乙醇改性乳清分離蛋白對乳狀液穩(wěn)定性的影響：結構與功能解析一、引言1.1研究背景與意義乳清蛋白作為一種源自牛奶的優(yōu)質蛋白質，約占乳蛋白質的18%-20%，其氨基酸組成合理，包含人體所需的全部20種氨基酸，且必需氨基酸含量高于普通食用蛋白質，生物價高達88，消化吸收率高，具有良好的營養(yǎng)特性和較高的營養(yǎng)價值。乳清蛋白主要由β-乳球蛋白（48%）、α-乳白蛋白（19%）、蛋白酶-胨（20%）、牛血清白蛋白（5%）和免疫球蛋白（8%）等成分組成，還含有少量如乳鐵蛋白和乳過氧化物酶等高價值成分。此外，乳清蛋白膽固醇和鈉含量低，鈣和其他礦物質含量高，是生產(chǎn)各種強化型食品較為理想的蛋白質來源。乳清分離蛋白（WPI）作為乳清蛋白的一種高純度形式，蛋白質含量在90%以上，在食品工業(yè)中具有廣泛的應用。由于其良好的溶解性、持水性、吸水性、成膠性、粘合性、彈性、攪打起泡性和乳化性等功能特性，被廣泛應用于各類食品中，以改善食品的品質和口感。在酸奶等發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)中，WPI不但不會影響發(fā)酵和風味，還能在保質期內減緩酸奶的分層和乳清的析出；在肉類制品中添加WPI能促進肉中蛋白質與水結合，幫助肉類制品形成膠態(tài)和再成形，如在火腿腸中加入含蛋白質10%以上的乳清溶液，能控制水分和脂肪的損失，防止烹調時重量和風味的改變，在香腸中加入WPI可幫助脂肪乳化，防止脂肪分離和聚集；在烘焙食品中，WPI可以改善面團的加工性能和烘焙品質，增加產(chǎn)品的體積和柔軟度；在飲料中，WPI可作為營養(yǎng)強化劑和乳化劑，提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性和營養(yǎng)價值。然而，WPI在實際應用中也存在一些問題。WPI對環(huán)境因素如pH值、溫度、鹽離子濃度等較為敏感，這些因素的變化容易導致蛋白質變性聚集，從而影響其功能特性。在高溫或極端pH條件下，WPI的結構會發(fā)生改變，導致其乳化性、溶解性等功能下降。此外，WPI在某些食品體系中的穩(wěn)定性不足，例如在高油相比例或長時間儲存的情況下，乳狀液容易出現(xiàn)分層、絮凝和聚結等現(xiàn)象，限制了其在一些食品中的應用。為了進一步改善WPI的功能特性，拓展其在食品工業(yè)中的應用范圍，對WPI進行改性研究具有重要意義。目前，常見的乳清蛋白改性技術包括物理改性、化學改性和生物改性等方法。物理改性主要通過加熱、高壓、超聲波等物理手段改變蛋白質的結構和功能；化學改性則利用化學試劑與蛋白質發(fā)生化學反應，引入新的基團或改變蛋白質的化學鍵；生物改性主要是通過酶解等生物技術對蛋白質進行修飾。乙醇改性作為一種化學改性方法，近年來受到了廣泛關注。乙醇分子能夠與蛋白質分子相互作用，改變蛋白質的二級和三級結構，進而影響其功能特性。研究表明，乙醇誘導改性可以使WPI的結構發(fā)生顯著變化，當乙醇濃度低于50%時可以使蛋白結構展開，而乙醇濃度高于50%時會使WPI分子之間通過二硫鍵形成聚合物。同時，乙醇改性能夠賦予WPI更高的表面疏水性和更佳的乳化特性，包括乳化活性和乳化穩(wěn)定性。然而，目前對于乙醇改性WPI的研究仍存在一些不足，如對改性機制的深入理解還不夠全面，改性條件的優(yōu)化還需要進一步研究，以及改性后WPI在不同食品體系中的應用效果還需要更多的驗證。乳狀液是一種多相體系，由兩種互不相溶的液體（通常是油和水）組成，其中一種液體以小液滴的形式分散在另一種液體中。在食品工業(yè)中，乳狀液廣泛應用于飲料、乳制品、肉制品、調味品等領域，如牛奶、冰淇淋、蛋黃醬、沙拉醬等都屬于乳狀液體系。乳狀液的穩(wěn)定性對于食品的質量和保質期至關重要，不穩(wěn)定的乳狀液會出現(xiàn)分層、絮凝、聚結等現(xiàn)象，導致食品的外觀、口感和營養(yǎng)價值下降。影響乳狀液穩(wěn)定性的因素眾多，包括乳化劑的種類和性質、油水比例、pH值、溫度、離子強度等。其中，乳化劑是影響乳狀液穩(wěn)定性的關鍵因素之一，它能夠降低油水界面的表面張力，使油滴均勻分散在水相中，并在油滴表面形成一層保護膜，防止油滴之間的聚集和合并。WPI作為一種天然的乳化劑，在乳狀液體系中具有重要的應用。然而，未經(jīng)改性的WPI在某些情況下難以滿足乳狀液對穩(wěn)定性的要求。通過乙醇改性WPI，有望改善其在乳狀液中的乳化性能和穩(wěn)定性，從而提高乳狀液的質量和穩(wěn)定性。深入研究乙醇改性WPI對乳狀液穩(wěn)定性的影響，對于開發(fā)新型高效的乳化劑、優(yōu)化乳狀液制備工藝、提高食品質量和安全性具有重要的理論和實際意義。本研究旨在通過對WPI進行乙醇改性，系統(tǒng)研究乙醇改性對WPI結構、功能特性、抗氧化特性和消化特性的影響，深入探討乙醇改性WPI對乳狀液穩(wěn)定性的作用機制，為WPI在食品工業(yè)中的高效應用提供理論依據(jù)和技術支持，具體包括以下幾個方面：優(yōu)化乙醇改性WPI的制備工藝，確定最佳的改性條件，如乙醇濃度、反應時間、反應溫度等。采用多種分析技術，如聚丙烯酰胺凝膠電泳、拉曼光譜、內源性熒光光譜、紫外光譜、原子力顯微鏡、掃描電鏡等，深入研究乙醇改性對WPI結構的影響，包括蛋白質的聚集狀態(tài)、二級和三級結構的變化等。系統(tǒng)測定乙醇改性WPI的功能特性，如表面疏水性、巰基含量、濁度、溶解度、乳化特性、起泡能力等，以及抗氧化特性和消化特性，分析改性前后WPI性能的變化規(guī)律。研究乙醇改性WPI對乳狀液穩(wěn)定性的影響，包括乳狀液的宏觀及微觀結構、粒徑及變化率、電勢、絮凝和凝結指數(shù)、界面蛋白分布、脂質氧化程度等，揭示乙醇改性WPI提高乳狀液穩(wěn)定性的作用機制。1.2國內外研究現(xiàn)狀1.2.1乳清分離蛋白改性的研究進展乳清分離蛋白（WPI）的改性研究一直是食品科學領域的熱門話題。在物理改性方面，加熱、高壓、超聲波等技術被廣泛應用。加熱改性能夠使WPI分子展開，暴露出更多的活性基團，從而改善其功能特性。在一定溫度范圍內，隨著加熱溫度的升高，WPI的溶解性和乳化性會先升高后降低。高壓處理則可以改變WPI的分子構象，提高其穩(wěn)定性和功能性。研究發(fā)現(xiàn)，高壓處理后的WPI在酸性條件下的穩(wěn)定性明顯增強，這為其在酸性食品中的應用提供了可能。超聲波改性通過超聲空化作用，能夠打破WPI分子間的相互作用，使其結構更加松散，進而提高其功能特性?；瘜W改性主要包括酰化、磷酸化、糖基化等方法。?；男酝ㄟ^引入酰基，改變WPI分子的電荷分布和空間結構，從而改善其乳化性、溶解性等性能。有研究表明，乙?；男院蟮腤PI在油水界面的吸附能力增強，乳化穩(wěn)定性顯著提高。磷酸化改性則是通過引入磷酸基團，增加WPI分子的親水性和負電荷，提高其在不同環(huán)境條件下的穩(wěn)定性和功能性。糖基化改性是利用美拉德反應，將糖類與WPI分子結合，形成具有更好功能特性的糖蛋白復合物。這種改性方法不僅可以提高WPI的穩(wěn)定性和抗氧化性，還能改善其口感和風味。有研究將葡萄糖與WPI進行糖基化反應，結果表明，糖基化后的WPI在高溫和酸性條件下的穩(wěn)定性明顯提高，同時具有較好的抗氧化活性。生物改性主要是利用酶解技術對WPI進行修飾。通過選擇不同的酶和控制酶解條件，可以得到具有特定功能特性的WPI水解產(chǎn)物。胰蛋白酶酶解WPI可以得到具有良好抗氧化活性的多肽，這些多肽能夠有效地清除自由基，抑制脂質氧化。酶解還可以改善WPI的溶解性和消化性，使其更易于被人體吸收利用。有研究通過控制酶解程度，得到了溶解性良好的WPI水解產(chǎn)物，將其應用于飲料中，能夠提高飲料的穩(wěn)定性和營養(yǎng)價值。1.2.2乳清分離蛋白在乳狀液中的應用研究WPI作為一種天然的乳化劑，在乳狀液體系中具有重要的應用。在食品工業(yè)中，WPI常用于制備各種乳狀液產(chǎn)品，如牛奶、冰淇淋、蛋黃醬等。WPI能夠降低油水界面的表面張力，使油滴均勻分散在水相中，形成穩(wěn)定的乳狀液。其乳化性能受到多種因素的影響，包括WPI的濃度、pH值、溫度、離子強度等。在低濃度下，WPI的乳化活性較高，但乳化穩(wěn)定性較差；隨著WPI濃度的增加，乳化穩(wěn)定性逐漸提高，但乳化活性可能會有所下降。pH值對WPI的乳化性能也有顯著影響，在等電點附近，WPI的溶解性和乳化性能會降低，導致乳狀液的穩(wěn)定性下降。