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文檔簡介

臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)沈陽市第六人民醫(yī)院李魯平電話:23393138E-mail:luping4758@163.com6/18/20251臨床標(biāo)本的采集與處理細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查細(xì)菌的分離培養(yǎng)與接種技術(shù)細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定的理論基礎(chǔ)醫(yī)院感染的實(shí)驗(yàn)診斷抗菌藥物敏感性試驗(yàn)6/18/20252一、微生物檢查基本方法6/18/20253致病菌的檢驗(yàn)程序標(biāo)本直接涂片染色鏡檢分離培養(yǎng)與鑒定病原菌抗原檢測其它檢測形態(tài)、結(jié)構(gòu)、染色性涂片鏡檢菌落特征生化反應(yīng)藥敏試驗(yàn)血清學(xué)反應(yīng)沉淀反應(yīng)協(xié)同凝集免疫熒光對流免疫電泳酶免疫測定免疫印跡細(xì)菌代謝產(chǎn)物(氣相色譜)細(xì)菌核酸(PCR)噬菌體分離細(xì)菌素測定分子生物學(xué)技術(shù)動物試驗(yàn)6/18/20254一、微生物檢查基本方法與診斷技術(shù)

(一)

細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查法:1.顯微鏡檢查法:①普通光學(xué)顯微鏡:②

暗視野顯微鏡:③

相差顯微鏡:④

熒光顯微鏡:⑤

電子顯微鏡:2.細(xì)菌標(biāo)本染色法;①單染色法:用一種染料將細(xì)菌和周圍物體染成同一種染色。②復(fù)染色法:用兩種或兩種以上染料染色的方法革蘭染色;抗酸染色;6/18/20255(二)

細(xì)菌的人工培養(yǎng)及生化實(shí)驗(yàn)1.細(xì)菌的人工培養(yǎng)法

①培養(yǎng)基:根據(jù)用途分基礎(chǔ)培養(yǎng)基、營養(yǎng)培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、特殊培養(yǎng)基。根據(jù)物理性狀分液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。②

細(xì)菌接種法:③細(xì)菌培養(yǎng)法:需氧培養(yǎng);厭氧培養(yǎng);二氧化碳培養(yǎng);微需氧培養(yǎng)。6/18/202562.細(xì)菌生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法、種類及原理

糖分解產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn);葡萄糖代謝類型鑒別試驗(yàn);七葉苷水解試驗(yàn);淀粉水解實(shí)驗(yàn);甲基紅試驗(yàn);V-P試驗(yàn);ONPG試驗(yàn).

蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物試驗(yàn)明膠液化試驗(yàn);吲哚試驗(yàn);硫化氫試驗(yàn);尿素酶試驗(yàn);苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn);氨基酸脫羧酶試驗(yàn).③碳源利用試驗(yàn)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn),丙二酸鹽利用試驗(yàn).④呼吸酶類試驗(yàn)氧化酶試驗(yàn);觸酶試驗(yàn);硝酸鹽還原試驗(yàn).⑤其他生化試驗(yàn)脂酶試驗(yàn);磷酸酶試驗(yàn);DNA試驗(yàn);凝固酶實(shí)驗(yàn);膽汁溶菌試驗(yàn)6/18/20257細(xì)菌L型生長緩慢,營養(yǎng)要求高,對滲透壓敏感,普通營養(yǎng)基上不能生長,培養(yǎng)時必須用高滲的含血清的培養(yǎng)基。細(xì)菌L型在高滲的含血清的培養(yǎng)基上生長后形成三種類型的菌落。

(三)

