乳脂肪降解乳酸菌的篩選鑒定及其在酸奶油中的創(chuàng)新應(yīng)用研究一、引言1.1研究背景與意義乳酸菌作為一類在食品工業(yè)中占據(jù)關(guān)鍵地位的微生物，因其獨特的發(fā)酵特性和對人體健康的積極影響，一直是研究的焦點。乳酸菌能夠發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸，這不僅賦予食品獨特的風(fēng)味和質(zhì)地，還能有效抑制有害微生物的生長，延長食品的保質(zhì)期。在酸奶、泡菜、發(fā)酵肉制品等眾多發(fā)酵食品中，乳酸菌都發(fā)揮著不可或缺的作用，是提升食品品質(zhì)和安全性的重要因素。酸奶油作為一種備受歡迎的發(fā)酵乳制品，以其濃郁的風(fēng)味和細膩的質(zhì)地深受消費者喜愛。其制作過程依賴于乳酸菌的發(fā)酵作用，然而，傳統(tǒng)酸奶油生產(chǎn)中，乳酸菌對乳脂肪的分解能力有限，導(dǎo)致酸奶油的風(fēng)味和營養(yǎng)品質(zhì)存在一定的提升空間。篩選具有高效降解乳脂肪能力的乳酸菌，能夠促進乳脂肪的分解和轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生更多的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，如脂肪酸、醛類、酮類等，這些物質(zhì)能夠賦予酸奶油更加濃郁、復(fù)雜的風(fēng)味，提升產(chǎn)品的感官品質(zhì)，滿足消費者對高品質(zhì)酸奶油的需求。同時，乳脂肪的降解還可能改變酸奶油的質(zhì)地和穩(wěn)定性，使其更加細膩、均勻，延長產(chǎn)品的貨架期。從行業(yè)發(fā)展的角度來看，篩選降解乳脂肪乳酸菌有助于推動酸奶油產(chǎn)業(yè)的創(chuàng)新和升級，開發(fā)出具有獨特風(fēng)味和高品質(zhì)的新產(chǎn)品，增強市場競爭力。在理論研究方面，深入探究乳酸菌降解乳脂肪的機制，能夠豐富微生物代謝和發(fā)酵理論，為進一步優(yōu)化酸奶油生產(chǎn)工藝和菌種選育提供科學(xué)依據(jù)。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在乳酸菌篩選方面，國內(nèi)外學(xué)者已開展了大量研究，采用多種篩選方法從不同來源的樣品中分離和篩選乳酸菌。傳統(tǒng)的篩選方法如溶鈣圈法、溴甲酚綠指示劑法等，利用乳酸菌產(chǎn)酸的特性，通過觀察菌落周圍的溶鈣圈或指示劑顏色變化來篩選乳酸菌。在溶鈣圈法中，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸能夠溶解培養(yǎng)基中的碳酸鈣，形成透明的溶鈣圈，從而方便篩選出具有產(chǎn)酸能力的乳酸菌。學(xué)者鄒遠強在《乳酸菌的篩選及應(yīng)用課件》中介紹了乳酸菌的篩選方法，包括溶鈣圈法和溴甲酚綠指示劑法等，詳細闡述了這些方法的原理和操作步驟。隨著科技的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)逐漸應(yīng)用于乳酸菌的篩選和鑒定，如16SrRNA基因序列分析、PCR技術(shù)等，這些技術(shù)能夠更加準(zhǔn)確地鑒定乳酸菌的種類和特性。通過16SrRNA基因序列分析，可以確定乳酸菌的分類地位，了解其親緣關(guān)系，為乳酸菌的篩選和應(yīng)用提供更科學(xué)的依據(jù)。學(xué)者孫媛媛在《游離棉酚降解乳酸菌的篩選及降解特性研究》中利用16SrRNA基因序列分析對篩選得到的乳酸菌進行鑒定，明確了其種屬關(guān)系，為后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)。在酸奶油生產(chǎn)中，乳酸菌的應(yīng)用研究也取得了一定進展。目前，常用的乳酸菌發(fā)酵劑包括乳酸乳球菌屬、乳桿菌屬等，不同的乳酸菌發(fā)酵劑對酸奶油的風(fēng)味、質(zhì)地和品質(zhì)有不同的影響。乳酸乳球菌屬中的乳酸乳球菌乳酸亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種混合發(fā)酵后的酸奶油具有更豐富的風(fēng)味成分。寧夏大學(xué)魏超昆副教授團隊和北方民族大學(xué)魏兆軍教授團隊在《Characterizationofafermenteddairy,sourcream:Lipolysisandthereleaseprofileofflavorcompounds》中研究了發(fā)酵時間對酸奶油理化性質(zhì)、感官特性和脂質(zhì)降解的影響，發(fā)現(xiàn)乳酸菌的脂解能力會導(dǎo)致酸奶油中脂質(zhì)的分解和氧化，從而影響其風(fēng)味和品質(zhì)。然而，現(xiàn)有研究仍存在一些不足與空白。在乳酸菌篩選方面，雖然已篩選出多種乳酸菌，但具有高效降解乳脂肪能力的乳酸菌報道相對較少，對乳酸菌降解乳脂肪的機制研究還不夠深入。在酸奶油生產(chǎn)中，如何通過優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵條件和菌種組合，進一步提升酸奶油的風(fēng)味和品質(zhì)，以及延長其貨架期，仍是需要解決的問題。同時，對于新型乳酸菌發(fā)酵劑的開發(fā)和應(yīng)用研究也有待加強，以滿足消費者對高品質(zhì)酸奶油的需求。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在篩選出具有高效降解乳脂肪能力的乳酸菌菌株，并將其應(yīng)用于酸奶油的生產(chǎn)中，以提升酸奶油的風(fēng)味和品質(zhì)。通過對篩選得到的乳酸菌進行鑒定和特性研究，深入探究其降解乳脂肪的機制，為酸奶油產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論支持和技術(shù)創(chuàng)新。本研究將從不同來源的樣品中，如乳制品、發(fā)酵食品、自然環(huán)境等，采集樣本并進行乳酸菌的分離。采用傳統(tǒng)的篩選方法，如溶鈣圈法、溴甲酚綠指示劑法等，結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，如16SrRNA基因序列分析、PCR技術(shù)等，篩選出具有降解乳脂肪能力的乳酸菌菌株。對篩選得到的乳酸菌進行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性分析以及16SrRNA基因序列測定，確定其種屬分類地位。研究乳酸菌在不同環(huán)境條件下，如溫度、pH值、接種量等，對乳脂肪降解能力的影響，優(yōu)化其生長和降解條件。利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）、高效液相色譜儀（HPLC）等分析手段，檢測乳酸菌降解乳脂肪過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和脂肪酸組成的變化，探討其降解乳脂肪的機制。將篩選得到的具有高效降解乳脂肪能力的乳酸菌應(yīng)用于酸奶油的生產(chǎn)中，研究其對酸奶油風(fēng)味、質(zhì)地、穩(wěn)定性和貨架期的影響。通過感官評價、理化指標(biāo)檢測等方法，評估酸奶油的品質(zhì)，確定最佳的乳酸菌發(fā)酵劑和發(fā)酵條件。對比添加篩選乳酸菌發(fā)酵劑和傳統(tǒng)發(fā)酵劑制作的酸奶油在風(fēng)味、質(zhì)地、營養(yǎng)成分等方面的差異，明確篩選乳酸菌對酸奶油品質(zhì)提升的效果。通過加速貨架期實驗和實際貨架期監(jiān)測，研究篩選乳酸菌對酸奶油貨架期的影響，分析其作用機制。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究將綜合運用多種研究方法，從樣品采集與乳酸菌分離、乳酸菌篩選與鑒定、降解乳脂肪特性研究、酸奶油制作與品質(zhì)分析等方面展開，以實現(xiàn)篩選高效降解乳脂肪乳酸菌并應(yīng)用于酸奶油生產(chǎn)的目標(biāo)。具體研究方法如下：樣品采集與乳酸菌分離：從乳制品、發(fā)酵食品、自然環(huán)境等不同來源采集樣品，如市售酸奶、泡菜、土壤等。將采集的樣品用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，取合適稀釋度的樣品涂布于MRS培養(yǎng)基平板上，37℃厭氧培養(yǎng)48h，挑取具有乳酸菌典型特征的菌落，如圓形、邊緣整齊、表面光滑、乳白色的菌落，進行革蘭氏染色和鏡檢，確認革蘭氏陽性且無芽孢的菌落為乳酸菌候選菌株。通過多次劃線分離，獲得純化的乳酸菌菌株。