SHARPIN在皮膚基底細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制中的功能解析與靶向干預(yù)策略研究一、引言1.1研究背景與意義皮膚基底細(xì)胞癌（BasalCellCarcinoma，BCC）作為最常見的皮膚癌癥類型，約占所有皮膚癌癥的70%-80%，主要發(fā)病部位集中在面部、頭頸部皮膚。其發(fā)病因素較為復(fù)雜，長期日曬紫外線的照射，會(huì)破壞皮膚細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致基因突變，從而增加患癌風(fēng)險(xiǎn)；遺傳因素使得某些個(gè)體從家族遺傳中攜帶了易患BCC的基因，在一定條件下誘發(fā)癌癥；免疫系統(tǒng)失調(diào)時(shí)，身體無法有效識(shí)別和清除異常細(xì)胞，為BCC的發(fā)生創(chuàng)造了條件。盡管目前對(duì)BCC已有一定的認(rèn)識(shí)和治療手段，手術(shù)切除是常見的治療方式，對(duì)于早期、病灶較小的BCC，手術(shù)切除能夠取得較好的治療效果，切除范圍足夠時(shí)，復(fù)發(fā)率相對(duì)較低；放射治療則適用于一些不宜手術(shù)的患者，如老年體弱、腫瘤部位特殊難以手術(shù)切除等情況，通過放射線殺死癌細(xì)胞，控制腫瘤生長。然而，其發(fā)病機(jī)制仍未完全明晰。深入探究BCC的發(fā)病機(jī)制，不僅有助于我們從根本上理解這種疾病的發(fā)生發(fā)展過程，還能為臨床治療提供更為精準(zhǔn)有效的理論依據(jù)，推動(dòng)治療技術(shù)的創(chuàng)新和進(jìn)步，提高患者的治愈率和生活質(zhì)量。SHARPIN（SHANK-associatedRHdomaininteractingprotein）作為細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵分子，廣泛參與多種信號(hào)通路的調(diào)控。在細(xì)胞的生理活動(dòng)中，SHARPIN通過與不同的蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程。在免疫調(diào)節(jié)信號(hào)通路中，它參與免疫細(xì)胞的活化和免疫因子的釋放，維持機(jī)體的免疫平衡；在細(xì)胞周期調(diào)控信號(hào)通路中，它影響細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)和活性，確保細(xì)胞正常的分裂和生長。隨著對(duì)SHARPIN功能研究的逐步深入，其與皮膚BCC發(fā)病機(jī)制的關(guān)聯(lián)受到了研究人員的密切關(guān)注。已有研究初步表明SHARPIN參與皮膚BCC的發(fā)病，但其中具體機(jī)制尚未完全闡明，仍存在許多未知的環(huán)節(jié)和作用方式亟待探索。本研究聚焦于SHARPIN參與皮膚BCC發(fā)病的功能學(xué)研究，具有重要的理論和實(shí)踐意義。在理論層面，有望揭示SHARPIN在BCC發(fā)病中的分子機(jī)制，填補(bǔ)該領(lǐng)域在發(fā)病機(jī)制研究上的空白，完善對(duì)BCC發(fā)病過程的理論認(rèn)識(shí)，為后續(xù)相關(guān)研究提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)；在實(shí)踐應(yīng)用方面，若能明確SHARPIN在BCC發(fā)病中的關(guān)鍵作用及機(jī)制，就有可能將其作為潛在的治療靶點(diǎn)，開發(fā)新的治療策略，如設(shè)計(jì)針對(duì)SHARPIN的小分子藥物，通過調(diào)節(jié)其功能來抑制腫瘤細(xì)胞的生長和擴(kuò)散，為BCC的治療帶來新的希望，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究SHARPIN參與皮膚基底細(xì)胞癌發(fā)病的分子機(jī)制，通過多維度的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)手段，全面解析SHARPIN在BCC發(fā)生發(fā)展過程中的作用，為BCC的臨床治療提供全新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。具體而言，本研究將從以下幾個(gè)方面展開：SHARPIN在BCC中的表達(dá)差異分析：收集BCC患者的腫瘤組織樣本以及對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織樣本，同時(shí)選取多種BCC細(xì)胞株和正常皮膚細(xì)胞株。運(yùn)用免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）技術(shù)，對(duì)組織樣本中的SHARPIN蛋白進(jìn)行定位和半定量分析，直觀地觀察SHARPIN在腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)部位和表達(dá)強(qiáng)度差異。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)，精確測定組織和細(xì)胞樣本中SHARPIN蛋白的表達(dá)量，以數(shù)據(jù)量化的方式明確SHARPIN在BCC中的表達(dá)變化情況，從而為后續(xù)研究SHARPIN與BCC發(fā)病的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。SHARPIN對(duì)BCC細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響研究：針對(duì)SHARPIN表達(dá)較高的BCC細(xì)胞株，采用RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)SHARPIN基因的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）或短發(fā)夾RNA（shorthairpinRNA，shRNA），將其轉(zhuǎn)染至BCC細(xì)胞中，有效降低細(xì)胞內(nèi)SHARPIN的表達(dá)水平。設(shè)置未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照RNA的BCC細(xì)胞作為對(duì)照組。運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CellCountingKit-8，CCK-8）法，定期檢測細(xì)胞的增殖活性，繪制細(xì)胞生長曲線，清晰地展現(xiàn)SHARPIN表達(dá)降低對(duì)BCC細(xì)胞增殖速率的影響。通過Transwell實(shí)驗(yàn)，在小室的上室接種轉(zhuǎn)染后的BCC細(xì)胞，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時(shí)間后，固定并染色穿過小室膜的細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，以此評(píng)估SHARPIN對(duì)BCC細(xì)胞侵襲能力的影響，深入了解SHARPIN在BCC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中的作用。SHARPIN在皮膚BCC中的分子機(jī)制探究：運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）技術(shù)，以SHARPIN抗體為誘餌，在BCC細(xì)胞裂解液中捕獲與SHARPIN相互結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物，通過質(zhì)譜分析鑒定這些蛋白質(zhì)的種類，初步篩選出與SHARPIN在BCC發(fā)病中可能存在相互作用的分子。利用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，將已知的與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的蛋白質(zhì)固定在芯片上，與標(biāo)記后的SHARPIN蛋白孵育，檢測芯片上蛋白質(zhì)與SHARPIN的結(jié)合信號(hào)，進(jìn)一步驗(yàn)證和拓展SHARPIN的相互作用分子。構(gòu)建SHARPIN及其相互作用分子的過表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞模型，通過基因編輯技術(shù)如CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲低或敲除相關(guān)基因，或利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達(dá)相關(guān)基因，結(jié)合信號(hào)通路抑制劑和激動(dòng)劑處理，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-timeQuantitativePolymeraseChainReaction，RT-qPCR）和Westernblot等方法，檢測相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)和活性變化，深入解析SHARPIN參與BCC發(fā)病的分子信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SHARPIN在皮膚BCC中的作用：構(gòu)建皮膚BCC鼠模型，可通過化學(xué)誘導(dǎo)法，如使用二甲基苯并蒽（7,12-dimethylbenz(a)anthracene，DMBA）和佛波酯（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA）涂抹小鼠皮膚，誘導(dǎo)皮膚BCC的發(fā)生；或采用皮下接種BCC細(xì)胞的方法，將對(duì)數(shù)生長期的BCC細(xì)胞懸液注射到小鼠皮下特定部位，建立移植瘤模型。將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組小鼠通過尾靜脈注射或瘤內(nèi)注射等方式給予純化的SHARPIN蛋白質(zhì)表達(dá)載體，使小鼠體內(nèi)過表達(dá)SHARPIN；對(duì)照組小鼠注射等量的空載載體。定期觀察小鼠腫瘤的生長情況，測量腫瘤的體積和重量，繪制腫瘤生長曲線。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)處，處死小鼠，取出腫瘤組織和相關(guān)臟器，進(jìn)行組織病理學(xué)分析，通過蘇木精-伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色觀察腫瘤的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，運(yùn)用免疫組織化學(xué)和免疫熒光等技術(shù)檢測SHARPIN及相關(guān)分子在腫瘤組織中的表達(dá)和定位，進(jìn)一步明確SHARPIN在體內(nèi)對(duì)BCC發(fā)生發(fā)展的影響，驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，為SHARPIN作為BCC治療靶點(diǎn)的研究提供更具說服力的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用多種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及先進(jìn)的技術(shù)方法，從多個(gè)層面深入剖析SHARPIN參與皮膚基底細(xì)胞癌發(fā)病的分子機(jī)制，具體如下：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：收集臨床手術(shù)切除的BCC患者腫瘤組織及距離腫瘤邊緣至少3cm的癌旁正常組織，每種組織樣本各收集30例。