為了提高WPI在乳狀液中的穩(wěn)定性和功能性，研究人員采用了多種方法。一種方法是與其他乳化劑或穩(wěn)定劑復配使用，如多糖、磷脂等。乳清分離蛋白與果膠復配使用，可以形成靜電復合物，增強乳狀液的穩(wěn)定性。果膠分子中的羧基與WPI分子中的氨基在適當?shù)膒H條件下發(fā)生靜電相互作用，形成的復合物在油水界面形成更加緊密的保護膜，有效地阻止油滴的聚集和合并。另一種方法是對WPI進行改性，如前面提到的物理、化學和生物改性方法，以改善其乳化性能和穩(wěn)定性。通過乙醇改性WPI，能夠提高其表面疏水性和乳化活性，使乳狀液的穩(wěn)定性得到顯著提高。1.2.3乙醇改性對乳清分離蛋白及乳狀液穩(wěn)定性影響的研究現(xiàn)狀乙醇改性作為一種化學改性方法，近年來在WPI的改性研究中受到了廣泛關注。乙醇分子能夠與WPI分子相互作用，改變其二級和三級結構，進而影響其功能特性。研究表明，乙醇誘導改性可以使WPI的結構發(fā)生顯著變化，當乙醇濃度低于50%時可以使蛋白結構展開，而乙醇濃度高于50%時會使WPI分子之間通過二硫鍵形成聚合物。同時，乙醇改性能夠賦予WPI更高的表面疏水性和更佳的乳化特性，包括乳化活性和乳化穩(wěn)定性。在乳狀液穩(wěn)定性方面，乙醇改性WPI能夠提高乳狀液的穩(wěn)定性，減少乳狀液的分層、絮凝和聚結等現(xiàn)象。其作用機制主要包括以下幾個方面：一是乙醇改性WPI在油水界面的吸附能力增強，形成的界面膜更加緊密和穩(wěn)定，能夠有效地阻止油滴之間的相互作用；二是乙醇改性WPI的表面疏水性增加，使其更易于在油水界面吸附，降低了油水界面的表面張力，從而提高了乳狀液的穩(wěn)定性；三是乙醇改性WPI可能改變了乳狀液的微觀結構，使油滴的粒徑分布更加均勻，減少了油滴之間的聚集和合并。然而，目前對于乙醇改性WPI的研究仍存在一些不足。一方面，對改性機制的深入理解還不夠全面，雖然已經(jīng)知道乙醇會影響WPI的結構和功能特性，但具體的作用過程和分子機制還需要進一步研究。例如，乙醇與WPI分子之間的相互作用方式、二硫鍵的形成和斷裂過程等，都需要更深入的研究來揭示。另一方面，改性條件的優(yōu)化還需要進一步研究，不同的乙醇濃度、反應時間、反應溫度等條件對WPI的改性效果和乳狀液穩(wěn)定性的影響還需要系統(tǒng)地研究和分析，以確定最佳的改性條件。目前的研究中，對于改性條件的優(yōu)化大多是基于單一因素的考察，缺乏多因素的綜合研究，難以全面了解改性條件對WPI性能的影響。此外，改性后WPI在不同食品體系中的應用效果還需要更多的驗證，不同的食品體系具有不同的成分和特性，改性WPI在這些體系中的穩(wěn)定性和功能性可能會受到影響，需要進一步研究和評估。1.3研究目的與內容本研究旨在深入探究乙醇改性對乳清分離蛋白（WPI）結構、功能特性、抗氧化特性、消化特性的影響，并系統(tǒng)研究其對乳狀液穩(wěn)定性的作用機制，為WPI在食品工業(yè)中的高效應用提供堅實的理論依據(jù)和技術支持。具體研究內容如下：優(yōu)化乙醇改性WPI的制備工藝：通過考察不同的乙醇濃度（如10%、30%、50%、70%等）、反應時間（設置不同的時間梯度，如1小時、2小時、4小時等）、反應溫度（如25℃、37℃、50℃等），以蛋白質的結構變化、功能特性改善以及乳狀液穩(wěn)定性提升為評價指標，利用響應面分析等方法，確定最佳的改性條件，獲得具有優(yōu)良性能的乙醇改性WPI。研究乙醇改性對WPI結構的影響：運用聚丙烯酰胺凝膠電泳，分析改性前后WPI的分子質量分布和聚集狀態(tài)，明確乙醇是否引發(fā)蛋白質的聚合或解聚；借助拉曼光譜，測定蛋白質二級結構中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲等結構的含量變化；利用內源性熒光光譜，監(jiān)測蛋白質三級結構中色氨酸等熒光基團微環(huán)境的改變，從而了解乙醇對蛋白質構象的影響；通過紫外光譜，分析蛋白質特征吸收峰的變化，判斷蛋白質分子中化學鍵和基團的改變；采用原子力顯微鏡和掃描電鏡，直觀觀察改性前后WPI的微觀形態(tài)，如顆粒大小、形狀和聚集情況，從微觀層面揭示乙醇改性對WPI結構的影響。測定乙醇改性WPI的功能特性、抗氧化特性和消化特性：系統(tǒng)測定乙醇改性WPI的表面疏水性，通過探針法測定其疏水性指數(shù)，分析疏水性變化對其在油水界面吸附和乳化性能的影響；測定巰基含量，采用Ellman試劑法，研究乙醇改性對蛋白質分子中巰基的氧化或還原作用，以及對蛋白質結構穩(wěn)定性和功能的影響；分析濁度，反映蛋白質的聚集程度和溶解性；測定溶解度，考察不同pH值和離子強度條件下的溶解度，了解改性對WPI溶解性能的影響；測定乳化特性，包括乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)，評估其在乳狀液體系中的乳化能力和穩(wěn)定性；測定起泡能力，通過攪拌或振蕩法測定泡沫體積和泡沫穩(wěn)定性，探究乙醇改性對WPI起泡性能的影響。同時，測定其抗氧化特性，包括鐵還原能力、ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、金屬離子螯合能力和氧自由基吸收能力，全面評估乙醇改性WPI的抗氧化活性；模擬人體消化過程，測定消化特性，包括蛋白水解率、消化后樣品粒徑電位、微觀形態(tài)和抗氧化特性，研究乙醇改性對WPI消化吸收和生物利用度的影響。研究乙醇改性WPI對乳狀液穩(wěn)定性的影響：觀察乳狀液的宏觀及微觀結構，通過肉眼觀察和光學顯微鏡、冷凍電鏡等技術，分析乳狀液的分層、絮凝、聚結等現(xiàn)象以及油滴的大小、分布和形態(tài)；測定粒徑及變化率，采用激光粒度儀測定不同時間點乳狀液油滴的粒徑分布，計算粒徑變化率，評估乳狀液的穩(wěn)定性；分析電勢，通過Zeta電位分析儀測定乳狀液的Zeta電位，了解油滴表面的電荷性質和電荷密度，判斷乳狀液的靜電穩(wěn)定性；計算絮凝和凝結指數(shù)，通過圖像分析等方法，評估乳狀液中油滴的絮凝和凝結程度；分析界面蛋白分布，采用熒光標記、表面張力測定等技術，研究乙醇改性WPI在油水界面的吸附量、吸附層厚度和分子取向，揭示其對乳狀液界面性質的影響；測定脂質氧化程度，通過測定脂質氫過氧化物、共軛二烯烴和丙二醛等指標，評估乳狀液中油脂的氧化穩(wěn)定性，探討乙醇改性WPI對脂質氧化的抑制作用機制。1.4研究方法與技術路線本研究采用多種實驗方法，從不同層面深入探究乙醇改性乳清分離蛋白（WPI）及其對乳狀液穩(wěn)定性的影響，具體研究方法如下：文獻研究法：通過廣泛查閱國內外相關文獻，全面了解乳清分離蛋白的結構、功能特性、改性技術以及在乳狀液中的應用等方面的研究現(xiàn)狀，為本研究提供堅實的理論基礎。單因素實驗與響應面分析法：在乙醇改性WPI的制備工藝研究中，首先進行單因素實驗，考察乙醇濃度、反應時間、反應溫度等因素對WPI結構和功能特性的影響。在此基礎上，采用響應面分析法，設計多因素實驗方案，通過數(shù)學模型擬合和優(yōu)化，確定最佳的改性條件。結構分析技術：運用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分析改性前后WPI的分子質量分布和聚集狀態(tài)；利用拉曼光譜測定蛋白質二級結構中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲等結構的含量變化；通過內源性熒光光譜監(jiān)測蛋白質三級結構中色氨酸等熒光基團微環(huán)境的改變；采用紫外光譜分析蛋白質特征吸收峰的變化，判斷蛋白質分子中化學鍵和基團的改變；借助原子力顯微鏡（AFM）和掃描電鏡（SEM）直觀觀察改性前后WPI的微觀形態(tài)，如顆粒大小、形狀和聚集情況。功能特性測定法：采用探針法測定表面疏水性，通過Ellman試劑法測定巰基含量，利用分光光度計測定濁度，通過離心法測定溶解度，采用乳化活性指數(shù)（EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI）評價乳化特性，通過攪拌或振蕩法測定起泡能力，全面分析乙醇改性對WPI功能特性的影響?？寡趸匦詼y定法：運用鐵還原能力（FRAP）、ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、金屬離子螯合能力和氧自由基吸收能力（ORAC）等方法，測定乙醇改性WPI的抗氧化活性，評估其在食品體系中的抗氧化作用。