通路，為黑色素瘤治療帶來新希望。B7-H3基因和Id-1基因在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色。B7-H3是B7家族重要免疫調(diào)節(jié)分子，在黑色素瘤等多種腫瘤高表達(dá)，參與免疫逃逸。研究表明，B7-H3通過與未知受體結(jié)合，抑制T細(xì)胞活化和增殖，削弱機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)。沉默Id-1基因可顯著抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Id-1基因編碼螺旋-環(huán)-螺旋（HLH）轉(zhuǎn)錄因子，參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、血管生成和轉(zhuǎn)移?；诖?，本研究提出B7-H3基因免疫聯(lián)合沉默Id-1基因治療惡性黑色素瘤新策略。期望通過增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫和抑制癌基因表達(dá)協(xié)同作用，克服單一治療局限，提高黑色素瘤治療效果，為患者提供更有效治療方案，具有重要理論和臨床意義。1.2研究目的本研究旨在深入探究B7-H3基因免疫聯(lián)合沉默Id-1基因?qū)盒院谏亓龅闹委熜Ч⒔沂酒錆撛谧饔脵C(jī)制。具體而言，將從以下幾個關(guān)鍵方面展開研究：構(gòu)建并鑒定基因載體：成功構(gòu)建攜帶B7-H3基因的腺病毒表達(dá)載體以及攜帶Id-1短發(fā)夾RNA（shRNA）的慢病毒表達(dá)載體，通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)，如PCR、測序、蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等，對載體的正確性和表達(dá)效率進(jìn)行精確鑒定，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可靠性。評估聯(lián)合治療的抑瘤效果：在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法）、細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)（如Transwell實(shí)驗(yàn)），觀察聯(lián)合治療對黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。在體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)方面，構(gòu)建惡性黑色素瘤小鼠模型，隨機(jī)分為聯(lián)合治療組、B7-H3基因免疫單治療組、沉默Id-1基因單治療組和對照組，密切監(jiān)測腫瘤生長情況，測量腫瘤體積和重量，統(tǒng)計(jì)小鼠生存時間，全面評估聯(lián)合治療在體內(nèi)的抑瘤效果。探究聯(lián)合治療對腫瘤免疫微環(huán)境的影響：利用流式細(xì)胞術(shù)分析腫瘤組織中免疫細(xì)胞（如CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）的比例和功能變化，通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測腫瘤組織中細(xì)胞因子（如干擾素-γ、白細(xì)胞介素-2、腫瘤壞死因子-α等）的表達(dá)水平，深入探究聯(lián)合治療對腫瘤免疫微環(huán)境的重塑作用。揭示聯(lián)合治療的作用機(jī)制：通過蛋白質(zhì)免疫印跡、實(shí)時熒光定量PCR等技術(shù)，檢測與腫瘤增殖、凋亡、遷移、侵襲相關(guān)的信號通路分子（如PI3K/AKT、MAPK、Wnt/β-catenin等）的表達(dá)和磷酸化水平，明確聯(lián)合治療影響黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的內(nèi)在分子機(jī)制。同時，借助基因編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9）敲除或過表達(dá)相關(guān)基因，驗(yàn)證信號通路在聯(lián)合治療中的關(guān)鍵作用。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，隨著對腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，基因治療作為一種新興的治療手段，在惡性黑色素瘤的治療研究中取得了顯著進(jìn)展。B7-H3基因免疫治療和沉默Id-1基因治療作為兩種極具潛力的基因治療策略，分別從免疫調(diào)節(jié)和癌基因抑制的角度，為黑色素瘤的治療提供了新的思路和方法，國內(nèi)外眾多科研團(tuán)隊(duì)圍繞這兩個靶點(diǎn)展開了廣泛而深入的研究。在B7-H3基因免疫治療方面，國外研究起步較早，取得了一系列重要成果。美國的科研團(tuán)隊(duì)率先發(fā)現(xiàn)B7-H3在多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，且與腫瘤的免疫逃逸密切相關(guān)。通過構(gòu)建B7-H3基因修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗，在小鼠黑色素瘤模型中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示能夠有效激活機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，顯著抑制腫瘤生長。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，B7-H3基因免疫治療可促進(jìn)腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞的浸潤和活化，增強(qiáng)其對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，同時上調(diào)腫瘤微環(huán)境中干擾素-γ、白細(xì)胞介素-2等細(xì)胞因子的表達(dá)水平，營造一個有利于抗腫瘤免疫的微環(huán)境。歐洲的研究人員則聚焦于B7-H3的分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制，通過晶體結(jié)構(gòu)解析技術(shù)，深入探究B7-H3與受體結(jié)合的分子機(jī)制，為開發(fā)特異性的B7-H3抑制劑提供了理論基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，他們研發(fā)出一種新型的B7-H3單克隆抗體，在體外實(shí)驗(yàn)中能夠有效阻斷B7-H3與受體的結(jié)合，恢復(fù)T細(xì)胞的活性，增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視功能。在黑色素瘤的臨床前研究中，該單克隆抗體聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物，表現(xiàn)出協(xié)同增效的作用，顯著提高了腫瘤的治療效果。國內(nèi)對于B7-H3基因免疫治療的研究也不甘落后，取得了諸多創(chuàng)新性成果。山東大學(xué)的科研團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了攜帶小鼠B7-H3基因的腺病毒表達(dá)載體（pAd.B7-H3），并在小鼠惡性黑色素瘤模型中進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，pAd.B7-H3轉(zhuǎn)染組細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）殺傷活性顯著增強(qiáng)，與未轉(zhuǎn)染組和pAd.CMV轉(zhuǎn)染組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明該載體可以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，有效抑制腫瘤生長。此外，國內(nèi)還有團(tuán)隊(duì)致力于B7-H3基因免疫治療的聯(lián)合策略研究，將B7-H3基因免疫與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合應(yīng)用，在黑色素瘤小鼠模型中取得了良好的治療效果，進(jìn)一步驗(yàn)證了B7-H3基因免疫治療在黑色素瘤治療中的潛力。在沉默Id-1基因治療方面，國外研究主要集中在探索Id-1基因在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制以及沉默Id-1基因?qū)δ[瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。研究發(fā)現(xiàn)，Id-1基因通過調(diào)控一系列與腫瘤增殖、遷移、侵襲相關(guān)的信號通路，如PI3K/AKT、MAPK等，促進(jìn)黑色素瘤的惡性進(jìn)展。通過RNA干擾技術(shù)沉默Id-1基因后，黑色素瘤細(xì)胞的增殖能力明顯減弱，遷移和侵襲能力受到顯著抑制，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，同時誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建沉默Id-1基因的黑色素瘤小鼠模型，結(jié)果顯示腫瘤生長速度明顯減緩，小鼠生存期顯著延長。國內(nèi)學(xué)者在沉默Id-1基因治療黑色素瘤的研究中也取得了重要突破。有團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了攜帶Id-1短發(fā)夾RNA（shRNA）的慢病毒表達(dá)載體，通過體外轉(zhuǎn)染黑色素瘤細(xì)胞，成功實(shí)現(xiàn)了對Id-1基因的有效沉默。進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，沉默Id-1基因能夠顯著抑制黑色素瘤的生長和轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制與下調(diào)PI3K/AKT信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和磷酸化水平有關(guān)。此外，國內(nèi)還有研究將沉默Id-1基因與其他治療方法，如化療、放療聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對放化療的敏感性，提高治療效果。盡管B7-H3基因免疫治療和沉默Id-1基因治療在惡性黑色素瘤的研究中取得了一定進(jìn)展，但目前仍面臨一些挑戰(zhàn)和問題。例如，B7-H3基因免疫治療的療效受到多種因素的影響，如腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性、免疫細(xì)胞的功能狀態(tài)等，如何優(yōu)化治療方案，提高治療的有效性和穩(wěn)定性，仍是亟待解決的問題。沉默Id-1基因治療則面臨著基因傳遞效率低、脫靶效應(yīng)等問題，如何開發(fā)高效、安全的基因傳遞系統(tǒng)，提高沉默Id-1基因治療的特異性和安全性，也是當(dāng)前研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。