細(xì)菌L型的概念及檢查法6/18/20258二、微生物學(xué)檢驗(yàn)概述

(一)標(biāo)本采集種類與原則1)血液:一般在病人發(fā)熱初期或高峰期采集,懷疑細(xì)菌性心內(nèi)膜炎時,血培養(yǎng)不少于三次。一般為靜脈血,成人采血量10—20ml,嬰兒和兒童1—2ml。2)尿液:最好用導(dǎo)尿管收集尿液,要防止逆行性感染。3)糞便:取膿血或粘液的糞便置清潔容器中送檢。排便困難者,可用直腸拭子采樣。4)鼻咽拭子:5)痰:清晨第一口痰為宜,必須先用清水漱口,避免唾液混入。6/18/202596)腦脊液及其他:CSF應(yīng)無菌操作進(jìn)行腰椎穿刺;胸水、腹水、包液、滑囊液等用注射器無菌操作采集。7)眼,耳部標(biāo)本:用無菌拭子采集,及時接種相應(yīng)培養(yǎng)基。8)性傳播疾病標(biāo)本:男性采取尿道膿性分泌物,女性采取宮頸分泌物,供鏡檢及培養(yǎng);梅毒取皮膚滲出物和淋巴穿刺液涂片;皰疹取皰內(nèi)液體或刺破小皰后,用無菌拭子采樣。9)創(chuàng)傷、組織、膿腫標(biāo)本:根據(jù)不同部位采取不同標(biāo)本。6/18/202510標(biāo)本運(yùn)送1)采集時間應(yīng)在疾病早期,急性期,癥狀典型或用藥之前采集標(biāo)本.2)根據(jù)不同目的采用不同的采集方法.3)除痰,大便,肛拭子等體外標(biāo)本,其他標(biāo)本采集時應(yīng)用無菌操作,采集量不得過少.4)最好床邊接種.(保溫,冷藏,厭氧或種入運(yùn)送培養(yǎng)基內(nèi)).5)采集運(yùn)送時必須注意安全,防止污染及交叉感染.6/18/202511(二)微生物學(xué)檢查接到標(biāo)本后立即進(jìn)行微生物學(xué)檢查.1.

直接鏡檢:標(biāo)本經(jīng)涂片染色或制備濕片鏡檢。2.

快速診斷:快速檢測病原體成分主要是指特異性抗原和核酸檢測.特異性抗原檢測包括免疫熒光技術(shù),膠乳凝集試驗(yàn),酶免疫技術(shù),對流免疫電泳,化學(xué)發(fā)光免疫測定等.

3.

直接藥敏試驗(yàn):直接將標(biāo)本接種于平板,用抗生素紙片作藥物敏感試驗(yàn),在18—24h內(nèi)可獲得結(jié)果。

4.

常規(guī)檢驗(yàn):1)分離培養(yǎng):通常由正常無菌部位采取的標(biāo)本接種血平板,置空氣或5%—10%二氧化碳的氣缸中培養(yǎng),大部分細(xì)菌可于24—48h生長良好。2)鑒定:分離出的細(xì)菌一般經(jīng)過細(xì)菌形態(tài),菌落特點(diǎn),生化反應(yīng),血清學(xué)試驗(yàn),動物接種等鑒定。6/18/202512

3)體外純菌藥物敏感性試驗(yàn):包括抑菌試驗(yàn),殺菌試驗(yàn),聯(lián)合藥敏試驗(yàn)和檢測細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素滅活酶等。4)報告:直接鏡檢要求2小時報告,說明標(biāo)本合格,發(fā)現(xiàn)微生物情況和特點(diǎn);初步鑒定和直接藥敏結(jié)果于24小時或次晨報告,報告可能的病原菌和直接藥敏結(jié)果;最后鑒定和細(xì)菌藥敏結(jié)果一般不超過3天。

5.血清學(xué)診斷:是指用已知抗原或已知抗體檢測患者血清中相應(yīng)抗體或抗原的方法。血清學(xué)凝集試驗(yàn):采用含有已知特異性抗體的血清與分離培養(yǎng)出的未知純種細(xì)菌或標(biāo)本種的抗原進(jìn)行血清學(xué)反應(yīng),以確定病原菌的種或型。6/18/202513臨床微生物實(shí)驗(yàn)室安全措施和質(zhì)量保證

1.