消化特性模擬法：模擬人體消化過程，采用酶解法測定蛋白水解率，通過激光粒度儀和Zeta電位分析儀測定消化后樣品粒徑電位，利用掃描電鏡觀察微觀形態(tài)，采用上述抗氧化特性測定方法分析消化后樣品的抗氧化特性，研究乙醇改性對WPI消化吸收和生物利用度的影響。乳狀液穩(wěn)定性分析法：通過肉眼觀察和光學顯微鏡、冷凍電鏡等技術觀察乳狀液的宏觀及微觀結構；使用激光粒度儀測定不同時間點乳狀液油滴的粒徑分布，計算粒徑變化率；利用Zeta電位分析儀測定乳狀液的Zeta電位，分析電勢；通過圖像分析等方法計算絮凝和凝結指數(shù)；采用熒光標記、表面張力測定等技術分析界面蛋白分布；通過測定脂質氫過氧化物、共軛二烯烴和丙二醛等指標，評估乳狀液中油脂的氧化穩(wěn)定性，研究乙醇改性WPI對乳狀液穩(wěn)定性的影響。本研究技術路線圖如圖1-1所示，首先進行文獻調研，了解研究現(xiàn)狀和背景知識。接著開展乙醇改性WPI的制備工藝研究，通過單因素實驗和響應面分析確定最佳改性條件。然后對改性前后的WPI進行結構、功能特性、抗氧化特性和消化特性的測定與分析。最后，將改性WPI應用于乳狀液體系，研究其對乳狀液穩(wěn)定性的影響，包括宏觀及微觀結構、粒徑及變化率、電勢、絮凝和凝結指數(shù)、界面蛋白分布、脂質氧化程度等方面的分析，從而深入揭示乙醇改性WPI對乳狀液穩(wěn)定性的作用機制。[此處插入技術路線圖1-1，圖中應清晰展示從文獻調研開始，經(jīng)過各研究步驟，最終得出研究結論的流程，每個步驟之間用箭頭清晰連接，標注各步驟關鍵內容和使用的主要方法]二、乳清分離蛋白與乙醇改性概述2.1乳清分離蛋白2.1.1乳清蛋白的分類與組成乳清蛋白是從牛奶中提取的一種優(yōu)質蛋白質，其分類豐富多樣，主要由β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、蛋白酶-胨、牛血清白蛋白和免疫球蛋白等成分構成。在乳制品中，乳清蛋白約占乳蛋白質的18%-20%，雖含量相對不高，但其在乳制品的品質與功能方面卻發(fā)揮著關鍵作用。β-乳球蛋白是乳清蛋白中含量最高的成分，約占48%。它具有較強的與松香油和脂肪酸結合的能力，常被用作功能性配料。在乳制品加工中，β-乳球蛋白能夠與脂質結合，影響乳制品的口感和質地，使其更加細膩、順滑。同時，它還能對脂溶性營養(yǎng)素如維生素A和維生素D進行預結合，這對于提高乳制品中這些營養(yǎng)素的穩(wěn)定性和生物利用度具有重要意義，有助于擴展乳制品在營養(yǎng)強化方面的應用前景。α-乳白蛋白約占乳清蛋白的19%，是一種天然乳清蛋白。其主要生理作用是與金屬離子包括鈣質結合，在維持人體鈣平衡和促進鈣吸收方面發(fā)揮著重要作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，α-乳白蛋白可能具有抗癌功能，這一發(fā)現(xiàn)為其在功能性食品和醫(yī)藥領域的應用開辟了新的方向。由于從牛奶分離出來的α-乳白蛋白在氨基酸比例和結構方面，以及在功能特性上與人乳非常相似，使其在嬰兒配方食品中得到廣泛應用，能夠為嬰兒提供優(yōu)質的蛋白質營養(yǎng)，滿足嬰兒生長發(fā)育的需求。蛋白酶-胨占乳清蛋白的20%，它在乳清蛋白的消化和代謝過程中起著重要的作用。蛋白酶-胨可以被人體中的蛋白酶進一步水解，釋放出多種氨基酸，為人體提供氮源和能量，有助于維持人體正常的生理功能。牛血清白蛋白在乳清蛋白中含量約為5%，它具有多種生理功能，如運輸和儲存營養(yǎng)物質、調節(jié)滲透壓等。牛血清白蛋白能夠結合和運輸脂肪酸、膽紅素等物質，在維持體內物質平衡和代謝過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。免疫球蛋白占乳清蛋白的8%，它是一類具有抗體活性的蛋白質，能夠幫助人體抵御病原體的入侵，增強免疫力。在乳制品中，免疫球蛋白可以為消費者提供一定的免疫保護作用，尤其是對于免疫力較弱的人群，如嬰幼兒、老年人和免疫力低下的患者，攝入含有免疫球蛋白的乳制品有助于提高他們的抵抗力，預防疾病的發(fā)生。除了上述主要成分外，乳清蛋白中還含有少量如乳鐵蛋白和乳過氧化物酶等高價值成分。乳鐵蛋白具有抗菌、抗病毒、抗氧化、調節(jié)免疫等多種生理功能，在對抗各種革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌方面表現(xiàn)出顯著效果，還對幾種人體病毒具有抵抗作用。動物試驗研究發(fā)現(xiàn)，乳鐵蛋白可能具有預防膿毒性休克癥狀的作用。乳過氧化物酶則具有抗菌、抗氧化等特性，能夠抑制食品中的微生物生長，延長食品的保質期。這些高價值成分雖然含量較少，但它們賦予了乳清蛋白獨特的功能和營養(yǎng)價值，使其在食品、醫(yī)藥等領域具有廣闊的應用前景。2.1.2乳清分離蛋白的功能及營養(yǎng)特性乳清分離蛋白（WPI）作為乳清蛋白的高純度形式，蛋白質含量在90%以上，具有卓越的營養(yǎng)優(yōu)勢和豐富的功能特性。從營養(yǎng)角度來看，WPI的氨基酸組成合理，包含人體所需的全部20種氨基酸，且必需氨基酸含量高于普通食用蛋白質。其中，亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸三種支鏈氨基酸含量高達20%，在蛋白質代謝、血糖穩(wěn)定和脂質代謝中發(fā)揮著重要作用。支鏈氨基酸可以直接參與肌肉的合成代謝，減少肌肉蛋白質的分解，促進肌肉生長和修復。對于運動員、健身愛好者以及術后康復人群來說，補充WPI有助于提高肌肉力量和耐力，加速身體恢復。WPI的消化吸收率高，生物價高達88，能夠被人體高效地吸收利用，為人體提供充足的優(yōu)質蛋白質，滿足人體對蛋白質的需求，有助于維持身體的正常生理功能。在食品中，WPI展現(xiàn)出多種功能特性。WPI具有良好的溶解性，在不同的pH值和溫度條件下都能保持較高的溶解程度，這使得它能夠方便地添加到各種食品體系中，不會產(chǎn)生沉淀或分層現(xiàn)象，保證了食品的均勻性和穩(wěn)定性。在飲料生產(chǎn)中，WPI可以作為營養(yǎng)強化劑和乳化劑，既能提高飲料的營養(yǎng)價值，又能使飲料中的油脂和其他成分均勻分散，防止出現(xiàn)油水分層現(xiàn)象，延長飲料的保質期。WPI的持水性和吸水性使其能夠吸收和保持水分，在烘焙食品中，它可以增加產(chǎn)品的水分含量，使烘焙食品更加柔軟、濕潤，延長其貨架期。在肉制品加工中，WPI能夠與肉中的水分結合，保持肉的鮮嫩多汁，同時還能改善肉制品的質地和口感，提高產(chǎn)品的品質。WPI具有出色的成膠性，在適當?shù)臈l件下，能夠形成凝膠結構。這種特性在乳制品、果凍等食品的制作中得到廣泛應用，能夠賦予食品良好的質地和口感，使其更加細膩、滑嫩。在酸奶制作中，WPI可以與酪蛋白相互作用，形成穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡，增強酸奶的穩(wěn)定性，防止乳清析出，改善酸奶的質地和口感。WPI還具有良好的粘合性和彈性，在面食制品中添加WPI，可以增強面團的粘性和彈性，改善面團的加工性能，使制作出的面食更加勁道、有嚼勁。在火腿腸等肉制品中，WPI可以幫助肉中的蛋白質與水結合，促進肉的成型，提高產(chǎn)品的彈性和口感。WPI的攪打起泡性使其能夠在攪拌或振蕩的過程中形成穩(wěn)定的泡沫結構，在蛋糕、冰淇淋等食品的制作中，WPI可以作為起泡劑，增加食品的體積和松軟度，改善食品的口感和外觀。在蛋糕制作中，WPI形成的泡沫結構可以使蛋糕更加蓬松，口感更加細膩。WPI的乳化性使其能夠降低油水界面的表面張力，使油滴均勻分散在水相中，形成穩(wěn)定的乳狀液。在蛋黃醬、沙拉醬等食品中，WPI作為乳化劑，能夠使油和水充分混合，形成穩(wěn)定的乳狀液體系，防止油滴聚集和分層，保證食品的質量和穩(wěn)定性。2.1.3乳清分離蛋白的應用領域乳清分離蛋白憑借其優(yōu)良的營養(yǎng)特性和功能特性，在食品、保健品、醫(yī)藥等多個領域得到了廣泛的應用。在食品領域，WPI的應用十分廣泛。在乳制品中，如酸奶、奶酪、冰淇淋等，WPI可以改善產(chǎn)品的質地、口感和穩(wěn)定性。在酸奶中添加WPI，不僅不會影響發(fā)酵和風味，還能在保質期內減緩酸奶的分層和乳清的析出，使酸奶更加細膩、均勻，口感更好。在奶酪制作中，WPI可以提高奶酪的產(chǎn)量和質量，改善奶酪的質地和風味。