乳酸菌篩選：采用溶鈣圈法，在MRS培養(yǎng)基中添加碳酸鈣，將分離得到的乳酸菌菌株接種于該培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)48h。挑選菌落周圍產(chǎn)生溶鈣圈的菌株，溶鈣圈越大，表明菌株產(chǎn)酸能力越強，初步篩選出具有潛在降解乳脂肪能力的乳酸菌。利用溴甲酚綠指示劑法進行復(fù)篩，在MRS培養(yǎng)基中加入溴甲酚綠酒精溶液，將初篩得到的乳酸菌接種于該培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)24h。挑取使溴甲酚綠變色的菌落，變色明顯的菌株產(chǎn)酸能力較強，進一步篩選出降解乳脂肪能力可能較強的乳酸菌。乳酸菌鑒定：對篩選得到的乳酸菌進行形態(tài)學(xué)觀察，包括菌落形態(tài)和菌體形態(tài)。在MRS固體平板上培養(yǎng)乳酸菌，觀察菌落的大小、形狀、顏色、邊緣、表面質(zhì)地等特征；通過革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體的形狀、排列方式等。進行生理生化特性分析，包括過氧化氫酶反應(yīng)、硫化氫產(chǎn)生、明膠液化、吲哚產(chǎn)生、石蕊牛乳反應(yīng)以及碳水化合物利用等實驗。將乳酸菌接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基中，按照標(biāo)準(zhǔn)方法進行培養(yǎng)和檢測，根據(jù)實驗結(jié)果對照伯杰細菌鑒定手冊進行綜合評定，確定乳酸菌的屬和種。利用16SrRNA基因序列測定進行分子鑒定，提取乳酸菌的基因組DNA，以其為模板，采用通用引物擴增16SrRNA基因片段。將擴增產(chǎn)物進行測序，將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，與已知序列進行同源性分析，確定乳酸菌的種屬分類地位。降解乳脂肪特性研究：研究乳酸菌在不同溫度（25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）、pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）條件下對乳脂肪降解能力的影響。將乳酸菌接種于含有乳脂肪的培養(yǎng)基中，在不同條件下培養(yǎng)一定時間后，采用索氏抽提法或其他合適的方法測定乳脂肪含量，計算乳脂肪降解率，確定最佳的生長和降解條件。利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析乳酸菌降解乳脂肪過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，采用固相微萃取等方法提取揮發(fā)性成分，進行GC-MS分析，鑒定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量變化。通過高效液相色譜儀（HPLC）檢測乳酸菌降解乳脂肪過程中脂肪酸組成的變化，采用合適的方法提取脂肪酸，進行HPLC分析，確定脂肪酸的種類和含量變化，探討乳酸菌降解乳脂肪的機制。酸奶油制作與品質(zhì)分析：以稀奶油為原料，添加篩選得到的乳酸菌發(fā)酵劑，接種量為2%-5%，在25-45℃下發(fā)酵8-36h，制作酸奶油。同時，以傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵劑制作的酸奶油作為對照。對制作的酸奶油進行感官評價，組織專業(yè)評審人員，按照一定的評價標(biāo)準(zhǔn)，對酸奶油的色澤、香氣、滋味、質(zhì)地等方面進行評價，采用評分法或描述性分析法進行評價。測定酸奶油的理化指標(biāo)，包括pH值、酸度、脂肪含量、蛋白質(zhì)含量、水分含量等，采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法或行業(yè)常用方法進行測定。通過加速貨架期實驗和實際貨架期監(jiān)測，研究篩選乳酸菌對酸奶油貨架期的影響。在加速貨架期實驗中，將酸奶油置于較高溫度（如37℃）下貯藏，定期測定其理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)，觀察酸奶油的品質(zhì)變化；在實際貨架期監(jiān)測中，將酸奶油置于正常貯藏條件下，定期進行感官評價和理化指標(biāo)檢測，分析篩選乳酸菌對酸奶油貨架期的作用機制?；谝陨涎芯糠椒ǎ狙芯康募夹g(shù)路線如圖1-1所示：[此處插入技術(shù)路線圖，圖中應(yīng)清晰展示從樣品采集到酸奶油品質(zhì)分析的整個流程，包括各個步驟的具體操作和方法，以及不同步驟之間的邏輯關(guān)系]通過以上研究方法和技術(shù)路線，本研究有望篩選出具有高效降解乳脂肪能力的乳酸菌，并明確其在酸奶油生產(chǎn)中的應(yīng)用效果，為酸奶油產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。二、具有降解乳脂肪能力乳酸菌的篩選2.1材料與儀器乳源樣品選取市售新鮮牛奶、酸奶、奶酪等乳制品，以及從自然環(huán)境采集的土壤、植物表面附著的微生物樣本，這些樣本來源廣泛，有助于獲取不同特性的乳酸菌。土壤樣本采集自有機農(nóng)場的肥沃土壤，植物樣本則選取了表面帶有自然發(fā)酵跡象的水果和蔬菜，如蘋果、葡萄、白菜等。培養(yǎng)基原料包括蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、葡萄糖、檸檬酸三銨、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、碳酸鈣、溴甲酚綠、吐溫-80等，均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。這些原料為乳酸菌的生長提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，滿足其生長和代謝需求。蛋白胨提供氮源，牛肉膏和酵母提取物提供多種維生素、氨基酸和生長因子，葡萄糖作為碳源，其他成分則參與維持培養(yǎng)基的滲透壓、酸堿度以及提供微量元素等。MRS培養(yǎng)基用于乳酸菌的分離和培養(yǎng)，其配方為：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母提取物5.0g、葡萄糖20.0g、檸檬酸三銨2.0g、乙酸鈉5.0g、磷酸氫二鉀2.0g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g、吐溫-801.0mL、瓊脂18.0g、蒸餾水1L，pH6.5。在制備用于篩選具有降解乳脂肪能力乳酸菌的培養(yǎng)基時，會在MRS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加適量的乳脂肪，以模擬酸奶油生產(chǎn)中的實際環(huán)境。儀器設(shè)備涵蓋了高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，YXQ-LS-50SII型），用于培養(yǎng)基和實驗器具的滅菌處理，確保實驗環(huán)境的無菌狀態(tài)，防止雜菌污染對實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾。恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，BPH-9272型），為乳酸菌的生長提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境，可精確控制溫度，滿足乳酸菌在不同培養(yǎng)階段的溫度需求。厭氧培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司，YQX-II型），用于創(chuàng)造厭氧環(huán)境，因為乳酸菌大多為厭氧菌或兼性厭氧菌，厭氧環(huán)境有利于其生長和代謝。離心機（德國Eppendorf公司，5424R型），用于分離和收集菌體，通過離心作用使菌體與培養(yǎng)液分離，便于后續(xù)的實驗操作?？梢姺止夤舛扔嫞ㄉ虾＠夤饧夹g(shù)有限公司，722型），用于測定菌液的濃度和代謝產(chǎn)物的含量，通過檢測光吸收值來間接反映物質(zhì)的濃度變化，為實驗數(shù)據(jù)的獲取提供了重要手段。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司，7890B-5977B型），用于分析乳酸菌降解乳脂肪過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，能夠準(zhǔn)確鑒定揮發(fā)性成分的種類和含量，為研究乳酸菌的代謝機制和酸奶油風(fēng)味形成提供關(guān)鍵信息。