感染性廢棄物的處理1)去污染,任何污染材料未經(jīng)消毒不能拿出實(shí)驗(yàn)室.2)液體廢棄物必須收集在防漏,未破的容器內(nèi),經(jīng)高濃度的化學(xué)消毒劑處理.3)對剩余的標(biāo)本,接種過的培養(yǎng)基,菌種等丟棄前均須消毒.4)對于任何有污染的銳器如針頭,注射器,玻片等在處理前不要用手接觸.6/18/2025142.微生物實(shí)驗(yàn)室的室內(nèi)質(zhì)控

1)

對細(xì)菌檢驗(yàn)人員的要求;2)

操作手冊;3)

儀器設(shè)備的功能監(jiān)測;4)

培養(yǎng)基的質(zhì)量控制;5)

試劑,染色液以及抗血清的質(zhì)量控制;6)

標(biāo)本檢驗(yàn)的質(zhì)量控制;7)

標(biāo)準(zhǔn)菌株的來源和保存及室內(nèi)質(zhì)量的全面控制.

微生物檢驗(yàn)的室間質(zhì)評6/18/2025151.微生物檢查基本方法與診斷技術(shù)。2.微生物學(xué)檢驗(yàn)概述。內(nèi)容小結(jié)6/18/202516二、臨床常見的微生物及檢驗(yàn)方法(例)6/18/202517一、球菌

葡萄球菌(一)

生物學(xué)特性1.

形態(tài)與結(jié)構(gòu):本菌屬G染色陽性,呈圓球形,不規(guī)則成堆排列,形似葡萄串狀,無莢膜.無鞭毛和芽孢.2.

培養(yǎng)特性:需氧或兼性厭氧,營養(yǎng)要求不高.最適PH為7.4,經(jīng)37℃24—48h培養(yǎng),可形成圓形,凸起,表面光滑濕潤,邊緣整齊不透明的菌落,可產(chǎn)生不同的脂溶性色素,如白色,金黃色,檸檬色色素。在血平板上,幾乎所有的葡萄球菌可產(chǎn)生α,β,γ和δ溶血在液體培養(yǎng)基中生長迅速生長呈均勻混濁狀.6/18/202518

3)分類方法:根據(jù)其在固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生的不同色素分為金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌和檸檬色葡萄球菌。1965年,國際葡萄球菌和微球菌分類委員會將葡萄球菌分為凝固酶陽性和陰性葡萄(CNS)。CNS包括表葡、腐生葡萄球菌。凝固酶陽性葡萄球菌包括金葡、中間型和家畜葡萄球菌。

(二)

微生物檢查

1.標(biāo)本采集:膿汁,滲出液,分泌物,血,尿,糞便,痰液及腦脊液。2.檢查方法及鑒定6/18/202519

1)直接鏡檢涂片,G染色鏡檢,如為陽性球菌呈葡萄狀排列可初診.初報為找到G陽性葡萄狀排列球菌,疑為葡萄球菌。

2)分離培養(yǎng)膿汁,尿液.腦脊液等離心沉淀,可直接接種血平板。37℃18—24h培養(yǎng)可產(chǎn)生不同色素的菌落.金黃色葡萄球菌在周圍有透明溶血環(huán).3)鑒定試驗(yàn)a.觸酶試驗(yàn):細(xì)菌產(chǎn)生的過氧化氫酶催化雙氧水生成水和氧氣,產(chǎn)生氣泡.b.血漿凝固酶試驗(yàn):血漿凝固酶是金黃色葡萄球菌所產(chǎn)生的一種與其致病力有關(guān)的侵襲性酶,分游離型和結(jié)合型。其作用是血漿中的纖維蛋白在菌體表面沉積和凝固以阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬。6/18/202520c.甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)d.新生霉素敏感試驗(yàn)?zāi)堂戈幮缘钠咸亚蚓好舾袨楸砥て咸亚蚓?耐藥為腐生葡萄球菌。e.同時進(jìn)行體外藥物敏感試驗(yàn)本唑西林:MSS/MRSβ-內(nèi)酰胺酶萬古酶素的敏感性。