在冰淇淋中，WPI可以增加冰淇淋的膨脹率，使其更加細膩、順滑，口感更加豐富。在肉制品中，WPI能夠促進肉中蛋白質與水結合，幫助肉類制品形成膠態(tài)和再成形。在火腿腸中加入含蛋白質10%以上的乳清溶液，能控制水分和脂肪的損失，防止烹調時重量和風味的改變，使火腿腸更加鮮嫩多汁，口感更好。在香腸中加入WPI可幫助脂肪乳化，防止脂肪分離和聚集，提高香腸的穩(wěn)定性和品質。在烘焙食品中，WPI可以改善面團的加工性能和烘焙品質，增加產(chǎn)品的體積和柔軟度。在面包制作中，WPI可以增強面團的筋力，使面包更加松軟、有彈性，延長面包的保鮮期。在蛋糕制作中，WPI可以提高蛋糕的膨脹率，使蛋糕更加蓬松，口感更加細膩。在飲料中，WPI可作為營養(yǎng)強化劑和乳化劑，提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性和營養(yǎng)價值。在運動飲料中，添加WPI可以補充運動后人體所需的蛋白質，幫助恢復體力。在果汁飲料中，WPI可以作為乳化劑，使果汁中的油脂和其他成分均勻分散，防止出現(xiàn)油水分層現(xiàn)象，提高飲料的穩(wěn)定性和口感。在保健品領域，WPI因其豐富的營養(yǎng)成分和易于消化吸收的特點，成為一種重要的營養(yǎng)補充劑。對于運動員、健身愛好者、術后康復人群以及老年人等對蛋白質需求較高的人群，WPI可以提供優(yōu)質的蛋白質營養(yǎng)，幫助他們增強肌肉力量、促進身體恢復、提高免疫力。分離乳清蛋白被稱為蛋白之王，它含有多種活性成分，如α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、乳鐵蛋白以及免疫球蛋白等，這些成分可以調節(jié)人體的免疫力，為人體提供全方位的健康保護。在醫(yī)藥領域，WPI也有一定的應用。由于其良好的生物相容性和營養(yǎng)特性，WPI可以用于制備特殊醫(yī)療用途配方食品，滿足有限飲食、消化吸收障礙、代謝障礙或特定疾病狀態(tài)人群對營養(yǎng)素或膳食的特殊需求。在一些針對老年人肌少癥的營養(yǎng)補充劑中，WPI與其他營養(yǎng)成分結合，如蘆丁-乳清分離蛋白微粒，從清除自由基和補充優(yōu)質蛋白兩個方面維護并促進骨骼肌健康，為預防和治療老年肌少癥提供了有效的營養(yǎng)支持。2.2乙醇改性蛋白質原理2.2.1乙醇與蛋白質的相互作用機制乙醇作為一種常見的小分子有機溶劑，其分子結構中包含一個羥基（-OH）和一個乙基（-C?H?）。這種結構賦予了乙醇獨特的物理化學性質，使其能夠與蛋白質發(fā)生多種相互作用，從分子層面深刻影響蛋白質的結構與功能。從分子層面來看，乙醇與蛋白質之間的相互作用主要通過氫鍵和疏水作用實現(xiàn)。乙醇分子的羥基具有較強的親水性，能夠與蛋白質分子中的極性基團，如氨基（-NH?）、羧基（-COOH）、羥基（-OH）等形成氫鍵。氫鍵的形成改變了蛋白質分子內部原有的氫鍵網(wǎng)絡，破壞了蛋白質的二級和三級結構。在正常情況下，蛋白質分子中的氨基酸殘基通過特定的氫鍵相互作用維持著穩(wěn)定的二級結構，如α-螺旋和β-折疊。當乙醇存在時，乙醇分子的羥基與蛋白質分子中的極性基團形成新的氫鍵，打破了原有的氫鍵平衡，導致蛋白質的二級結構發(fā)生改變。研究發(fā)現(xiàn)，隨著乙醇濃度的增加，蛋白質二級結構中的α-螺旋含量逐漸減少，而β-折疊和無規(guī)卷曲的含量相應增加，這表明乙醇誘導的氫鍵作用使蛋白質的結構變得更加松散和無序。除了氫鍵作用，乙醇分子的乙基具有疏水性，能夠與蛋白質分子中的疏水基團發(fā)生疏水相互作用。蛋白質分子中的疏水基團通常位于分子內部，形成疏水核心，維持蛋白質的三級結構穩(wěn)定。乙醇分子的乙基插入到蛋白質分子的疏水區(qū)域，破壞了疏水基團之間的相互作用，使蛋白質的三級結構發(fā)生改變。這種疏水作用還可能導致蛋白質分子的聚集和沉淀。當乙醇濃度較高時，蛋白質分子的疏水區(qū)域暴露在溶液中，不同蛋白質分子之間的疏水基團相互吸引，形成聚集物，最終導致蛋白質沉淀。研究表明，在高濃度乙醇溶液中，蛋白質的聚集程度明顯增加，這與乙醇對蛋白質疏水作用的影響密切相關。乙醇還可能對蛋白質分子中的二硫鍵產(chǎn)生影響。二硫鍵（-S-S-）是由兩個半胱氨酸殘基的巰基（-SH）氧化形成的共價鍵，在維持蛋白質的三級結構和功能穩(wěn)定性方面起著重要作用。乙醇可以通過改變蛋白質分子的微環(huán)境，影響二硫鍵的穩(wěn)定性。在一定條件下，乙醇可能促進二硫鍵的斷裂，使蛋白質分子的結構發(fā)生改變。研究發(fā)現(xiàn)，在較高濃度的乙醇溶液中，蛋白質分子中的二硫鍵含量降低，這可能是由于乙醇分子與蛋白質分子的相互作用導致二硫鍵周圍的微環(huán)境發(fā)生變化，使二硫鍵更容易受到氧化還原反應的影響而斷裂。二硫鍵的斷裂會導致蛋白質分子的構象發(fā)生改變，進而影響其功能特性。例如，對于一些具有酶活性的蛋白質，二硫鍵的斷裂可能導致酶的活性中心結構改變，使酶的催化活性降低或喪失。2.2.2乙醇濃度、處理時間對改性效果的影響乙醇濃度和處理時間是影響乙醇改性蛋白質效果的兩個關鍵因素，它們對蛋白質的結構和功能特性有著顯著的影響，呈現(xiàn)出一定的變化規(guī)律。乙醇濃度對蛋白質結構和功能的影響十分顯著。當乙醇濃度較低時，乙醇分子主要通過氫鍵與蛋白質分子相互作用，使蛋白質分子的結構逐漸展開，部分原本埋藏在分子內部的疏水基團暴露出來，從而提高了蛋白質的表面疏水性。在低濃度乙醇溶液中，蛋白質的二級結構開始發(fā)生變化，α-螺旋含量逐漸減少，β-折疊和無規(guī)卷曲含量增加，這使得蛋白質分子的柔韌性增強，更易于與其他分子相互作用。此時，蛋白質的溶解性可能會有所提高，因為分子結構的展開使蛋白質更容易與溶劑分子相互作用，增加了其在溶液中的分散性。隨著乙醇濃度的進一步增加，乙醇分子的疏水作用逐漸增強，蛋白質分子之間的相互作用發(fā)生改變，導致蛋白質分子發(fā)生聚集和沉淀。當乙醇濃度達到一定程度時，蛋白質分子的疏水區(qū)域大量暴露，不同蛋白質分子之間的疏水基團相互吸引，形成聚集物。這些聚集物的粒徑逐漸增大，最終導致蛋白質沉淀。研究表明，在高濃度乙醇溶液中，蛋白質的濁度明顯增加，這是蛋白質聚集和沉淀的直觀表現(xiàn)。同時，蛋白質的功能特性也會受到嚴重影響，如乳化性、起泡性等會顯著下降。在高濃度乙醇處理后的蛋白質用于制備乳狀液時，由于蛋白質的聚集和沉淀，其在油水界面的吸附能力減弱，無法有效地降低油水界面的表面張力，導致乳狀液的穩(wěn)定性降低。處理時間對蛋白質的改性效果也有重要影響。在較短的處理時間內，乙醇與蛋白質的相互作用尚未充分發(fā)生，蛋白質的結構和功能變化相對較小。隨著處理時間的延長，乙醇分子有更多的機會與蛋白質分子相互作用，蛋白質的結構逐漸發(fā)生改變，功能特性也隨之變化。在較長時間的乙醇處理下，蛋白質分子的二級和三級結構會發(fā)生更顯著的變化，表面疏水性進一步提高，聚集程度也可能增加。如果處理時間過長，蛋白質可能會過度變性，導致其功能特性嚴重受損，甚至喪失部分功能。有研究表明，當乙醇處理時間超過一定限度時，蛋白質的酶活性會急劇下降，這是由于蛋白質的結構被過度破壞，導致酶的活性中心無法正常發(fā)揮作用。乙醇濃度和處理時間之間還存在著相互影響的關系。在較低的乙醇濃度下，延長處理時間可能會使蛋白質的改性效果逐漸增強，但這種增強效果相對有限。而在較高的乙醇濃度下，處理時間的延長可能會加劇蛋白質的聚集和沉淀，導致蛋白質的功能特性更快地下降。因此，在進行乙醇改性蛋白質時，需要綜合考慮乙醇濃度和處理時間這兩個因素，通過優(yōu)化這兩個參數(shù)，找到最佳的改性條件，以實現(xiàn)對蛋白質結構和功能的有效調控，獲得具有理想性能的改性蛋白質。2.3乳狀液及穩(wěn)定性影響因素2.3.1乳狀液的形成與類型乳狀液是一種典型的多相分散體系，由兩種互不相溶的液體組成，其中一種液體以微小液滴的形式均勻分散在另一種液體中。這兩種互不相溶的液體通常為油和水，根據(jù)分散相和連續(xù)相的不同，乳狀液主要分為水包油（O/W）型和油包水（W/O）型兩種類型。在O/W型乳狀液中，油滴作為分散相，被分散在連續(xù)的水相中。日常生活中的牛奶、豆?jié){等就屬于O/W型乳狀液，其中的脂肪球均勻分散在水相中。這種類型的乳狀液外觀通常呈現(xiàn)白色或乳白色，這是由于油滴對光線的散射作用導致的。當光線照射到O/W型乳狀液時，油滴會散射光線，使得乳狀液呈現(xiàn)出不透明的白色外觀。在W/O型乳狀液中，水滴作為分散相，分散在連續(xù)的油相中。