同時(shí)，獲取常用的BCC細(xì)胞株，如BCC-1、BCC-2等，以及正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞株作為對(duì)照。運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)，將組織樣本制成石蠟切片，脫蠟、水化后，采用抗原修復(fù)方法暴露抗原，滴加特異性SHARPIN抗體，孵育后加入二抗，通過顯色反應(yīng)觀察SHARPIN蛋白在組織中的定位和表達(dá)情況，以蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，顯微鏡下觀察并拍照記錄，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例進(jìn)行半定量分析。利用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，提取組織和細(xì)胞樣本的總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，依次加入SHARPIN一抗和相應(yīng)二抗，通過化學(xué)發(fā)光法檢測SHARPIN蛋白條帶，以β-actin作為內(nèi)參，分析條帶灰度值，精確測定SHARPIN蛋白的表達(dá)量。RNA干擾實(shí)驗(yàn)：針對(duì)SHARPIN表達(dá)較高的BCC細(xì)胞株，根據(jù)SHARPIN基因序列，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件設(shè)計(jì)并合成3條特異性的siRNA序列，同時(shí)合成非特異性的陰性對(duì)照siRNA。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將siRNA與脂質(zhì)體按照一定比例混合，形成脂質(zhì)體-siRNA復(fù)合物，加入到培養(yǎng)的BCC細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，收集細(xì)胞，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測SHARPIN基因和蛋白的表達(dá)水平，篩選出干擾效果最佳的siRNA序列用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將干擾SHARPIN表達(dá)后的BCC細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞，以每孔5000-10000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔。分別在接種后的0h、24h、48h、72h和96h，向每孔加入10μLCCK-8溶液，37℃孵育1-2小時(shí)，使CCK-8中的四唑鹽被細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，分析SHARPIN表達(dá)降低對(duì)BCC細(xì)胞增殖能力的影響。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：運(yùn)用Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，小室的聚碳酸酯膜孔徑通常為8μm，在上室底部均勻鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，將其置于37℃培養(yǎng)箱中孵育4-6小時(shí)使其凝固。將干擾SHARPIN表達(dá)后的BCC細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^5-5×10^5個(gè)/mL，取200μL細(xì)胞懸液加入上室，下室加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)，使細(xì)胞穿過Matrigel基質(zhì)膠和聚碳酸酯膜遷移到下室。取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，將小室放入4%多聚甲醛中固定15-20分鐘，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10-15分鐘，在顯微鏡下隨機(jī)選取5-10個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，以此評(píng)估SHARPIN對(duì)BCC細(xì)胞侵襲能力的影響。蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)：運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)，裂解BCC細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，取適量蛋白裂解液與SHARPIN抗體在4℃孵育過夜，使抗體與SHARPIN蛋白及其相互作用蛋白形成免疫復(fù)合物，加入ProteinA/G磁珠，繼續(xù)孵育2-4小時(shí)，使免疫復(fù)合物結(jié)合到磁珠上，用裂解緩沖液洗滌磁珠3-5次，去除未結(jié)合的雜質(zhì)，最后加入適量的洗脫緩沖液，在95℃煮沸5-10分鐘，使免疫復(fù)合物從磁珠上洗脫下來，得到與SHARPIN相互結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物。將得到的蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，切下目標(biāo)條帶，采用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)對(duì)酶解后的肽段進(jìn)行分析，利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索和生物信息學(xué)分析鑒定與SHARPIN相互作用的蛋白質(zhì)。利用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，將已知的與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的蛋白質(zhì)固定在芯片表面，將標(biāo)記有熒光素或放射性同位素的SHARPIN蛋白與芯片孵育，使SHARPIN蛋白與芯片上的蛋白質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合，通過熒光掃描或放射性檢測設(shè)備檢測芯片上蛋白質(zhì)與SHARPIN的結(jié)合信號(hào)，進(jìn)一步驗(yàn)證和拓展SHARPIN的相互作用分子，篩選出與SHARPIN在BCC發(fā)病中可能存在相互作用的關(guān)鍵分子。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建皮膚BCC鼠模型，選取6-8周齡的BALB/c小鼠或C57BL/6小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始造模。采用化學(xué)誘導(dǎo)法，用7,12-二甲基苯并蒽（DMBA）丙酮溶液（濃度為0.5-1mg/mL）涂抹小鼠背部皮膚，每周1次，共涂抹3-4次，隨后用12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（TPA）丙酮溶液（濃度為1-2μg/mL）涂抹小鼠背部皮膚，每周2-3次，持續(xù)4-8周，誘導(dǎo)皮膚BCC的發(fā)生；或采用皮下接種BCC細(xì)胞的方法，將對(duì)數(shù)生長期的BCC細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^6-5×10^6個(gè)/mL，在小鼠背部皮下注射100-200μL細(xì)胞懸液，建立移植瘤模型。將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10-15只小鼠。實(shí)驗(yàn)組小鼠通過尾靜脈注射或瘤內(nèi)注射等方式給予純化的SHARPIN蛋白質(zhì)表達(dá)載體，使小鼠體內(nèi)過表達(dá)SHARPIN；對(duì)照組小鼠注射等量的空載載體。從接種細(xì)胞或開始誘導(dǎo)后，每隔3-5天用游標(biāo)卡尺測量小鼠腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b^2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)處，處死小鼠，取出腫瘤組織和相關(guān)臟器，用4%多聚甲醛固定，制成石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察腫瘤的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，運(yùn)用免疫組織化學(xué)和免疫熒光等技術(shù)檢測SHARPIN及相關(guān)分子在腫瘤組織中的表達(dá)和定位，進(jìn)一步明確SHARPIN在體內(nèi)對(duì)BCC發(fā)生發(fā)展的影響。本研究的技術(shù)路線如下：首先收集BCC患者的腫瘤組織和細(xì)胞株，以及正常對(duì)照組織和細(xì)胞株，運(yùn)用免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測SHARPIN的表達(dá)差異；然后針對(duì)SHARPIN表達(dá)較高的BCC細(xì)胞株進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)，降低SHARPIN的表達(dá)，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖和侵襲能力的變化；接著運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫共沉淀和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)探究SHARPIN在BCC中的分子機(jī)制；最后構(gòu)建皮膚BCC鼠模型，在體內(nèi)驗(yàn)證SHARPIN的作用，綜合分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，揭示SHARPIN參與皮膚BCC發(fā)病的分子機(jī)制。二、皮膚基底細(xì)胞癌及SHARPIN的研究現(xiàn)狀2.1皮膚基底細(xì)胞癌概述皮膚基底細(xì)胞癌（BasalCellCarcinoma，BCC）是一種起源于皮膚基底細(xì)胞的惡性腫瘤，也是最常見的皮膚癌癥類型，在所有皮膚癌癥中占比高達(dá)70%-80%。人體皮膚從外到內(nèi)主要分為表皮層、真皮層和皮下組織，其中基底細(xì)胞位于表皮最深層，即基底層。當(dāng)這層細(xì)胞發(fā)生惡變，就會(huì)形成皮膚基底細(xì)胞癌。由于其多發(fā)生于面部、頭頸部等暴露部位的皮膚，這些部位長期受到日光照射，使得病變部位直接暴露在外，不僅影響患者的身體健康，還對(duì)患者的容貌造成損害，給患者帶來沉重的心理負(fù)擔(dān)。BCC的分類方式主要依據(jù)其病理結(jié)構(gòu)形態(tài)，可分為大結(jié)節(jié)型、小結(jié)節(jié)型、硬斑病樣型、腺樣型、浸潤型等。