高效液相色譜儀（日本島津公司，LC-20AT型），用于檢測脂肪酸組成的變化，通過對脂肪酸的分離和檢測，深入了解乳酸菌對乳脂肪的降解作用和代謝途徑。2.2篩選方法2.2.1溶鈣圈法原理與操作溶鈣圈法是一種基于乳酸菌產(chǎn)酸特性的篩選方法。其原理在于乳酸菌在生長代謝過程中會產(chǎn)生乳酸，當(dāng)培養(yǎng)基中含有碳酸鈣（CaCO?）時，乳酸能夠與碳酸鈣發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成可溶性的乳酸鈣、二氧化碳和水，從而在菌落周圍形成透明的溶鈣圈。通過觀察溶鈣圈的有無及大小，可初步判斷乳酸菌的產(chǎn)酸能力，溶鈣圈越大，通常表明乳酸菌的產(chǎn)酸能力越強，進而篩選出具有潛在降解乳脂肪能力的乳酸菌，因為較強的產(chǎn)酸能力可能與降解乳脂肪的能力相關(guān)。在操作過程中，首先進行培養(yǎng)基制備。準(zhǔn)確稱取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母提取物5.0g、葡萄糖20.0g、檸檬酸三銨2.0g、乙酸鈉5.0g、磷酸氫二鉀2.0g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g、吐溫-801.0mL、瓊脂18.0g，加入1L蒸餾水，攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH至6.5，得到MRS培養(yǎng)基。將配制好的MRS培養(yǎng)基和碳酸鈣分別進行高壓蒸汽滅菌，滅菌條件為121℃，20min。待MRS培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時，加入已滅菌的碳酸鈣，使其終濃度為1%-2%，充分混勻后，倒平板，每皿約15-20mL，待平板凝固后備用。對于樣品處理，若樣品為乳制品，如牛奶、酸奶等，可稱取10g樣品，加入90mL無菌生理鹽水，置于無菌均質(zhì)器中，以10000-15000r/min的速度均質(zhì)1-2min，使樣品充分分散，制成10?1的樣品稀釋液。若樣品為土壤、植物表面等環(huán)境樣本，可稱取5-10g樣品，加入裝有90-100mL無菌生理鹽水并帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩20-30min，使微生物充分分散，靜置5-10min，取上清液作為10?1的樣品稀釋液。然后，將10?1的樣品稀釋液進行10倍梯度稀釋，分別制成10?2、10?3、10??、10??、10??的系列稀釋液。接種培養(yǎng)時，選取10??、10??、10??三個稀釋度的樣品稀釋液，分別吸取0.1mL涂布于含有碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基平板上，用無菌涂布棒將菌液均勻涂布。將涂布好的平板置于厭氧培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)48h。培養(yǎng)過程中，乳酸菌生長代謝產(chǎn)生乳酸，與培養(yǎng)基中的碳酸鈣反應(yīng)，逐漸形成溶鈣圈。最后進行溶鈣圈觀察。培養(yǎng)結(jié)束后，取出平板，觀察菌落周圍溶鈣圈的形成情況。用游標(biāo)卡尺測量溶鈣圈直徑（D）和菌落直徑（d），計算溶鈣圈直徑與菌落直徑的比值（D/d），比值越大，表明乳酸菌的產(chǎn)酸能力越強。挑選D/d值較大的菌落，用接種環(huán)挑取，在MRS培養(yǎng)基平板上進行劃線分離，重復(fù)劃線3-4次，直至獲得單菌落。將單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24h，制成菌懸液，用于后續(xù)的鑒定和復(fù)篩。2.2.2溴甲酚綠指示劑法原理與操作溴甲酚綠指示劑法是利用溴甲酚綠在不同pH環(huán)境下顏色變化的特性來篩選乳酸菌。溴甲酚綠是一種酸堿指示劑，在酸性環(huán)境下呈黃色，在堿性環(huán)境下呈藍色。乳酸菌在生長過程中產(chǎn)生乳酸，使培養(yǎng)基的pH值降低，當(dāng)pH值低于溴甲酚綠的變色范圍（pH3.8-5.4）時，溴甲酚綠由藍色變?yōu)辄S色，從而通過觀察菌落周圍培養(yǎng)基顏色的變化來篩選出能夠產(chǎn)酸的乳酸菌。在操作前，先配制含溴甲酚綠的培養(yǎng)基。在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加0.04%-0.06%的溴甲酚綠酒精溶液（將0.4-0.6g溴甲酚綠溶解于100mL95%乙醇中，充分溶解后備用）。具體配制時，稱取MRS培養(yǎng)基各成分，加入適量蒸餾水，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至6.5，然后加入溴甲酚綠酒精溶液，混勻后，高壓蒸汽滅菌，121℃，20min，待冷卻至50℃左右，倒平板，每皿約15-20mL，備用。樣品處理步驟與溶鈣圈法類似，將采集的樣品制成10?1的樣品稀釋液，再進行10倍梯度稀釋，得到10?2、10?3、10??、10??、10??的系列稀釋液。接種培養(yǎng)時，取10??、10??、10??三個稀釋度的樣品稀釋液各0.1mL，分別涂布于含溴甲酚綠的MRS培養(yǎng)基平板上，用無菌涂布棒均勻涂布。將平板置于厭氧培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24h。在培養(yǎng)過程中，乳酸菌產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH降低，當(dāng)pH值低于溴甲酚綠的變色范圍時，菌落周圍的培養(yǎng)基由藍色變?yōu)辄S色。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察平板上菌落周圍培養(yǎng)基顏色的變化。挑選使溴甲酚綠變色明顯，即黃色圈較大且清晰的菌落，用接種環(huán)挑取，在MRS培養(yǎng)基平板上進行劃線分離，重復(fù)劃線3-4次，獲得單菌落。將單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24h，制成菌懸液，用于后續(xù)的鑒定和進一步篩選。通過溴甲酚綠指示劑法篩選出的乳酸菌，可作為具有潛在降解乳脂肪能力的菌株，進行下一步的研究和驗證。2.3篩選過程2.3.1樣品預(yù)處理與梯度稀釋對于乳源樣品，若為液態(tài)的牛奶或酸奶，準(zhǔn)確稱取10g樣品置于無菌的250mL三角瓶中，加入90mL無菌生理鹽水，使用無菌均質(zhì)器以12000r/min的速度均質(zhì)1.5min，使樣品中的微生物充分分散，得到10?1的樣品稀釋液。若樣品為固態(tài)的奶酪，先用無菌刀將奶酪切成小塊，稱取10g放入無菌研缽中，加入少量無菌生理鹽水研磨成糊狀，再轉(zhuǎn)移至裝有90mL無菌生理鹽水的250mL三角瓶中，振蕩25min，使微生物分散均勻，制成10?1的樣品稀釋液。將10?1的樣品稀釋液進行10倍梯度稀釋。準(zhǔn)備6支裝有9mL無菌生理鹽水的試管，分別標(biāo)記為10?2、10?3、10??、10??、10??、10??。用1mL無菌移液管吸取1mL10?1的樣品稀釋液，加入到標(biāo)記為10?2的試管中，吹吸3-5次，使菌液與生理鹽水充分混勻，得到10?2的樣品稀釋液。按照同樣的方法，依次從10?2的樣品稀釋液中吸取1mL，加入到10?3的試管中，以此類推，完成10?2至10??系列稀釋液的制備。在稀釋過程中，每吸取一次菌液，都要更換無菌移液管，以避免交叉污染，確保稀釋液的準(zhǔn)確性和可靠性。2.3.2涂布培養(yǎng)與菌落挑選取制備好的10??、10??、10??三個稀釋度的樣品稀釋液各0.1mL，分別滴加到含有碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基平板上，每個稀釋度設(shè)置3個重復(fù)平板。用無菌涂布棒將樣品稀釋液均勻涂布在平板表面，涂布時從低濃度到高濃度依次進行，每涂布完一個平板，將涂布棒在酒精燈火焰上灼燒滅菌，冷卻后再進行下一個平板的涂布，以防止不同稀釋度之間的交叉污染。將涂布好的平板倒置放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)48h。在培養(yǎng)過程中，乳酸菌生長代謝產(chǎn)生乳酸，與培養(yǎng)基中的碳酸鈣反應(yīng)，逐漸形成溶鈣圈。培養(yǎng)結(jié)束后，取出平板，觀察菌落周圍溶鈣圈的形成情況。用游標(biāo)卡尺測量溶鈣圈直徑（D）和菌落直徑（d），計算溶鈣圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）。