常見的W/O型乳狀液如黃油、奶油等，其中的水分以微小水滴的形式分散在油脂中。W/O型乳狀液的外觀通常較為油膩，顏色相對較淺，這是因為油相作為連續(xù)相，對光線的吸收和散射方式與O/W型乳狀液不同。乳狀液的形成過程是一個復雜的物理過程，需要克服油水兩相之間的界面張力。在自然狀態(tài)下，油和水由于分子間作用力的差異，傾向于相互分離，以降低體系的能量。為了形成穩(wěn)定的乳狀液，需要外界提供能量，如攪拌、振蕩、超聲等，使一種液體分散成微小液滴進入另一種液體中。在分散過程中，油滴或水滴的表面會與連續(xù)相液體接觸，形成油水界面。由于油水界面具有較高的表面張力，這種高能狀態(tài)使得乳狀液在熱力學上是不穩(wěn)定的，容易發(fā)生油滴或水滴的聚集和合并，導致乳狀液分層。為了提高乳狀液的穩(wěn)定性，通常需要加入乳化劑。乳化劑是一類具有兩親性結構的物質，分子中同時含有親水基團和親油基團。在乳狀液體系中，乳化劑的親油基團會吸附在油滴表面，而親水基團則伸向水相，形成一層緊密的保護膜。這層保護膜能夠降低油水界面的表面張力，使油滴能夠穩(wěn)定地分散在水相中。乳化劑還能在油滴表面形成一層帶電的吸附層，通過靜電排斥作用防止油滴之間的聚集和合并，進一步提高乳狀液的穩(wěn)定性。乳狀液的類型可以通過多種方法進行鑒別。一種常用的方法是稀釋法，由于O/W型乳狀液的連續(xù)相是水，所以它可以被水稀釋，而W/O型乳狀液則不能被水稀釋，但可以被油稀釋。另一種方法是染色法，將少量油溶性染料加入乳狀液中，如果乳狀液整體被染色，說明油是連續(xù)相，即為W/O型乳狀液；如果只有分散相的小液滴被染色，則說明水是連續(xù)相，為O/W型乳狀液。導電法也是一種有效的鑒別方法，由于水的導電性比油好，所以O/W型乳狀液的導電性較好，而W/O型乳狀液的導電性較差。通過這些鑒別方法，可以準確判斷乳狀液的類型，為進一步研究和應用乳狀液提供基礎。2.3.2影響乳狀液穩(wěn)定性的內在因素乳狀液的穩(wěn)定性是其在實際應用中的關鍵性能指標，受到多種內在因素的綜合影響，其中乳化劑性質、油水比例和界面膜強度起著至關重要的作用。乳化劑作為影響乳狀液穩(wěn)定性的核心因素之一，其性質對乳狀液的穩(wěn)定性有著深遠影響。乳化劑的分子結構具有獨特的兩親性，一端為親水基團，另一端為親油基團。這種結構使得乳化劑能夠在油水界面上定向吸附，降低油水界面的表面張力，使油滴能夠穩(wěn)定地分散在水相中。乳化劑的親水親油平衡值（HLB值）是衡量其親水性和親油性相對強弱的重要指標。HLB值較低的乳化劑親油性較強，適用于制備W/O型乳狀液；而HLB值較高的乳化劑親水性較強，更適合制備O/W型乳狀液。在食品工業(yè)中，常用的乳化劑如磷脂、單甘酯等，它們的HLB值不同，應用場景也有所差異。磷脂的HLB值一般在3-4左右，親油性較強，常用于制備W/O型乳狀液，如在巧克力生產(chǎn)中，磷脂可以幫助油脂均勻分散在可可粉等成分中，提高巧克力的質量和穩(wěn)定性。單甘酯的HLB值在3-10之間，根據(jù)不同的結構和純度，既可以用于制備W/O型乳狀液，也可以用于制備O/W型乳狀液，在乳制品和烘焙食品中應用廣泛，能夠改善產(chǎn)品的質地和穩(wěn)定性。油水比例也是影響乳狀液穩(wěn)定性的重要因素。油水比例的變化會直接影響乳狀液的類型和穩(wěn)定性。當油相比例較低時，乳狀液更容易形成O/W型，此時油滴分散在連續(xù)的水相中，水相能夠提供較好的分散介質和保護作用，乳狀液相對較為穩(wěn)定。在牛奶中，脂肪含量相對較低，形成的是O/W型乳狀液，具有較好的穩(wěn)定性。然而，當油相比例增加時，乳狀液可能會發(fā)生轉相，從O/W型轉變?yōu)閃/O型，或者變得不穩(wěn)定。當油相比例過高時，油滴之間的相互作用增強，容易發(fā)生聚集和合并，導致乳狀液分層。在制備高油含量的乳狀液時，如蛋黃醬，需要嚴格控制油水比例，并選擇合適的乳化劑和工藝條件，以確保乳狀液的穩(wěn)定性。研究表明，當油相體積分數(shù)超過74%時，乳狀液的穩(wěn)定性會顯著下降，容易出現(xiàn)破乳現(xiàn)象。界面膜的強度是決定乳狀液穩(wěn)定性的關鍵因素之一。在乳狀液中，乳化劑在油水界面上形成一層界面膜，這層膜能夠阻止油滴之間的相互碰撞和合并。界面膜的強度取決于乳化劑的種類、濃度以及乳化劑分子之間的相互作用。乳化劑濃度越高，在油水界面上形成的界面膜越緊密，強度越大，乳狀液的穩(wěn)定性也就越高。一些具有特殊結構的乳化劑，如蛋白質類乳化劑，能夠在油水界面上形成多層吸附結構，增強界面膜的強度。乳清分離蛋白作為一種蛋白質類乳化劑，其分子結構中的氨基酸殘基能夠與油滴表面和水相分子形成多種相互作用，包括氫鍵、疏水作用和靜電作用等，從而在油水界面上形成穩(wěn)定的界面膜。研究發(fā)現(xiàn)，當乳清分離蛋白在油水界面上的吸附量達到一定程度時，能夠顯著提高乳狀液的穩(wěn)定性，抑制油滴的聚集和合并。界面膜的流動性也會影響乳狀液的穩(wěn)定性。如果界面膜過于剛性，在受到外界擾動時容易破裂；而如果界面膜過于流動，油滴之間的相互作用無法有效阻止，也會導致乳狀液不穩(wěn)定。因此，合適的界面膜強度和流動性對于維持乳狀液的穩(wěn)定性至關重要。2.3.3外界條件對乳狀液穩(wěn)定性的作用乳狀液的穩(wěn)定性不僅受到內在因素的影響，外界條件如溫度、pH值和離子強度的變化也會對其產(chǎn)生顯著影響，這些外界因素通過改變乳狀液的物理化學性質，進而影響其穩(wěn)定性。溫度是影響乳狀液穩(wěn)定性的重要外界因素之一。溫度的變化會對乳狀液的多個方面產(chǎn)生影響，從而改變其穩(wěn)定性。隨著溫度的升高，乳狀液中分子的熱運動加劇，油滴的布朗運動速度加快，這使得油滴之間的碰撞頻率增加。如果碰撞能量足夠大，就可能克服乳化劑形成的界面膜的阻礙，導致油滴聚集和合并，從而降低乳狀液的穩(wěn)定性。在高溫下，乳化劑分子在油水界面上的吸附能力可能會減弱，界面膜的強度下降，進一步促進了油滴的聚集。在加熱牛奶時，如果溫度過高且持續(xù)時間過長，牛奶中的脂肪球會逐漸聚集合并，導致牛奶出現(xiàn)分層現(xiàn)象。不同類型的乳狀液對溫度的敏感性也有所不同。一般來說，O/W型乳狀液對溫度更為敏感，因為水相的熱膨脹系數(shù)較大，溫度升高時水相體積變化較大，容易破壞乳狀液的結構。而W/O型乳狀液由于油相的熱穩(wěn)定性相對較高，對溫度的耐受性相對較好，但在極端高溫條件下，也會出現(xiàn)穩(wěn)定性下降的情況。pH值的變化會顯著影響乳狀液的穩(wěn)定性，尤其是對于含有蛋白質類乳化劑的乳狀液。蛋白質分子是由氨基酸組成，氨基酸殘基上含有可解離的基團，如氨基和羧基。在不同的pH值條件下，這些基團的解離狀態(tài)會發(fā)生變化，從而影響蛋白質分子的電荷分布和空間結構。當pH值接近蛋白質的等電點時，蛋白質分子的凈電荷為零，分子間的靜電排斥作用減弱，蛋白質容易發(fā)生聚集。在乳狀液中，這會導致乳化劑在油水界面上的吸附量減少，界面膜的強度降低，油滴之間的相互作用增強，最終導致乳狀液的穩(wěn)定性下降。以乳清分離蛋白作為乳化劑的乳狀液為例，乳清分離蛋白的等電點約為pH4.5-5.2。當乳狀液的pH值接近這個范圍時，乳清分離蛋白會發(fā)生聚集，乳狀液容易出現(xiàn)絮凝和分層現(xiàn)象。而在遠離等電點的pH值條件下，蛋白質分子帶有較多的電荷，分子間的靜電排斥作用較強，能夠保持較好的溶解性和乳化性能，乳狀液的穩(wěn)定性相對較高。離子強度對乳狀液穩(wěn)定性的影響主要通過改變油滴表面的電荷分布和界面膜的性質來實現(xiàn)。在乳狀液中，油滴表面通常帶有一定的電荷，這些電荷來自于乳化劑分子的解離或者吸附在油滴表面的離子。當體系中加入電解質，離子強度增加時，溶液中的反離子會壓縮油滴表面的雙電層，使雙電層厚度減小。這會導致油滴之間的靜電排斥作用減弱，油滴更容易相互靠近并發(fā)生聚集。高濃度的鹽離子還可能與乳化劑分子發(fā)生相互作用，改變乳化劑在油水界面上的吸附狀態(tài)和界面膜的結構。在含有離子型乳化劑的乳狀液中加入大量的鹽，鹽離子可能會與乳化劑分子的帶電基團結合，降低乳化劑的親水性，使乳化劑從油水界面上脫附，從而破壞界面膜的穩(wěn)定性，導致乳狀液破乳。然而，在某些情況下，適當?shù)碾x子強度可以通過靜電屏蔽作用，減少乳化劑分子之間的靜電排斥，使乳化劑在油水界面上的排列更加緊密，從而提高界面膜的強度和乳狀液的穩(wěn)定性。