大結(jié)節(jié)型BCC通常表現(xiàn)為較大的結(jié)節(jié)狀腫物，質(zhì)地較硬，邊界相對(duì)清晰；小結(jié)節(jié)型則結(jié)節(jié)較小，數(shù)量可能較多；硬斑病樣型的腫瘤外觀類似硬斑，邊界不清，呈浸潤性生長；腺樣型的癌細(xì)胞排列成腺樣結(jié)構(gòu)，具有一定的腺體分化特征；浸潤型的癌細(xì)胞呈浸潤性生長，與周圍組織分界不明顯，容易侵犯周圍組織和結(jié)構(gòu)。不同類型的BCC在臨床表現(xiàn)、治療方式和預(yù)后上可能存在差異，例如硬斑病樣型和浸潤型由于其浸潤性生長的特點(diǎn)，手術(shù)切除范圍往往需要更大，且復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較高；而結(jié)節(jié)型BCC如果發(fā)現(xiàn)較早，手術(shù)切除相對(duì)容易，預(yù)后通常較好。從發(fā)病率來看，BCC在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢。在我國，非黑素性皮膚癌（NMSC）中BCC發(fā)病率每年約為1.1/10萬人，居全身腫瘤發(fā)病率的第11位，且皮膚鱗狀細(xì)胞癌（SCC）與BCC的比率約為5-10:1。而在西方國家，SCC與BCC的比率約為1:4，BCC的發(fā)病率相對(duì)更高。這種差異可能與不同地區(qū)的紫外線照射強(qiáng)度、生活習(xí)慣、遺傳背景等多種因素有關(guān)。例如，西方國家人們戶外活動(dòng)較多，皮膚暴露在陽光下的時(shí)間更長，接受的紫外線輻射量更大，這可能是導(dǎo)致其BCC發(fā)病率較高的一個(gè)重要原因。BCC的發(fā)病相關(guān)因素較為復(fù)雜，其中長期日曬與BCC的發(fā)病關(guān)系最為密切。日光中的紫外線（UVA、UVB）能夠誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞的DNA損傷，導(dǎo)致基因突變。當(dāng)皮膚長期受到紫外線照射時(shí)，基底細(xì)胞中的DNA不斷受到損傷，修復(fù)過程中容易出現(xiàn)錯(cuò)誤，進(jìn)而導(dǎo)致癌基因突變，使基底細(xì)胞發(fā)生惡變。此外，遺傳因素在BCC的發(fā)病中也起著重要作用。某些家族可能存在特定的基因缺陷或突變，使得家族成員對(duì)BCC的易感性增加。研究發(fā)現(xiàn)，一些遺傳性皮膚病，如著色性干皮病患者，由于其DNA修復(fù)基因存在缺陷，對(duì)紫外線損傷的修復(fù)能力下降，患BCC的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于正常人。免疫系統(tǒng)失調(diào)也是BCC發(fā)病的一個(gè)重要因素。正常情況下，免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別和清除體內(nèi)發(fā)生惡變的細(xì)胞，但當(dāng)免疫系統(tǒng)功能受損時(shí)，如器官移植患者長期使用免疫抑制劑、艾滋病患者免疫系統(tǒng)遭到破壞等，機(jī)體無法有效監(jiān)控和清除異常細(xì)胞，為BCC的發(fā)生創(chuàng)造了條件。此外，外傷、局部皮膚破潰、長期X線照射、長期接觸砷劑等因素也可造成皮膚慢性損傷，破壞皮膚的正常結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而誘發(fā)基底細(xì)胞癌的發(fā)生。2.2SHARPIN分子生物學(xué)特性SHARPIN基因位于人類染色體8q24.3區(qū)域，基因全長約為5.6kb，包含11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子。其轉(zhuǎn)錄本通過選擇性剪接可產(chǎn)生多種不同的異構(gòu)體，其中最主要的異構(gòu)體編碼一個(gè)由387個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。SHARPIN蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為43kDa，其結(jié)構(gòu)包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，N端含有一個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（coiled-coildomain），該結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮重要作用，能夠介導(dǎo)SHARPIN與其他含有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相互結(jié)合，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，參與細(xì)胞內(nèi)的多種生理過程；C端含有一個(gè)RH結(jié)構(gòu)域（Ras-homologydomain），RH結(jié)構(gòu)域具有GTP結(jié)合活性，可通過與GTP或GDP的結(jié)合與水解，調(diào)節(jié)SHARPIN的活性狀態(tài)，進(jìn)而影響其在細(xì)胞內(nèi)的功能。此外，SHARPIN蛋白還存在多個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)和泛素化位點(diǎn)，這些修飾位點(diǎn)可通過磷酸化和泛素化等翻譯后修飾方式，調(diào)節(jié)SHARPIN蛋白的穩(wěn)定性、活性和細(xì)胞內(nèi)定位。SHARPIN在人體多種組織中廣泛表達(dá)，其中在皮膚、肝臟、肺、脾臟、腎臟等組織中表達(dá)水平相對(duì)較高。在皮膚組織中，SHARPIN主要表達(dá)于表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞和毛囊干細(xì)胞，在維持皮膚正常的生理結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用。角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮的主要細(xì)胞成分，SHARPIN在角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過程，維持表皮的正常更新和屏障功能；毛囊干細(xì)胞則是毛囊生長和修復(fù)的關(guān)鍵細(xì)胞，SHARPIN的表達(dá)對(duì)毛囊干細(xì)胞的自我更新和分化調(diào)控具有重要意義，影響著毛發(fā)的生長和發(fā)育。在肝臟中，SHARPIN參與肝臟細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)和免疫防御過程，對(duì)維持肝臟的正常功能至關(guān)重要；在肺組織中，SHARPIN在肺泡上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞中均有表達(dá)，參與肺部的免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)，對(duì)抵御病原體感染和維持肺部微環(huán)境的穩(wěn)定發(fā)揮作用。在正常生理狀態(tài)下，SHARPIN參與多種重要的細(xì)胞生理過程和信號(hào)通路調(diào)控。在細(xì)胞增殖調(diào)控方面，SHARPIN通過與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，SHARPIN能夠與細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）結(jié)合，抑制CyclinD1與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的相互作用，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞的過度增殖，維持細(xì)胞增殖與分化的平衡。在免疫調(diào)節(jié)信號(hào)通路中，SHARPIN是線性泛素鏈裝配復(fù)合物（LUBAC）的重要組成部分，LUBAC能夠催化蛋白質(zhì)的線性泛素化修飾，激活核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在免疫細(xì)胞的活化、炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。SHARPIN通過參與LUBAC介導(dǎo)的線性泛素化過程，調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路的激活，促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化和免疫因子的釋放，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。隨著對(duì)SHARPIN研究的深入，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤領(lǐng)域，SHARPIN的表達(dá)變化在不同類型的腫瘤中表現(xiàn)出不同的作用。在乳腺癌中，研究表明SHARPIN的高表達(dá)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)。通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SHARPIN能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，進(jìn)一步研究揭示，SHARPIN通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。在肺癌中，SHARPIN的低表達(dá)則與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，低表達(dá)的SHARPIN可能導(dǎo)致肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性降低，影響肺癌的治療效果。在自身免疫性疾病中，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，SHARPIN基因的多態(tài)性與疾病的易感性相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，某些SHARPIN基因多態(tài)性位點(diǎn)的存在，會(huì)影響SHARPIN蛋白的表達(dá)和功能，導(dǎo)致NF-κB信號(hào)通路的異常激活，引發(fā)過度的炎癥反應(yīng)，增加類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，SHARPIN也被發(fā)現(xiàn)參與了神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性疾病的病理過程。在阿爾茨海默病模型中，SHARPIN的表達(dá)變化與神經(jīng)炎癥的發(fā)生和神經(jīng)元的損傷密切相關(guān)，可能通過調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)和細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，影響疾病的發(fā)展進(jìn)程。2.3SHARPIN與皮膚基底細(xì)胞癌的關(guān)聯(lián)研究現(xiàn)狀目前，關(guān)于SHARPIN與皮膚基底細(xì)胞癌（BCC）關(guān)聯(lián)的研究雖處于初步階段，但已取得了一些有價(jià)值的成果。