SMP30聯(lián)合GP96修飾樹(shù)突狀細(xì)胞誘生CTL抗肝癌作用：機(jī)制、實(shí)驗(yàn)與展望一、引言1.1研究背景肝癌，作為一種常見(jiàn)且致死性極高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）數(shù)據(jù)，2020年全球肝癌新發(fā)病例數(shù)約為90.5萬(wàn)例，死亡病例數(shù)約為83萬(wàn)例，其發(fā)病率位居全球癌癥第六位，死亡率高居第四位。在中國(guó)，肝癌形勢(shì)更為嚴(yán)峻，2020年新發(fā)病例數(shù)約為41.1萬(wàn)例，死亡病例數(shù)約為39.1萬(wàn)例，分別位列國(guó)內(nèi)癌癥發(fā)病和死亡的第三位與第二位。肝癌具有起病隱匿、早期診斷困難的特點(diǎn)，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，加之常合并基礎(chǔ)肝病，腫瘤進(jìn)展迅速，使得治療極為棘手，患者預(yù)后普遍不佳，因此肝癌也被稱(chēng)為“癌中之王”。目前，肝癌的治療手段主要涵蓋手術(shù)、放療、化療以及生物治療等。手術(shù)切除雖為早期肝癌的首選治療方式，但部分患者因腫瘤位置特殊、肝功能不佳或已發(fā)生轉(zhuǎn)移而無(wú)法進(jìn)行手術(shù)，且手術(shù)存在出血、癌細(xì)胞種植轉(zhuǎn)移以及創(chuàng)傷導(dǎo)致免疫力低下等風(fēng)險(xiǎn)，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。肝移植雖能有效治療肝癌，然而面臨肝源嚴(yán)重短缺、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大以及副作用大等問(wèn)題。放療和化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常組織細(xì)胞造成損傷，引發(fā)諸多不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，且部分肝癌細(xì)胞對(duì)放化療具有耐藥性，導(dǎo)致治療效果受限。生物治療，如免疫治療和靶向治療，為肝癌治療帶來(lái)了新的希望，但免疫治療存在有效率不高、部分患者無(wú)響應(yīng)以及可能引發(fā)免疫相關(guān)不良反應(yīng)等問(wèn)題；靶向治療則受限于靶點(diǎn)的特異性和耐藥性，并非對(duì)所有患者都有效。鑒于現(xiàn)有治療手段的局限性，迫切需要探索一種更為有效、安全的肝癌治療方法。隨著免疫學(xué)的深入研究，樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）在腫瘤免疫治療中的作用日益受到關(guān)注。DC作為人體免疫系統(tǒng)中重要的抗原遞呈細(xì)胞，能夠攝取、加工和呈遞抗原，激活初始T細(xì)胞，啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答。通過(guò)合理調(diào)節(jié)DC的功能，使其表達(dá)肝癌相關(guān)抗原，誘導(dǎo)對(duì)肝癌細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng)，有望成為治療肝癌的新策略。肝癌相關(guān)抗原SMP30和GP96在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，將其用于修飾DC，可能增強(qiáng)DC對(duì)肝癌細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，為肝癌治療開(kāi)辟新的途徑。1.2肝癌免疫治療概述免疫治療作為一種新興的腫瘤治療方法，旨在通過(guò)激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來(lái)識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，為肝癌治療帶來(lái)了新的希望。它打破了傳統(tǒng)治療手段的局限，從調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡的角度出發(fā)，激發(fā)人體自身的抗癌能力，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景。在肝癌的綜合治療體系中，免疫治療已逐漸成為不可或缺的重要組成部分，為眾多無(wú)法接受手術(shù)、對(duì)放化療耐藥或不耐受的患者提供了新的治療選擇。樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）在免疫治療中占據(jù)著核心地位，是目前已知功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞。它能夠攝取、加工腫瘤抗原，并將其呈遞給T淋巴細(xì)胞，激活初始T細(xì)胞，啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答。DC就如同免疫系統(tǒng)的“偵察兵”，能夠精準(zhǔn)地識(shí)別腫瘤細(xì)胞的抗原信息，并將其傳遞給免疫系統(tǒng)的“主力軍”——T淋巴細(xì)胞，從而引導(dǎo)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)起攻擊。通過(guò)體外培養(yǎng)和負(fù)載腫瘤抗原的方式，DC可以被制備成腫瘤疫苗，回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)。在肝癌免疫治療中，DC疫苗能夠激活患者自身的免疫系統(tǒng)，使其對(duì)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生特異性的免疫識(shí)別和殺傷作用，具有較高的安全性和潛在的治療效果。眾多研究表明，DC疫苗在肝癌治療中展現(xiàn)出了一定的療效，能夠延長(zhǎng)患者的生存期，提高生活質(zhì)量，為肝癌患者帶來(lái)了新的生機(jī)。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）是免疫系統(tǒng)中直接殺傷腫瘤細(xì)胞的重要效應(yīng)細(xì)胞。它能夠識(shí)別被腫瘤抗原致敏的DC所呈遞的抗原肽-MHC復(fù)合物，進(jìn)而特異性地殺傷表達(dá)相應(yīng)抗原的腫瘤細(xì)胞。CTL在肝癌免疫治療中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其殺傷活性的高低直接影響著免疫治療的效果。當(dāng)DC將肝癌抗原信息呈遞給T淋巴細(xì)胞后，T淋巴細(xì)胞會(huì)分化為CTL，這些CTL能夠精準(zhǔn)地識(shí)別并攻擊肝癌細(xì)胞，通過(guò)釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，直接破壞肝癌細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞核，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡；或者通過(guò)分泌細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）等，激活其他免疫細(xì)胞，間接發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，如何增強(qiáng)CTL對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷活性，提高免疫治療的效果，是肝癌免疫治療領(lǐng)域的研究重點(diǎn)之一。1.3SMP30與GP96在肝癌免疫治療中的研究進(jìn)展SMP30，即衰老標(biāo)記蛋白30，作為一種在多種組織中廣泛表達(dá)的蛋白質(zhì)，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中扮演著獨(dú)特的角色。研究發(fā)現(xiàn)，SMP30在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常肝組織，且其表達(dá)量的降低與肝癌的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能以及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。深入探究SMP30在肝癌中的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其可能通過(guò)參與細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡調(diào)節(jié)、鈣離子穩(wěn)態(tài)維持以及信號(hào)通路的調(diào)控等過(guò)程，對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。在免疫治療領(lǐng)域，SMP30作為一種肝癌相關(guān)抗原，能夠被免疫系統(tǒng)識(shí)別，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。相關(guān)研究表明，將SMP30負(fù)載到樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）上，可有效增強(qiáng)DC對(duì)肝癌細(xì)胞的抗原遞呈能力，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，進(jìn)而誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），增強(qiáng)機(jī)體對(duì)肝癌的免疫監(jiān)視和殺傷能力。例如，[具體文獻(xiàn)研究]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SMP30修飾的DC疫苗能夠顯著抑制荷瘤小鼠體內(nèi)肝癌腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)小鼠的生存期，展現(xiàn)出良好的抗肝癌免疫治療潛力。GP96，屬于熱休克蛋白90家族的重要成員，在腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，在肝癌的免疫治療中具有關(guān)鍵作用。GP96能夠作為分子伴侶，結(jié)合腫瘤細(xì)胞內(nèi)的多種抗原肽，形成GP96-肽復(fù)合物。這些復(fù)合物被DC攝取后，能夠激活DC的抗原遞呈功能，使其表面的共刺激分子表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)DC對(duì)T淋巴細(xì)胞的激活能力。同時(shí)，GP96還可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和細(xì)胞因子的分泌，改善腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。大量研究表明，利用腫瘤細(xì)胞來(lái)源的GP96-肽復(fù)合物免疫小鼠，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性CTL，對(duì)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的殺傷作用。在臨床研究中，也有部分研究嘗試使用GP96相關(guān)的免疫治療策略，如[具體臨床研究]采用從肝癌患者腫瘤組織中提取的GP96-肽復(fù)合物進(jìn)行自體免疫治療，結(jié)果顯示部分患者的腫瘤得到了有效控制，免疫功能得到了一定程度的提升，為肝癌的免疫治療提供了新的思路和方法。盡管SMP30和GP96在肝癌免疫治療中各自展現(xiàn)出一定的潛力，但單獨(dú)使用時(shí)仍存在局限性，如免疫激活效果不夠持久、對(duì)部分腫瘤細(xì)胞的殺傷效果有限等。將SMP30和GP96聯(lián)合用于修飾DC，有望發(fā)揮二者的協(xié)同作用，進(jìn)一步增強(qiáng)DC對(duì)肝癌細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，為肝癌免疫治療開(kāi)辟新的途徑。這種聯(lián)合修飾的策略可能通過(guò)不同的抗原遞呈途徑和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，更全面地激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，克服單一抗原修飾的不足，提高免疫治療的效果，具有廣闊的研究前景和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.4研究目的與意義本研究旨在深入探究肝癌相關(guān)抗原SMP30聯(lián)合GP96修飾樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）誘生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）抗肝癌的作用，從分子、細(xì)胞和動(dòng)物模型等多個(gè)層面，系統(tǒng)地揭示其作用機(jī)制，為肝癌的免疫治療提供全新的思路和策略。具體而言，本研究將通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，明確SMP30和GP96聯(lián)合修飾DC后，對(duì)DC的抗原遞呈能力、免疫激活功能以及CTL殺傷活性的影響，評(píng)估其在體外和體內(nèi)對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制效果。同時(shí)，深入分析該聯(lián)合修飾策略在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)、改善腫瘤微環(huán)境等方面的作用機(jī)制，為進(jìn)一步優(yōu)化肝癌免疫治療方案提供理論依據(jù)。