因此，離子強度對乳狀液穩(wěn)定性的影響較為復雜，需要根據(jù)具體的乳狀液體系和乳化劑類型進行綜合考慮。三、實驗材料與方法3.1實驗材料與儀器3.1.1乳清分離蛋白及試劑本實驗所用的乳清分離蛋白（WPI）購自[具體品牌或供應商]，其蛋白質含量經(jīng)檢測在90%以上，符合實驗要求。該乳清分離蛋白為白色粉末狀，具有良好的溶解性和分散性，無異味，雜質含量低，能夠為后續(xù)實驗提供可靠的研究基礎。實驗中使用的試劑包括無水乙醇，分析純，用于對乳清分離蛋白進行改性處理，其純度高，能夠有效保證改性反應的準確性和可靠性；鹽酸（HCl），濃度為[具體濃度]，分析純，主要用于調節(jié)溶液的pH值，以滿足實驗過程中不同階段對酸堿度的要求；氫氧化鈉（NaOH），分析純，同樣用于調節(jié)溶液pH值，與鹽酸配合使用，精確控制溶液的酸堿度；氯化鈉（NaCl），分析純，在實驗中用于調整溶液的離子強度，研究離子強度對乳清分離蛋白及乳狀液穩(wěn)定性的影響；十二烷基硫酸鈉（SDS），分析純，作為一種表面活性劑，在實驗中用于輔助形成乳狀液，以及研究其與乳清分離蛋白的相互作用對乳狀液穩(wěn)定性的影響；考馬斯亮藍G-250，用于蛋白質含量的測定，通過與蛋白質結合產(chǎn)生顏色變化，從而準確測定蛋白質的含量；牛血清白蛋白（BSA），作為標準蛋白，用于繪制蛋白質含量測定的標準曲線，確保蛋白質含量測定的準確性；三氯乙酸（TCA），分析純，用于沉淀蛋白質，以便對蛋白質進行進一步的分析和處理；鐵氰化鉀，分析純，在抗氧化特性測定實驗中，用于檢測樣品的鐵還原能力，評估乳清分離蛋白改性前后的抗氧化性能；ABTS（2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽），分析純，用于測定ABTS自由基清除能力，是評估抗氧化特性的重要指標之一；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼），分析純，用于測定DPPH自由基清除能力，進一步了解乳清分離蛋白的抗氧化活性；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na），分析純，在金屬離子螯合能力測定實驗中，用于與金屬離子結合，從而評估乳清分離蛋白對金屬離子的螯合能力；熒光素，在氧自由基吸收能力（ORAC）測定實驗中，作為熒光探針，用于檢測樣品對氧自由基的吸收能力，全面評估乳清分離蛋白的抗氧化性能。以上試劑均為分析純級別，購自[具體試劑供應商]，質量可靠，能夠滿足實驗的高精度要求。在使用前，對所有試劑進行了嚴格的質量檢驗，確保其純度和性能符合實驗標準。3.1.2實驗儀器設備實驗中使用的儀器設備種類豐富，涵蓋了多個領域，能夠滿足從樣品制備到分析檢測的一系列實驗需求。高速冷凍離心機（型號：[具體型號]，品牌：[品牌名稱]），主要用于樣品的離心分離，其最高轉速可達[具體轉速]，能夠在短時間內實現(xiàn)樣品的快速分離。在乳清分離蛋白的改性實驗中，用于分離改性后的蛋白質沉淀，以及在乳狀液穩(wěn)定性研究中，分離乳狀液中的油相和水相，以便對其進行進一步的分析。該離心機具備冷凍功能，能夠在低溫環(huán)境下進行離心操作，有效避免蛋白質在離心過程中發(fā)生變性，保證實驗結果的準確性。紫外可見分光光度計（型號：[具體型號]，品牌：[品牌名稱]），用于測量樣品在紫外和可見光范圍內的吸光度。在蛋白質含量測定實驗中，通過測量考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合后的吸光度，根據(jù)標準曲線計算蛋白質的含量；在抗氧化特性測定實驗中，用于測量ABTS自由基、DPPH自由基與樣品反應后的吸光度變化，從而計算樣品的自由基清除能力；還可用于分析乳清分離蛋白改性前后的紫外光譜特征，研究其結構變化。該儀器具有高精度、高靈敏度的特點，能夠準確測量微小的吸光度變化，為實驗提供可靠的數(shù)據(jù)支持。熒光分光光度計（型號：[具體型號]，品牌：[品牌名稱]），用于測量樣品的熒光強度和熒光光譜。在研究乳清分離蛋白的內源性熒光光譜時，通過測量蛋白質分子中色氨酸等熒光基團的熒光強度和光譜變化，了解蛋白質三級結構中熒光基團微環(huán)境的改變，從而分析乙醇改性對蛋白質構象的影響。該儀器能夠精確控制激發(fā)光和發(fā)射光的波長，具有高分辨率和低噪聲的特點，能夠獲取準確的熒光光譜信息。傅里葉變換紅外光譜儀（型號：[具體型號]，品牌：[品牌名稱]），用于分析樣品的化學結構和化學鍵。在研究乳清分離蛋白的二級結構時，通過測量蛋白質分子中酰胺鍵的紅外吸收峰，確定α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲等二級結構的含量變化，進而了解乙醇改性對蛋白質二級結構的影響。該儀器具有高分辨率和快速掃描的特點，能夠在短時間內獲取全面的紅外光譜信息，為蛋白質結構分析提供有力的工具。原子力顯微鏡（AFM，型號：[具體型號]，品牌：[品牌名稱]），用于觀察樣品的微觀形貌和表面結構。在研究乳清分離蛋白改性前后的微觀形態(tài)時，能夠直接觀察蛋白質顆粒的大小、形狀和聚集情況，從微觀層面揭示乙醇改性對蛋白質結構的影響。AFM具有高分辨率的特點，能夠分辨納米級別的結構細節(jié)，為蛋白質微觀結構研究提供直觀的圖像信息。掃描電子顯微鏡（SEM，型號：[具體型號]，品牌：[品牌名稱]），同樣用于觀察樣品的微觀形貌，但與AFM相比，SEM能夠提供更高分辨率的圖像，并且可以觀察樣品的表面和內部結構。在研究乳清分離蛋白和乳狀液的微觀結構時，通過對樣品進行處理和噴金等操作，能夠清晰地觀察到蛋白質分子的聚集狀態(tài)、乳狀液中油滴的大小和分布情況等，為深入研究乳清分離蛋白的改性效果和乳狀液的穩(wěn)定性提供重要的微觀信息。激光粒度儀（型號：[具體型號]，品牌：[品牌名稱]），用于測量乳狀液中油滴的粒徑分布。在研究乳狀液穩(wěn)定性時，通過測量不同時間點乳狀液油滴的粒徑大小和分布情況，計算粒徑變化率，評估乳狀液的穩(wěn)定性。該儀器采用激光散射原理，能夠快速、準確地測量粒徑范圍廣泛的顆粒，具有高精度和重復性好的特點，為乳狀液粒徑分析提供可靠的數(shù)據(jù)。Zeta電位分析儀（型號：[具體型號]，品牌：[品牌名稱]），用于測量乳狀液中油滴表面的Zeta電位。Zeta電位是衡量乳狀液穩(wěn)定性的重要指標之一，通過測量Zeta電位，可以了解油滴表面的電荷性質和電荷密度，判斷乳狀液的靜電穩(wěn)定性。該儀器能夠精確測量微小的電位變化，為研究乳狀液的穩(wěn)定性提供重要的電學參數(shù)。恒溫振蕩水浴鍋（型號：[具體型號]，品牌：[品牌名稱]），在實驗中用于提供恒定的溫度環(huán)境，并使樣品在振蕩條件下充分反應。在乙醇改性乳清分離蛋白的實驗中，用于控制反應溫度和時間，使乙醇與乳清分離蛋白充分反應；在乳狀液制備和穩(wěn)定性研究實驗中，用于模擬實際應用中的溫度條件，觀察乳狀液在不同溫度下的穩(wěn)定性變化。該水浴鍋具有溫度控制精度高、振蕩速度可調的特點，能夠滿足不同實驗對溫度和振蕩條件的要求。pH計（型號：[具體型號]，品牌：[品牌名稱]），用于測量溶液的pH值。在實驗過程中，準確控制溶液的pH值對于研究乳清分離蛋白的功能特性和乳狀液的穩(wěn)定性至關重要。pH計具有高精度、快速響應的特點，能夠準確測量溶液的pH值，并可通過校準確保測量的準確性。電子天平（型號：[具體型號]，品牌：[品牌名稱]），用于準確稱量實驗所需的各種試劑和樣品。其精度可達[具體精度]，能夠滿足實驗對稱量精度的嚴格要求。在實驗中，精確稱量試劑和樣品的質量是保證實驗結果準確性的基礎，電子天平的高精度稱量功能為實驗的順利進行提供了保障。以上儀器設備在實驗前均進行了嚴格的調試和校準，確保其性能穩(wěn)定、測量準確。在實驗過程中，嚴格按照儀器操作規(guī)程進行操作，定期對儀器進行維護和保養(yǎng)，以保證實驗數(shù)據(jù)的可靠性和實驗的順利進行。三、實驗材料與方法3.2乙醇改性乳清分離蛋白的制備3.2.1實驗步驟與參數(shù)設置乙醇改性乳清分離蛋白的制備過程如下：首先，準確稱取一定量的乳清分離蛋白（WPI）粉末，將其溶解于去離子水中，配制成質量濃度為[X]%的WPI溶液。在配制過程中，為了確保WPI充分溶解，使用磁力攪拌器進行攪拌，攪拌速度設置為[X]r/min，攪拌時間為[X]min，使溶液均勻分散，避免出現(xiàn)蛋白質團聚現(xiàn)象。隨后，向上述WPI溶液中加入無水乙醇，以制備不同乙醇濃度的反應體系。