二、惡性黑色素瘤及相關(guān)基因概述2.1惡性黑色素瘤的生物學(xué)特性2.1.1發(fā)病機(jī)制惡性黑色素瘤的發(fā)病是一個涉及多基因、多信號通路復(fù)雜調(diào)控的過程，其根源在于黑色素細(xì)胞的惡變。正常情況下，黑色素細(xì)胞起源于神經(jīng)嵴，遷移至皮膚、黏膜、眼葡萄膜等部位，負(fù)責(zé)合成和分泌黑色素，以保護(hù)皮膚免受紫外線損傷。然而，在多種內(nèi)外因素的共同作用下，黑色素細(xì)胞的基因穩(wěn)定性遭到破壞，引發(fā)一系列基因突變和異常表達(dá)，進(jìn)而促使其向惡性黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化。紫外線（UV）照射是黑色素瘤最重要的環(huán)境危險(xiǎn)因素之一。UV中的UVA和UVB波段能夠直接損傷DNA，導(dǎo)致堿基突變、嘧啶二聚體形成以及DNA鏈斷裂。這些損傷若未能得到及時有效的修復(fù)，會進(jìn)一步誘導(dǎo)原癌基因的激活和抑癌基因的失活。例如，BRAF基因是黑色素瘤中最常見的突變基因，約50%-60%的黑色素瘤患者存在BRAF基因突變。其中，BRAFV600E突變最為常見，該突變使得BRAF蛋白的激酶活性持續(xù)激活，進(jìn)而過度激活下游的MEK/ERK信號通路。持續(xù)活化的MEK/ERK信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，推動黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展。NRAS基因也是黑色素瘤中常見的突變基因之一，其突變率約為15%-20%。NRAS基因突變同樣會導(dǎo)致MAPK信號通路的異常激活。NRAS蛋白作為一種小GTP酶，在正常狀態(tài)下，通過結(jié)合GTP和GDP的循環(huán)來調(diào)節(jié)其活性。當(dāng)NRAS基因發(fā)生突變時，NRAS蛋白持續(xù)結(jié)合GTP，處于激活狀態(tài)，從而激活下游的RAF/MEK/ERK信號級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和存活。除了MAPK信號通路，PI3K/AKT/mTOR信號通路在黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展中也起著關(guān)鍵作用。PTEN是PI3K/AKT/mTOR信號通路的重要負(fù)調(diào)控因子，它能夠通過去磷酸化作用抑制AKT的活性。在黑色素瘤中，PTEN基因常常發(fā)生缺失或突變，導(dǎo)致其功能喪失，無法有效抑制AKT的激活。激活的AKT進(jìn)一步磷酸化并激活下游的mTOR等分子，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長和代謝重編程，為腫瘤細(xì)胞的快速增殖和存活提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，Wnt/β-catenin信號通路在黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制中也具有重要意義。在正常細(xì)胞中，β-catenin與E-cadherin結(jié)合，定位于細(xì)胞膜上，維持細(xì)胞間的黏附連接。當(dāng)Wnt信號通路激活時，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，并進(jìn)入細(xì)胞核與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合，啟動一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，如c-Myc、CyclinD1等。這些靶基因參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程，其異常表達(dá)會導(dǎo)致黑色素細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。在黑色素瘤中，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良密切相關(guān)。腫瘤微環(huán)境（TME）也在黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。TME由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等組成，是一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)。其中，免疫細(xì)胞在腫瘤免疫監(jiān)視和免疫逃逸中起著關(guān)鍵作用。在黑色素瘤的早期階段，機(jī)體的免疫系統(tǒng)能夠識別并攻擊腫瘤細(xì)胞。然而，隨著腫瘤的發(fā)展，腫瘤細(xì)胞會通過多種機(jī)制逃避免疫監(jiān)視，其中B7-H3基因的異常表達(dá)是導(dǎo)致免疫逃逸的重要因素之一。B7-H3是B7家族的重要免疫調(diào)節(jié)分子，在黑色素瘤等多種腫瘤中高表達(dá)。它通過與未知受體結(jié)合，抑制T細(xì)胞的活化和增殖，削弱機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而為腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。綜上所述，惡性黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制涉及多個基因的突變和信號通路的異常激活，同時受到腫瘤微環(huán)境的影響。這些復(fù)雜的分子事件相互交織，共同推動了黑色素細(xì)胞的惡變和腫瘤的發(fā)展。深入研究惡性黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制，有助于揭示其發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)，為開發(fā)更有效的治療策略提供理論依據(jù)。2.1.2臨床特征與治療現(xiàn)狀惡性黑色素瘤的臨床特征較為多樣，且與腫瘤的生長部位、分期密切相關(guān)。早期黑色素瘤通常表現(xiàn)為皮膚或黏膜上的色素性皮損，顏色、形狀和大小的改變是其常見的特征。具體而言，顏色可呈現(xiàn)出黑色、棕色、褐色、藍(lán)色甚至白色等多樣化，且分布不均；形狀上多表現(xiàn)為不對稱，邊界不規(guī)則，可呈鋸齒狀或模糊不清；大小方面，直徑往往大于6mm，且可能會逐漸增大。此外，皮損還可能出現(xiàn)瘙癢、壓痛、出血、潰瘍等癥狀。隨著病情進(jìn)展，黑色素瘤可侵犯周圍組織和器官，導(dǎo)致局部淋巴結(jié)腫大、疼痛，若發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，還會出現(xiàn)相應(yīng)轉(zhuǎn)移部位的癥狀，如肺轉(zhuǎn)移可引起咳嗽、咯血、呼吸困難；肝轉(zhuǎn)移可導(dǎo)致肝區(qū)疼痛、黃疸、肝功能異常；骨轉(zhuǎn)移則會出現(xiàn)骨痛、病理性骨折等。目前，惡性黑色素瘤的診斷主要依靠臨床檢查、皮膚鏡檢查、組織病理學(xué)檢查以及免疫組織化學(xué)檢測等方法。臨床檢查主要是通過醫(yī)生的肉眼觀察和觸診，對可疑皮損的形態(tài)、顏色、大小、邊界等特征進(jìn)行初步評估。皮膚鏡檢查作為一種無創(chuàng)性的輔助檢查手段，能夠放大觀察皮膚表面和表皮下的結(jié)構(gòu)，提高早期黑色素瘤的診斷準(zhǔn)確率。對于高度懷疑為黑色素瘤的皮損，需進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，通過切除或活檢獲取病變組織，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和排列方式，以明確診斷。免疫組織化學(xué)檢測則利用特異性抗體標(biāo)記腫瘤細(xì)胞中的相關(guān)抗原，如S-100蛋白、HMB45、Melan-A等，進(jìn)一步輔助鑒別診斷和判斷腫瘤的來源及分化程度。在治療方面，手術(shù)切除是早期惡性黑色素瘤的主要治療方法，通過完整切除腫瘤組織，可達(dá)到根治的目的。對于厚度小于1mm的黑色素瘤，切除邊緣距腫瘤0.5-1cm即可；對于厚度在1-2mm之間的腫瘤，切除邊緣需擴(kuò)大至1-2cm；而對于厚度大于2mm的黑色素瘤，切除邊緣應(yīng)達(dá)到2-3cm。然而，對于中晚期黑色素瘤，單純手術(shù)治療往往難以徹底清除腫瘤細(xì)胞，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較高，因此需要結(jié)合其他輔助治療手段。化療是中晚期黑色素瘤常用的治療方法之一，通過使用化學(xué)藥物抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和分裂。常用的化療藥物包括達(dá)卡巴嗪（DTIC）、替莫唑胺（TMZ）等。雖然化療在一定程度上能夠控制腫瘤的生長，但由于黑色素瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性較高，化療的總體有效率較低，且不良反應(yīng)較大，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。放療則是利用高能射線照射腫瘤組織，破壞腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。放療主要用于緩解黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶引起的癥狀，如骨轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的疼痛、腦轉(zhuǎn)移引起的顱內(nèi)壓增高等。然而，放療也存在一定的局限性，如對正常組織的損傷、局部復(fù)發(fā)等問題。近年來，免疫治療和靶向治療的出現(xiàn)為惡性黑色素瘤的治療帶來了新的突破。免疫治療通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來識別和攻擊腫瘤細(xì)胞，主要包括免疫檢查點(diǎn)抑制劑和過繼性細(xì)胞免疫治療等。免疫檢查點(diǎn)抑制劑如抗PD-1單抗（帕博利珠單抗、納武利尤單抗）和抗CTLA-4單抗（伊匹木單抗），能夠阻斷免疫檢查點(diǎn)分子PD-1/PD-L1和CTLA-4的信號通路，解除腫瘤細(xì)胞對免疫系統(tǒng)的抑制，增強(qiáng)T細(xì)胞的活性，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。多項(xiàng)臨床研究表明，免疫檢查點(diǎn)抑制劑顯著提高了晚期黑色素瘤患者的生存率和無進(jìn)展生存期。然而，部分患者對免疫治療存在原發(fā)性耐藥或在治療過程中出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥，且免疫治療可能會引發(fā)一系列免疫相關(guān)不良反應(yīng)，如免疫性肺炎、免疫性腸炎、甲狀腺功能異常等，限制了其臨床應(yīng)用。靶向治療則是針對黑色素瘤中特定的基因突變或信號通路異常，使用相應(yīng)的靶向藥物進(jìn)行精準(zhǔn)治療。例如，對于BRAFV600突變的黑色素瘤患者，BRAF抑制劑（維莫非尼、達(dá)拉非尼）和MEK抑制劑（曲美替尼、考比替尼）的聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，提高患者的生存率。然而，靶向治療同樣面臨耐藥問題，多數(shù)患者在治療后一段時間內(nèi)會出現(xiàn)耐藥，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)和進(jìn)展?？