金黃色葡萄球菌:觸酶+凝固酶+甘露醇+新生酶素S表皮葡萄球菌:+-+S腐生葡萄球菌:+-+R報告:檢出XXX葡萄球菌6/18/2025214)耐藥性檢測:耐甲氧西林金葡菌(MRSA),

耐甲氧西林的表葡菌(MRSE)。5)

臨床意義:葡萄球菌感染的特點(diǎn)是感染部位組織的化膿,壞死和膿腫形成。金葡,表葡和腐生葡萄球菌是引起臨床感染最常見的葡萄球菌。①金葡菌引起癤,癰,外科傷口,創(chuàng)傷的局部化膿性感染,入血后可引起深部組織的化膿性感染。其產(chǎn)生的腸毒素可引起食物中毒,表現(xiàn)為急性胃腸炎。主要致病物質(zhì)有血漿凝固酶,葡萄球菌溶血素,殺WBC素,腸毒素,表皮溶解毒素和毒性休克綜合癥毒素②

表葡是存在于皮膚的正常菌群,由于各種導(dǎo)管植入和人造組織的使用,該菌已成為醫(yī)院感染的重要病原菌,是導(dǎo)致血培養(yǎng)污染的常見菌之一。③

腐生葡萄球菌是導(dǎo)致尿路感染的常見菌之一。6/18/202522四、醫(yī)院感染與抗菌藥物敏感性試驗(yàn)6/18/202523一、醫(yī)院獲得性感染(hospitalacquiredinfection):包括醫(yī)院內(nèi)各種人群所獲得的感染。對象——一切在醫(yī)院內(nèi)活動的人群(主要為住院病人)地點(diǎn)——感染發(fā)生必須在醫(yī)院內(nèi)時間——病人在住院期間或出院后不久發(fā)生的感染,及與前次住院有關(guān)的感染。一、醫(yī)院感染6/18/202524

醫(yī)院感染的類型按微生物來源內(nèi)源性醫(yī)院感染——由自身正常菌群轉(zhuǎn)變成機(jī)會性致病菌所致特定條件——寄居部位改變——免疫功能下降——菌群失調(diào)外源性醫(yī)院感染(交叉感染)——患者遭受醫(yī)院內(nèi)非自身存在的病原體侵襲而發(fā)生的感染。病人之間、醫(yī)患之間、污染醫(yī)護(hù)用品或診治設(shè)備、環(huán)境空氣等,也稱醫(yī)院內(nèi)感染。按感染部位分類——全身各部位均可發(fā)生6/18/202525

易感宿主:主要是原發(fā)病引起機(jī)體抵抗力低下,接受影響免疫功能的藥物治療或接受侵襲性操作措施的病人。這些病人主要表現(xiàn)為局部或全身免疫功能受損,正常菌群被破壞,抑制外部細(xì)菌定植能力減弱或消失,使病人處于高度易感狀態(tài)。

醫(yī)院感染常見的微生物主要是機(jī)會性致病菌(常為內(nèi)源性感染)常為耐藥菌;新的病原菌不斷出現(xiàn);主要是細(xì)菌,其次為病毒和真菌。常見的微生物有:1.細(xì)菌葡萄球菌屬、微球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌科、假單胞菌屬、不動桿菌屬、軍團(tuán)菌、腦膜炎敗血性黃桿菌、結(jié)核桿菌、李斯特菌、類桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風(fēng)桿菌、核梭桿菌、丙酸桿菌、消化球菌等。6/18/202526

2.真菌念珠菌、組織胞漿菌、球孢子菌、隱球菌、曲霉菌等。3.病毒肝炎病毒、水痘病毒、流感病毒、輪狀病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒等。4.對于機(jī)體的不同系統(tǒng),醫(yī)院感染的病原菌也不同,

目前G陰性桿菌仍占主要地位,凝固酶陰性葡萄球菌及腸球菌感染率逐漸上升,尤其應(yīng)該注意的是MRSA及耐萬古霉素腸球菌引起的醫(yī)院感染。6/18/202527二、監(jiān)控抗感染治療的實(shí)驗(yàn)室方法

(一)