乙醇濃度分別設置為10%、30%、50%、70%（v/v），通過精確量取無水乙醇和WPI溶液的體積，確保乙醇濃度的準確性。在加入乙醇的過程中，采用緩慢滴加的方式，并持續(xù)攪拌，使乙醇能夠均勻地分散在WPI溶液中，避免局部濃度過高導致蛋白質變性不均勻。將含有不同乙醇濃度的WPI溶液轉移至具塞錐形瓶中，密封后放入恒溫振蕩水浴鍋中進行反應。反應溫度設置為[X]℃，振蕩速度為[X]r/min，反應時間分別設定為1h、2h、4h。在反應過程中，嚴格控制溫度和振蕩速度，確保反應條件的穩(wěn)定性。恒溫振蕩水浴鍋能夠精確控制溫度，波動范圍在±0.5℃以內，保證了反應體系在設定溫度下進行反應。振蕩速度的穩(wěn)定控制有助于乙醇與WPI分子充分接觸，促進反應的進行，使改性效果更加均勻。3.2.2改性產(chǎn)物的分離與純化反應結束后，將錐形瓶從恒溫振蕩水浴鍋中取出，立即放入冰浴中冷卻15min，以終止反應。冷卻過程能夠迅速降低反應體系的溫度，防止蛋白質在高溫下進一步發(fā)生變化，保證改性產(chǎn)物的穩(wěn)定性。將冷卻后的溶液轉移至離心管中，在高速冷凍離心機中進行離心分離。離心條件設置為轉速[X]r/min，離心時間為20min，溫度為4℃。高速離心能夠使改性后的蛋白質沉淀與上清液分離，較低的離心溫度可以減少蛋白質的變性，確保蛋白質的結構和功能不受影響。離心后，小心地將上清液倒掉，保留底部的蛋白質沉淀。為了去除沉淀中殘留的乙醇和其他雜質，向沉淀中加入適量的去離子水，用玻璃棒輕輕攪拌，使沉淀重新分散。再次將分散后的溶液轉移至離心管中，按照上述離心條件進行離心洗滌，重復此洗滌步驟3次。每次洗滌后，盡量將上清液去除干凈，以提高蛋白質沉淀的純度。將洗滌后的蛋白質沉淀轉移至培養(yǎng)皿中，在冷凍干燥機中進行干燥處理。冷凍干燥的條件為：預凍溫度-50℃，預凍時間2h；真空度10Pa，干燥時間24h。冷凍干燥能夠在低溫下將蛋白質中的水分升華去除，避免高溫對蛋白質結構和功能的破壞，得到干燥的乙醇改性乳清分離蛋白粉末。將干燥后的粉末密封保存于干燥器中，置于4℃冰箱中備用，以防止蛋白質受潮和氧化，保證其質量的穩(wěn)定性。3.3結構及功能特性測定3.3.1蛋白質結構分析方法為全面深入地探究乙醇改性對乳清分離蛋白（WPI）結構的影響，本研究綜合運用了多種先進的光譜技術和顯微鏡技術，從不同層面解析蛋白質的結構變化。聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是分析蛋白質分子質量分布和聚集狀態(tài)的重要手段。其原理基于蛋白質分子在電場作用下，根據(jù)自身電荷和分子質量的差異在聚丙烯酰胺凝膠的分子篩中進行遷移。在實驗操作時，首先需制備不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠，一般分離膠濃度為10%-15%，濃縮膠濃度為4%-5%。將未改性和乙醇改性后的WPI樣品與上樣緩沖液混合，經(jīng)加熱變性處理后，加入到凝膠的加樣孔中。接通電源，在恒定電壓下進行電泳，一般濃縮膠電壓為80V，分離膠電壓為120V-150V。電泳結束后，使用考馬斯亮藍染色液對凝膠進行染色，染色時間通常為1h-2h，再用脫色液進行脫色，直至背景清晰，蛋白質條帶顯現(xiàn)。通過觀察蛋白質條帶的位置和數(shù)量，可判斷WPI的分子質量分布情況，若出現(xiàn)多條條帶且位置發(fā)生變化，表明蛋白質發(fā)生了聚集或解聚，從而直觀地反映出乙醇改性對WPI分子質量分布和聚集狀態(tài)的影響。拉曼光譜可有效測定蛋白質二級結構中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲等結構的含量變化。其原理是利用光與分子振動和轉動的相互作用，當激光照射到蛋白質分子上時，分子中的化學鍵振動會引起散射光頻率的變化，產(chǎn)生拉曼散射。在操作過程中，將WPI樣品配制成一定濃度的溶液，置于特制的樣品池中，以避免溶液中雜質對光譜的干擾。選擇合適的激光波長，一般常用532nm或785nm的激光作為激發(fā)光源，以保證有足夠的能量激發(fā)分子振動，同時避免樣品的光損傷。調整激光功率和積分時間，使拉曼信號強度適中，一般激光功率在10mW-50mW之間，積分時間為10s-30s。采集拉曼光譜后，通過對光譜中特定峰位的分析，如α-螺旋對應1650cm?1-1660cm?1的峰，β-折疊對應1610cm?1-1640cm?1的峰，β-轉角對應1670cm?1-1690cm?1的峰，無規(guī)卷曲對應1640cm?1-1650cm?1的峰，利用曲線擬合等方法計算各二級結構的相對含量，從而了解乙醇改性對蛋白質二級結構的影響。內源性熒光光譜能夠監(jiān)測蛋白質三級結構中色氨酸等熒光基團微環(huán)境的改變。蛋白質中的色氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基具有內源性熒光，其熒光強度和發(fā)射波長會受到周圍微環(huán)境的影響。實驗時，將WPI樣品稀釋至適當濃度，一般為0.1mg/mL-1mg/mL，以減少熒光淬滅等現(xiàn)象的影響。在熒光分光光度計中，設置合適的激發(fā)波長和發(fā)射波長范圍，對于色氨酸，激發(fā)波長通常為280nm，發(fā)射波長范圍為300nm-400nm。掃描發(fā)射光譜，記錄熒光強度和發(fā)射波長的變化。若乙醇改性后熒光強度增強或發(fā)射波長發(fā)生藍移，說明色氨酸等熒光基團所處的微環(huán)境變得更加疏水，蛋白質的三級結構發(fā)生了變化，更多的疏水基團暴露出來；反之，若熒光強度減弱或發(fā)射波長發(fā)生紅移，則表明微環(huán)境變得更加親水，蛋白質結構可能發(fā)生了一定程度的展開或改變。紫外光譜可用于分析蛋白質特征吸收峰的變化，進而判斷蛋白質分子中化學鍵和基團的改變。蛋白質分子中的肽鍵、芳香族氨基酸等基團在紫外區(qū)有特定的吸收峰。將WPI樣品配制成一定濃度的溶液，在紫外可見分光光度計中，掃描波長范圍一般為200nm-300nm。在280nm處，主要是芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸等）的吸收峰，其強度變化可反映這些氨基酸暴露程度的改變；在200nm-220nm處，是肽鍵的吸收峰，其變化可反映蛋白質二級結構的改變。通過比較改性前后WPI在這些波長處的吸收峰強度和位置，可判斷乙醇改性是否導致蛋白質分子中化學鍵和基團的變化，如肽鍵的斷裂、氨基酸殘基的暴露或隱藏等。原子力顯微鏡（AFM）和掃描電鏡（SEM）則從微觀形態(tài)角度直觀地展示改性前后WPI的顆粒大小、形狀和聚集情況。AFM是利用微小探針與樣品表面的相互作用力來獲取樣品表面的形貌信息，能夠在接近生理條件下對蛋白質進行成像。在操作時，將WPI樣品稀釋后滴在云母片等平整的基底上，待其自然干燥或用氮氣吹干后，放入AFM中進行掃描。設置合適的掃描范圍和掃描速率，一般掃描范圍為1μm×1μm-10μm×10μm，掃描速率為0.5Hz-2Hz，以獲取清晰的圖像。通過AFM圖像，可以直接觀察到蛋白質顆粒的高度、直徑等信息，分析其大小和形狀的變化，以及是否存在聚集現(xiàn)象。SEM則是利用電子束掃描樣品表面，產(chǎn)生二次電子等信號來成像，能夠提供更高分辨率的圖像。在使用SEM時，需要先將WPI樣品進行固定、脫水、干燥等預處理，然后在樣品表面噴鍍一層金屬（如金、鉑等），以增加樣品的導電性。將處理后的樣品放入SEM中，設置合適的加速電壓和工作距離，一般加速電壓為5kV-15kV，工作距離為5mm-10mm，進行圖像采集。通過SEM圖像，可以清晰地觀察到蛋白質分子的聚集狀態(tài)、表面形貌等細節(jié)，從微觀層面深入了解乙醇改性對WPI結構的影響。3.3.2功能特性檢測指標與方法表面疏水性是影響蛋白質在油水界面吸附和乳化性能的重要因素，本研究采用探針法進行測定。將WPI樣品配制成不同濃度的溶液，一般濃度范圍為0.1mg/mL-1mg/mL。向每個濃度的樣品溶液中加入適量的8-苯胺基-1-萘磺酸銨鹽（ANS）探針溶液，使ANS的終濃度為10μmol/L-50μmol/L。充分混合后，在黑暗條件下孵育30min，以確保ANS與蛋白質充分結合。在熒光分光光度計中，設置激發(fā)波長為390nm，發(fā)射波長為470nm，測量熒光強度。以蛋白質濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標繪制曲線，曲線的斜率即為表面疏水性指數(shù)，該指數(shù)越大，表明蛋白質的表面疏水性越強。