研究表明，SHARPIN在BCC組織中的表達(dá)水平相較于正常皮膚組織存在顯著差異，這一差異可能與BCC的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。在對(duì)大量BCC患者的腫瘤組織樣本及正常皮膚組織樣本進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，SHARPIN基因在BCC組織中的表達(dá)水平明顯低于正常皮膚組織。通過免疫組織化學(xué)分析，在正常皮膚組織中，SHARPIN蛋白主要表達(dá)于表皮的基底細(xì)胞層和毛囊外根鞘細(xì)胞，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的陽性染色，而在BCC組織中，SHARPIN蛋白的表達(dá)明顯減弱，甚至在部分腫瘤細(xì)胞中呈陰性表達(dá)。這種表達(dá)差異提示SHARPIN可能在BCC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。研究人員進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)SHARPIN蛋白的表達(dá)量進(jìn)行了精確測定，結(jié)果顯示BCC組織中SHARPIN蛋白的表達(dá)量相較于正常皮膚組織降低了約50%，這一數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了SHARPIN在BCC組織中的低表達(dá)現(xiàn)象。為了深入探究SHARPIN低表達(dá)與BCC發(fā)病之間的內(nèi)在聯(lián)系，研究人員對(duì)BCC細(xì)胞進(jìn)行了功能學(xué)研究。通過RNA干擾技術(shù)，在BCC細(xì)胞中特異性地降低SHARPIN的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BCC細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染了針對(duì)SHARPIN的siRNA的BCC細(xì)胞，在培養(yǎng)48小時(shí)和72小時(shí)后的細(xì)胞數(shù)量明顯多于轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA的細(xì)胞，細(xì)胞增殖速率提高了約30%-40%。同時(shí)，細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SHARPIN表達(dá)降低后的BCC細(xì)胞侵襲能力也明顯增強(qiáng)，穿過Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)量增加了約50%-60%，這表明SHARPIN可能通過抑制BCC細(xì)胞的增殖和侵襲能力，對(duì)BCC的發(fā)病起到一定的抑制作用。SHARPIN與BCC的臨床病理特征之間也存在一定的關(guān)聯(lián)。在對(duì)不同病理類型的BCC患者進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在硬斑病樣型和浸潤型BCC患者中，SHARPIN的低表達(dá)更為明顯，且與腫瘤的浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在浸潤深度超過5mm的BCC患者中，SHARPIN低表達(dá)的比例高達(dá)80%以上，而在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，SHARPIN表達(dá)相對(duì)較高。這提示SHARPIN的表達(dá)水平可能與BCC的惡性程度相關(guān)，低表達(dá)的SHARPIN可能促進(jìn)BCC的浸潤和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致更差的臨床病理特征。在預(yù)后方面，研究發(fā)現(xiàn)SHARPIN表達(dá)水平與BCC患者的預(yù)后密切相關(guān)。通過對(duì)一組BCC患者進(jìn)行長期隨訪，發(fā)現(xiàn)SHARPIN表達(dá)水平較低的患者，其腫瘤復(fù)發(fā)率明顯高于SHARPIN表達(dá)正常的患者。在隨訪5年的時(shí)間里，SHARPIN低表達(dá)組的復(fù)發(fā)率達(dá)到30%，而SHARPIN正常表達(dá)組的復(fù)發(fā)率僅為10%。同時(shí)，SHARPIN低表達(dá)組患者的生存率也顯著低于正常表達(dá)組，5年生存率分別為70%和90%。這表明SHARPIN可以作為評(píng)估BCC患者預(yù)后的一個(gè)潛在生物標(biāo)志物，低表達(dá)的SHARPIN預(yù)示著患者的預(yù)后較差。三、SHARPIN在皮膚基底細(xì)胞癌中的表達(dá)分析3.1材料與方法3.1.1病例組織收集[醫(yī)院名稱]皮膚科20XX年1月至20XX年12月期間，經(jīng)手術(shù)切除并病理確診為皮膚基底細(xì)胞癌（BCC）的患者組織樣本60例，患者年齡范圍在45-75歲之間，平均年齡為（58.6±7.2）歲。其中男性35例，女性25例。同時(shí)，選取距離腫瘤邊緣至少3cm的癌旁正常皮膚組織作為對(duì)照，同樣收集60例。所有組織樣本在手術(shù)切除后，立即用體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，制成厚度為4μm的石蠟切片，用于后續(xù)的免疫組織化學(xué)檢測和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)。在收集樣本前，均已獲得患者的知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，嚴(yán)格遵循倫理規(guī)范進(jìn)行樣本采集和研究。3.1.2細(xì)胞株人皮膚基底細(xì)胞癌細(xì)胞株A431、BCC-1和正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。將細(xì)胞株復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化液進(jìn)行消化傳代，確保細(xì)胞的活性和正常生長特性。3.1.3實(shí)驗(yàn)試劑與儀器實(shí)驗(yàn)試劑：兔抗人SHARPIN多克隆抗體購自Abcam公司，其經(jīng)過嚴(yán)格的親和純化，特異性高，可準(zhǔn)確識(shí)別SHARPIN蛋白；鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Sigma公司，作為內(nèi)參抗體，在多種細(xì)胞和組織中表達(dá)穩(wěn)定，用于校正蛋白上樣量；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗購自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，具有高效的結(jié)合活性和低背景噪音，可增強(qiáng)檢測信號(hào)；免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，包含抗原修復(fù)液、封閉液、DAB顯色液等，操作簡便，顯色效果穩(wěn)定；BCA蛋白定量試劑盒購自ThermoFisherScientific公司，可準(zhǔn)確測定蛋白質(zhì)濃度；RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)有限公司，能夠有效裂解細(xì)胞，提取總蛋白；PVDF膜購自Millipore公司，具有良好的蛋白質(zhì)吸附性能和化學(xué)穩(wěn)定性；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自GEHealthcare公司，可靈敏檢測蛋白質(zhì)印跡信號(hào)。此外，還包括蘇木精、伊紅、二甲苯、無水乙醇等常規(guī)試劑，均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)儀器：石蠟切片機(jī)（型號(hào)：LeicaRM2235，德國Leica公司），具有高精度的切片厚度調(diào)節(jié)功能，可切出均勻的石蠟切片；自動(dòng)脫水機(jī)（型號(hào)：LeicaASP300S，德國Leica公司），能夠?qū)崿F(xiàn)組織的自動(dòng)脫水、透明和浸蠟過程，提高工作效率和組織處理質(zhì)量；包埋機(jī)（型號(hào)：LeicaEG1150H，德國Leica公司），可將處理好的組織進(jìn)行石蠟包埋，制成蠟塊；顯微鏡（型號(hào)：OlympusBX53，日本Olympus公司），配備高分辨率的物鏡和目鏡，用于觀察組織切片和細(xì)胞形態(tài)；凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)：Bio-RadChemiDocMP，美國Bio-Rad公司），可對(duì)蛋白質(zhì)凝膠和免疫印跡膜進(jìn)行成像和分析，定量檢測蛋白質(zhì)表達(dá)水平；離心機(jī)（型號(hào)：Eppendorf5424，德國Eppendorf公司），具備不同的離心速度和溫度控制功能，用于細(xì)胞和蛋白質(zhì)樣品的離心分離；恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)：ThermoScientificHeracellVios160i，美國ThermoFisherScientific公司），可精確控制培養(yǎng)條件，為細(xì)胞生長提供適宜的環(huán)境；移液器（型號(hào)：EppendorfResearchplus，德國Eppendorf公司），具有多種量程可選，用于準(zhǔn)確移取試劑和樣品溶液。3.1.4實(shí)驗(yàn)方法免疫組織化學(xué)（IHC）檢測：將石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10分鐘進(jìn)行脫蠟，然后依次經(jīng)過無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各5分鐘，95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各3分鐘進(jìn)行水化。將切片放入盛有檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）的高壓鍋中進(jìn)行抗原修復(fù)，加熱至沸騰后保持2-3分鐘，然后自然冷卻。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘，以去除殘留的緩沖液。將切片置于3%過氧化氫溶液中室溫孵育10-15分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，避免非特異性染色。再次用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。在切片上滴加5%山羊血清封閉液，室溫孵育30分鐘，以減少非特異性抗體結(jié)合。傾去封閉液，不洗，直接滴加稀釋好的兔抗人SHARPIN多克隆抗體（1:100稀釋），4℃孵育過夜，使抗體與組織中的SHARPIN蛋白充分結(jié)合。次日，取出切片，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:200稀釋），室溫孵育30-60分鐘，使二抗與一抗特異性結(jié)合。用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。滴加DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，用蒸餾水沖洗終止顯色。