挑選D/d值大于3.0的菌落，這些菌落通常具有較強的產(chǎn)酸能力，可能具有較好的降解乳脂肪能力。用接種環(huán)挑取符合標(biāo)準(zhǔn)的菌落，在MRS培養(yǎng)基平板上進行劃線分離，重復(fù)劃線3-4次，以獲得單菌落。對于溴甲酚綠指示劑法篩選，取10??、10??、10??三個稀釋度的樣品稀釋液各0.1mL，涂布于含溴甲酚綠的MRS培養(yǎng)基平板上，每個稀釋度同樣設(shè)置3個重復(fù)平板，涂布操作與上述一致。將平板置于厭氧培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察平板上菌落周圍培養(yǎng)基顏色的變化，挑選使溴甲酚綠變色明顯，即黃色圈直徑大于菌落直徑2倍的菌落，用接種環(huán)挑取進行劃線分離，獲得單菌落。2.3.3純化與保藏將挑取的單菌落接種于MRS培養(yǎng)基平板上，采用四區(qū)劃線法進行劃線。將接種環(huán)在酒精燈火焰上灼燒至通紅，冷卻后，挑取單菌落，在平板的A區(qū)進行密集劃線，劃完A區(qū)后，將接種環(huán)再次灼燒滅菌，冷卻后，從A區(qū)劃線的末端開始，在B區(qū)進行劃線，重復(fù)灼燒接種環(huán)和劃線操作，依次完成C區(qū)和D區(qū)的劃線。將劃線后的平板倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24h，使菌落充分生長。經(jīng)過一次劃線分離后，若平板上的菌落生長良好且單一性較好，再進行一次劃線分離，以確保得到的菌落為純種。將再次劃線分離得到的單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24h，使菌體大量繁殖。然后，采用試管穿刺法進行保藏。將培養(yǎng)好的菌液用無菌接種針蘸取，垂直穿刺接種到裝有MRS半固體培養(yǎng)基的試管中，穿刺深度約為試管高度的2/3。將接種后的試管放入4℃冰箱中保藏，定期觀察菌種的生長情況，若發(fā)現(xiàn)菌種有污染或活力下降的情況，及時進行轉(zhuǎn)接和復(fù)壯。三、乳酸菌的鑒定3.1形態(tài)學(xué)鑒定3.1.1菌落形態(tài)觀察將篩選得到的乳酸菌菌株接種于MRS固體平板上，置于37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出平板，在無菌條件下，利用體視顯微鏡對菌落形態(tài)進行仔細觀察。在MRS固體平板上，乳酸菌菌落呈現(xiàn)出較為典型的特征。菌落大小不一，直徑范圍在1-3mm之間，部分生長旺盛的菌株菌落直徑可達3mm左右，而一些生長相對緩慢或活性較弱的菌株菌落直徑約為1mm。菌落形狀多為圓形，邊緣整齊，如同用圓規(guī)繪制一般，沒有明顯的鋸齒狀或不規(guī)則邊緣，表明乳酸菌在生長過程中具有較為均勻的擴展模式。菌落顏色通常為白色或乳白色，色澤均勻，無雜色斑點，呈現(xiàn)出純凈的外觀，這與乳酸菌的代謝產(chǎn)物和細胞結(jié)構(gòu)特征相關(guān)。菌落表面光滑濕潤，具有一定的光澤，用接種環(huán)輕輕觸碰，可感受到其表面的濕潤質(zhì)地，這是由于乳酸菌在生長過程中分泌的胞外多糖等物質(zhì)導(dǎo)致的，這些物質(zhì)不僅有助于乳酸菌在環(huán)境中的附著和生存，還影響了菌落的外觀特性。菌落質(zhì)地較為柔軟，易于挑起，表明其細胞結(jié)構(gòu)相對疏松，沒有形成堅硬的細胞壁或其他結(jié)構(gòu)來增強其機械強度。通過對菌落形態(tài)的觀察，初步判斷這些菌株具有乳酸菌的典型特征，但為了進一步準(zhǔn)確鑒定，還需結(jié)合菌體形態(tài)觀察以及其他鑒定方法進行綜合分析。不同種屬的乳酸菌在菌落形態(tài)上可能存在細微差異，這些差異可以作為初步分類和篩選的依據(jù)，為后續(xù)的深入研究提供基礎(chǔ)。3.1.2革蘭氏染色與菌體形態(tài)觀察革蘭氏染色是一種重要的細菌鑒別染色方法，通過該方法可以將細菌分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，對于乳酸菌的鑒定具有重要意義。在進行革蘭氏染色時，首先進行涂片操作。用無菌接種環(huán)從MRS固體平板上挑取少量乳酸菌菌落，在潔凈的載玻片中央滴加的一滴生理鹽水中，輕輕攪拌，使菌體均勻分散，形成一層薄薄的菌膜，注意菌膜不宜過厚，以免影響染色效果和觀察。將涂片在空氣中自然干燥，或者在酒精燈火焰上方微微加熱，加速干燥過程，但要注意溫度不宜過高，避免菌體蛋白變性。干燥后的涂片通過在酒精燈火焰上以鐘擺速度快速通過3-4次進行固定，固定的目的是使菌體蛋白質(zhì)凝固，牢固粘附于載玻片上，便于后續(xù)染色操作，同時增加菌體對染料的結(jié)合力。固定后的涂片進行染色，先滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，覆蓋菌膜，染色1-2min，使菌體充分染上紫色。用蒸餾水緩慢沖洗涂片，洗去多余的染色液，注意水流不宜過大，以免沖掉菌膜。接著滴加路哥氏碘液，覆蓋菌膜約1min，碘液作為媒染劑，能與結(jié)晶紫結(jié)合形成結(jié)晶紫-碘復(fù)合物，增強染料與菌體的結(jié)合力。再次用蒸餾水沖洗，去除多余碘液。然后進行脫色，這是革蘭氏染色的關(guān)鍵步驟。將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇，脫色時間控制在20-30s，期間密切觀察涂片顏色變化，當(dāng)流出的乙醇幾乎無色時，立即停止脫色，用蒸餾水沖洗，終止脫色過程。脫色時間過長，革蘭氏陽性菌可能會被過度脫色而呈現(xiàn)假陰性；脫色時間過短，革蘭氏陰性菌可能脫色不完全，呈現(xiàn)假陽性。最后滴加0.5%番紅染色液復(fù)染1-2min，使革蘭氏陰性菌染上紅色，而革蘭氏陽性菌仍保持紫色。用蒸餾水沖洗，濾紙吸干水分，待涂片完全干燥后，進行鏡檢。在顯微鏡下，使用油鏡觀察菌體形態(tài)。乳酸菌菌體形態(tài)多樣，多數(shù)呈桿狀或球狀。桿狀乳酸菌菌體長短不一，一般長度在1-5μm之間，寬度約為0.5-1μm，呈單個或鏈狀排列，鏈的長度因菌株而異，有的短鏈僅由2-3個菌體組成，有的長鏈則包含10個以上菌體。球狀乳酸菌細胞直徑約為0.5-1μm，呈成對或鏈狀排列，鏈狀排列的球狀乳酸菌形成的鏈有時較為規(guī)則，菌體緊密相連，有時則相對松散。乳酸菌菌體均為革蘭氏陽性，在顯微鏡下呈現(xiàn)出紫色，細胞壁較厚，這是革蘭氏陽性菌的典型特征，其細胞壁主要由肽聚糖組成，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密，在染色過程中，乙醇脫色時細胞壁脫水，肽聚糖層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑收縮以至關(guān)閉，阻止結(jié)晶紫-碘復(fù)合物的逸出，從而使菌體保持紫色。通過革蘭氏染色和菌體形態(tài)觀察，進一步確認篩選得到的菌株為乳酸菌，并為后續(xù)的種屬鑒定提供重要依據(jù)。3.2生理生化鑒定3.2.1過氧化氫酶反應(yīng)過氧化氫酶反應(yīng)的原理是基于酶對過氧化氫的催化作用。具有過氧化氫酶的細菌，能夠催化過氧化氫（H?O?）分解，生成水（H?O）和新生態(tài)氧（[O]），新生態(tài)氧繼而結(jié)合形成氧分子（O?），在反應(yīng)體系中表現(xiàn)為產(chǎn)生氣泡。這一反應(yīng)對于細菌的生存和代謝具有重要意義，因為過氧化氫是細胞代謝過程中產(chǎn)生的一種有害物質(zhì)，能夠氧化細胞內(nèi)的生物分子，如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等，從而對細胞造成損傷。過氧化氫酶的存在使得細菌能夠及時分解過氧化氫，保護自身免受其毒性影響。在具體操作時，首先將篩選得到的乳酸菌菌株接種于MRS斜面培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使菌株充分生長繁殖，形成良好的菌苔。培養(yǎng)結(jié)束后，使用無菌滴管吸取適量的3%過氧化氫溶液，輕輕滴加在斜面上的菌苔上。觀察滴加過氧化氫溶液后的反應(yīng)現(xiàn)象，若在短時間內(nèi)（通常1分鐘內(nèi)）菌苔表面迅速產(chǎn)生大量氣泡，則判定為過氧化氫酶陽性反應(yīng)，表明該菌株具有過氧化氫酶，能夠分解過氧化氫；若菌苔表面無氣泡產(chǎn)生，則判定為過氧化氫酶陰性反應(yīng)，說明該菌株不具有過氧化氫酶或其活性極低，無法分解過氧化氫。過氧化氫酶反應(yīng)結(jié)果可以初步區(qū)分不同類型的乳酸菌，為后續(xù)的鑒定和分類提供重要依據(jù)。