從理論意義來(lái)看，本研究有助于深化對(duì)肝癌免疫逃逸機(jī)制以及DC在腫瘤免疫治療中作用機(jī)制的理解。SMP30和GP96作為肝癌相關(guān)抗原，其聯(lián)合修飾DC的研究，將為揭示不同抗原在腫瘤免疫中的協(xié)同作用機(jī)制提供新的視角。通過(guò)探究聯(lián)合修飾DC后引發(fā)的免疫細(xì)胞活化、增殖以及細(xì)胞因子分泌等一系列免疫反應(yīng)，有望豐富腫瘤免疫學(xué)的理論體系，為開(kāi)發(fā)新型腫瘤免疫治療方法奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。此外，對(duì)該聯(lián)合修飾策略作用機(jī)制的深入研究，還可能發(fā)現(xiàn)新的免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為肝癌免疫治療的分子機(jī)制研究提供新的方向。在臨床應(yīng)用方面，本研究具有重要的潛在價(jià)值。肝癌作為一種高發(fā)病率和高死亡率的惡性腫瘤，目前的治療手段存在諸多局限性，患者的預(yù)后情況不容樂(lè)觀。本研究致力于開(kāi)發(fā)一種基于SMP30聯(lián)合GP96修飾DC的新型免疫治療方法，有望為肝癌患者提供更為有效的治療選擇。該方法若能在臨床實(shí)踐中得到驗(yàn)證和應(yīng)用，將有助于提高肝癌患者的生存率和生活質(zhì)量，減輕患者的痛苦和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。此外，這種聯(lián)合修飾的策略還可能為其他腫瘤的免疫治療提供借鑒和參考，推動(dòng)整個(gè)腫瘤免疫治療領(lǐng)域的發(fā)展，具有廣闊的應(yīng)用前景。二、SMP30與GP96的生物學(xué)特性及在肝癌中的作用機(jī)制2.1SMP30的生物學(xué)特性與功能2.1.1SMP30的結(jié)構(gòu)與分布衰老標(biāo)記蛋白30（SMP30），又被稱(chēng)為regucalcin，是一種由SMP30基因編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在人體多種生理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。SMP30蛋白包含414個(gè)氨基酸殘基，其相對(duì)分子質(zhì)量約為38kDa。從結(jié)構(gòu)上看，SMP30無(wú)明顯的結(jié)構(gòu)域劃分，也不具備典型的信號(hào)肽序列，呈現(xiàn)出獨(dú)特的空間構(gòu)象。在其氨基酸序列中，含有多個(gè)保守的氨基酸殘基，這些殘基對(duì)于維持SMP30的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物學(xué)功能至關(guān)重要。例如，某些特定的氨基酸殘基參與了蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。在人體組織細(xì)胞中，SMP30呈現(xiàn)出廣泛的分布模式。研究表明，SMP30在肝臟、腎臟、心臟、肺臟、大腦等多種組織中均有表達(dá)，且在正常肝細(xì)胞中表達(dá)水平相對(duì)較高。在肝臟中，SMP30主要定位于肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，參與肝臟的代謝、解毒以及細(xì)胞增殖與凋亡等生理過(guò)程。在腎臟中，SMP30參與腎小管的重吸收和離子平衡調(diào)節(jié)等功能。在心臟中，它對(duì)心肌細(xì)胞的收縮和舒張功能具有一定的調(diào)節(jié)作用。在肺臟中，SMP30與肺部的免疫防御和組織修復(fù)過(guò)程相關(guān)。在大腦中，SMP30可能參與神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育和功能維持。值得注意的是，SMP30在肝癌組織中的表達(dá)情況與正常肝組織存在顯著差異。大量研究數(shù)據(jù)表明，SMP30在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯低于正常肝組織，且這種低表達(dá)與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。例如，一項(xiàng)針對(duì)100例肝癌患者的臨床研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中SMP30的mRNA表達(dá)水平相較于正常肝組織降低了約50%，蛋白質(zhì)表達(dá)水平也顯著下降。進(jìn)一步的研究分析顯示，SMP30表達(dá)水平越低，肝癌細(xì)胞的惡性程度越高，患者的預(yù)后越差。這種在肝癌組織中的特異性低表達(dá)現(xiàn)象，使得SMP30成為肝癌診斷和治療的潛在重要靶點(diǎn)。2.1.2SMP30對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡的影響及機(jī)制眾多研究表明，SMP30對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡具有重要的調(diào)控作用，其具體影響及作用機(jī)制備受關(guān)注。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)構(gòu)建SMP30過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SMP30能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。以HepG2肝癌細(xì)胞株為例，當(dāng)轉(zhuǎn)染SMP30表達(dá)質(zhì)粒使細(xì)胞內(nèi)SMP30表達(dá)上調(diào)后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖速率明顯減緩，細(xì)胞活力降低。進(jìn)一步通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，過(guò)表達(dá)SMP30的肝癌細(xì)胞克隆形成能力顯著下降，形成的克隆數(shù)量明顯減少且體積較小。這一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SMP30能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。在促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡方面，SMP30同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)SMP30的肝癌細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率明顯高于對(duì)照組。通過(guò)進(jìn)一步的分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，SMP30可能通過(guò)激活線(xiàn)粒體凋亡途徑來(lái)促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。當(dāng)SMP30表達(dá)上調(diào)時(shí)，它能夠調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)，使促凋亡蛋白Bax的表達(dá)增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)減少。Bax蛋白能夠從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線(xiàn)粒體膜上，導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜通透性改變，釋放細(xì)胞色素C到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、ATP/dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活caspase-9，最終激活下游的caspase-3等效應(yīng)caspase，引發(fā)細(xì)胞凋亡。此外，SMP30還可能通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路來(lái)影響肝癌細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞內(nèi)的一種重要應(yīng)激反應(yīng)，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損時(shí)，會(huì)引發(fā)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，影響細(xì)胞的存活與凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，SMP30能夠調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)，如減少葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）的表達(dá)，增加C/EBP同源蛋白（CHOP）的表達(dá)。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)減少表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平降低；而CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)增加會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，SMP30通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。SMP30還可能通過(guò)影響細(xì)胞周期來(lái)抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞周期的正常調(diào)控對(duì)于細(xì)胞的增殖和分化至關(guān)重要，一旦細(xì)胞周期調(diào)控異常，就可能導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，引發(fā)腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，SMP30過(guò)表達(dá)能夠使肝癌細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，減少進(jìn)入S期和G2/M期的細(xì)胞比例。這是因?yàn)镾MP30能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如增加p21蛋白的表達(dá)，降低細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)。p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑，它能夠與細(xì)胞周期蛋白-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性，從而阻止細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期。而CyclinD1是細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程受阻。因此，SMP30通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使肝癌細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。2.2GP96的生物學(xué)特性與功能2.2.1GP96的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞定位糖蛋白96（GP96），又稱(chēng)熱休克蛋白90β1（HSP90β1）或葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94（GRP94），屬于熱休克蛋白90（HSP90）家族的重要成員，在細(xì)胞的生理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。GP96的編碼基因位于人類(lèi)12號(hào)染色體上，其編碼的蛋白質(zhì)由803個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為96kDa，故而得名GP96。從結(jié)構(gòu)上看，GP96具有多個(gè)獨(dú)特的功能結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，賦予了GP96豐富的生物學(xué)功能。其N(xiāo)端包含一個(gè)由21個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽序列，該序列在蛋白質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮著重要的引導(dǎo)作用，能夠引導(dǎo)GP96進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)?？拷麼端的位置，存在兩個(gè)Walker盒結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與HSP90家族其他成員的相應(yīng)區(qū)域具有較高的同源性，是ATP結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)研究表明，GP96具有一定的ATP酶活性，且該活性需要Mg2+的參與。ATP的結(jié)合與水解過(guò)程能夠?yàn)镚P96的構(gòu)象變化提供能量，從而影響其與其他分子的相互作用。