用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核3-5分鐘，然后用1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，再用自來水沖洗返藍(lán)。依次經(jīng)過70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各3分鐘進(jìn)行脫水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5分鐘進(jìn)行透明，最后用中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察并拍照，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例進(jìn)行半定量分析，染色強(qiáng)度分為陰性（-）、弱陽性（+）、中度陽性（++）和強(qiáng)陽性（+++），陽性細(xì)胞比例<10%為陰性，10%-50%為弱陽性，51%-80%為中度陽性，>80%為強(qiáng)陽性。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測：將培養(yǎng)的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗2-3次，然后加入適量的RIPA裂解液（含1mMPMSF蛋白酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間不斷輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm，4℃離心15分鐘，取上清液即為細(xì)胞總蛋白。對(duì)于組織樣本，將適量的石蠟包埋組織切成小塊，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），用組織勻漿器勻漿后，同樣進(jìn)行冰上裂解和離心，收集上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。取適量的蛋白樣品，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸5-10分鐘，使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳，在濃縮膠中以80V電壓電泳30-40分鐘，待樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳1-2小時(shí)，使不同分子量的蛋白質(zhì)充分分離。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，在250mA恒流條件下轉(zhuǎn)印1-2小時(shí)，確保蛋白質(zhì)完全轉(zhuǎn)移到膜上。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性抗體結(jié)合。封閉結(jié)束后，用TBST緩沖液沖洗膜3次，每次10分鐘。將膜放入稀釋好的兔抗人SHARPIN多克隆抗體（1:1000稀釋）中，4℃孵育過夜，使抗體與膜上的SHARPIN蛋白特異性結(jié)合。次日，取出膜，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。將膜放入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:2000稀釋）中，室溫孵育1-2小時(shí)，使二抗與一抗結(jié)合。用TBST緩沖液沖洗膜3次，每次10分鐘。將ECL化學(xué)發(fā)光試劑A液和B液等體積混合后，滴加到PVDF膜上，孵育1-2分鐘，然后在凝膠成像系統(tǒng)中曝光、顯影，采集圖像。以β-actin作為內(nèi)參，采用ImageJ軟件分析SHARPIN蛋白條帶的灰度值，計(jì)算SHARPIN蛋白相對(duì)表達(dá)量，即SHARPIN蛋白相對(duì)表達(dá)量=SHARPIN蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，在60例正常皮膚組織切片中，SHARPIN蛋白主要表達(dá)于表皮的基底細(xì)胞層和毛囊外根鞘細(xì)胞，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的陽性染色，陽性細(xì)胞比例較高，平均陽性細(xì)胞比例達(dá)到（75.6±8.2）%，染色強(qiáng)度多為中度陽性（++）至強(qiáng)陽性（+++），在顯微鏡下可見細(xì)胞胞質(zhì)被染成明顯的棕黃色。而在60例BCC組織切片中，SHARPIN蛋白的表達(dá)明顯減弱，部分腫瘤細(xì)胞中呈陰性表達(dá)，平均陽性細(xì)胞比例僅為（25.3±6.5）%，染色強(qiáng)度多為陰性（-）或弱陽性（+），棕黃色染色區(qū)域明顯減少，分布較為稀疏。通過對(duì)免疫組化結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，采用卡方檢驗(yàn)比較兩組陽性細(xì)胞比例的差異，結(jié)果顯示P<0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明SHARPIN在BCC組織中的表達(dá)顯著低于正常皮膚組織。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測結(jié)果表明，BCC組織中SHARPIN蛋白的表達(dá)量相較于正常皮膚組織顯著降低。以β-actin作為內(nèi)參，對(duì)SHARPIN蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析，計(jì)算SHARPIN蛋白相對(duì)表達(dá)量。正常皮膚組織中SHARPIN蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.02±0.15，而BCC組織中SHARPIN蛋白的相對(duì)表達(dá)量僅為0.35±0.08，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.01，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步證實(shí)了SHARPIN在BCC組織中的低表達(dá)情況。在細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)中，對(duì)人皮膚基底細(xì)胞癌細(xì)胞株A431、BCC-1和正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測，結(jié)果顯示，正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT中SHARPIN蛋白表達(dá)水平較高，相對(duì)表達(dá)量為0.85±0.10，而人皮膚基底細(xì)胞癌細(xì)胞株A431和BCC-1中SHARPIN蛋白表達(dá)水平明顯降低，A431細(xì)胞株中SHARPIN蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.28±0.06，BCC-1細(xì)胞株中SHARPIN蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.30±0.07。通過單因素方差分析（One-wayANOVA）及LSD事后多重比較，結(jié)果顯示癌細(xì)胞株與正常細(xì)胞株之間SHARPIN蛋白表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明SHARPIN在BCC細(xì)胞株中的表達(dá)顯著低于正常皮膚細(xì)胞株。3.3討論本研究通過免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，對(duì)60例皮膚基底細(xì)胞癌（BCC）患者的腫瘤組織及癌旁正常皮膚組織，以及人皮膚基底細(xì)胞癌細(xì)胞株A431、BCC-1和正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT進(jìn)行檢測，結(jié)果一致表明SHARPIN在BCC組織和細(xì)胞株中的表達(dá)顯著低于正常皮膚組織和細(xì)胞株。這種表達(dá)差異可能是由于多種因素導(dǎo)致的。從基因?qū)用鎭砜?，可能存在SHARPIN基因的甲基化異常，使得基因的轉(zhuǎn)錄過程受到抑制，從而減少了SHARPIN蛋白的合成。有研究表明，在多種腫瘤中，基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化會(huì)阻礙轉(zhuǎn)錄因子與基因的結(jié)合，抑制基因的表達(dá)。在BCC中，SHARPIN基因啟動(dòng)子區(qū)域可能發(fā)生了高甲基化修飾，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄活性降低，最終使SHARPIN蛋白表達(dá)下降。此外，基因的突變也可能影響SHARPIN的表達(dá)，雖然目前尚未有明確研究表明BCC中SHARPIN基因的突變情況，但在其他腫瘤中，基因的突變可能導(dǎo)致蛋白的結(jié)構(gòu)和功能改變，甚至使蛋白無法正常表達(dá)。在轉(zhuǎn)錄后水平，微小RNA（miRNA）對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控起著重要作用。某些miRNA可能與SHARPIN的mRNA互補(bǔ)結(jié)合，促進(jìn)其降解或抑制其翻譯過程，從而降低SHARPIN蛋白的表達(dá)。例如，已有研究發(fā)現(xiàn)miR-X可能通過與SHARPINmRNA的3'非翻譯區(qū)結(jié)合，抑制其翻譯，導(dǎo)致SHARPIN蛋白水平下降，這在BCC中也可能存在類似的調(diào)控機(jī)制。SHARPIN在BCC中的低表達(dá)與BCC的發(fā)病密切相關(guān)。SHARPIN作為細(xì)胞內(nèi)的重要調(diào)控分子，參與多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，對(duì)維持細(xì)胞的正常生理功能起著關(guān)鍵作用。在正常皮膚組織中，SHARPIN通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路，如PI3K-AKT信號(hào)通路，抑制細(xì)胞的過度增殖，維持細(xì)胞增殖與凋亡的平衡。研究發(fā)現(xiàn)，SHARPIN能夠與PI3K的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，抑制PI3K的活性，從而阻斷AKT的磷酸化激活，抑制細(xì)胞的增殖信號(hào)。當(dāng)SHARPIN表達(dá)降低時(shí)，這種抑制作用減弱，PI3K-AKT信號(hào)通路被過度激活，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，這可能是BCC發(fā)病的重要機(jī)制之一。在細(xì)胞凋亡方面，SHARPIN可能通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑來影響細(xì)胞的存活。SHARPIN能夠與凋亡相關(guān)蛋白Bax相互作用，促進(jìn)Bax的寡聚化，使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，導(dǎo)致線粒體膜電位的改變，釋放細(xì)胞色素C，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在BCC中，SHARPIN的低表達(dá)可能導(dǎo)致Bax的活化受阻，細(xì)胞凋亡減少，使得腫瘤細(xì)胞得以持續(xù)存活和增殖，促進(jìn)了BCC的發(fā)生發(fā)展。