抗菌藥物選擇原則:合理使用抗生素,應(yīng)根據(jù)病原學(xué)及其藥敏試驗(yàn)結(jié)果,結(jié)合抗生素的性能,藥理學(xué)情況及患者生理、病理、免疫狀態(tài)合理選用抗生素。(二)

抑菌試驗(yàn)原理及方法目前常用的方法是紙片瓊脂擴(kuò)散法,是一種半定量的方法。美國CLSI(NCCLS)紙片擴(kuò)散法敏感試驗(yàn)分委會所推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法是K—B法,此法是目前公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法。6/18/202528

紙片瓊脂擴(kuò)散法

原理將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種待檢菌的瓊脂平板上,紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后會不斷地向紙片周圍區(qū)擴(kuò)散,形成遞減的剃度濃度,在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)待檢菌的生長被抑制,從而產(chǎn)生透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反應(yīng)檢測菌對測定藥物的敏感程度,并與該菌對待檢菌的最低抑菌濃度呈負(fù)相關(guān)。試驗(yàn)方法在純培養(yǎng)平板上挑取相同的菌落4-5個。用無菌生理鹽水調(diào)菌液為0.5麥?zhǔn)蠁挝唬s含菌1X108CFU/ml),在15min內(nèi)接種完。6/18/202529用無菌棉試蘸取菌液,在試管壁上擠壓幾次,壓去多余的菌液,分三個方向即每次旋轉(zhuǎn)平板60°,使整個MH平板涂布均勻.涂布菌液的平板于室溫中干燥3-5min后,用紙片分配器或無菌鑷子取藥敏紙片,貼于平板表面,并用鑷尖輕壓一下紙片,使其貼平.每張紙片的間距不小于24mm,紙片的中心距平板的邊緣不小于15mm,90mm直徑的平板宜貼6張藥敏紙片.將貼好紙片的平板置35℃孵育18-24h后,用標(biāo)尺量取抑菌圈直徑.結(jié)果判斷根據(jù)量取抑菌圈的直徑(包含紙片的直徑),以毫米數(shù)報告(取整數(shù))。(不同抗生素其抑菌圈大小的標(biāo)準(zhǔn)不一致),判斷為敏感(S)、耐藥(R)或中度敏感結(jié)果判讀。6/18/202530結(jié)果報告敏感(susceptible,S):是指當(dāng)使用常規(guī)推薦劑量的抗菌藥物進(jìn)行治療時,該抗菌藥在患者感染部位所能達(dá)到的濃度可抑制該感染菌的生長。耐藥(resistant,R):是指使用常規(guī)推薦劑量的抗菌藥物進(jìn)行治療時,該抗菌藥在患者感染部位通常所能達(dá)到的濃度不能抑制該感染菌的生長;或者該藥對該感染菌的臨床療效尚未在以往的治療研究中被證實(shí)是可靠的;或者抑菌圈直徑落在特定細(xì)菌發(fā)揮耐藥機(jī)制(如β-內(nèi)酰胺酶)的合適范圍。6/18/202531中介(intermesiate,I)抗菌藥對感染菌的MIC接近該藥在血液和組織中的濃度,感染菌的臨床應(yīng)答率可能低于敏感菌。根據(jù)藥代動力學(xué)資料分析,若某藥在生理濃集部位具有臨床效力,如尿中喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺酶類藥物濃度較高,則中介意味著該藥治療該部位的感染可能有效;于之相反,若某藥由于通透性等原因在某個組織、器官或體液中濃度較低,甚至在炎癥的情況下濃度亦較低,如一些藥在腦脊液中,則中介意味著盡可能不用該藥進(jìn)行治療,而應(yīng)選用其他有效藥物.6/18/202532若某藥在高劑量使用時是安全的(如β-內(nèi)酰胺酶藥物),則中介意味著高劑量給藥可能奏效在判斷藥敏試驗(yàn)結(jié)果時,中介的數(shù)據(jù)位置處于敏感與耐藥之間,它可作為一個緩沖帶,用以防止因?yàn)橐恍┬〉摹⒉荒芸刂频募夹g(shù)因素而引起的結(jié)果解釋的偏差,特別對于那些藥毒范圍(pharmacotoxicitymargin)較窄的藥物來講這個緩沖帶相當(dāng)重要。6/18/202533局限性:體外試驗(yàn)敏感的,體內(nèi)不一定敏感。細(xì)菌室分離的病原菌不一定都是致病菌我國采用的藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為美國CLSI根據(jù)藥敏標(biāo)準(zhǔn)推薦的抗生素結(jié)合當(dāng)?shù)赜盟幒涂股卣哌x擇選擇代表性抗生素,推測其他藥物結(jié)果(包括某些耐藥機(jī)制的檢測)耐藥表型(個體)→耐藥機(jī)制→耐藥表型(同類)(預(yù)測藥物)(同類藥物)不是所有抗生素都需要檢測敏感性6/18/2025341、必須進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的情況當(dāng)某些致病菌或條件致病菌的藥敏特點(diǎn)不能從其種屬特征上了解時,或其藥敏結(jié)果易變時,這些菌的臨床分離株必須進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。如:腸桿菌科的細(xì)菌、非發(fā)酵菌、葡萄球菌屬和腸球菌屬的細(xì)菌等。2、不需要進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的情況①自標(biāo)本中分離出多種細(xì)菌(呈混合生長),不能區(qū)別和確定致病菌,即分離菌可能系來自環(huán)境或人體正常菌群的污染時,通常不必做藥敏試驗(yàn),以免試驗(yàn)結(jié)果誤導(dǎo)臨床治療。②當(dāng)某致病菌對某抗菌藥物高度敏感而從未見有耐藥情況報告時,常規(guī)藥敏試驗(yàn)可不進(jìn)行。③分離自正常寄生部位的條件致病菌和非條件致病菌,不需要做藥敏試驗(yàn)。如糞便中分離出的非致病性大腸埃希菌,皮膚上分離出的微球菌和陰道中分離出的丙酸桿菌。6/18/202535CLSI將藥敏試驗(yàn)抗生素分為4組A組:首選試驗(yàn)和報告B組:首選試驗(yàn)但選擇報告C組:補(bǔ)充試驗(yàn)選擇報告U組:僅用于泌尿系6/18/202536