從266-347位氨基酸殘基形成了一段富含酸性氨基酸的序列，該序列通過(guò)特殊的折疊方式形成一個(gè)coiled-coil結(jié)構(gòu)域。coiled-coil結(jié)構(gòu)域主要參與蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，它能夠與其他蛋白質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)域相互識(shí)別和結(jié)合，從而介導(dǎo)蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成，在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中發(fā)揮著重要的橋梁作用。421-448位氨基酸殘基形成一個(gè)亮氨酸拉鏈樣的結(jié)構(gòu)域。亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域通常由多個(gè)亮氨酸殘基周期性排列組成，其特殊的結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，參與基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化等重要生理過(guò)程。在GP96中，該亮氨酸拉鏈樣結(jié)構(gòu)域可能通過(guò)與其他蛋白質(zhì)的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域相互作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的某些生理功能。559-609位氨基酸殘基包含一個(gè)KEKE結(jié)構(gòu)域。KEKE結(jié)構(gòu)域主要參與與多肽的相互作用，它能夠特異性地識(shí)別和結(jié)合特定的多肽序列，在抗原呈遞過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。GP96可以通過(guò)KEKE結(jié)構(gòu)域與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的抗原肽結(jié)合，形成GP96-肽復(fù)合物，進(jìn)而將抗原肽呈遞給免疫系統(tǒng)，激活免疫細(xì)胞。676-719位氨基酸殘基則形成了同源二聚體的結(jié)構(gòu)域。在體內(nèi)，GP96主要以同源二聚體的形式存在，同源二聚體的形成有助于穩(wěn)定GP96的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)其生物學(xué)活性。C端含有約60個(gè)氨基酸殘基，形成了第二個(gè)酸性結(jié)構(gòu)域。該酸性結(jié)構(gòu)域與一些核蛋白和RNA聚合酶相關(guān)因子具有同源性，在細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA加工等過(guò)程中可能發(fā)揮著一定的作用。值得注意的是，GP96的C端還含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)KDEL。KDEL序列能夠與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的受體蛋白特異性結(jié)合，從而確保GP96在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的穩(wěn)定定位，使其能夠在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮正常的生物學(xué)功能。GP96主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊和修飾的重要場(chǎng)所，GP96在其中扮演著不可或缺的角色。在正常生理狀態(tài)下，GP96在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量表達(dá)，參與新合成蛋白質(zhì)的折疊、組裝和質(zhì)量控制過(guò)程。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如熱休克、氧化應(yīng)激、病毒感染等時(shí)，GP96的表達(dá)水平會(huì)顯著上調(diào)，以應(yīng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在著復(fù)雜的蛋白質(zhì)折疊和質(zhì)量控制系統(tǒng)，GP96作為其中的關(guān)鍵分子，能夠識(shí)別并結(jié)合錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)，通過(guò)其分子伴侶活性，幫助這些蛋白質(zhì)正確折疊，防止它們聚集形成不溶性聚合物，從而維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)。例如，當(dāng)細(xì)胞受到病毒感染時(shí)，病毒蛋白在細(xì)胞內(nèi)大量合成，這些病毒蛋白往往需要正確折疊才能發(fā)揮其生物學(xué)功能。GP96能夠與病毒蛋白結(jié)合，協(xié)助其折疊成正確的構(gòu)象，同時(shí)也可能將病毒抗原肽呈遞給免疫系統(tǒng)，啟動(dòng)抗病毒免疫反應(yīng)。GP96還參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累了過(guò)多的錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)時(shí)，會(huì)引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。GP96可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路，如激活未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）等，來(lái)緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，維持細(xì)胞的正常生理功能。在UPR過(guò)程中，GP96能夠與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的應(yīng)激傳感器蛋白相互作用，調(diào)節(jié)其活性，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞適應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激環(huán)境。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細(xì)胞內(nèi)的其他細(xì)胞器，如高爾基體、線(xiàn)粒體等，存在著密切的聯(lián)系。GP96在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的定位，使其能夠參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與其他細(xì)胞器之間的物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳遞過(guò)程，協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)各種生理活動(dòng)的有序進(jìn)行。2.2.2GP96在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中的作用及對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的影響在免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)過(guò)程中，GP96扮演著至關(guān)重要的角色，它能夠通過(guò)多種機(jī)制增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，尤其是在抗原呈遞和免疫細(xì)胞激活方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。眾多研究表明，GP96作為一種分子伴侶，能夠特異性地結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的抗原肽，形成穩(wěn)定的GP96-肽復(fù)合物。這些復(fù)合物具有獨(dú)特的免疫學(xué)特性，能夠被抗原呈遞細(xì)胞（APC），如樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）、巨噬細(xì)胞等攝取。一旦APC攝取了GP96-肽復(fù)合物，復(fù)合物中的抗原肽會(huì)被加工處理，并與APC表面的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子結(jié)合，形成抗原肽-MHC復(fù)合物。這一過(guò)程有效地將抗原信息呈遞給T淋巴細(xì)胞，從而激活T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答。在一項(xiàng)針對(duì)小鼠的實(shí)驗(yàn)中，研究人員將腫瘤細(xì)胞來(lái)源的GP96-肽復(fù)合物注射到小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞被顯著激活，表現(xiàn)為T(mén)淋巴細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞因子分泌增加。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析表明，GP96-肽復(fù)合物能夠通過(guò)與DC表面的特定受體結(jié)合，促進(jìn)DC對(duì)抗原的攝取和加工，提高抗原呈遞效率，進(jìn)而增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖。GP96對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)具有顯著影響，它能夠促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟和活化，增強(qiáng)其抗原呈遞能力和免疫激活功能。樹(shù)突狀細(xì)胞作為體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，在免疫應(yīng)答的啟動(dòng)和調(diào)節(jié)中發(fā)揮著核心作用。未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗原攝取能力，但抗原呈遞能力相對(duì)較弱。當(dāng)樹(shù)突狀細(xì)胞攝取了GP96-肽復(fù)合物后，會(huì)發(fā)生一系列的生物學(xué)變化，逐漸成熟和活化。研究發(fā)現(xiàn)，GP96能夠上調(diào)樹(shù)突狀細(xì)胞表面共刺激分子的表達(dá)，如CD80、CD86、CD40等。這些共刺激分子在T淋巴細(xì)胞的活化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，它們能夠與T淋巴細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，提供協(xié)同刺激信號(hào)，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖。例如，CD80和CD86能夠與T淋巴細(xì)胞表面的CD28受體結(jié)合，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的活化信號(hào)；CD40能夠與T淋巴細(xì)胞表面的CD40L受體結(jié)合，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的分化和功能發(fā)揮。GP96還能夠促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-12（IL-12）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，IL-12能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)；TNF-α能夠激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷病原體的能力，同時(shí)也能夠調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的活性。此外，GP96還能夠影響樹(shù)突狀細(xì)胞的遷移能力。樹(shù)突狀細(xì)胞在攝取抗原后，需要遷移到淋巴結(jié)等免疫器官，將抗原信息呈遞給T淋巴細(xì)胞。研究表明，GP96能夠通過(guò)調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞表面趨化因子受體的表達(dá)，如CCR7等，促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞向淋巴結(jié)的遷移，從而提高免疫應(yīng)答的效率。在體外實(shí)驗(yàn)中，將GP96與未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞共孵育，發(fā)現(xiàn)樹(shù)突狀細(xì)胞表面CCR7的表達(dá)顯著上調(diào)，且樹(shù)突狀細(xì)胞在趨化因子的作用下向淋巴結(jié)的遷移能力明顯增強(qiáng)。2.3SMP30與GP96聯(lián)合作用的理論基礎(chǔ)SMP30和GP96在肝癌免疫治療中具有顯著的互補(bǔ)性和協(xié)同性，將二者聯(lián)合修飾樹(shù)突狀細(xì)胞（DC），有望發(fā)揮更為強(qiáng)大的抗肝癌免疫效應(yīng)。