例如，在乳酸菌屬中，某些種的乳酸菌具有過氧化氫酶活性，而另一些種則無此活性，通過過氧化氫酶反應(yīng)可以初步判斷菌株所屬的種或類群。3.2.2硫化氫實驗硫化氫實驗是基于某些細菌能夠分解含硫化合物產(chǎn)生硫化氫（H?S）的特性。在三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基中，含有豐富的含硫氨基酸以及其他營養(yǎng)物質(zhì)，為細菌的生長和代謝提供了必要條件。當(dāng)乳酸菌接種于該培養(yǎng)基后，若其具有分解含硫氨基酸的能力，在生長過程中會將含硫氨基酸分解，產(chǎn)生硫化氫。硫化氫是一種具有刺激性氣味的無色氣體，在培養(yǎng)基中，它能夠與其中的硫酸亞鐵（FeSO?）發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成黑色的硫化亞鐵（FeS）沉淀。硫化亞鐵的黑色沉淀在培養(yǎng)基中清晰可見，通過觀察培養(yǎng)基是否變黑，即可判斷細菌是否產(chǎn)生硫化氫。操作時，將篩選得到的乳酸菌菌株用無菌接種針挑取適量菌體，穿刺接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基試管中，接種深度約為試管高度的2/3，確保菌體能夠在培養(yǎng)基的不同層次生長，充分利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分。接種后，將試管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間一般為24-48h，具體時間可根據(jù)菌株的生長特性和實驗要求進行調(diào)整。培養(yǎng)結(jié)束后，取出試管，仔細觀察培養(yǎng)基的顏色變化。若培養(yǎng)基沿著接種線或在接種部位周圍出現(xiàn)明顯的黑色沉淀，則判定為硫化氫實驗陽性，表明該乳酸菌菌株能夠產(chǎn)生硫化氫；若培養(yǎng)基顏色無明顯變化，仍保持原本的顏色（通常為淡黃色或橙紅色），則判定為硫化氫實驗陰性，說明該菌株不具備產(chǎn)生硫化氫的能力。硫化氫實驗結(jié)果可以幫助鑒別不同種屬的乳酸菌，因為不同種屬的乳酸菌在代謝能力上存在差異，某些種屬的乳酸菌具有分解含硫化合物產(chǎn)生硫化氫的能力，而另一些種屬則不具備，這一特性在乳酸菌的分類和鑒定中具有重要的參考價值。3.2.3明膠液化實驗明膠是一種由膠原蛋白水解得到的蛋白質(zhì)，具有在一定溫度下凝固，而在較高溫度下融化的特性。明膠液化實驗的原理基于某些細菌能夠產(chǎn)生蛋白酶，這些蛋白酶可以分解明膠分子，使其失去凝固特性，從而導(dǎo)致明膠培養(yǎng)基由固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)。當(dāng)乳酸菌接種于明膠培養(yǎng)基后，若該菌株能夠產(chǎn)生蛋白酶，在其生長繁殖過程中，分泌的蛋白酶會逐漸作用于明膠分子，將其分解為小分子的多肽和氨基酸，破壞明膠的凝膠結(jié)構(gòu)，使明膠培養(yǎng)基發(fā)生液化現(xiàn)象。操作時，用無菌接種環(huán)挑取適量的乳酸菌菌株，接種于裝有明膠培養(yǎng)基的試管中，接種后將試管置于20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，需定期觀察明膠培養(yǎng)基的狀態(tài)，一般每隔24h觀察一次。若在培養(yǎng)一段時間后，發(fā)現(xiàn)明膠培養(yǎng)基在低于其正常凝固溫度（通常為20℃左右）下出現(xiàn)融化現(xiàn)象，原本固態(tài)的明膠變?yōu)橐簯B(tài)，且這種液化現(xiàn)象自上而下逐漸發(fā)展，形成明顯的液化層，則判定為明膠液化實驗陽性，表明該乳酸菌菌株具有明膠液化能力，能夠產(chǎn)生分解明膠的蛋白酶；若經(jīng)過長時間培養(yǎng)，明膠培養(yǎng)基仍保持固態(tài)，無明顯的液化跡象，則判定為明膠液化實驗陰性，說明該菌株不具備分解明膠的能力。明膠液化實驗可以作為乳酸菌生理生化鑒定的一個重要指標(biāo)，不同種屬的乳酸菌在明膠液化能力上存在差異，通過該實驗可以初步判斷乳酸菌的種屬分類，為進一步的鑒定提供依據(jù)。3.2.4吲哚實驗吲哚實驗的原理是基于某些細菌能夠分解培養(yǎng)基中的色氨酸，產(chǎn)生吲哚。在蛋白胨水培養(yǎng)基中，含有豐富的色氨酸等營養(yǎng)成分，為細菌的生長和代謝提供了底物。當(dāng)乳酸菌接種于該培養(yǎng)基后，若其具有分解色氨酸的能力，在生長過程中，會通過一系列的酶促反應(yīng)將色氨酸分解，最終產(chǎn)生吲哚。吲哚是一種具有特殊氣味的有機化合物，本身無色，但在特定條件下可以與某些試劑發(fā)生顯色反應(yīng)。在操作過程中，首先將篩選得到的乳酸菌菌株接種于蛋白胨水培養(yǎng)基試管中，每管接種量約為0.1-0.2mL，確保菌體能夠在培養(yǎng)基中充分生長。接種后，將試管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使菌株有足夠的時間分解色氨酸產(chǎn)生吲哚。培養(yǎng)結(jié)束后，向試管中加入3-5滴乙醚，振蕩試管約1min，使乙醚與培養(yǎng)基充分混合。乙醚的作用是萃取培養(yǎng)基中的吲哚，因為吲哚在乙醚中的溶解度較高，通過萃取可以將吲哚富集到乙醚層中。振蕩后，靜置試管1-2min，使乙醚與培養(yǎng)基分層，乙醚密度小于水，會浮在培養(yǎng)基上層。然后，沿試管壁緩慢加入2-3滴吲哚試劑（通常為對二***基苯甲醛試劑），使吲哚試劑緩慢流入乙醚層與培養(yǎng)基的界面處。若在液層界面處出現(xiàn)玫瑰紅色環(huán)，則判定為吲哚實驗陽性，表明該乳酸菌菌株能夠分解色氨酸產(chǎn)生吲哚；若液層界面處無明顯顏色變化，仍保持試劑原本的顏色，則判定為吲哚實驗陰性，說明該菌株不具備分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力。吲哚實驗結(jié)果可以幫助鑒別不同種屬的乳酸菌，因為不同種屬的乳酸菌在代謝色氨酸的能力上存在差異，這一特性在乳酸菌的分類和鑒定中具有一定的參考價值。3.2.5石蕊牛乳實驗石蕊牛乳實驗是一種綜合性的生理生化實驗，用于檢測乳酸菌對牛乳中多種成分的代謝能力和代謝方式，主要包括酸凝、酶凝、胨化、還原等現(xiàn)象。石蕊作為一種酸堿指示劑，在酸性條件下呈紅色，在堿性條件下呈藍色，中性條件下呈紫色，它被添加到牛乳培養(yǎng)基中，用于指示培養(yǎng)基酸堿度的變化以及乳酸菌對牛乳成分的代謝情況。操作時，將篩選得到的乳酸菌菌株用無菌吸管吸取適量菌液，接種于裝有石蕊牛乳培養(yǎng)基的試管中，接種量一般為0.2-0.3mL，使菌體能夠在牛乳培養(yǎng)基中充分生長。接種后，將試管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1d、3d、5d、7d、14d時觀察試管中培養(yǎng)基的變化情況。酸凝現(xiàn)象是指乳酸菌發(fā)酵牛乳中的乳糖產(chǎn)生乳酸，隨著乳酸的積累，培養(yǎng)基的pH值逐漸降低，當(dāng)pH值低于牛乳中酪蛋白的等電點（約為4.6）時，酪蛋白會凝固沉淀，使牛乳培養(yǎng)基呈現(xiàn)凝固狀態(tài)，同時由于酸性增強，石蕊指示劑變?yōu)榧t色。酶凝現(xiàn)象是由于乳酸菌產(chǎn)生的凝乳酶作用于牛乳中的酪蛋白，使其凝固，形成類似果凍狀的凝塊，此時培養(yǎng)基的顏色變化可能不明顯，取決于乳酸菌產(chǎn)酸和產(chǎn)酶的相對程度。胨化現(xiàn)象是指乳酸菌分泌的蛋白酶將牛乳中的蛋白質(zhì)分解為小分子的多肽和氨基酸，使凝固的酪蛋白逐漸溶解，培養(yǎng)基變得澄清透明，同時可能會產(chǎn)生一些異味。還原現(xiàn)象是指乳酸菌在代謝過程中消耗氧氣，使培養(yǎng)基處于還原狀態(tài)，石蕊指示劑中的氧化態(tài)物質(zhì)被還原，顏色逐漸變淺，甚至變?yōu)闊o色。通過對這些現(xiàn)象的觀察和分析，可以全面了解乳酸菌對牛乳成分的代謝特性，為乳酸菌的鑒定和分類提供重要依據(jù)，不同種屬的乳酸菌在石蕊牛乳實驗中會表現(xiàn)出不同的現(xiàn)象組合，從而有助于區(qū)分和鑒定不同的乳酸菌。3.2.6乳酸紙層析實驗乳酸紙層析實驗是一種利用紙層析技術(shù)分離和鑒定樣品中乳酸的方法。紙層析的原理是基于不同物質(zhì)在固定相（濾紙纖維所吸附的水分）和流動相（層析溶劑）之間的分配系數(shù)不同，當(dāng)流動相在濾紙表面流動時，不同物質(zhì)在固定相和流動相之間不斷進行分配，由于分配系數(shù)的差異，它們在濾紙上的移動速度也不同，從而實現(xiàn)分離。在乳酸紙層析實驗中，樣品中的乳酸在層析過程中會與其他成分分離，并在濾紙上形成特定的位置。