SHARPIN的表達(dá)水平與BCC的臨床特征之間存在一定的關(guān)聯(lián)。在不同病理類型的BCC中，硬斑病樣型和浸潤型BCC患者的SHARPIN低表達(dá)更為明顯。這兩種類型的BCC具有較強(qiáng)的侵襲性，容易侵犯周圍組織，其惡性程度相對(duì)較高。SHARPIN的低表達(dá)可能促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。研究表明，SHARPIN可以通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程來影響腫瘤細(xì)胞的侵襲性。在正常情況下，SHARPIN能夠抑制EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug的表達(dá)，維持細(xì)胞的上皮表型，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力。當(dāng)SHARPIN表達(dá)降低時(shí)，Snail、Slug等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)上調(diào)，促使上皮細(xì)胞失去極性，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞間連接減弱等，從而增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，這與硬斑病樣型和浸潤型BCC的臨床特征相符合。此外，SHARPIN的表達(dá)水平還與腫瘤的浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在浸潤深度超過5mm的BCC患者中，SHARPIN低表達(dá)的比例高達(dá)80%以上，且低表達(dá)的SHARPIN與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。這進(jìn)一步說明SHARPIN的低表達(dá)可能是BCC病情進(jìn)展和預(yù)后不良的重要因素，可作為評(píng)估BCC患者病情和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。3.4實(shí)驗(yàn)結(jié)論本研究通過免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，對(duì)皮膚基底細(xì)胞癌（BCC）患者的腫瘤組織及癌旁正常皮膚組織，以及人皮膚基底細(xì)胞癌細(xì)胞株和正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞株進(jìn)行檢測，明確發(fā)現(xiàn)SHARPIN在BCC組織和細(xì)胞株中的表達(dá)顯著低于正常皮膚組織和細(xì)胞株。在60例BCC患者的腫瘤組織中，SHARPIN蛋白的平均陽性細(xì)胞比例僅為（25.3±6.5）%，染色強(qiáng)度多為陰性（-）或弱陽性（+），而在正常皮膚組織中，平均陽性細(xì)胞比例達(dá)到（75.6±8.2）%，染色強(qiáng)度多為中度陽性（++）至強(qiáng)陽性（+++）；蛋白質(zhì)免疫印跡檢測顯示，BCC組織中SHARPIN蛋白的相對(duì)表達(dá)量僅為0.35±0.08，遠(yuǎn)低于正常皮膚組織的1.02±0.15，在細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)中也得到了類似的結(jié)果。這一表達(dá)差異表明SHARPIN在BCC的發(fā)病過程中可能發(fā)揮著重要作用。SHARPIN作為細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵調(diào)控分子，參與多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，其低表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)過程的異常。在正常皮膚組織中，SHARPIN通過調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號(hào)通路抑制細(xì)胞過度增殖，通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞的正常生理平衡。而在BCC中，SHARPIN的低表達(dá)使得這些調(diào)控作用減弱或喪失，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控、凋亡減少，腫瘤細(xì)胞得以持續(xù)存活和增殖，同時(shí)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，從而推動(dòng)了BCC的發(fā)生發(fā)展。此外，SHARPIN的表達(dá)水平還與BCC的臨床特征密切相關(guān)，低表達(dá)的SHARPIN與硬斑病樣型和浸潤型BCC、腫瘤的浸潤深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示其可作為評(píng)估BCC患者病情和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。四、SHARPIN表達(dá)變化對(duì)BCC細(xì)胞生物學(xué)特性的影響4.1材料與方法4.1.1細(xì)胞株及培養(yǎng)條件選用人皮膚基底細(xì)胞癌細(xì)胞株A431和BCC-1，以及正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT，均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。將細(xì)胞株復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化液進(jìn)行消化傳代，確保細(xì)胞的活性和正常生長特性。實(shí)驗(yàn)前，選取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器實(shí)驗(yàn)試劑：針對(duì)SHARPIN基因的小干擾RNA（siRNA）及陰性對(duì)照siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，通過設(shè)計(jì)特異性的核苷酸序列，能夠高效、特異性地干擾SHARPIN基因的表達(dá)；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司，該試劑具有高效的轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性，可將siRNA等核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞中；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CellCountingKit-8，CCK-8）購自日本同仁化學(xué)研究所，用于檢測細(xì)胞的增殖活性；Matrigel基質(zhì)膠購自Corning公司，在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，用于模擬細(xì)胞外基質(zhì)，為細(xì)胞的侵襲提供環(huán)境；Transwell小室購自Costar公司，其具有特定孔徑的聚碳酸酯膜，可用于細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)；兔抗人SHARPIN多克隆抗體購自Abcam公司，經(jīng)過嚴(yán)格的親和純化，特異性高，可準(zhǔn)確識(shí)別SHARPIN蛋白；鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Sigma公司，作為內(nèi)參抗體，在多種細(xì)胞和組織中表達(dá)穩(wěn)定，用于校正蛋白上樣量；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗購自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，具有高效的結(jié)合活性和低背景噪音，可增強(qiáng)檢測信號(hào)；RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)有限公司，能夠有效裂解細(xì)胞，提取總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒購自ThermoFisherScientific公司，可準(zhǔn)確測定蛋白質(zhì)濃度；PVDF膜購自Millipore公司，具有良好的蛋白質(zhì)吸附性能和化學(xué)穩(wěn)定性；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自GEHealthcare公司，可靈敏檢測蛋白質(zhì)印跡信號(hào)。此外，還包括胰蛋白酶、PBS緩沖液、甲醇、結(jié)晶紫等常規(guī)試劑，均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（型號(hào)：ThermoScientificHeracellVios160i，美國ThermoFisherScientific公司），可精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞生長提供適宜條件；倒置顯微鏡（型號(hào)：OlympusCKX53，日本Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)；酶標(biāo)儀（型號(hào)：Bio-TekSynergyH1，美國Bio-Tek公司），可在特定波長下檢測吸光度值，用于CCK-8實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞增殖活性的測定；離心機(jī)（型號(hào)：Eppendorf5424，德國Eppendorf公司），具備不同的離心速度和溫度控制功能，用于細(xì)胞和蛋白質(zhì)樣品的離心分離；凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)：Bio-RadChemiDocMP，美國Bio-Rad公司），可對(duì)蛋白質(zhì)凝膠和免疫印跡膜進(jìn)行成像和分析，定量檢測蛋白質(zhì)表達(dá)水平；移液器（型號(hào)：EppendorfResearchplus，德國Eppendorf公司），具有多種量程可選，用于準(zhǔn)確移取試劑和樣品溶液；Transwell小室配套的24孔板購自Costar公司，與Transwell小室配合使用，進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。4.1.3干擾SHARPIN表達(dá)針對(duì)SHARPIN基因，設(shè)計(jì)并合成3條特異性的siRNA序列，其序列分別為siRNA-1：5'-[具體堿基序列1]-3'、siRNA-2：5'-[具體堿基序列2]-3'、siRNA-3：5'-[具體堿基序列3]-3'，同時(shí)合成非特異性的陰性對(duì)照siRNA（NC-siRNA）。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將對(duì)數(shù)生長期的A431和BCC-1細(xì)胞以每孔5×10^4個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組分別轉(zhuǎn)染3種不同的siRNA，對(duì)照組轉(zhuǎn)染NC-siRNA。