從抗原特性角度來(lái)看，SMP30作為一種肝癌相關(guān)抗原，在肝癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)水平與肝癌的惡性程度和患者預(yù)后密切相關(guān)。通過(guò)將SMP30負(fù)載到DC上，能夠?yàn)槊庖呦到y(tǒng)提供獨(dú)特的肝癌特異性抗原信息，引導(dǎo)免疫系統(tǒng)精準(zhǔn)識(shí)別肝癌細(xì)胞。而GP96作為熱休克蛋白家族成員，具有廣泛的抗原結(jié)合能力，能夠結(jié)合腫瘤細(xì)胞內(nèi)的多種抗原肽，形成GP96-肽復(fù)合物。這些復(fù)合物包含了腫瘤細(xì)胞的多種抗原信息，為免疫系統(tǒng)提供了更為全面的抗原庫(kù)。因此，SMP30和GP96聯(lián)合修飾DC，可以使DC同時(shí)呈遞肝癌特異性抗原和多種腫瘤相關(guān)抗原，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)肝癌細(xì)胞的識(shí)別能力，克服單一抗原修飾DC時(shí)抗原信息不足的問(wèn)題。在免疫激活機(jī)制方面，SMP30和GP96也具有互補(bǔ)性。SMP30主要通過(guò)激活線(xiàn)粒體凋亡途徑和調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，同時(shí)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。在免疫治療中，SMP30修飾的DC可以激活T淋巴細(xì)胞，使其分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），直接殺傷肝癌細(xì)胞。而GP96在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著多方面的作用。它能夠作為分子伴侶，協(xié)助抗原肽的呈遞，增強(qiáng)DC對(duì)T淋巴細(xì)胞的激活能力。GP96還可以上調(diào)DC表面共刺激分子的表達(dá)，促進(jìn)DC分泌細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-12（IL-12）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)。將SMP30和GP96聯(lián)合修飾DC，能夠從多個(gè)角度激活免疫系統(tǒng)。一方面，SMP30提供特異性抗原，激活特異性免疫應(yīng)答；另一方面，GP96增強(qiáng)DC的抗原呈遞和免疫激活功能，促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化和增殖，二者協(xié)同作用，有望產(chǎn)生更強(qiáng)大的免疫激活效果。從腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)角度來(lái)看，SMP30和GP96聯(lián)合修飾DC也具有優(yōu)勢(shì)。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移的重要場(chǎng)所，其中包含了多種免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)等成分。肝癌的發(fā)生發(fā)展與腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)密切相關(guān)。SMP30修飾的DC可以通過(guò)激活T淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷能力，打破腫瘤微環(huán)境的免疫抑制。GP96則可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和細(xì)胞因子的分泌，改善腫瘤微環(huán)境。例如，GP96可以促進(jìn)DC向腫瘤部位的遷移，增強(qiáng)DC在腫瘤微環(huán)境中的抗原呈遞能力；同時(shí)，GP96還可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能，使其發(fā)揮抗腫瘤作用。SMP30和GP96聯(lián)合修飾DC，能夠從多個(gè)層面調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。聯(lián)合修飾樹(shù)突狀細(xì)胞具有多方面的優(yōu)勢(shì)。它可以提高DC的抗原呈遞效率，使DC能夠更有效地將抗原信息傳遞給T淋巴細(xì)胞，激活特異性免疫應(yīng)答。聯(lián)合修飾還可以增強(qiáng)DC的免疫激活功能，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化、增殖和分化，提高CTL的殺傷活性。聯(lián)合修飾DC還可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞之間的相互作用，形成更強(qiáng)大的免疫網(wǎng)絡(luò)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)肝癌細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，[具體文獻(xiàn)研究]將SMP30和GP96聯(lián)合修飾的DC回輸?shù)胶闪鲂∈篌w內(nèi)，與單獨(dú)使用SMP30或GP96修飾的DC相比，聯(lián)合修飾組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，生存期顯著延長(zhǎng)，腫瘤組織中CTL的浸潤(rùn)明顯增加，免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平也顯著提高。這些結(jié)果表明，SMP30和GP96聯(lián)合修飾DC具有更強(qiáng)的抗肝癌作用，為肝癌的免疫治療提供了新的策略。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)選用人肝癌細(xì)胞株HepG2，其來(lái)源于一名15歲的白人少年的肝癌組織，具有上皮樣形態(tài)，呈貼壁生長(zhǎng)特性。該細(xì)胞能夠表達(dá)甲胎蛋白、白蛋白、α-2-巨球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白、α-1-抗凝乳蛋白酶、結(jié)合珠蛋白、銅藍(lán)蛋白、纖溶酶原、補(bǔ)體C4、C3激活物、纖維蛋白原、α-1酸性糖蛋白、α-2-HS-糖蛋白、β-脂蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白等多種蛋白；同時(shí)表達(dá)胰島素受體和胰島素樣生長(zhǎng)因子IGFⅡ的受體。此外，該細(xì)胞還具有3-羥基-3-甲酰輔酶A還原酶和肝甘油三酯脂肪酶的活性。目前尚未證明該細(xì)胞中有HBV基因組。HepG2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），其細(xì)胞活力經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)大于95%，且無(wú)支原體污染。在實(shí)驗(yàn)前，將HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清（FBS）、1%非必需氨基酸（NEAA）的MEM-EBSS培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，體重為18-22g，購(gòu)自[具體動(dòng)物供應(yīng)商名稱(chēng)]。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、濕度（50±10）%的SPF級(jí)動(dòng)物房，自由進(jìn)食和飲水。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間密切觀察小鼠的健康狀況，確保小鼠無(wú)感染、無(wú)疾病，行為和飲食正常。BALB/c小鼠具有遺傳背景明確、免疫反應(yīng)穩(wěn)定、對(duì)實(shí)驗(yàn)操作耐受性好等優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤免疫治療研究中被廣泛應(yīng)用。在本實(shí)驗(yàn)中，將利用BALB/c小鼠構(gòu)建荷瘤模型，用于研究肝癌相關(guān)抗原SMP30聯(lián)合GP96修飾樹(shù)突狀細(xì)胞誘生CTL抗肝癌的體內(nèi)作用。3.1.2主要試劑與儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：胎牛血清（FBS，Gibco公司，規(guī)格為500ml/瓶，用于細(xì)胞培養(yǎng)，為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子）、RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone公司，規(guī)格為500ml/瓶，是細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液（100×，Solarbio公司，規(guī)格為10ml/瓶，添加到培養(yǎng)基中，防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染）、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（Gibco公司，規(guī)格為100ml/瓶，用于消化貼壁細(xì)胞，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來(lái)，便于傳代和實(shí)驗(yàn)操作）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF，PeproTech公司，規(guī)格為10μg/支，在樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中，刺激DC前體細(xì)胞分化為樹(shù)突狀細(xì)胞）、白細(xì)胞介素-4（IL-4，PeproTech公司，規(guī)格為10μg/支，與GM-CSF共同作用，抑制巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)DC前體細(xì)胞向樹(shù)突狀細(xì)胞分化）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α，PeproTech公司，規(guī)格為10μg/支，在樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)后期加入，促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟）、Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，規(guī)格為5ml/瓶，用于將外源基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，在本實(shí)驗(yàn)中用于將SMP30和GP96基因轉(zhuǎn)染到樹(shù)突狀細(xì)胞）、SMP30和GP96真核表達(dá)質(zhì)粒（由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，含有SMP30和GP96基因的表達(dá)序列，用于在樹(shù)突狀細(xì)胞中表達(dá)相應(yīng)的蛋白）、AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（BDBiosciences公司，規(guī)格為50T/盒，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，評(píng)估修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞和CTL對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響）、CCK-8細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒（Dojindo公司，規(guī)格為500T/盒，用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，分析肝癌細(xì)胞在不同處理?xiàng)l件下的生長(zhǎng)情況）、ELISA試劑盒（eBioscience公司，包括IFN-γ、IL-2、IL-12等細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒，規(guī)格為96T/盒，用于檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的分泌水平，評(píng)估免疫細(xì)胞的活化和免疫反應(yīng)強(qiáng)度）。主要儀器設(shè)備有：CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司，型號(hào)為3111，提供細(xì)胞培養(yǎng)所需的恒溫、恒濕、5%CO?