傮w而言，盡管目前針對惡性黑色素瘤的治療手段不斷豐富，但對于中晚期患者，尤其是發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，治療效果仍不盡人意，患者的生存率和生活質(zhì)量有待進(jìn)一步提高。因此，探索新的治療策略，如本研究提出的B7-H3基因免疫聯(lián)合沉默Id-1基因治療，對于改善惡性黑色素瘤患者的預(yù)后具有重要意義。2.2B7-H3基因與腫瘤免疫2.2.1B7-H3基因的結(jié)構(gòu)與功能B7-H3基因，又稱為CD276，位于人類染色體15q24.1區(qū)域。其編碼產(chǎn)物B7-H3蛋白是一種I型跨膜蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和短胞內(nèi)區(qū)組成。B7-H3蛋白的胞外區(qū)包含兩個或四個免疫球蛋白（Ig）樣結(jié)構(gòu)域，據(jù)此可分為2IgB7-H3和4IgB7-H3兩種主要剪接異構(gòu)體。其中，4IgB7-H3由兩對相同的類IgV（可變區(qū)）和類IgC（恒定區(qū)）結(jié)構(gòu)域組成，而2IgB7-H3則由一對IGV樣和IGC樣結(jié)構(gòu)域組成。在人類免疫細(xì)胞和癌細(xì)胞上，2IgB7-H3是主要表達(dá)的亞型，而小鼠B7-H3僅表達(dá)2IgB7-H3這一種亞型。B7-H3在免疫系統(tǒng)中扮演著極為復(fù)雜且重要的角色，兼具共刺激和共抑制的雙重功能。早期研究認(rèn)為，B7-H3主要作為共刺激受體發(fā)揮作用。在抗原呈遞細(xì)胞（APC）表面表達(dá)的B7-H3，能夠與T細(xì)胞表面的未知受體相互作用，進(jìn)而促進(jìn)CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖。這種增殖作用使得T細(xì)胞數(shù)量增加，增強(qiáng)了機(jī)體的免疫反應(yīng)。同時，B7-H3還能刺激T細(xì)胞分泌干擾素-γ（IFN-γ）。IFN-γ是一種重要的細(xì)胞因子，它可以激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷病原體的能力，還能調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能，進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。此外，B7-H3還可增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，使其能夠更有效地識別和殺傷被病原體感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。然而，近年來越來越多的研究表明，B7-H3在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮著關(guān)鍵的共抑制作用。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的B7-H3可通過多種機(jī)制抑制T細(xì)胞的活化和功能。一方面，B7-H3能夠抑制T細(xì)胞受體（TCR）信號通路，使T細(xì)胞難以被激活。具體來說，B7-H3可以下調(diào)NF-κB、NFAT和AP-1等信號通路相關(guān)分子的活性。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控多種免疫相關(guān)基因的表達(dá)；NFAT在T細(xì)胞的活化和增殖過程中起著關(guān)鍵作用；AP-1則參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程。B7-H3對這些信號通路的抑制，導(dǎo)致T細(xì)胞無法正?；罨瑥亩鵁o法發(fā)揮有效的抗腫瘤免疫功能。另一方面，B7-H3還可以抑制T細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-2（IL-2）。IL-2是一種重要的細(xì)胞因子，對于T細(xì)胞的增殖、存活和分化至關(guān)重要。B7-H3抑制IL-2的分泌，使得T細(xì)胞的生長和功能受到抑制，進(jìn)一步削弱了機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。除了對T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用外，B7-H3還能夠調(diào)控自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的功能。NK細(xì)胞是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞和被病原體感染的細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，B7-H3可以抑制NK細(xì)胞的活性，降低其對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。此外，B7-H3還可以調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）的功能。Treg細(xì)胞是一類具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，能夠抑制其他免疫細(xì)胞的活性，維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)。在腫瘤微環(huán)境中，B7-H3可以促進(jìn)Treg細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)其免疫抑制功能，從而有利于腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。綜上所述，B7-H3基因編碼的B7-H3蛋白在免疫系統(tǒng)中具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能，其共刺激和共抑制作用的平衡對于維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)和抗腫瘤免疫反應(yīng)至關(guān)重要。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，B7-H3的異常表達(dá)及其共抑制功能的增強(qiáng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和攻擊，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了有利條件。深入研究B7-H3的結(jié)構(gòu)與功能，對于揭示腫瘤免疫逃逸的機(jī)制，開發(fā)有效的腫瘤免疫治療策略具有重要意義。2.2.2B7-H3基因在惡性黑色素瘤中的表達(dá)及意義大量研究表明，B7-H3基因在惡性黑色素瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。通過免疫組織化學(xué)染色、實(shí)時熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對黑色素瘤組織標(biāo)本和正常皮膚組織標(biāo)本進(jìn)行檢測分析，結(jié)果一致顯示，黑色素瘤組織中B7-H3蛋白和mRNA的表達(dá)水平顯著高于正常皮膚組織。例如，有研究對50例惡性黑色素瘤患者的腫瘤組織和配對的正常皮膚組織進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)惡性黑色素瘤組織中B7-H3蛋白的陽性表達(dá)率高達(dá)80%，而正常皮膚組織中B7-H3蛋白的陽性表達(dá)率僅為10%。進(jìn)一步的臨床病理分析表明，B7-H3基因的高表達(dá)與惡性黑色素瘤的多種臨床病理特征密切相關(guān)。在腫瘤生長方面，B7-H3基因的高表達(dá)與惡性黑色素瘤的快速生長密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，B7-H3可以通過激活多條信號通路，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖和存活。一方面，B7-H3能夠激活PI3K/AKT信號通路。在正常情況下，PI3K/AKT信號通路受到嚴(yán)格的調(diào)控，維持細(xì)胞的正常生長和代謝。然而，當(dāng)B7-H3高表達(dá)時，它可以與細(xì)胞表面的相關(guān)受體結(jié)合，激活PI3K，使其催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為一種第二信使，能夠招募AKT到細(xì)胞膜上，并使其磷酸化激活。激活的AKT進(jìn)一步磷酸化下游的多種底物，如mTOR、GSK-3β等。mTOR是一種重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成、代謝和自噬等過程，促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖。GSK-3β則參與調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等過程，AKT對GSK-3β的磷酸化抑制作用，使得細(xì)胞周期進(jìn)程加快，細(xì)胞凋亡受到抑制，從而促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖和存活。另一方面，B7-H3還可以激活MAPK信號通路。B7-H3與受體結(jié)合后，通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，激活Raf蛋白，進(jìn)而依次激活MEK和ERK。激活的ERK可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，如c-Myc、CyclinD1等。c-Myc是一種重要的原癌基因，它可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和代謝，抑制細(xì)胞凋亡。CyclinD1則是細(xì)胞周期蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程。B7-H3通過激活MAPK信號通路，上調(diào)c-Myc和CyclinD1的表達(dá)，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖和存活。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，B7-H3基因的高表達(dá)與惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。研究表明，B7-H3可以通過多種機(jī)制促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。首先，B7-H3可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的降解。ECM是細(xì)胞生存的重要微環(huán)境，它由多種蛋白質(zhì)和多糖組成，對細(xì)胞的生長、分化和遷移等過程起著重要的調(diào)節(jié)作用。B7-H3可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，如MMP-2和MMP-9。MMPs是一類能夠降解ECM成分的蛋白酶，它們可以降解膠原蛋白、層粘連蛋白等ECM成分，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開辟道路。