操作時，首先進行點樣。用毛細管分別吸取適量的乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)液、2%乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（作為對照）以及空白培養(yǎng)液（用于排除濾紙和溶劑本身的干擾），在濾紙的一端距離邊緣約1-1.5cm處，均勻地點上樣品點，每個樣品點的直徑控制在2-3mm左右，點樣后待樣品自然風(fēng)干或用吹風(fēng)機低溫吹干，確保樣品在濾紙上固定。然后進行層析，將點好樣的濾紙垂直放入裝有展層劑（水-正丁醇-苯甲醇體積比為1：5：5）的層析缸中，展層劑的高度應(yīng)低于樣品點，避免樣品被直接溶解在展層劑中。蓋上層析缸蓋子，使展層劑在濾紙的毛細作用下緩慢向上爬升，展開時間約為10h，期間保持層析缸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，避免震動和溫度波動。展開結(jié)束后，取出濾紙，用吹風(fēng)機吹干或自然風(fēng)干。最后進行顯色，向濾紙上均勻噴灑0.04%溴酚藍乙醇溶液，溴酚藍是一種酸堿指示劑，在酸性條件下呈黃色，乳酸是酸性物質(zhì)，當(dāng)溴酚藍與乳酸接觸時，會使乳酸所在位置的濾紙變?yōu)辄S色斑點。通過觀察樣品斑點與乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液斑點的位置關(guān)系，計算Rf值（Rf=溶質(zhì)移動距離/溶劑前沿移動距離），若樣品的Rf值與乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的Rf值相近，則可判斷樣品中含有乳酸，從而確定乳酸菌具有產(chǎn)生乳酸的能力。乳酸紙層析實驗可以直觀地檢測乳酸菌發(fā)酵過程中乳酸的產(chǎn)生情況，為乳酸菌的鑒定和發(fā)酵性能評估提供重要依據(jù)。3.2.7碳水化合物利用實驗碳水化合物利用實驗的原理基于乳酸菌對不同碳水化合物的代謝能力差異。不同種屬的乳酸菌具有不同的酶系統(tǒng)，這些酶系統(tǒng)決定了它們能夠利用哪些碳水化合物作為碳源進行生長和代謝。當(dāng)乳酸菌接種于含有特定碳水化合物的培養(yǎng)基中時，若其具有相應(yīng)的酶，能夠?qū)⒃撎妓衔锓纸鉃樾》肿游镔|(zhì)，如葡萄糖、果糖等，進而利用這些小分子物質(zhì)進行能量代謝和物質(zhì)合成，培養(yǎng)基會發(fā)生一系列變化，如顏色改變、產(chǎn)生氣體等，通過觀察這些變化可以判斷乳酸菌對該碳水化合物的利用能力。操作時，將篩選得到的乳酸菌菌株分別接入含有不同碳水化合物（如葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇等）的培養(yǎng)試管中，每管接入適量菌液，接種量約為0.1-0.2mL，確保菌體能夠在培養(yǎng)基中充分生長。同時設(shè)置空白對照試管，只加入培養(yǎng)基，不接種乳酸菌，用于對比觀察。接種后，將試管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察試管中培養(yǎng)物的顏色變化以及是否有氣體產(chǎn)生。對于含有酸堿指示劑（如溴甲酚紫等）的培養(yǎng)基，若乳酸菌能夠利用其中的碳水化合物產(chǎn)酸，會使培養(yǎng)基的pH值降低，指示劑顏色發(fā)生相應(yīng)變化，如溴甲酚紫在酸性條件下由紫色變?yōu)辄S色；若乳酸菌在利用碳水化合物過程中產(chǎn)生氣體，會在培養(yǎng)基中形成氣泡，或使倒置的杜氏小管中出現(xiàn)氣泡。通過觀察各試管中培養(yǎng)物的變化情況，記錄乳酸菌對不同碳水化合物的利用結(jié)果，若某試管中出現(xiàn)顏色變化或氣體產(chǎn)生，則表明該乳酸菌能夠利用相應(yīng)的碳水化合物；若試管中無明顯變化，則說明該乳酸菌不能利用該碳水化合物。碳水化合物利用實驗結(jié)果可以幫助鑒別不同種屬的乳酸菌，因為不同種屬的乳酸菌對碳水化合物的利用譜存在差異，這一特性在乳酸菌的分類和鑒定中具有重要的參考價值。3.316SrRNA分子鑒定3.3.1DNA提取與PCR擴增乳酸菌基因組DNA的提取采用試劑盒法，選用專門用于細菌DNA提取的試劑盒，如天根生化科技（北京）有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒，該試劑盒操作簡便、提取效率高，能夠有效去除雜質(zhì)和蛋白質(zhì)，獲得高質(zhì)量的DNA。具體操作步驟如下：從MRS液體培養(yǎng)基中取1.5mL培養(yǎng)至對數(shù)生長期的乳酸菌菌液，轉(zhuǎn)移至2mL離心管中，12000r/min離心5min，棄上清，收集菌體沉淀。向離心管中加入200μL緩沖液GA，振蕩懸浮菌體，使菌體充分分散在緩沖液中。加入20μL蛋白酶K溶液，混勻后，56℃水浴10min，期間不時振蕩，以促進蛋白酶K對菌體蛋白質(zhì)的消化作用，使DNA充分釋放。加入220μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃水浴10min，溶液變清亮，此時蛋白質(zhì)和DNA已充分分離。加入220μL無水乙醇，充分顛倒混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀，為DNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合物。將上一步所得溶液和絮狀沉淀全部加入吸附柱CB3中，12000r/min離心30s，棄廢液，吸附柱中會吸附DNA。向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD，12000r/min離心30s，棄廢液，進一步去除雜質(zhì)。向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000r/min離心30s，棄廢液，重復(fù)此步驟一次，以確保徹底去除鹽分和其他雜質(zhì)。將吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min離心2min，以去除殘留的漂洗液。將吸附柱CB3置于新的1.5mL離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50-100μL洗脫緩沖液TE，室溫放置5min，12000r/min離心2min，離心管中收集的溶液即為提取的乳酸菌基因組DNA，將其置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。以提取的乳酸菌基因組DNA為模板，采用16SrRNA通用引物進行PCR擴增。正向引物27F為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物1492R為5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反應(yīng)體系總體積為25μL，包括10×PCR緩沖液2.5μL，提供PCR反應(yīng)所需的緩沖環(huán)境和離子；2.5mmol/LdNTPs2μL，作為DNA合成的原料；25mmol/LMgCl?1.5μL，參與DNA聚合酶的激活和穩(wěn)定；正向引物和反向引物（10μmol/L）各0.5μL，引導(dǎo)DNA的擴增；TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，催化DNA的合成；模板DNA1μL，提供擴增的起始序列；無菌超純水16.3μL，補充反應(yīng)體系至所需體積。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，使DNA雙鏈充分解旋；然后進行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30s，破壞DNA雙鏈的氫鍵，使其解鏈；55℃退火30s，引物與模板DNA互補配對；72℃延伸1min，TaqDNA聚合酶在引物的引導(dǎo)下，以dNTPs為原料，合成新的DNA鏈；最后72℃延伸10min，確保所有擴增產(chǎn)物充分延伸。PCR擴增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴增條帶的大小和亮度，確認是否成功擴增出約1500bp的16SrRNA基因片段。3.3.2測序與序列分析將PCR擴增得到的產(chǎn)物送至專業(yè)的測序公司，如華大基因、生工生物工程（上海）股份有限公司等進行測序。測序公司采用Sanger測序法，該方法是一種經(jīng)典的DNA測序技術(shù)，具有準(zhǔn)確性高、可靠性強的特點。