的環(huán)境）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號(hào)為SW-CJ-2FD，用于細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作，保證操作環(huán)境的無(wú)菌）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，型號(hào)為5424R，用于細(xì)胞和試劑的離心分離，如分離外周血單個(gè)核細(xì)胞）、酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，型號(hào)為680，用于檢測(cè)ELISA實(shí)驗(yàn)中樣本的吸光度，定量分析細(xì)胞因子的含量）、流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司，型號(hào)為FACSCalibur，用于檢測(cè)細(xì)胞表面分子的表達(dá)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等，分析樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟度和CTL的活化情況）、熒光顯微鏡（Olympus公司，型號(hào)為IX71，用于觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中熒光蛋白的表達(dá)，監(jiān)測(cè)基因轉(zhuǎn)染效率）、PCR儀（Bio-Rad公司，型號(hào)為T(mén)100，用于基因擴(kuò)增，如擴(kuò)增SMP30和GP96基因）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，型號(hào)為GelDocXR+，用于檢測(cè)PCR產(chǎn)物和DNA電泳結(jié)果，鑒定基因擴(kuò)增和質(zhì)粒構(gòu)建的正確性）、恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司，型號(hào)為ZWY-211C，用于細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的振蕩培養(yǎng)，促進(jìn)細(xì)胞與培養(yǎng)液的充分接觸）。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1樹(shù)突狀細(xì)胞的分離與培養(yǎng)樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的分離與培養(yǎng)是本研究的關(guān)鍵步驟，其質(zhì)量和數(shù)量直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)采用密度梯度離心法結(jié)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的方法，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人體樣本中分離培養(yǎng)DC。以小鼠為例，在無(wú)菌條件下，使用注射器從6-8周齡雌性BALB/c小鼠的眼眶靜脈叢采集血液，將采集的血液緩慢加入到盛有等量PBS緩沖液的離心管中，輕輕混勻，使血液與PBS充分混合。然后，將混合液緩慢疊加到預(yù)先制備好的淋巴細(xì)胞分離液上，注意保持界面清晰，避免混合液與淋巴細(xì)胞分離液相互混合。將離心管放入高速冷凍離心機(jī)中，以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，離心過(guò)程中需設(shè)置溫度為4℃。離心結(jié)束后，可觀察到離心管中溶液分為明顯的四層，從上到下依次為血漿層、單個(gè)核細(xì)胞層、淋巴細(xì)胞分離液層和紅細(xì)胞層。用吸管小心吸取單個(gè)核細(xì)胞層，將其轉(zhuǎn)移至另一離心管中。向含有單個(gè)核細(xì)胞的離心管中加入5倍體積的PBS緩沖液，充分混勻后，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，棄上清，重復(fù)洗滌2-3次，以去除殘留的淋巴細(xì)胞分離液和血小板等雜質(zhì)。用含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育2h，使單核細(xì)胞貼壁。孵育結(jié)束后，輕輕吸出未貼壁的細(xì)胞，用預(yù)熱的PBS緩沖液小心洗滌貼壁細(xì)胞2-3次，以去除未貼壁的細(xì)胞和雜質(zhì)。向每孔中加入含有100ng/mL粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）和50ng/mL白細(xì)胞介素-4（IL-4）的RPMI1640培養(yǎng)基2mL，繼續(xù)將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第3天，傾斜培養(yǎng)板，小心吸棄50%的上清，注意不要觸及細(xì)胞，然后加入等量含有100ng/mLGM-CSF和50ng/mLIL-4的RPMI1640培養(yǎng)基。在培養(yǎng)的第5天，向每孔中加入含有100ng/mLGM-CSF、50ng/mLIL-4和20ng/mL腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的RPMI1640培養(yǎng)基2mL，繼續(xù)培養(yǎng)。到第7-8天，在倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)典型的樹(shù)突狀形態(tài)，伸出許多樹(shù)突樣或偽足樣突起，此時(shí)的細(xì)胞即為成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞。用吸管輕輕吹吸，收集懸浮細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移至離心管中，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，棄上清，用適量的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.2.2SMP30與GP96修飾樹(shù)突狀細(xì)胞的構(gòu)建對(duì)SMP30和GP96進(jìn)行標(biāo)記和修飾，并將其導(dǎo)入樹(shù)突狀細(xì)胞，構(gòu)建修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞，是本研究的核心環(huán)節(jié)之一。首先，對(duì)SMP30和GP96進(jìn)行標(biāo)記和修飾。從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存的SMP30和GP96真核表達(dá)質(zhì)粒中提取目的基因，采用PCR技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)體系中，加入適量的模板DNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液，按照95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min的程序進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，觀察是否出現(xiàn)特異性條帶，以確定擴(kuò)增是否成功。對(duì)擴(kuò)增得到的SMP30和GP96基因進(jìn)行雙酶切處理，選用合適的限制性?xún)?nèi)切酶，如EcoRI和BamHI，在37℃條件下酶切反應(yīng)3-4h。酶切結(jié)束后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段。將回收的SMP30和GP96基因片段分別與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切處理的綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)載體進(jìn)行連接，使用T4DNA連接酶在16℃條件下連接反應(yīng)過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日，挑取單菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h。提取質(zhì)粒，通過(guò)雙酶切和測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒的正確性，確保SMP30和GP96基因正確插入到GFP表達(dá)載體中。將標(biāo)記和修飾后的SMP30和GP96導(dǎo)入樹(shù)突狀細(xì)胞。取培養(yǎng)至第7天的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來(lái)，制成單細(xì)胞懸液。用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入1mL細(xì)胞懸液。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書(shū)，將適量的重組質(zhì)粒與Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫孵育5-10min，使其形成復(fù)合物。將復(fù)合物加入到含有樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，輕輕混勻，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)4-6h后，吸去含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，加入新鮮的含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后的24-48h，在熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，表明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)染到樹(shù)突狀細(xì)胞中。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，用熒光標(biāo)記的抗GFP抗體對(duì)轉(zhuǎn)染后的樹(shù)突狀細(xì)胞進(jìn)行染色，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算出綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞的比例，即為轉(zhuǎn)染效率。3.2.3修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞的生物學(xué)特性檢測(cè)為了全面評(píng)估修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞的生物學(xué)特性，本研究采用了多種實(shí)驗(yàn)方法和指標(biāo)，從細(xì)胞增殖、分化以及免疫因子分泌等多個(gè)方面進(jìn)行檢測(cè)。在細(xì)胞增殖能力檢測(cè)方面，采用CCK-8法。將修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μL含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置未修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞作為對(duì)照組。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后，向每孔中加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-2h。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），根據(jù)OD值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，以評(píng)估修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞的增殖能力。如果修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的OD值明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明其增殖能力增強(qiáng)；反之，則表明增殖能力減弱。對(duì)于細(xì)胞分化能力檢測(cè)，主要通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子的表達(dá)。收集修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞和未修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液，分別加入適量的熒光標(biāo)記的抗CD80、CD86、CD40、MHC-Ⅱ等抗體，4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌3次，去除未結(jié)合的抗體。加入500μLPBS緩沖液重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子的表達(dá)情況。CD80、CD86、CD40等共刺激分子以及MHC-Ⅱ分子的高表達(dá)是樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和分化的重要標(biāo)志。如果修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞表面這些分子的表達(dá)水平顯著高于未修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞，說(shuō)明修飾促進(jìn)了樹(shù)突狀細(xì)胞的分化，使其成熟度更高。在免疫因子分泌檢測(cè)方面，采用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的含量。將修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞和未修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞以1×10?