巰基含量的變化能反映乙醇改性對蛋白質分子中巰基的氧化或還原作用，以及對蛋白質結構穩(wěn)定性和功能的影響，采用Ellman試劑法進行測定。準確稱取一定量的WPI樣品，溶解于含有8mol/L尿素的Tris-HCl緩沖液（pH8.0）中，使蛋白質濃度為1mg/mL-5mg/mL，以破壞蛋白質的二硫鍵，使巰基充分暴露。取適量上述溶液，加入Ellman試劑（5,5-二硫代雙-2-硝基苯甲酸）溶液，Ellman試劑與巰基反應生成黃色的5-硫代-2-硝基苯甲酸。在412nm波長下，用紫外可見分光光度計測量吸光度。根據(jù)吸光度與巰基含量的標準曲線，計算樣品中的巰基含量。濁度可反映蛋白質的聚集程度和溶解性，通過分光光度計進行測定。將WPI樣品配制成一定濃度的溶液，一般濃度為1mg/mL-5mg/mL。在比色皿中加入適量樣品溶液，以相同的緩沖液作為空白對照，在600nm波長下，用紫外可見分光光度計測量吸光度。吸光度越大，表明蛋白質的濁度越高，聚集程度越大，溶解性可能越差。溶解度是衡量蛋白質在溶液中溶解能力的重要指標，通過離心法測定。將WPI樣品配制成不同pH值（如pH2、4、6、8、10）和不同離子強度（如0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L的NaCl溶液）的溶液，蛋白質濃度一般為1mg/mL-5mg/mL。將溶液在一定溫度下（如25℃）攪拌均勻后，以一定轉速（如10000r/min）離心20min-30min。取上清液，采用Lowry法或考馬斯亮藍法測定上清液中的蛋白質含量，與初始蛋白質含量相比，計算溶解度，溶解度越高，表明蛋白質在該條件下的溶解性能越好。乳化特性包括乳化活性指數(shù)（EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI），采用分光光度法進行評估。制備不同濃度的WPI溶液，一般為0.1%-1%（w/v）。將油相（如大豆油）與WPI溶液按一定比例（如1:1）混合，在高速均質機中以一定轉速（如10000r/min-15000r/min）均質2min-5min，形成乳狀液。立即取適量乳狀液，稀釋一定倍數(shù)（如100倍）后，在500nm波長下，用紫外可見分光光度計測量吸光度，記為A?。將乳狀液在一定溫度下（如25℃）放置一定時間（如30min）后，再次取適量乳狀液，稀釋相同倍數(shù)后測量吸光度，記為A?。根據(jù)公式EAI=2×2.303×A?/（C×φ×1000）計算乳化活性指數(shù)，其中C為蛋白質濃度（g/mL），φ為油相體積分數(shù)；根據(jù)公式ESI=A?/（A?-A?）×t計算乳化穩(wěn)定性指數(shù)，其中t為放置時間（min）。EAI越大，表明乳化活性越高；ESI越大，表明乳化穩(wěn)定性越好。起泡能力通過攪拌或振蕩法測定泡沫體積和泡沫穩(wěn)定性來探究。將WPI樣品配制成一定濃度的溶液，一般為1%-5%（w/v）。取適量溶液于具塞量筒中，用攪拌器以一定轉速（如1000r/min-2000r/min）攪拌一定時間（如5min）或振蕩一定次數(shù)（如上下振蕩50次），使溶液產(chǎn)生泡沫。迅速記錄泡沫的初始體積V?。將量筒靜置，每隔一定時間（如10min）記錄泡沫體積V?。根據(jù)公式起泡能力=V?/V（V為初始溶液體積）計算起泡能力，根據(jù)公式泡沫穩(wěn)定性=V?/V?×100%計算泡沫穩(wěn)定性。起泡能力越大，表明蛋白質產(chǎn)生泡沫的能力越強；泡沫穩(wěn)定性越高，表明泡沫在放置過程中越不易破裂。3.4抗氧化特性測定3.4.1多種抗氧化能力評價指標鐵還原能力（FRAP）是評估樣品抗氧化活性的重要指標之一，其測定原理基于抗氧化劑能夠將Fe3?還原為Fe2?。在酸性條件下，三吡啶三吖嗪（TPTZ）與Fe3?形成穩(wěn)定的絡合物，當樣品中的抗氧化劑存在時，會將Fe3?-TPTZ絡合物中的Fe3?還原為Fe2?，形成Fe2?-TPTZ絡合物，該絡合物在593nm處有強烈的吸收峰。通過測量樣品在593nm處吸光度的變化，與標準鐵溶液的吸光度進行比較，即可計算出樣品的鐵還原能力，吸光度越大，表明樣品的鐵還原能力越強，抗氧化活性越高。ABTS自由基清除能力的測定原理是基于ABTS在過硫酸鉀的作用下被氧化生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基ABTS??。當樣品中的抗氧化劑與ABTS??接觸時，抗氧化劑能夠提供電子與ABTS??發(fā)生反應，使ABTS??的濃度降低，溶液的顏色變淺，在734nm處的吸光度下降。通過測量樣品加入前后ABTS??溶液在734nm處吸光度的變化，計算出樣品對ABTS自由基的清除率，清除率越高，說明樣品的ABTS自由基清除能力越強，抗氧化活性越高。DPPH自由基清除能力的測定基于DPPH自由基具有穩(wěn)定的單電子，在517nm處有強烈的吸收，使溶液呈現(xiàn)深紫色。當樣品中的抗氧化劑與DPPH自由基接觸時，抗氧化劑能夠提供氫原子或電子與DPPH自由基結合，使其失去單電子而變成穩(wěn)定的DPPH-H，溶液的顏色變淺，在517nm處的吸光度降低。通過測量樣品加入前后DPPH溶液在517nm處吸光度的變化，計算出樣品對DPPH自由基的清除率，清除率越高，表明樣品的DPPH自由基清除能力越強，抗氧化活性越高。金屬離子螯合能力主要用于評估樣品對金屬離子的螯合能力，以抑制金屬離子催化的氧化反應。在測定過程中，常用的金屬離子為Fe2?。樣品中的抗氧化劑能夠與Fe2?形成穩(wěn)定的絡合物，從而減少Fe2?參與氧化反應的機會。當樣品與Fe2?溶液混合后，加入亞鐵嗪試劑，亞鐵嗪與未被螯合的Fe2?反應形成紫紅色絡合物，在562nm處有吸收峰。通過測量樣品加入前后溶液在562nm處吸光度的變化，計算出樣品對Fe2?的螯合率，螯合率越高，說明樣品的金屬離子螯合能力越強，能夠更有效地抑制金屬離子催化的氧化反應，抗氧化活性越高。氧自由基吸收能力（ORAC）是一種綜合評估樣品抗氧化能力的指標，其測定原理基于熒光素在氧自由基的作用下會發(fā)生熒光淬滅。在實驗中，首先將熒光素與樣品混合，然后加入過氧化物自由基源（如AAPH），啟動氧化反應。隨著氧化反應的進行，熒光素逐漸被氧化，熒光強度逐漸降低。而樣品中的抗氧化劑能夠捕獲氧自由基，延緩熒光素的氧化，使熒光強度下降的速度減緩。通過測量熒光強度隨時間的變化，計算出樣品的氧自由基吸收能力，ORAC值越大，表明樣品對氧自由基的吸收能力越強，抗氧化活性越高。3.4.2實驗操作與數(shù)據(jù)分析鐵還原能力（FRAP）的實驗操作如下：首先，配制含有TPTZ、FeCl?和醋酸緩沖液（pH3.6）的FRAP工作液。將不同濃度的乙醇改性乳清分離蛋白（WPI）樣品與FRAP工作液混合，在37℃下孵育10min。然后，在593nm波長下，用紫外可見分光光度計測量混合液的吸光度。以不同濃度的FeSO?溶液作為標準品，繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣品的鐵還原能力，結果以μmolFe2?/g表示。ABTS自由基清除能力的實驗步驟為：將ABTS溶解于水中，配制成一定濃度的ABTS溶液，加入過硫酸鉀溶液，在室溫下避光反應12-16h，生成ABTS??溶液。將ABTS??溶液用無水乙醇稀釋至在734nm波長處吸光度為0.700±0.020。取適量不同濃度的乙醇改性WPI樣品溶液與稀釋后的ABTS??溶液混合，在室溫下避光反應6min。之后，在734nm波長下測量混合液的吸光度。根據(jù)公式計算ABTS自由基清除率：ABTS自由基清除率（%）=[1-（A樣品-A空白）/A對照]×100%，其中A樣品為樣品與ABTS??溶液混合后的吸光度，A空白為只含有ABTS??溶液和溶劑的吸光度，A對照為只含有樣品溶劑和ABTS??溶液的吸光度。DPPH自由基清除能力的實驗操作：將DPPH溶解于無水乙醇中，配制成一定濃度的DPPH溶液。取適量不同濃度的乙醇改性WPI樣品溶液與DPPH溶液混合，在室溫下避光反應30min。在517nm波長下測量混合液的吸光度。按照公式計算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率（%）=[1-（A樣品-A空白）/A對照]×100%，其中A樣品為樣品與DPPH溶液混合后的吸光度，A空白為只含有DPPH溶液和溶劑的吸光度，A對照為只含有樣品溶劑和DPPH溶液的吸光度。金屬離