在測序過程中，測序公司首先對PCR產(chǎn)物進行純化，去除反應(yīng)體系中的引物、dNTPs、酶等雜質(zhì)，以保證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。然后，將純化后的PCR產(chǎn)物與測序引物進行混合，加入測序反應(yīng)體系中，利用DNA聚合酶在引物的引導(dǎo)下，以PCR產(chǎn)物為模板合成新的DNA鏈。在合成過程中，加入帶有熒光標(biāo)記的ddNTP（雙脫氧核苷酸），由于ddNTP缺少3'-OH基團，當(dāng)它摻入到DNA鏈中時，DNA鏈的延伸就會終止。通過控制ddNTP的濃度和加入時間，使DNA鏈在不同位置終止延伸，從而得到一系列長度不同的DNA片段。這些DNA片段經(jīng)過電泳分離后，通過熒光檢測系統(tǒng)讀取每個片段末端的堿基信息，從而得到PCR產(chǎn)物的DNA序列。測序完成后，將獲得的序列利用生物信息學(xué)軟件進行分析。首先，使用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進行校對和拼接，去除測序過程中可能出現(xiàn)的錯誤和低質(zhì)量序列，得到完整的16SrRNA基因序列。然后，將拼接好的序列在NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）比對，通過與數(shù)據(jù)庫中已有的16SrRNA基因序列進行相似性比較，確定乳酸菌的種屬分類地位。BLAST比對結(jié)果會給出與目標(biāo)序列相似性較高的已知序列及其所屬的菌種信息，根據(jù)相似性程度和序列覆蓋度，初步判斷篩選得到的乳酸菌與已知乳酸菌的親緣關(guān)系。為了進一步確定乳酸菌的分類地位，利用MEGA（MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis）軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。將篩選得到的乳酸菌16SrRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中同源性較高的乳酸菌模式菌株序列一起導(dǎo)入MEGA軟件中，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）進行系統(tǒng)發(fā)育分析。在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的過程中，設(shè)置Bootstrap值為1000，進行自展檢驗，以評估系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性。Bootstrap值表示在多次重復(fù)抽樣構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時，某一分支出現(xiàn)的頻率，Bootstrap值越高，說明該分支的可靠性越強。通過系統(tǒng)發(fā)育樹，可以直觀地展示篩選得到的乳酸菌與其他乳酸菌之間的親緣關(guān)系，確定其在乳酸菌分類體系中的位置。四、降解乳脂肪能力乳酸菌的種類及降解原理4.1降解乳脂肪能力乳酸菌的種類在乳酸菌的龐大菌群中，部分菌種展現(xiàn)出獨特的降解乳脂肪能力，這為酸奶油等乳制品的品質(zhì)提升提供了關(guān)鍵支撐。以下將詳細介紹幾種常見的具有降解乳脂肪能力的乳酸菌種類及其分類地位和基本特征。德氏乳桿菌（Lactobacillusdelbrueckii）屬于乳桿菌屬，是革蘭氏陽性菌。其細胞形態(tài)呈長桿狀，無鞭毛，不形成芽孢。德氏乳桿菌在培養(yǎng)時對營養(yǎng)要求較為苛刻，需要從培養(yǎng)基中獲取多種氨基酸等營養(yǎng)成分。它能夠利用乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖等多種糖類作為單一碳源進行生長代謝。在發(fā)酵工業(yè)中，德氏乳桿菌應(yīng)用廣泛，尤其是其保加利亞亞種（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus），是酸奶生產(chǎn)的主要乳酸菌菌種之一。在酸奶油制作中，德氏乳桿菌通過代謝活動，能夠分解乳脂肪，產(chǎn)生脂肪酸和甘油等小分子物質(zhì)，這些物質(zhì)不僅有助于酸奶油獨特風(fēng)味的形成，還能改善其質(zhì)地，使其更加細膩、醇厚。學(xué)者王佳璐在《德氏乳桿菌保加利亞亞種產(chǎn)γ-氨基丁酸條件優(yōu)化及其對酸奶品質(zhì)的影響》中研究發(fā)現(xiàn)，德氏乳桿菌保加利亞亞種在發(fā)酵過程中，不僅能產(chǎn)生乳酸，還能對乳脂肪進行一定程度的分解，改變酸奶的風(fēng)味和質(zhì)地。德氏乳桿菌在代謝過程中，其分泌的脂肪酶能夠特異性地作用于乳脂肪分子，將其分解為甘油和脂肪酸，其中脂肪酸的種類和含量變化會直接影響酸奶油的風(fēng)味特性。乳酸鏈球菌（Streptococcuslactis）屬于鏈球菌屬，細胞呈球形或卵圓形，多數(shù)呈鏈狀排列。其在乳制品發(fā)酵中具有重要作用，能夠發(fā)酵乳糖產(chǎn)生乳酸，同時也具備降解乳脂肪的能力。乳酸鏈球菌在生長過程中，會分泌脂肪酶，這些酶能夠?qū)⑷橹痉纸鉃楦视秃椭舅?，增加酸奶油中的游離脂肪酸含量，從而賦予酸奶油更濃郁的風(fēng)味。在發(fā)酵乳制品生產(chǎn)中，乳酸鏈球菌與其他乳酸菌配合使用，能夠協(xié)同作用，共同促進乳脂肪的降解和風(fēng)味物質(zhì)的生成。有研究表明，乳酸鏈球菌在酸奶油發(fā)酵過程中，能夠與其他乳酸菌相互作用，調(diào)節(jié)發(fā)酵環(huán)境的pH值和氧化還原電位，從而影響脂肪酶的活性和乳脂肪的降解效率。在與嗜熱鏈球菌共同發(fā)酵酸奶油時，兩者的代謝產(chǎn)物相互影響，促進了乳脂肪的降解和風(fēng)味物質(zhì)的合成，使酸奶油具有更豐富的風(fēng)味層次。植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）屬于乳桿菌屬，細胞呈直或彎的桿狀，為同型發(fā)酵乳酸菌。它具有較強的適應(yīng)能力，能在多種環(huán)境中生長。植物乳桿菌不僅在調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、增強免疫力等方面發(fā)揮作用，還能在乳制品發(fā)酵中降解乳脂肪。在酸奶油制作中，植物乳桿菌能夠利用自身的酶系統(tǒng)，將乳脂肪分解為小分子物質(zhì)，改變酸奶油的脂肪組成，進而影響其口感和穩(wěn)定性。其產(chǎn)生的脂肪酸和其他代謝產(chǎn)物，還能為酸奶油增添獨特的風(fēng)味。學(xué)者Zhang等在《CharacterizationoflipolyticactivityofLactobacillusplantarumisolatedfromtraditionalfermentedfoods》中對從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離得到的植物乳桿菌的脂解活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌能夠產(chǎn)生多種脂肪酶，對乳脂肪具有顯著的降解作用，且不同菌株的降解能力存在差異。這些脂肪酶的活性受到溫度、pH值等環(huán)境因素的影響，在適宜的條件下，植物乳桿菌能夠高效地降解乳脂肪，為酸奶油的品質(zhì)提升提供保障。嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）屬于乳桿菌屬，細胞呈桿狀，單個或成鏈排列。它是一種有益的益生菌，能夠在人體腸道內(nèi)定植，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡。在乳制品發(fā)酵領(lǐng)域，嗜酸乳桿菌也表現(xiàn)出一定的降解乳脂肪能力。在酸奶油發(fā)酵過程中，嗜酸乳桿菌能夠利用乳脂肪作為碳源和能源，通過自身的代謝活動將其分解，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物有助于改善酸奶油的風(fēng)味和質(zhì)地，同時還能增強酸奶油的保健功能。嗜酸乳桿菌在降解乳脂肪的過程中，會產(chǎn)生一些特殊的代謝產(chǎn)物，如短鏈脂肪酸等，這些物質(zhì)不僅具有獨特的風(fēng)味，還具有調(diào)節(jié)腸道菌群、降低膽固醇等生理活性，使酸奶油在滿足消費者口感需求的同時，還能提供一定的健康益處。4.2降解原理4.2.1酶解作用機制乳酸菌對乳脂肪的降解主要依賴于其分泌的脂肪酶。