其次，B7-H3還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附作用。細(xì)胞間的黏附作用對于維持組織的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。B7-H3可以下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，E-cadherin是一種重要的細(xì)胞黏附分子，它可以介導(dǎo)上皮細(xì)胞之間的黏附作用。B7-H3下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，使得細(xì)胞間的黏附力減弱，腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)部位脫離，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，從而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。此外，B7-H3還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。細(xì)胞骨架是細(xì)胞內(nèi)的一種蛋白質(zhì)纖維網(wǎng)絡(luò)，它對于維持細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動起著重要的作用。B7-H3可以調(diào)節(jié)Rho家族GTP酶的活性，如RhoA、Rac1和Cdc42等。這些GTP酶可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的組裝和重組，使得細(xì)胞能夠發(fā)生形態(tài)變化和遷移運(yùn)動。在預(yù)后方面，B7-H3基因的高表達(dá)與惡性黑色素瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。多項(xiàng)臨床研究對大量惡性黑色素瘤患者進(jìn)行長期隨訪，分析B7-H3表達(dá)水平與患者生存率和復(fù)發(fā)率的關(guān)系，結(jié)果顯示，B7-H3高表達(dá)的患者5年生存率明顯低于B7-H3低表達(dá)的患者，且復(fù)發(fā)率顯著高于B7-H3低表達(dá)的患者。例如，一項(xiàng)納入100例惡性黑色素瘤患者的研究發(fā)現(xiàn)，B7-H3高表達(dá)組患者的5年生存率為30%，而B7-H3低表達(dá)組患者的5年生存率為60%。同時，B7-H3高表達(dá)組患者的復(fù)發(fā)率為70%，而B7-H3低表達(dá)組患者的復(fù)發(fā)率為30%。進(jìn)一步的多因素分析表明，B7-H3表達(dá)水平是惡性黑色素瘤患者獨(dú)立的預(yù)后危險(xiǎn)因素。這意味著，無論患者的其他臨床病理特征如何，B7-H3的高表達(dá)都預(yù)示著患者的預(yù)后較差。綜上所述，B7-H3基因在惡性黑色素瘤組織中高表達(dá)，其高表達(dá)與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。B7-H3通過激活多種信號通路，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，同時抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致腫瘤的惡性進(jìn)展和不良預(yù)后。因此，B7-H3基因有望成為惡性黑色素瘤診斷、預(yù)后評估和治療的重要靶點(diǎn)。針對B7-H3的靶向治療策略，如B7-H3單克隆抗體、抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）、CAR-T細(xì)胞療法等，正在積極研發(fā)和臨床試驗(yàn)中，為惡性黑色素瘤的治療帶來了新的希望。2.3Id-1基因與腫瘤發(fā)生發(fā)展2.3.1Id-1基因的生物學(xué)功能Id-1基因，全稱為分化抑制因子1基因（inhibitorofdifferentiation1），是螺旋-環(huán)-螺旋（HLH）轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員。該基因定位于人類染色體20q11.2區(qū)域，其編碼的Id-1蛋白由157個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約為19kDa。Id-1蛋白獨(dú)特之處在于缺乏DNA結(jié)合所必需的堿性結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其無法直接與DNA結(jié)合，但能夠與其他具有堿性結(jié)構(gòu)域的HLH轉(zhuǎn)錄因子，如E12、E47、MyoD等形成異二聚體，從而抑制這些轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過程。在細(xì)胞增殖過程中，Id-1基因發(fā)揮著關(guān)鍵的促進(jìn)作用。研究表明，Id-1能夠通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，推動細(xì)胞從G1期向S期過渡。一方面，Id-1可以與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRb）結(jié)合，使pRb蛋白磷酸化，從而釋放出與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F進(jìn)而激活一系列與DNA合成和細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)的基因，如CyclinE、CyclinA等，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期，實(shí)現(xiàn)DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖。另一方面，Id-1還能夠通過激活Raf/MEK/ERK信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在這一信號通路中，Id-1與Raf蛋白相互作用，激活Raf激酶，進(jìn)而依次激活MEK和ERK。激活的ERK可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，如c-Myc、Elk-1等，促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，從而推動細(xì)胞增殖。此外，Id-1還能夠抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs），如p16、p21、p27等的表達(dá)，解除對細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的抑制作用，使CDKs能夠磷酸化其底物，推動細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞分化方面，Id-1基因起著抑制作用。正常情況下，細(xì)胞分化是一個有序的過程，涉及到多種轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同調(diào)控。Id-1通過與堿性HLH（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子形成異二聚體，抑制bHLH轉(zhuǎn)錄因子與DNA上的E-box序列結(jié)合，從而阻斷細(xì)胞分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活。以神經(jīng)干細(xì)胞分化為例，在神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的過程中，bHLH轉(zhuǎn)錄因子如NeuroD、Mash1等起著關(guān)鍵作用，它們能夠結(jié)合到神經(jīng)元特異性基因的啟動子區(qū)域，激活這些基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。然而，當(dāng)Id-1表達(dá)上調(diào)時，Id-1與NeuroD、Mash1等bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，形成無活性的異二聚體，抑制它們與E-box序列的結(jié)合，從而阻斷神經(jīng)元特異性基因的轉(zhuǎn)錄，抑制神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。同樣，在肌肉細(xì)胞分化過程中，MyoD是一種重要的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，它能夠啟動肌肉特異性基因的表達(dá)，促進(jìn)成肌細(xì)胞向肌纖維分化。Id-1通過與MyoD結(jié)合，抑制MyoD的活性，從而抑制肌肉細(xì)胞的分化。血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)，Id-1基因在這一過程中也發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，Id-1可以通過多種途徑促進(jìn)血管生成。首先，Id-1能夠上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)。VEGF是一種強(qiáng)效的促血管生成因子，它能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，促進(jìn)新生血管的形成。Id-1通過與轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合，增強(qiáng)Sp1與VEGF啟動子區(qū)域的結(jié)合能力，從而上調(diào)VEGF的表達(dá)。其次，Id-1還能夠調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)。MMPs是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，它們在血管生成過程中起著重要作用，能夠降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，為血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和新生血管的形成開辟道路。Id-1可以上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，有利于血管生成。此外，Id-1還能夠通過調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)信號通路，如PI3K/AKT、MAPK等，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，從而促進(jìn)血管生成。綜上所述，Id-1基因在細(xì)胞增殖、分化和血管生成等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。其通過與多種轉(zhuǎn)錄因子和信號通路相互作用，調(diào)控細(xì)胞的生長、分化和血管生成，在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和腫瘤發(fā)生發(fā)展等生理病理過程中具有關(guān)鍵意義。深入研究Id-1基因的生物學(xué)功能，有助于揭示這些過程的分子機(jī)制，為相關(guān)疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。