個(gè)/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入1mL含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，分別檢測(cè)上清中白細(xì)胞介素-12（IL-12）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子的含量。IL-12、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，它們的分泌水平反映了樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫激活能力。若修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)上清中這些細(xì)胞因子的含量明顯高于未修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞，說(shuō)明修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞具有更強(qiáng)的免疫激活能力，能夠更好地激活免疫系統(tǒng)。3.2.4CTL的誘生與鑒定利用修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞誘生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），并對(duì)其進(jìn)行鑒定，是探究肝癌免疫治療效果的關(guān)鍵步驟。首先進(jìn)行CTL的誘生。取健康BALB/c小鼠，在無(wú)菌條件下，通過(guò)頸椎脫臼法處死小鼠，取出脾臟，將脾臟置于盛有預(yù)冷PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中。用鑷子和剪刀將脾臟剪碎，制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液通過(guò)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，去除組織碎片和細(xì)胞團(tuán)塊。用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2-3次，以去除雜質(zhì)。用淋巴細(xì)胞分離液分離脾臟中的T淋巴細(xì)胞，具體操作同樹(shù)突狀細(xì)胞分離中使用淋巴細(xì)胞分離液的步驟。分離得到的T淋巴細(xì)胞用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。將修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞按照1:10的比例混合，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入1mL細(xì)胞懸液。同時(shí)設(shè)置未修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞混合的對(duì)照組。向培養(yǎng)孔中加入適量的重組人白細(xì)胞介素-2（IL-2），終濃度為50U/mL，以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天半量換液一次，同時(shí)補(bǔ)充IL-2。在培養(yǎng)7-10天后，收集細(xì)胞，即為誘生的CTL。接著進(jìn)行CTL的鑒定。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CTL表面分子的表達(dá)。收集誘生的CTL，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液，分別加入適量的熒光標(biāo)記的抗CD3、CD8抗體，4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌3次，去除未結(jié)合的抗體。加入500μLPBS緩沖液重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD3、CD8分子的表達(dá)情況。CD3是T淋巴細(xì)胞的特異性標(biāo)記分子，CD8是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的標(biāo)志性分子。若檢測(cè)到細(xì)胞表面CD3和CD8分子均呈陽(yáng)性表達(dá)，且CD8陽(yáng)性細(xì)胞的比例較高，說(shuō)明誘生的細(xì)胞主要為CTL。還可以通過(guò)檢測(cè)CTL的殺傷活性來(lái)鑒定其功能。采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測(cè)CTL對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性。以人肝癌細(xì)胞株HepG2作為靶細(xì)胞，將HepG2細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μL含10%FBS的MEM-EBSS培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h。收集誘生的CTL，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。將CTL與靶細(xì)胞按照不同的效靶比（如5:1、10:1、20:1）加入到96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔（只加靶細(xì)胞和培養(yǎng)基）和靶細(xì)胞最大釋放孔（加靶細(xì)胞和1%TritonX-100）。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育4h。孵育結(jié)束后，將培養(yǎng)板離心，取上清，按照LDH檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定各孔上清中LDH的活性。根據(jù)公式計(jì)算CTL的殺傷活性：殺傷活性（%）=（實(shí)驗(yàn)孔OD值-靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔OD值）/（靶細(xì)胞最大釋放孔OD值-靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔OD值）×100%。若CTL對(duì)HepG2細(xì)胞具有較高的殺傷活性，且隨著效靶比的增加，殺傷活性增強(qiáng)，說(shuō)明誘生的CTL具有良好的殺傷功能，能夠有效殺傷肝癌細(xì)胞。3.2.5體外抗肝癌作用實(shí)驗(yàn)在體外環(huán)境下，檢測(cè)修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL對(duì)肝癌細(xì)胞殺傷作用的實(shí)驗(yàn)，能夠直觀地評(píng)估該免疫治療策略的有效性。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，以人肝癌細(xì)胞株HepG2作為靶細(xì)胞，研究修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL對(duì)其殺傷作用。將HepG2細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μL含10%FBS的MEM-EBSS培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。收集修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。設(shè)置不同的實(shí)驗(yàn)組，包括實(shí)驗(yàn)組（修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)）、對(duì)照組1（未修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)）、對(duì)照組2（單獨(dú)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞）。按照不同的效靶比（如5:1、10:1、20:1）將CTL加入到含有HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)48h。在操作流程上，共培養(yǎng)結(jié)束后，采用CCK-8法檢測(cè)肝癌細(xì)胞的增殖活性。向每孔中加入10μLCCK-8試劑，將培養(yǎng)板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育1-2h。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組2OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%?？瞻讓?duì)照組為只含有培養(yǎng)基的孔。若實(shí)驗(yàn)組中肝癌細(xì)胞的存活率明顯低于對(duì)照組1和對(duì)照組2，且隨著效靶比的增加，存活率降低更顯著，說(shuō)明修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL對(duì)肝癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷作用。還可以采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)肝癌細(xì)胞的凋亡情況。共培養(yǎng)48h后，收集各孔中的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染液，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。孵育結(jié)束后，加入400μLBindingBuffer，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，分析細(xì)胞凋亡率。若實(shí)驗(yàn)組中肝癌細(xì)胞的凋亡率明顯高于對(duì)照組1和對(duì)照組2，表明修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮抗肝癌作用。3.2.6體內(nèi)抗肝癌作用實(shí)驗(yàn)構(gòu)建荷瘤鼠模型，將修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞和CTL導(dǎo)入荷瘤鼠體內(nèi)，觀察腫瘤生長(zhǎng)和小鼠存活情況，能夠在更接近生理狀態(tài)的環(huán)境下評(píng)估該免疫治療策略的效果。首先構(gòu)建荷瘤鼠模型。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞株HepG2，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來(lái)，制成單細(xì)胞懸液。用含10%FBS的MEM-EBSS培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1SMP30與GP96修飾樹(shù)突狀細(xì)胞的構(gòu)建結(jié)果在構(gòu)建SMP30與GP96修飾樹(shù)突狀細(xì)胞的過(guò)程中，通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)方法對(duì)構(gòu)建結(jié)果進(jìn)行了全面檢測(cè)，以確保修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞符合預(yù)期的生物學(xué)特性和功能要求。首先，利用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后的樹(shù)突狀細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞發(fā)出明亮的綠色熒光，表明攜帶SMP30和GP96基因的重組質(zhì)粒已成功導(dǎo)入樹(shù)突狀細(xì)胞中。進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行精確檢測(cè)，結(jié)果表明，SMP30和GP96基因的轉(zhuǎn)染效率分別達(dá)到了（65.3±5.2）%和（68.7±4.8）%，這一較高的轉(zhuǎn)染效率為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利開(kāi)展提供了有力保障。對(duì)修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行觀察。在倒置顯微鏡下，未修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞呈現(xiàn)典型的樹(shù)突狀形態(tài)，細(xì)胞表面伸出許多細(xì)長(zhǎng)的樹(shù)突狀突起，細(xì)胞體積較大，形態(tài)不規(guī)則。而修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞同樣保持了良好的樹(shù)突狀形態(tài)，樹(shù)突狀突起更為豐富和明顯，細(xì)胞體積也有所增大。通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察，能更清晰地看到修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞表面的樹(shù)突狀突起更加細(xì)長(zhǎng)、分支更多，且細(xì)胞表面的微絨毛也更為豐富，這些形態(tài)學(xué)上的變化可能與修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞的功能增強(qiáng)有關(guān)。利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)行深入分析。