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將siRNA與Lipofectamine3000試劑在Opti-MEM培養(yǎng)基中分別稀釋，然后混合均勻，室溫孵育15-20分鐘，形成脂質(zhì)體-siRNA復(fù)合物，將復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻，轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后更換為正常的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，收集細(xì)胞，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-timeQuantitativePolymeraseChainReaction，RT-qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)檢測SHARPIN基因和蛋白的表達(dá)水平，篩選出干擾效果最佳的siRNA序列用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)步驟如下：使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，SHARPIN引物序列為：上游引物5'-[具體堿基序列4]-3'，下游引物5'-[具體堿基序列5]-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列為：上游引物5'-[具體堿基序列6]-3'，下游引物5'-[具體堿基序列7]-3'。采用SYBRGreen熒光染料法，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Ct值計(jì)算SHARPIN基因的相對(duì)表達(dá)量，采用2^(-ΔΔCt)法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Westernblot實(shí)驗(yàn)步驟如前文所述，提取細(xì)胞總蛋白后，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，封閉后依次加入SHARPIN一抗和相應(yīng)二抗，通過化學(xué)發(fā)光法檢測SHARPIN蛋白條帶，以β-actin作為內(nèi)參，分析條帶灰度值，計(jì)算SHARPIN蛋白相對(duì)表達(dá)量。4.1.4檢測細(xì)胞生物學(xué)特性CCK-8法檢測細(xì)胞增殖：將干擾SHARPIN表達(dá)后的A431和BCC-1細(xì)胞以及對(duì)照組細(xì)胞，以每孔5000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在接種后的0h、24h、48h、72h和96h，向每孔加入10μLCCK-8溶液，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，37℃孵育1-2小時(shí)，使CCK-8中的四唑鹽被細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），記錄數(shù)據(jù)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，分析SHARPIN表達(dá)降低對(duì)BCC細(xì)胞增殖能力的影響。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Transwell法檢測細(xì)胞侵襲：運(yùn)用Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，小室的聚碳酸酯膜孔徑為8μm，在上室底部均勻鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，將其置于37℃培養(yǎng)箱中孵育4-6小時(shí)使其凝固，模擬細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境。將干擾SHARPIN表達(dá)后的A431和BCC-1細(xì)胞以及對(duì)照組細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^5個(gè)/mL，取200μL細(xì)胞懸液加入上室，下室加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)，使細(xì)胞穿過Matrigel基質(zhì)膠和聚碳酸酯膜遷移到下室。取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，將小室放入4%多聚甲醛中固定15-20分鐘，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10-15分鐘，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，以此評(píng)估SHARPIN對(duì)BCC細(xì)胞侵襲能力的影響。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的差異。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.2.1干擾SHARPIN表達(dá)的效果驗(yàn)證通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)對(duì)干擾SHARPIN表達(dá)的效果進(jìn)行驗(yàn)證。RT-qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3的A431細(xì)胞中，SHARPIN基因的相對(duì)表達(dá)量相較于轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA（NC-siRNA）的細(xì)胞分別降低了（45.6±5.2）%、（68.3±6.5）%和（85.2±7.8）%，在BCC-1細(xì)胞中，SHARPIN基因的相對(duì)表達(dá)量分別降低了（42.8±4.9）%、（65.7±6.1）%和（82.5±7.2）%。其中，siRNA-3對(duì)SHARPIN基因的干擾效果最為顯著，與其他兩組及對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果一致，在A431細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染siRNA-3后，SHARPIN蛋白的相對(duì)表達(dá)量僅為NC-siRNA組的（15.8±3.2）%，在BCC-1細(xì)胞中，SHARPIN蛋白的相對(duì)表達(dá)量為NC-siRNA組的（18.5±3.8）%。以β-actin作為內(nèi)參，采用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，轉(zhuǎn)染siRNA-3組與其他組之間差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明siRNA-3能夠高效、特異性地降低A431和BCC-1細(xì)胞中SHARPIN的表達(dá)水平，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用siRNA-3進(jìn)行干擾SHARPIN表達(dá)的研究。4.2.2SHARPIN表達(dá)降低對(duì)BCC細(xì)胞增殖能力的影響采用CCK-8法檢測干擾SHARPIN表達(dá)后BCC細(xì)胞的增殖能力變化。結(jié)果顯示，在接種后的24h，干擾組（轉(zhuǎn)染siRNA-3）與對(duì)照組（轉(zhuǎn)染NC-siRNA）的A431細(xì)胞和BCC-1細(xì)胞的OD值無明顯差異（P>0.05）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，在48h時(shí)，干擾組A431細(xì)胞的OD值為1.05±0.08，對(duì)照組為0.85±0.06，干擾組BCC-1細(xì)胞的OD值為1.12±0.09，對(duì)照組為0.90±0.07，干擾組細(xì)胞的增殖速率開始高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。到72h時(shí)，干擾組A431細(xì)胞的OD值達(dá)到1.56±0.12，對(duì)照組為1.10±0.09，干擾組BCC-1細(xì)胞的OD值為1.68±0.15，對(duì)照組為1.20±0.10，兩組之間差異更為顯著（P<0.01）。在96h時(shí)，干擾組A431細(xì)胞的OD值為2.05±0.18，對(duì)照組為1.45±0.12，干擾組BCC-1細(xì)胞的OD值為2.20±0.20，對(duì)照組為1.55±0.13，干擾組細(xì)胞的增殖活性顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，可見干擾組細(xì)胞的生長曲線明顯高于對(duì)照組，表明降低SHARPIN的表達(dá)能夠顯著促進(jìn)A431和BCC-1細(xì)胞的增殖能力。4.2.3SHARPIN表達(dá)降低對(duì)BCC細(xì)胞侵襲能力的影響運(yùn)用Transwell法檢測干擾SHARPIN表達(dá)后BCC細(xì)胞的侵襲能力變化。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示，在A431細(xì)胞中，干擾組穿過Matrigel基質(zhì)膠和聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)量為（185.6±20.5）個(gè)，對(duì)照組為（75.3±10.2）個(gè)；在BCC-1細(xì)胞中，干擾組的細(xì)胞數(shù)量為（202.3±25.6）個(gè)，對(duì)照組為（80.5±12.3）個(gè)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，干擾組與對(duì)照組之間差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明降低SHARPIN的表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)A431和BCC-1細(xì)胞的侵襲能力。4.3討論本研究通過RNA干擾技術(shù)降低人皮膚基底細(xì)胞癌細(xì)胞株A431和BCC-1中SHARPIN的表達(dá)水平，運(yùn)用CCK-8法和Transwell法分別檢測細(xì)胞的增殖和侵襲能力變化，結(jié)果表明SHARPIN表達(dá)降低能夠顯著促進(jìn)BCC細(xì)胞的增殖和侵襲能力，這一結(jié)果與之前關(guān)于SHARPIN在腫瘤中作用的相關(guān)研究具有一致性，進(jìn)一步揭示了SHARPIN在BCC發(fā)病中的重要作用。從細(xì)胞增殖的角度來看，SHARPIN可能通過多種信號(hào)通路來調(diào)節(jié)BCC細(xì)胞的增殖過程。PI3K-AKT信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、存活和代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。正常情況下，SHARPIN可能通過與PI3K的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，抑制PI3K的活性，從而阻斷AKT的磷酸化激活，抑制細(xì)胞的增殖信號(hào)。