2.3.2Id-1基因在惡性黑色素瘤中的作用機(jī)制在惡性黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，Id-1基因扮演著極為關(guān)鍵的角色，通過多種復(fù)雜的分子機(jī)制推動腫瘤的進(jìn)展。Id-1基因能夠通過抑制腫瘤抑制基因P16/Ink4a來促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖。P16/Ink4a是細(xì)胞周期的重要負(fù)調(diào)控因子，它可以與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）和細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）形成的復(fù)合物結(jié)合，抑制CDK4的活性，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，Id-1可以通過與E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員結(jié)合，抑制P16/Ink4a基因的轉(zhuǎn)錄。具體來說，Id-1與E2F1、E2F3等結(jié)合，形成Id-1/E2F復(fù)合物，該復(fù)合物能夠結(jié)合到P16/Ink4a基因的啟動子區(qū)域，招募組蛋白去乙?；福℉DACs），使組蛋白去乙?；?，從而抑制P16/Ink4a基因的轉(zhuǎn)錄。此外，Id-1還可以通過激活PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)P16/Ink4a蛋白的磷酸化和降解。在PI3K/AKT信號通路中，AKT可以磷酸化P16/Ink4a蛋白的多個位點(diǎn)，使其與泛素連接酶結(jié)合，進(jìn)而被泛素化修飾，最終通過蛋白酶體途徑降解。P16/Ink4a基因的表達(dá)受到抑制，使得細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控機(jī)制失衡，CDK4活性增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而推動黑色素瘤細(xì)胞的增殖。Id-1基因還能夠通過激活PI3K/AKT和MAPK信號通路，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的存活、增殖、遷移和侵襲。在PI3K/AKT信號通路中，Id-1可以與PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85相互作用，促進(jìn)PI3K的激活。激活的PI3K催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，招募AKT到細(xì)胞膜上，并使其磷酸化激活。激活的AKT可以磷酸化多種底物，如mTOR、GSK-3β、BAD等，從而促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖、遷移和侵襲。例如，AKT磷酸化mTOR后，激活mTOR復(fù)合物1（mTORC1），mTORC1可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長和代謝等過程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。AKT磷酸化GSK-3β后，抑制GSK-3β的活性，使得β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，并進(jìn)入細(xì)胞核與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合，啟動一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，如c-Myc、CyclinD1等，促進(jìn)細(xì)胞增殖。AKT磷酸化BAD后，抑制BAD的促凋亡作用，促進(jìn)細(xì)胞存活。在MAPK信號通路中，Id-1可以通過與Raf蛋白相互作用，激活Raf激酶，進(jìn)而依次激活MEK和ERK。激活的ERK可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，如c-Myc、Elk-1、AP-1等，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)。例如，ERK磷酸化c-Myc后，增強(qiáng)c-Myc的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖。ERK磷酸化Elk-1后，激活Elk-1的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)。此外，Id-1基因還與黑色素瘤的血管生成密切相關(guān)。如前文所述，Id-1可以上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)，促進(jìn)血管生成。在黑色素瘤中，Id-1通過激活NF-κB信號通路，增強(qiáng)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄。具體來說，Id-1與IκB激酶（IKK）相互作用，促進(jìn)IKK的激活，激活的IKK磷酸化IκBα，使其降解，從而釋放出NF-κB。釋放的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合到VEGF基因的啟動子區(qū)域，增強(qiáng)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄。此外，Id-1還可以通過調(diào)節(jié)其他血管生成相關(guān)因子，如堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）等，促進(jìn)黑色素瘤的血管生成。這些血管生成相關(guān)因子可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，促進(jìn)新生血管的形成，為黑色素瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。綜上所述，Id-1基因在惡性黑色素瘤中通過抑制腫瘤抑制基因P16/Ink4a、激活PI3K/AKT和MAPK信號通路以及促進(jìn)血管生成等多種機(jī)制，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移、侵襲和血管生成，在黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。深入研究Id-1基因在黑色素瘤中的作用機(jī)制，為開發(fā)針對Id-1的靶向治療策略提供了重要的理論依據(jù)。三、B7-H3基因免疫聯(lián)合沉默Id-1基因治療的作用機(jī)制3.1B7-H3基因免疫治療的原理B7-H3基因免疫治療的核心在于通過將B7-H3基因?qū)肽[瘤細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞（APC），使其表達(dá)B7-H3蛋白，進(jìn)而激活機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。這一過程涉及多個關(guān)鍵步驟和復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。首先是基因載體的選擇與構(gòu)建。在B7-H3基因免疫治療中，常用的基因載體包括腺病毒、慢病毒、質(zhì)粒等。以腺病毒載體為例，其具有感染效率高、宿主范圍廣、能攜帶較大外源基因片段等優(yōu)點(diǎn)。構(gòu)建攜帶B7-H3基因的腺病毒表達(dá)載體時，需先獲取B7-H3基因的編碼序列，可通過從cDNA文庫中克隆或人工合成的方式獲得。然后，利用分子克隆技術(shù)，將B7-H3基因插入腺病毒載體的特定位置，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒。經(jīng)過一系列的鑒定，如限制性內(nèi)切酶酶切分析、PCR擴(kuò)增和測序驗(yàn)證，確保B7-H3基因正確插入載體且序列無誤。接著，將重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞系中，如人胚腎293細(xì)胞，通過細(xì)胞內(nèi)的病毒包裝機(jī)制，產(chǎn)生具有感染能力的重組腺病毒顆粒。這些重組腺病毒顆粒含有B7-H3基因，可用于后續(xù)的基因免疫治療實(shí)驗(yàn)。當(dāng)攜帶B7-H3基因的載體成功導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞或APC后，B7-H3基因會在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，表達(dá)出B7-H3蛋白。在腫瘤細(xì)胞中，B7-H3蛋白表達(dá)于細(xì)胞表面，使其成為免疫細(xì)胞識別的靶點(diǎn)。在APC中，B7-H3蛋白的表達(dá)則增強(qiáng)了APC對腫瘤抗原的呈遞能力。APC是免疫系統(tǒng)中的重要細(xì)胞，包括樹突狀細(xì)胞（DC）、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞等，它們能夠攝取、加工和呈遞抗原，激活T淋巴細(xì)胞。當(dāng)APC攝取腫瘤抗原后，會將抗原肽與自身的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子結(jié)合，形成MHC-抗原肽復(fù)合物，并呈遞到細(xì)胞表面。此時，APC表面表達(dá)的B7-H3蛋白與T細(xì)胞表面的未知受體相互作用，為T細(xì)胞的活化提供共刺激信號。T淋巴細(xì)胞的激活是B7-H3基因免疫治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。T細(xì)胞的活化需要兩個信號的協(xié)同作用：第一信號來自T細(xì)胞受體（TCR）與APC表面MHC-抗原肽復(fù)合物的特異性結(jié)合，識別腫瘤抗原；第二信號則是共刺激信號，由APC表面的共刺激分子與T細(xì)胞表面相應(yīng)受體相互作用產(chǎn)生。B7-H3作為一種重要的共刺激分子，其與T細(xì)胞表面受體結(jié)合后，可激活T細(xì)胞內(nèi)的多條信號通路。例如，B7-H3與受體結(jié)合能夠激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路。PI3K被激活后，催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募AKT到細(xì)胞膜上，并使其磷酸化激活。激活的AKT進(jìn)一步磷酸化下游的多種底物，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等。mTOR是細(xì)胞生長和代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其激活可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長和增殖。GSK-3β的磷酸化抑制使其失去活性，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，并進(jìn)入細(xì)胞核與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合，啟動一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，如c-Myc、CyclinD1等，促進(jìn)細(xì)胞增殖。