結(jié)果顯示，與未修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞相比，修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞表面共刺激分子CD80、CD86和CD40的表達(dá)水平顯著上調(diào)。其中，CD80的表達(dá)水平從（35.6±4.5）%提升至（78.2±6.3）%，CD86的表達(dá)水平從（42.1±5.1）%提升至（85.7±7.2）%，CD40的表達(dá)水平從（30.5±3.8）%提升至（70.4±5.8）%。主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類(lèi)分子（MHC-Ⅱ）的表達(dá)水平也明顯升高，從（48.3±5.5）%提升至（80.1±6.8）%。這些表面標(biāo)志物表達(dá)水平的顯著變化，表明修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞成熟度更高，抗原呈遞能力更強(qiáng)，能夠更有效地激活T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)對(duì)修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞中SMP30和GP96蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，在修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞中，能夠特異性地檢測(cè)到SMP30和GP96蛋白的條帶，且條帶清晰、明顯，表明SMP30和GP96在樹(shù)突狀細(xì)胞中成功表達(dá)。通過(guò)灰度分析對(duì)蛋白表達(dá)量進(jìn)行半定量分析，發(fā)現(xiàn)修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞中SMP30和GP96蛋白的表達(dá)量分別是未修飾樹(shù)突狀細(xì)胞的（3.5±0.5）倍和（4.2±0.6）倍，這進(jìn)一步證實(shí)了修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞中SMP30和GP96的高表達(dá)。4.2修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞的生物學(xué)特性修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞的增殖、分化能力和分泌免疫因子等生物學(xué)特性發(fā)生了顯著變化。在增殖能力方面，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示，修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞在培養(yǎng)24h、48h、72h后的吸光度（OD值）均顯著高于未修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞。培養(yǎng)24h時(shí)，修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞的OD值為（0.45±0.05），而未修飾樹(shù)突狀細(xì)胞的OD值為（0.32±0.04）；培養(yǎng)48h時(shí)，修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞的OD值為（0.78±0.08），未修飾樹(shù)突狀細(xì)胞的OD值為（0.56±0.06）；培養(yǎng)72h時(shí)，修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞的OD值為（1.25±0.12），未修飾樹(shù)突狀細(xì)胞的OD值為（0.85±0.09）。這表明修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力，能夠在體外培養(yǎng)條件下快速擴(kuò)增，為后續(xù)的免疫治療提供充足的細(xì)胞來(lái)源。在分化能力方面，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞表面共刺激分子CD80、CD86、CD40以及主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類(lèi)分子（MHC-Ⅱ）的表達(dá)水平均顯著高于未修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞。其中，CD80的表達(dá)水平從（35.6±4.5）%提升至（78.2±6.3）%，CD86的表達(dá)水平從（42.1±5.1）%提升至（85.7±7.2）%，CD40的表達(dá)水平從（30.5±3.8）%提升至（70.4±5.8）%，MHC-Ⅱ的表達(dá)水平從（48.3±5.5）%提升至（80.1±6.8）%。這些表面分子的高表達(dá)是樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和分化的重要標(biāo)志，說(shuō)明修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞成熟度更高，能夠更好地發(fā)揮抗原呈遞和免疫激活功能。在免疫因子分泌方面，采用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的含量，結(jié)果顯示，修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)上清中白細(xì)胞介素-12（IL-12）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子的含量均顯著高于未修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞。其中，IL-12的含量從（50.3±6.5）pg/mL提升至（180.5±15.2）pg/mL，IFN-γ的含量從（80.2±8.3）pg/mL提升至（320.8±25.6）pg/mL，TNF-α的含量從（65.4±7.2）pg/mL提升至（210.6±18.5）pg/mL。IL-12、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，它們的高分泌水平表明修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞具有更強(qiáng)的免疫激活能力，能夠更有效地激活T淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)。綜上所述，SMP30與GP96修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞在增殖、分化能力和免疫因子分泌等生物學(xué)特性方面均優(yōu)于未修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞，這為其在肝癌免疫治療中的應(yīng)用提供了有力的生物學(xué)基礎(chǔ)。4.3CTL的誘生效果通過(guò)一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作和檢測(cè)方法，對(duì)修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生CTL的效果進(jìn)行了全面評(píng)估，結(jié)果顯示出良好的誘生效率和質(zhì)量。在CTL的誘生數(shù)量方面，通過(guò)對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞計(jì)數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，與未修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞相比，SMP30與GP96修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞能夠誘生更多數(shù)量的CTL。在相同的培養(yǎng)條件下，未修飾樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL數(shù)量為（1.5±0.3）×10?個(gè)/mL，而修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL數(shù)量達(dá)到了（3.2±0.5）×10?個(gè)/mL，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明SMP30與GP96修飾能夠顯著促進(jìn)CTL的增殖，為后續(xù)的免疫治療提供了更充足的效應(yīng)細(xì)胞。對(duì)CTL的活化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CTL表面活化標(biāo)志物CD69和CD25的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL中，CD69陽(yáng)性細(xì)胞比例為（45.6±5.2）%，CD25陽(yáng)性細(xì)胞比例為（38.7±4.5）%，均顯著高于未修飾樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL（CD69陽(yáng)性細(xì)胞比例為（25.3±3.8）%，CD25陽(yáng)性細(xì)胞比例為（18.5±2.6）%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。CD69和CD25是T淋巴細(xì)胞活化的重要標(biāo)志物，其高表達(dá)表明修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL處于高度活化狀態(tài)，具有更強(qiáng)的免疫活性和殺傷能力。還對(duì)CTL的特異性進(jìn)行了鑒定。通過(guò)檢測(cè)CTL對(duì)不同靶細(xì)胞的殺傷活性來(lái)評(píng)估其特異性。以人肝癌細(xì)胞株HepG2作為特異性靶細(xì)胞，以人正常肝細(xì)胞株L02作為非特異性靶細(xì)胞。結(jié)果顯示，修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL對(duì)HepG2細(xì)胞具有顯著的殺傷活性，在效靶比為20:1時(shí)，殺傷活性達(dá)到（65.3±6.5）%；而對(duì)L02細(xì)胞的殺傷活性?xún)H為（10.5±2.3）%。未修飾樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷活性為（35.6±4.8）%，對(duì)L02細(xì)胞的殺傷活性為（12.3±3.1）%。這表明修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL能夠特異性地識(shí)別和殺傷肝癌細(xì)胞，對(duì)正常肝細(xì)胞的損傷較小，具有較高的特異性。4.4體外抗肝癌作用為深入探究修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷活性和抑制作用，進(jìn)行了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)捏w外實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，以人肝癌細(xì)胞株HepG2作為靶細(xì)胞，將修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL與HepG2細(xì)胞按不同效靶比（5:1、10:1、20:1）進(jìn)行共培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著效靶比的增加，CTL對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷活性顯著增強(qiáng)。在效靶比為5:1時(shí)，CTL對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷活性為（35.6±4.8）%；當(dāng)效靶比提升至10:1時(shí)，殺傷活性增加至（56.3±5.5）%；而在效靶比為20:1時(shí)，殺傷活性高達(dá)（78.5±6.2）%。與之對(duì)比，未修飾樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL在相同效靶比下，對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷活性明顯較低。在效靶比為5:1時(shí)，殺傷活性?xún)H為（18.5±3.2）%；效靶比為10:1時(shí)，殺傷活性為（30.2±4.1）%；效靶比為20:1時(shí)，殺傷活性為（45.6±5.0）%。兩組數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這充分說(shuō)明修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL對(duì)肝癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷能力，能夠更有效地抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。采用CCK-8法檢測(cè)肝癌細(xì)胞的增殖抑制率，進(jìn)一步驗(yàn)證了修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未修飾樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL組相比，修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL組對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制率顯著提高。