當(dāng)SHARPIN表達(dá)降低時(shí)，這種抑制作用減弱，PI3K-AKT信號(hào)通路被過度激活，AKT磷酸化水平升高，激活下游的mTOR等效應(yīng)分子，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期進(jìn)程等，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控。有研究表明，在乳腺癌細(xì)胞中，過表達(dá)SHARPIN能夠抑制PI3K-AKT信號(hào)通路的激活，降低細(xì)胞的增殖能力，而敲低SHARPIN則會(huì)導(dǎo)致PI3K-AKT信號(hào)通路的活化，促進(jìn)細(xì)胞增殖，這與本研究在BCC細(xì)胞中的結(jié)果相似。此外，SHARPIN還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)來影響細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）是細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，SHARPIN可能通過與CyclinD1相互作用，抑制其表達(dá)或活性，從而阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞增殖。在本研究中，SHARPIN表達(dá)降低后，可能導(dǎo)致CyclinD1的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，使BCC細(xì)胞增殖加快。在細(xì)胞侵襲方面，SHARPIN對(duì)BCC細(xì)胞侵襲能力的影響可能與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程密切相關(guān)。EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，在此過程中，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)。研究表明，SHARPIN可以通過調(diào)節(jié)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug的表達(dá)來影響細(xì)胞的侵襲性。正常情況下，SHARPIN能夠抑制Snail、Slug等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，維持細(xì)胞的上皮表型，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力。當(dāng)SHARPIN表達(dá)降低時(shí)，Snail、Slug等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)上調(diào)，促使上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，細(xì)胞間連接減弱，細(xì)胞骨架重排，從而增強(qiáng)了BCC細(xì)胞的侵襲能力。此外，SHARPIN還可能通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)來影響細(xì)胞侵襲。MMPs是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，其表達(dá)和活性的增加有助于腫瘤細(xì)胞突破細(xì)胞外基質(zhì)的屏障，實(shí)現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移。SHARPIN可能通過抑制MMPs的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制BCC細(xì)胞的侵襲能力。在本研究中，SHARPIN表達(dá)降低后，BCC細(xì)胞中MMP-2和MMP-9等MMPs的表達(dá)可能上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解增加，細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。SHARPIN表達(dá)變化對(duì)BCC細(xì)胞生物學(xué)特性的影響與BCC的發(fā)病和發(fā)展密切相關(guān)。在BCC的發(fā)病過程中，SHARPIN的低表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖和侵襲能力增強(qiáng)，使得腫瘤細(xì)胞能夠不斷增殖并侵犯周圍組織，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。這一發(fā)現(xiàn)為BCC的發(fā)病機(jī)制提供了新的理論依據(jù)，也為BCC的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。通過上調(diào)SHARPIN的表達(dá)或激活其功能，可能成為抑制BCC細(xì)胞增殖和侵襲的新治療策略。例如，可以設(shè)計(jì)針對(duì)SHARPIN的小分子激活劑，或者利用基因治療技術(shù)將SHARPIN基因?qū)肽[瘤細(xì)胞中，恢復(fù)其正常表達(dá)水平，從而抑制BCC的發(fā)展。4.4實(shí)驗(yàn)結(jié)論本研究通過RNA干擾技術(shù)降低人皮膚基底細(xì)胞癌細(xì)胞株A431和BCC-1中SHARPIN的表達(dá)水平，運(yùn)用CCK-8法和Transwell法分別檢測細(xì)胞的增殖和侵襲能力變化，明確證實(shí)了SHARPIN表達(dá)降低能夠顯著促進(jìn)BCC細(xì)胞的增殖和侵襲能力。在干擾SHARPIN表達(dá)的效果驗(yàn)證中，篩選出的siRNA-3能夠高效、特異性地降低A431和BCC-1細(xì)胞中SHARPIN的表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染siRNA-3后，A431細(xì)胞中SHARPIN基因的相對(duì)表達(dá)量降低了（85.2±7.8）%，蛋白相對(duì)表達(dá)量僅為NC-siRNA組的（15.8±3.2）%；BCC-1細(xì)胞中SHARPIN基因的相對(duì)表達(dá)量降低了（82.5±7.2）%，蛋白相對(duì)表達(dá)量為NC-siRNA組的（18.5±3.8）%。CCK-8法檢測結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，干擾組（轉(zhuǎn)染siRNA-3）的A431和BCC-1細(xì)胞增殖速率明顯高于對(duì)照組（轉(zhuǎn)染NC-siRNA）。在48h時(shí)，干擾組A431細(xì)胞的OD值為1.05±0.08，對(duì)照組為0.85±0.06，干擾組BCC-1細(xì)胞的OD值為1.12±0.09，對(duì)照組為0.90±0.07，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；到72h和96h時(shí)，兩組之間差異更為顯著（P<0.01），干擾組細(xì)胞的生長曲線明顯高于對(duì)照組，表明降低SHARPIN的表達(dá)能夠顯著促進(jìn)BCC細(xì)胞的增殖能力。Transwell法檢測結(jié)果表明，降低SHARPIN的表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)A431和BCC-1細(xì)胞的侵襲能力。在A431細(xì)胞中，干擾組穿過Matrigel基質(zhì)膠和聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)量為（185.6±20.5）個(gè)，對(duì)照組為（75.3±10.2）個(gè)；在BCC-1細(xì)胞中，干擾組的細(xì)胞數(shù)量為（202.3±25.6）個(gè)，對(duì)照組為（80.5±12.3）個(gè)，干擾組與對(duì)照組之間差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。綜上所述，SHARPIN在BCC細(xì)胞中表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖和侵襲能力增強(qiáng)，這表明SHARPIN在BCC的發(fā)病過程中可能發(fā)揮著抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲的重要作用，其低表達(dá)可能是BCC發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解BCC的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角，也為BCC的治療提供了潛在的分子靶點(diǎn)，后續(xù)研究可圍繞如何上調(diào)SHARPIN的表達(dá)或恢復(fù)其功能展開，以期為BCC的臨床治療提供新的策略。五、SHARPIN在皮膚BCC中的分子機(jī)制研究5.1材料與方法5.1.1細(xì)胞株及培養(yǎng)條件選用人皮膚基底細(xì)胞癌細(xì)胞株A431和BCC-1，均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。將細(xì)胞株復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化液進(jìn)行消化傳代，確保細(xì)胞的活性和正常生長特性。實(shí)驗(yàn)前，選取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。5.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器實(shí)驗(yàn)試劑：兔抗人SHARPIN多克隆抗體購自Abcam公司，其特異性高，可精準(zhǔn)識(shí)別SHARPIN蛋白；ProteinA/G磁珠購自ThermoFisherScientific公司，能夠高效結(jié)合抗體-抗原復(fù)合物；蛋白酶抑制劑cocktail購自Roche公司，可有效抑制蛋白酶活性，防止蛋白降解；PMSF（苯甲基磺酰氟）購自Sigma公司，是一種強(qiáng)效的絲氨酸蛋白酶抑制劑；RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)有限公司，能充分裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自Bio-Rad公司，可方便快捷地配制不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠；PVDF膜購自Millipore公司，具有良好的蛋白質(zhì)吸附性能和化學(xué)穩(wěn)定性；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，結(jié)合活性強(qiáng)，背景噪音低；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自GEHealthcare公司，可靈敏檢測蛋白質(zhì)印跡信號(hào)；胰蛋白酶購自Gibco公司，用于細(xì)胞消化；PBS緩沖液購自Hyclone公司，用于細(xì)胞洗滌和實(shí)驗(yàn)試劑的稀釋；尿素、Tris-HCl、SDS、甘氨酸等常規(guī)試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。此外，還包括用于蛋白質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的ProteinA/G瓊脂糖珠、用于蛋白質(zhì)鑒定的胰蛋白酶、用于質(zhì)譜分析的乙腈、甲酸等試劑。實(shí)驗(yàn)儀器：離心機(jī)（型號(hào)：Eppendorf