此外，B7-H3還能激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路。B7-H3與受體結(jié)合后，通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，激活Raf蛋白，進(jìn)而依次激活MEK和ERK。激活的ERK可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，如c-Myc、Elk-1、AP-1等，促進(jìn)細(xì)胞增殖、存活和分化相關(guān)基因的表達(dá)。這些信號通路的激活，使得T細(xì)胞被充分激活，從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，開始增殖和分化?；罨腡淋巴細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)。CD4+T細(xì)胞在B7-H3的刺激下，分化為Th1、Th2、Th17等不同亞型，分泌多種細(xì)胞因子。其中，Th1細(xì)胞主要分泌干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）等細(xì)胞因子。IFN-γ具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用，它可以激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力；還能上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面MHC分子的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤抗原的呈遞，促進(jìn)T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷。IL-2則是T細(xì)胞生長和增殖的重要細(xì)胞因子，它可以促進(jìn)T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增，增強(qiáng)T細(xì)胞的活性，同時還能激活自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用。Th17細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-17（IL-17）等細(xì)胞因子，可招募中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞到腫瘤部位，增強(qiáng)局部的免疫反應(yīng)。CD8+T細(xì)胞在B7-H3基因免疫治療中發(fā)揮著直接殺傷腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵作用?；罨腃D8+T細(xì)胞，即CTL，能夠識別并結(jié)合表達(dá)腫瘤抗原的腫瘤細(xì)胞。CTL表面的TCR與腫瘤細(xì)胞表面的MHC-抗原肽復(fù)合物特異性結(jié)合，同時CTL表面的共刺激分子與腫瘤細(xì)胞表面的相應(yīng)配體相互作用，為CTL的活化提供共刺激信號。激活的CTL通過釋放穿孔素和顆粒酶等細(xì)胞毒性物質(zhì)，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。穿孔素在細(xì)胞膜上形成孔道，使顆粒酶能夠進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白酶，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。此外，CTL還可以通過分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。TNF-α與腫瘤細(xì)胞表面的TNF受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。綜上所述，B7-H3基因免疫治療通過基因載體將B7-H3基因?qū)肽[瘤細(xì)胞或APC，表達(dá)的B7-H3蛋白激活T淋巴細(xì)胞，使其增殖和分化，分泌多種細(xì)胞因子，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。同時，活化的CD8+T細(xì)胞直接殺傷腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的目的。這一治療策略為惡性黑色素瘤等腫瘤的治療提供了新的思路和方法。3.2沉默Id-1基因的作用機(jī)制在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，RNA干擾（RNAi）技術(shù)作為一種高效且特異的基因沉默手段，為深入探究基因功能以及攻克復(fù)雜疾病提供了強(qiáng)大的工具。這一技術(shù)的核心原理是，細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA（dsRNA）能夠特異性地誘導(dǎo)與之同源的mRNA降解，從而實(shí)現(xiàn)對特定基因表達(dá)的精準(zhǔn)抑制。在腫瘤研究范疇，RNAi技術(shù)展現(xiàn)出了巨大的潛力，尤其是在沉默Id-1基因方面，為惡性黑色素瘤的治療開辟了嶄新的路徑。將針對Id-1基因設(shè)計(jì)的小干擾RNA（siRNA）或短發(fā)夾RNA（shRNA）導(dǎo)入黑色素瘤細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)的核酸酶Dicer會對dsRNA進(jìn)行切割，產(chǎn)生長度約為21-23個核苷酸的小干擾RNA（siRNA）。這些siRNA會與體內(nèi)的多種蛋白質(zhì)共同組裝，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。RISC中的siRNA會憑借堿基互補(bǔ)配對的原則，精準(zhǔn)識別并結(jié)合到Id-1基因的mRNA上。一旦結(jié)合完成，RISC中的核酸酶就會發(fā)揮作用，對mRNA進(jìn)行切割降解，使其無法作為模板進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯合成，從而在轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)對Id-1基因表達(dá)的沉默。Id-1基因的沉默對黑色素瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力產(chǎn)生顯著的抑制作用。在細(xì)胞增殖方面，Id-1基因沉默會導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程受阻。如前文所述，Id-1通過與pRb蛋白結(jié)合，使pRb磷酸化，釋放E2F，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。當(dāng)Id-1基因被沉默后，pRb蛋白無法被磷酸化，E2F持續(xù)與pRb結(jié)合，處于抑制狀態(tài)，無法激活下游與DNA合成和細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)的基因。這使得黑色素瘤細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，無法順利進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂，從而抑制了細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移方面，Id-1基因沉默主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的降解和細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)來發(fā)揮作用。Id-1基因沉默會下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)。MMPs是一類能夠降解ECM成分的蛋白酶，包括MMP-2和MMP-9等。在正常生理狀態(tài)下，MMPs參與組織的重塑和修復(fù)過程。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)MMPs，使其能夠降解ECM中的膠原蛋白、層粘連蛋白等成分，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開辟道路。當(dāng)Id-1基因沉默后，MMP-2和MMP-9等的表達(dá)水平顯著降低，導(dǎo)致ECM的降解能力減弱，腫瘤細(xì)胞難以突破ECM的屏障，從而抑制了細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。此外，Id-1基因沉默還會上調(diào)E-cadherin的表達(dá)。E-cadherin是一種重要的細(xì)胞黏附分子，主要介導(dǎo)上皮細(xì)胞之間的黏附作用。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞通過下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，降低細(xì)胞間的黏附力，使腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)部位脫離，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。當(dāng)Id-1基因沉默后，E-cadherin的表達(dá)水平升高，細(xì)胞間的黏附力增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞難以脫離原發(fā)部位，從而抑制了細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。綜上所述，利用RNA干擾技術(shù)沉默Id-1基因，通過降解Id-1基因的mRNA，抑制其蛋白質(zhì)表達(dá)，進(jìn)而阻斷Id-1基因參與的細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號通路，實(shí)現(xiàn)對黑色素瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的有效抑制。這一作用機(jī)制為惡性黑色素瘤的治療提供了重要的理論基礎(chǔ)和潛在的治療靶點(diǎn)。3.3聯(lián)合治療的協(xié)同作用機(jī)制B7-H3基因免疫聯(lián)合沉默Id-1基因治療惡性黑色素瘤，能夠從免疫激活和抑制腫瘤生長兩個關(guān)鍵方面發(fā)揮協(xié)同作用，展現(xiàn)出比單一治療更為顯著的治療效果。在免疫激活方面，B7-H3基因免疫治療通過增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，為聯(lián)合治療奠定了重要基礎(chǔ)。如前文所述，B7-H3基因免疫治療利用基因載體將B7-H3基因?qū)肽[瘤細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞（APC），使這些細(xì)胞表達(dá)B7-H3蛋白。B7-H3蛋白與T細(xì)胞表面的未知受體相互作用，為T細(xì)胞的活化提供共刺激信號，激活T細(xì)胞內(nèi)的PI3K/AKT和MAPK等信號通路，促使T細(xì)胞增殖和分化?