臨床用藥規(guī)則(K-B法)

腸桿菌科屬A組(首選)B組(次選)

氨芐西林-10阿米卡星-30頭孢唑林-30阿莫西林/棒酸-20/10頭孢噻吩-30頭孢孟多-30慶大酶素-10頭孢吡肟-30。。。。。。6/18/202537

腸桿菌科屬C組(補(bǔ)選)U組(尿標(biāo)本)

氨曲南-30羧芐西林-100氯霉素-30氯碳頭孢-30卡那霉素-30呋喃妥因-300奈替米星-30磺胺異惡唑-250。。。。。。。。。。。

臨床用藥規(guī)則(K-B法)6/18/202538

葡萄球菌屬

A組(首選)B組(次選)苯唑西林-1阿奇霉素-15青霉素-10克林霉素-2甲氧芐啶/磺胺甲惡唑萬古霉素-30利奈唑烷

臨床用藥規(guī)則(K-B法)6/18/202539

葡萄球菌屬C組(次選)U組(尿標(biāo)本)氯霉素-30洛美沙星-10環(huán)丙沙星-5呋喃妥因-300奎奴普丁磺胺異惡唑-250慶大霉素-10甲氧芐啶-5利福平-5

臨床用藥規(guī)則(K-B法)

6/18/202540

嗜麥牙窄食單胞菌

A組B組復(fù)方新諾明左氧佛沙星米諾環(huán)素

臨床用藥規(guī)則(K-B法)

6/18/202541細(xì)菌天然耐藥

1陰溝腸桿菌:耐頭孢西丁部份假單胞菌:耐亞胺培南嗜麥芽窄食單胞菌:耐亞胺培南、?-內(nèi)酰胺類克雷白菌:

氨芐西林

替考拉寧氨基糖苷類鮑曼不動桿菌:耐氨芐西林

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