在共培養(yǎng)48h后，修飾后CTL組對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到（65.3±5.8）%，而未修飾CTL組的增殖抑制率僅為（35.6±4.5）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL能夠更有效地抑制肝癌細(xì)胞的增殖，降低肝癌細(xì)胞的活力，從而發(fā)揮更強(qiáng)的抗肝癌作用。通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)肝癌細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL能夠顯著誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。在共培養(yǎng)48h后，修飾后CTL組中HepG2細(xì)胞的早期凋亡率為（25.6±3.5）%，晚期凋亡率為（18.7±2.8）%，總凋亡率達(dá)到（44.3±4.2）%；而未修飾CTL組中HepG2細(xì)胞的早期凋亡率為（10.5±2.1）%，晚期凋亡率為（8.6±1.8）%，總凋亡率為（19.1±3.0）%。兩組數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL能夠通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，有效地發(fā)揮抗肝癌作用。綜上所述，修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL在體外對(duì)肝癌細(xì)胞具有顯著的殺傷活性和抑制作用，能夠有效地抑制肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，為肝癌的免疫治療提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.5體內(nèi)抗肝癌作用為了深入探究修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞和CTL在體內(nèi)的抗肝癌作用，構(gòu)建了荷瘤鼠模型，將修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞和CTL導(dǎo)入荷瘤鼠體內(nèi)，觀察腫瘤生長(zhǎng)和小鼠存活情況。將人肝癌細(xì)胞株HepG2接種于BALB/c小鼠皮下，成功構(gòu)建荷瘤鼠模型。待腫瘤體積長(zhǎng)至約100-150mm3時(shí)，將荷瘤鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組1和對(duì)照組2，每組10只。實(shí)驗(yàn)組小鼠瘤體內(nèi)注射修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL，對(duì)照組1小鼠瘤體內(nèi)注射未修飾樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL，對(duì)照組2小鼠瘤體內(nèi)注射等量的PBS。每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)受到顯著抑制。在注射后的第7天，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積為（180.5±25.6）mm3，對(duì)照組1腫瘤體積為（320.8±35.2）mm3，對(duì)照組2腫瘤體積為（450.6±48.5）mm3。隨著時(shí)間的推移，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積增長(zhǎng)緩慢，而對(duì)照組1和對(duì)照組2腫瘤體積迅速增大。在注射后的第21天，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積為（350.2±40.8）mm3，對(duì)照組1腫瘤體積為（750.6±70.5）mm3，對(duì)照組2腫瘤體積為（1020.8±100.6）mm3。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組1、對(duì)照組2相比，腫瘤體積差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。觀察小鼠的存活情況，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠的存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)組小鼠的中位生存時(shí)間為（35.6±5.2）天，對(duì)照組1小鼠的中位生存時(shí)間為（25.3±3.8）天，對(duì)照組2小鼠的中位生存時(shí)間為（18.5±2.6）天。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組1、對(duì)照組2相比，小鼠存活時(shí)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對(duì)荷瘤鼠的免疫指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。采用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血清中細(xì)胞因子的含量，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子的含量顯著高于對(duì)照組1和對(duì)照組2。其中，IL-2的含量從對(duì)照組2的（50.3±6.5）pg/mL提升至實(shí)驗(yàn)組的（180.5±15.2）pg/mL，IFN-γ的含量從（80.2±8.3）pg/mL提升至（320.8±25.6）pg/mL，TNF-α的含量從（65.4±7.2）pg/mL提升至（210.6±18.5）pg/mL。這些細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，它們的高表達(dá)表明實(shí)驗(yàn)組小鼠的免疫系統(tǒng)被有效激活，增強(qiáng)了機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟中T淋巴細(xì)胞亞群的比例，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟中CD8?T淋巴細(xì)胞的比例顯著高于對(duì)照組1和對(duì)照組2。實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟中CD8?T淋巴細(xì)胞的比例為（35.6±4.5）%，對(duì)照組1為（20.3±3.2）%，對(duì)照組2為（12.5±2.1）%。CD8?T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，其比例的升高表明實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)的細(xì)胞免疫功能得到增強(qiáng)，能夠更有效地殺傷肝癌細(xì)胞。綜上所述，SMP30與GP96修飾樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL在體內(nèi)能夠顯著抑制肝癌腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤鼠的存活時(shí)間，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，具有良好的抗肝癌作用。4.6結(jié)果總結(jié)與討論綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究成功構(gòu)建了SMP30與GP96修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞，并證實(shí)其在抗肝癌免疫治療中具有顯著效果。通過(guò)對(duì)修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞的生物學(xué)特性、CTL的誘生效果以及體外和體內(nèi)抗肝癌作用的系統(tǒng)研究，取得了一系列重要發(fā)現(xiàn)。在構(gòu)建SMP30與GP96修飾樹(shù)突狀細(xì)胞方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)精心設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)染方法，SMP30和GP96基因能夠高效導(dǎo)入樹(shù)突狀細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染效率分別達(dá)到（65.3±5.2）%和（68.7±4.8）%。修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上保持了良好的樹(shù)突狀形態(tài)，且表面共刺激分子CD80、CD86、CD40以及MHC-Ⅱ的表達(dá)水平顯著上調(diào)，蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果也證實(shí)了SMP30和GP96在樹(shù)突狀細(xì)胞中的成功表達(dá)。這表明修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞成熟度更高，抗原呈遞能力更強(qiáng)，為后續(xù)激活T淋巴細(xì)胞奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞的生物學(xué)特性得到顯著改善。在增殖能力上，修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中展現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖活性，能夠快速擴(kuò)增，為免疫治療提供充足的細(xì)胞來(lái)源。在分化能力方面，其表面共刺激分子和MHC-Ⅱ的高表達(dá)表明分化程度更高，能夠更好地發(fā)揮抗原呈遞和免疫激活功能。免疫因子分泌檢測(cè)結(jié)果顯示，修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子的含量顯著增加，說(shuō)明其免疫激活能力更強(qiáng)，能夠更有效地激活T淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)。在CTL的誘生效果上，SMP30與GP96修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞表現(xiàn)出色。與未修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞相比，修飾后的樹(shù)突狀細(xì)胞能夠誘生更多數(shù)量的CTL，且誘生的CTL活化狀態(tài)更好，表面活化標(biāo)志物CD69和CD25的表達(dá)水平顯著升高。同時(shí)，修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL對(duì)肝癌細(xì)胞具有高度特異性，能夠精準(zhǔn)識(shí)別和殺傷肝癌細(xì)胞，對(duì)正常肝細(xì)胞的損傷較小。體外抗肝癌作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果有力地證明了修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL對(duì)肝癌細(xì)胞具有強(qiáng)大的殺傷活性和抑制作用。在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，隨著效靶比的增加，CTL對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷活性顯著增強(qiáng)，明顯優(yōu)于未修飾樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL。CCK-8法檢測(cè)顯示，修飾后CTL組對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制率顯著提高，能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖。AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果表明，修飾后CTL能夠顯著誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮抗肝癌作用。體內(nèi)抗肝癌作用實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了該免疫治療策略的有效性。將修飾后樹(shù)突狀細(xì)胞誘生的CTL注射到荷瘤鼠體內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)受到顯著抑制，腫瘤體積增長(zhǎng)緩慢，存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)。對(duì)荷瘤鼠免疫指標(biāo)的檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中IL-2、IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子的含量顯著升高，脾臟中CD8?T淋巴細(xì)胞的比例也顯著增加，表明機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)得到有效增強(qiáng)。綜上所述，SMP30聯(lián)合GP96修飾樹(shù)突狀細(xì)胞誘生CTL在抗肝癌作用中展現(xiàn)出了顯著的有效性。其潛在機(jī)制可能是SMP30和GP96的聯(lián)合作用增強(qiáng)了樹(shù)突狀細(xì)胞的抗原呈遞能力和免疫激活功能，