；罨腡細(xì)胞包括CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，它們在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著核心作用。當(dāng)B7-H3基因免疫與沉默Id-1基因聯(lián)合應(yīng)用時，沉默Id-1基因能夠進(jìn)一步優(yōu)化腫瘤免疫微環(huán)境，增強(qiáng)B7-H3基因免疫治療的效果。Id-1基因在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，不僅促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，還對腫瘤免疫微環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響。沉默Id-1基因后，腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力受到抑制，這減少了腫瘤細(xì)胞對免疫細(xì)胞的抑制和干擾。同時，沉默Id-1基因可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面MHC分子的表達(dá)。MHC分子在抗原呈遞過程中起著關(guān)鍵作用，它能夠?qū)⒛[瘤抗原呈遞給T細(xì)胞，使T細(xì)胞能夠識別并攻擊腫瘤細(xì)胞。MHC分子表達(dá)的上調(diào)，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的抗原呈遞能力，使得T細(xì)胞更容易識別腫瘤細(xì)胞，從而提高了T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷效率。此外，沉默Id-1基因還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的浸潤和功能。研究表明，Id-1基因沉默后，腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的浸潤顯著增加。CD8+T細(xì)胞是細(xì)胞免疫的重要執(zhí)行者，能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞。NK細(xì)胞則是固有免疫系統(tǒng)的重要成員，具有天然的抗腫瘤活性，能夠迅速識別和殺傷腫瘤細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞浸潤的增加，增強(qiáng)了腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞活性，進(jìn)一步提高了機(jī)體的抗腫瘤免疫能力。同時，沉默Id-1基因還可以降低調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）在腫瘤微環(huán)境中的比例。Treg細(xì)胞是一類具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，能夠抑制其他免疫細(xì)胞的活性，維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)。在腫瘤微環(huán)境中，Treg細(xì)胞的增多會抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。沉默Id-1基因降低Treg細(xì)胞的比例，解除了對免疫細(xì)胞的抑制作用，使得免疫細(xì)胞能夠更好地發(fā)揮抗腫瘤作用。在抑制腫瘤生長方面，B7-H3基因免疫治療和沉默Id-1基因治療也具有協(xié)同作用。B7-H3基因免疫治療通過激活T淋巴細(xì)胞，使其分泌多種細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）等，這些細(xì)胞因子具有直接的抗腫瘤作用。IFN-γ可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時還能增強(qiáng)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。IL-2則是T細(xì)胞生長和增殖的重要細(xì)胞因子，它可以促進(jìn)T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增，增強(qiáng)T細(xì)胞的活性，間接抑制腫瘤細(xì)胞的生長。沉默Id-1基因通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路，直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長。如前文所述，Id-1基因通過激活PI3K/AKT和MAPK信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲。沉默Id-1基因后，這些信號通路的活性受到抑制，腫瘤細(xì)胞的增殖速度減緩，遷移和侵襲能力下降。同時，沉默Id-1基因還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，Id-1基因沉默后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白，如Bax、Caspase-3等的表達(dá)上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。當(dāng)B7-H3基因免疫與沉默Id-1基因聯(lián)合應(yīng)用時，兩者在抑制腫瘤生長方面的作用相互協(xié)同。B7-H3基因免疫治療激活的免疫細(xì)胞可以識別并殺傷腫瘤細(xì)胞，而沉默Id-1基因則使腫瘤細(xì)胞對免疫細(xì)胞的殺傷更加敏感。同時，B7-H3基因免疫治療分泌的細(xì)胞因子可以增強(qiáng)沉默Id-1基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的抑制作用。例如，IFN-γ可以進(jìn)一步抑制PI3K/AKT和MAPK信號通路的活性，增強(qiáng)沉默Id-1基因?qū)δ[瘤細(xì)胞增殖和存活的抑制效果。此外，兩者還可能通過共同調(diào)節(jié)一些關(guān)鍵的信號通路或分子，如Wnt/β-catenin信號通路、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等，協(xié)同抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。綜上所述，B7-H3基因免疫聯(lián)合沉默Id-1基因治療惡性黑色素瘤，在免疫激活和抑制腫瘤生長方面具有顯著的協(xié)同作用。通過增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，優(yōu)化腫瘤免疫微環(huán)境，以及協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，這種聯(lián)合治療策略有望為惡性黑色素瘤的治療帶來新的突破，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。四、實(shí)驗(yàn)研究4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞株選用6-8周齡的雌性C57BL/6小鼠，體重約18-22g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的SPF級動物房，采用12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律，自由攝食和飲水。在實(shí)驗(yàn)開始前，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)所用的惡性黑色素瘤細(xì)胞株為B16-F10，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。該細(xì)胞株源于C57BL/6小鼠的皮膚黑色素瘤，具有高度的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，能夠較好地模擬人類惡性黑色素瘤的生物學(xué)行為。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時，先用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，在37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，待細(xì)胞大部分變圓并脫落時，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液，按1:2-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。4.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器構(gòu)建攜帶B7-H3基因的腺病毒表達(dá)載體（pAd.B7-H3）所需的各種工具酶，如限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ，T4DNA連接酶等，均購自NEB公司。用于擴(kuò)增B7-H3基因的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列根據(jù)小鼠B7-H3基因的CDS序列（GenBank登錄號：NM_021879.2）設(shè)計(jì)，上游引物：5'-CGGGATCCATGGCTGCTGCTGCTGCTG-3'（下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物：5'-CCCAAGCTTTCACACAGAAAGCAGCAGC-3'（下劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn)）。構(gòu)建攜帶Id-1短發(fā)夾RNA（shRNA）的慢病毒表達(dá)載體（pLV.shId-1）所需的工具酶與上述相同。針對小鼠Id-1基因設(shè)計(jì)的shRNA序列為：5'-GCCACATGCTGATCTTCAATT-3'，由上海吉瑪基因科技有限公司合成。同時，合成陰性對照shRNA序列（5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'），用于對照實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000購自Invitrogen公司。用于檢測B7-H3蛋白和Id-1蛋白表達(dá)的一抗，如兔抗小鼠B7-H3多克隆抗體、兔抗小鼠Id-1多克隆抗體，均購自Abcam公司；相應(yīng)的二抗，如山羊抗兔IgG-HRP，購自CellSignalingTechnology公司。細(xì)胞增殖檢測試劑盒CCK-8購自日本同仁化學(xué)研究所。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)所用的Transwell小室購自Corning公司。實(shí)驗(yàn)中用到的主要儀器包括：PCR儀（Bio-Rad公司，T100），用于擴(kuò)增目的基因；離心機(jī)（Eppendorf公司，5424R），用于細(xì)胞和蛋白質(zhì)的分離；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司，VarioskanLUX），用于檢測CCK-8實(shí)驗(yàn)的吸光度值；流式細(xì)胞儀（BD公司，F(xiàn)ACSCalibur），用于分析腫瘤組織中免疫細(xì)胞的比例和功能；蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）相關(guān)儀器，包括電泳儀（Bio-Rad公司，Mini-PROTEANTetra）、轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司，Trans-BlotTurbo）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，ChemiDocMP），用于檢測蛋白表達(dá)水平；實(shí)時熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司，QuantStudio6Flex），用于檢測基因表達(dá)水平。4.1.3實(shí)驗(yàn)分組與處理將40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為對照組、B7-H3基因治療組、沉默Id-1基因治療組和聯(lián)合治療組。首先構(gòu)建小鼠惡性黑色素瘤模型。取對數(shù)生長期的B16-F10細(xì)胞，用PBS洗滌2次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個/mL。在每只小鼠的右后肢背部皮下接種0.1mL細(xì)胞懸液，接種后密切觀察小鼠的一般狀態(tài)和腫瘤生長情況。當(dāng)腫瘤體積長至約100mm3時，開始進(jìn)行治療干預(yù)。對照組小鼠瘤內(nèi)注射100μL生理鹽水，每周注射3次，連續(xù)注射2周。B7-H3基因治療組小鼠瘤內(nèi)注射100μL攜帶B7-H3基因的腺病毒表達(dá)載體（pAd.B7-H3），病毒滴度為1×101?PFU/mL，每周注射3次，連續(xù)注射2周。沉默Id-1基因治療組小鼠瘤內(nèi)注射100μL攜帶Id-1shRNA的慢病毒表達(dá)載體（pLV.shId-1），病毒滴度為1×10?TU/mL，每周注射3次，連續(xù)注射2周。聯(lián)合治療組小鼠瘤內(nèi)同時注射100μLpAd.B7-H3和100μLpLV.shId-1，注射頻率和療程與上述兩組相同。在治療期間，每隔3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。觀察并記錄小鼠的體重、精神狀態(tài)、飲食情況等一般指標(biāo)。治療結(jié)束后，處死小鼠，完整剝離腫瘤組織，稱重并拍照。部分腫瘤組織用于后續(xù)的病理學(xué)檢測、免疫組化分析、蛋白質(zhì)免疫印跡檢測和實(shí)時熒光定量PCR檢測等，以評估聯(lián)合治療對腫瘤生長、免疫微環(huán)境和相關(guān)基因、蛋白表達(dá)的影響。4.2實(shí)驗(yàn)步驟與檢測指標(biāo)4.2.1載體構(gòu)建與鑒定構(gòu)建攜帶B7-H3基因的腺病毒表達(dá)載體時，首先從C57BL/6小鼠脾臟組織中提取總RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此cDNA為模板，采用高保真PCR技術(shù)擴(kuò)增B7-H3基因。擴(kuò)增體系包括：cDNA模板2μL，上下游引物（10μM）各1μL，2×Q5高保真PCRMasterMix25μL，ddH?O補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；72℃終延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的B7-H3基因片段和腺病毒載體pAdEasy-1分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切。酶切體系為：DNA片段或載體5μg，10×Buffer5μL，BamHⅠ和HindⅢ各1μL，ddH?O補(bǔ)足至50μL。37℃水浴酶切2h后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，并回收目的片段。使用T4DNA連接酶將酶切后的B7-H3基因片段與腺病毒載體pAdEasy-1連接。連接體系為：B7-H3基因片段3μL，pAdEasy-1載體1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase1μL，ddH?O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中。在含有卡那霉素的LB平板上進(jìn)行篩選，挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒。通過PCR和測序?qū)χ亟M質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。PCR鑒定體系及反應(yīng)條件與擴(kuò)增B7-H3基因時相似，以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，若能擴(kuò)增出與目的基因大小相符的條帶，則初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。進(jìn)一步將重組質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與小鼠B7-H3基因的CDS序列進(jìn)行比對，若完全一致，則確定重組腺病毒表達(dá)載體pAd.B7-H3構(gòu)建成功。構(gòu)建攜帶Id-1短發(fā)夾RNA（shRNA）的慢病毒表達(dá)載體時，首先根據(jù)小鼠Id-1基因的mRNA序列，利用RNAi設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)針對Id-1基因的shRNA序列，并合成相應(yīng)的寡核苷酸序列。將合成的寡核苷酸序列退火形成雙鏈DNA，然后將其克隆到慢病毒載體pLVX-shRNA1中。連接體系為：雙鏈DNA3μL，pLVX-shRNA1載體1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase1μL，ddH?O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌Stbl3中。在含有氨芐青霉素的LB平板上進(jìn)行篩選，挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒。同樣通過PCR和測序?qū)χ亟M慢病毒表達(dá)載體進(jìn)行鑒定。PCR鑒定以重組質(zhì)粒為模板，使用載體通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，若能擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的條帶，則初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。測序結(jié)果與設(shè)計(jì)的shRNA序列比對一致后，確定重組慢病毒表達(dá)載體pLV.shId-1構(gòu)建成功。將構(gòu)建成功的pAd.B7-H3和pLV.shId-1分別在293T細(xì)胞中進(jìn)行包裝，獲得重組腺病毒和重組慢病毒。收集病毒上清液，通過超速離心法濃縮病毒，并使用TCID??法測定病毒滴度。4.2.2動物模型建立與治療在無菌條件下，取對數(shù)生長期的B16-F10細(xì)胞，用PBS洗滌2次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個/mL。在每只C57BL/6小鼠的右后肢背部皮下緩慢注射0.1mL細(xì)胞懸液，注射時需注意避開血管和神經(jīng)。接種后，將小鼠放回飼養(yǎng)籠中，密切觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食情況、活動能力等。每天檢查接種部位，觀察腫瘤的生長情況，記錄腫瘤出現(xiàn)的時間和初始大小。當(dāng)腫瘤體積長至約100mm3時，將40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為對照組、B7-H3基因治療組、沉默Id-1基因治療組和聯(lián)合治療組。對照組小鼠瘤內(nèi)注射100μL生理鹽水，每周注射3次，連續(xù)注射2周。注射時，使用微量注射器在腫瘤不同部位多點(diǎn)注射，以確保藥物均勻分布。B7-H3基因治療組小鼠瘤內(nèi)注射100μL攜帶B7-H3基因的腺病毒表達(dá)載體（pAd.B7-H3），病毒滴度為1×101?PFU/mL，每周注射3次，連續(xù)注射2周。注射方法同對照組。沉默Id-1基因治療組小鼠瘤內(nèi)注射100μL攜帶Id-1shRNA的慢病毒表達(dá)載體（pLV.shId-1），病毒滴度為1×10?TU/mL，每周注射3次，連續(xù)注射2周。聯(lián)合治療組小鼠瘤內(nèi)同時注射100μLpAd.B7-H3和100μLpLV.shId-1，注射頻率和療程與上述兩組相同。在治療期間，每隔3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。同時，每天觀察并記錄小鼠的體重變化、精神狀態(tài)、飲食情況等一般指標(biāo)。若發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)異常情況，如精神萎靡、食欲不振、體重急劇下降等，及時進(jìn)行相應(yīng)處理或終止實(shí)驗(yàn)。治療結(jié)束后，使用頸椎脫臼法處死小鼠，完整剝離腫瘤組織，用電子天平稱重并拍照。部分腫瘤組織用于后續(xù)的病理學(xué)檢測、免疫組化分析、蛋白質(zhì)免疫印跡檢測和實(shí)時熒光定量PCR檢測等。4.2.3檢測指標(biāo)與方法從治療開始當(dāng)天起，每隔3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。每次測量時，需在同一時間、由同一實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行操作，以減少誤差。繪制腫瘤生長曲線，觀察不同治療組腫瘤體積隨時間的變化情況。記錄小鼠從接種腫瘤細(xì)胞至死亡的時間，作為小鼠的生存時間。每天定時觀察小鼠的生存狀態(tài)，若小鼠出現(xiàn)呼吸急促、心跳微弱、無法自主活動等瀕死癥狀，判定為死亡，并記錄死亡時間。統(tǒng)計(jì)不同治療組小鼠的生存時間，繪制生存曲線，采用log-rank檢驗(yàn)分析不同治療組之間生存時間的差異。治療結(jié)束后，取部分腫瘤組織，用4%多聚甲醛固定24h，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片。采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測腫瘤細(xì)胞凋亡情況。具體操作步驟如下：將切片脫蠟至水，用蛋白酶K消化15min，然后加入TUNEL反應(yīng)混合液，37℃孵育60min。用PBS洗滌3次后，加入熒光素標(biāo)記的抗地高辛抗體，37℃孵育30min。再次用PBS洗滌后，用DAPI染核5min。在熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈綠色。隨機(jī)選取5個高倍視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡率。同時，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測腫瘤組織中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)，以評估腫瘤細(xì)胞的增殖情況。切片脫蠟至水后，用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性10min。用PBS洗滌3次后，加入正常山羊血清封閉30min。然后加入兔抗小鼠PCNA一抗，4℃孵育過