脂肪酶是一類特殊的水解酶，能夠特異性地作用于乳脂肪分子，將其分解為甘油和脂肪酸，這一過程在酸奶油的風(fēng)味形成和質(zhì)地改善中起著關(guān)鍵作用。乳脂肪是由甘油和脂肪酸通過酯鍵連接而成的甘油三酯。乳酸菌分泌的脂肪酶屬于羧酸酯水解酶類，其作用位點位于甘油三酯分子中的酯鍵。脂肪酶的催化機制基于其特殊的結(jié)構(gòu)和活性中心。脂肪酶的活性中心通常包含一個由絲氨酸、天冬氨酸（或谷氨酸）和組氨酸組成的催化三聯(lián)體。在催化過程中，絲氨酸殘基的羥基作為親核試劑，進攻甘油三酯分子中的酯鍵，形成一個共價的?；?酶中間體。同時，天冬氨酸（或谷氨酸）通過靜電相互作用穩(wěn)定組氨酸殘基，組氨酸則作為酸堿催化劑，促進絲氨酸羥基的親核進攻和反應(yīng)中間體的形成。隨后，?；?酶中間體被水分子攻擊，酯鍵斷裂，釋放出脂肪酸和甘油，完成脂肪酶的催化循環(huán)。脂肪酶對不同脂肪酸鏈長度和飽和度的乳脂肪具有不同的催化活性。一般來說，脂肪酶對短鏈脂肪酸（C4-C10）的甘油三酯具有較高的催化活性，因為短鏈脂肪酸的空間位阻較小，更容易接近脂肪酶的活性中心。而對于長鏈脂肪酸（C12-C22）的甘油三酯，脂肪酶的催化活性相對較低。脂肪酸的飽和度也會影響脂肪酶的活性，不飽和脂肪酸由于其雙鍵的存在，使得分子結(jié)構(gòu)更為靈活，脂肪酶對其催化活性通常高于飽和脂肪酸。有研究表明，乳酸菌分泌的脂肪酶對油酸甘油酯（不飽和脂肪酸甘油酯）的水解速率比對硬脂酸甘油酯（飽和脂肪酸甘油酯）的水解速率快2-3倍。在酸奶油發(fā)酵過程中，乳酸菌分泌的脂肪酶持續(xù)作用于乳脂肪。隨著發(fā)酵時間的延長，乳脂肪逐漸被水解，游離脂肪酸的含量不斷增加。這些游離脂肪酸不僅是酸奶油風(fēng)味物質(zhì)的重要前體，還能影響酸奶油的口感和質(zhì)地。游離脂肪酸中的短鏈脂肪酸，如丁酸、己酸等，具有較強的揮發(fā)性和特殊的氣味，是酸奶油風(fēng)味的重要組成部分，能夠賦予酸奶油濃郁的奶香和獨特的酸味。而長鏈脂肪酸則對酸奶油的質(zhì)地和穩(wěn)定性有重要影響，它們可以與乳蛋白相互作用，改變酸奶油的流變學(xué)性質(zhì)，使其更加細膩、均勻。4.2.2代謝途徑對乳脂肪降解的影響乳酸菌的代謝途徑是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，其中糖酵解、三羧酸循環(huán)等關(guān)鍵代謝途徑與乳脂肪降解密切相關(guān)，它們相互協(xié)調(diào)，共同影響著乳脂肪降解過程中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量利用，進而對酸奶油的品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。糖酵解是乳酸菌代謝的重要途徑之一，在這一過程中，乳酸菌將葡萄糖等糖類物質(zhì)分解為丙酮酸，并產(chǎn)生少量的ATP和NADH。糖酵解途徑為乳酸菌的生長和代謝提供了能量和碳骨架，同時也對乳脂肪降解產(chǎn)生間接影響。丙酮酸是糖酵解的重要中間產(chǎn)物，它可以進一步代謝為乳酸、乙酸、乙醇等物質(zhì)。這些代謝產(chǎn)物不僅影響發(fā)酵環(huán)境的pH值，還能調(diào)節(jié)脂肪酶的活性。乳酸的積累會使發(fā)酵液的pH值降低，在一定范圍內(nèi)，酸性環(huán)境可以激活乳酸菌分泌的脂肪酶，促進乳脂肪的水解。學(xué)者趙建新在《乳酸菌發(fā)酵特性及代謝產(chǎn)物對發(fā)酵乳品質(zhì)的影響》中研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵液pH值在5.0-5.5時，乳酸菌脂肪酶的活性較高，乳脂肪的降解速率加快。丙酮酸還可以通過其他代謝途徑轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，為三羧酸循環(huán)提供底物，從而間接影響乳脂肪的降解過程。三羧酸循環(huán)是細胞內(nèi)物質(zhì)代謝和能量產(chǎn)生的核心途徑之一，雖然乳酸菌的三羧酸循環(huán)并不完全，但仍在其代謝中發(fā)揮著重要作用。在乳脂肪降解過程中，三羧酸循環(huán)與脂肪代謝相互關(guān)聯(lián)。乳脂肪水解產(chǎn)生的甘油可以通過糖酵解途徑的逆反應(yīng)轉(zhuǎn)化為磷酸二羥丙酮，進而參與三羧酸循環(huán)。脂肪酸則在β-氧化作用下，逐步分解為乙酰輔酶A，進入三羧酸循環(huán)徹底氧化分解，產(chǎn)生CO?、H?O和能量（ATP）。在三羧酸循環(huán)中，乙酰輔酶A與草酰乙酸結(jié)合，經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)，釋放出能量，同時產(chǎn)生NADH、FADH?等還原當(dāng)量，這些還原當(dāng)量通過呼吸鏈傳遞，產(chǎn)生ATP，為乳酸菌的生長和代謝提供能量。三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，如α-酮戊二酸、琥珀酸等，還可以作為合成其他物質(zhì)的前體，參與氨基酸、核苷酸等生物分子的合成，影響乳酸菌的代謝和生長。除了糖酵解和三羧酸循環(huán)，乳酸菌的其他代謝途徑也對乳脂肪降解產(chǎn)生影響。乳酸菌的磷酸戊糖途徑可以產(chǎn)生NADPH，NADPH在脂肪酸的合成和代謝中起著重要作用。在乳脂肪降解過程中，NADPH參與脂肪酸的β-氧化和其他代謝反應(yīng)，為脂肪代謝提供還原力。乳酸菌的氨基酸代謝途徑也與乳脂肪降解相關(guān)，氨基酸代謝產(chǎn)生的某些物質(zhì)，如氨、有機酸等，會影響發(fā)酵環(huán)境的pH值和滲透壓，進而影響乳酸菌的生長和脂肪酶的活性。乳酸菌在代謝過程中還會產(chǎn)生一些次生代謝產(chǎn)物，如細菌素、維生素等，這些物質(zhì)可能對乳脂肪降解過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝活動產(chǎn)生影響，從而間接影響乳脂肪的降解。五、乳酸菌在酸奶油中的應(yīng)用現(xiàn)狀5.1酸奶油的概述酸奶油，作為一種獨具特色的發(fā)酵乳制品，是以優(yōu)質(zhì)奶油為原料，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵工藝制成。其營養(yǎng)豐富，富含脂肪、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、乳酸、維生素、氨基酸和乳糖等營養(yǎng)成分，還含有人體所需的必需脂肪酸和不飽和脂肪酸，具有極高的營養(yǎng)價值。乳脂作為重要的供能物質(zhì)，在酸奶油中含量豐富，極易被人體吸收，對人體的健康成長和發(fā)育有著積極作用。在風(fēng)味方面，酸奶油具有濃郁且獨特的酸香風(fēng)味，這種風(fēng)味的形成源于乳酸菌在發(fā)酵過程中的一系列代謝活動。乳酸菌利用乳糖產(chǎn)生乳酸，賦予酸奶油獨特的酸味；同時，乳酸菌還會分解乳中的檸檬酸，生成雙乙酰等揮發(fā)性化合物，為酸奶油增添了濃郁的香氣，使其芳香味更濃，區(qū)別于其他乳制品。在質(zhì)地方面，酸奶油質(zhì)地均勻細膩，表面光亮，呈現(xiàn)出濃稠的半流體狀態(tài)，具有良好的涂抹性和可塑性，能夠為食品增添豐富的口感層次。酸奶油在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛，涵蓋了多個領(lǐng)域。在烘焙產(chǎn)品中，酸奶油的加入能夠改善面團的質(zhì)地，使其更加柔軟、細膩，增加烘焙產(chǎn)品的濕潤度和風(fēng)味，如在制作蛋糕、面包、曲奇等時，酸奶油可替代部分油脂或水分，使產(chǎn)品具有獨特的風(fēng)味和更好的口感。在沙拉醬的制作中，酸奶油作為主要原料之一，賦予沙拉醬濃郁的奶香和醇厚的口感，同時其豐富的營養(yǎng)成分也提升了沙拉醬的營養(yǎng)價值，與各種蔬菜、水果搭配相得益彰。在調(diào)味汁領(lǐng)域，酸奶油可與其他調(diào)料混合，制作出各種風(fēng)味的調(diào)味汁，用于蘸食、淋汁或烹飪調(diào)味，如搭配烤肉、炸物等，能中和油膩感，增添清新的風(fēng)味。酸奶油還可直接食用，作為健康的零食，在日常飲食中適量食用有利于維持腸道健康，促進營養(yǎng)吸收。隨著消費者對健康、營養(yǎng)食品的需求不斷增加，以及對食品風(fēng)味和品質(zhì)要求的提高，酸奶油市場前景廣闊。全球酸奶油市場規(guī)模持續(xù)增長，在2023年達到94.11億元，預(yù)計到2029年將達到101.4億元，預(yù)測區(qū)間CAGR為1.34%。中國作為亞太地區(qū)主要的消費市場之一，酸奶油市場也呈現(xiàn)出良好的發(fā)展態(tài)勢，市場規(guī)模不斷擴大，消費者對酸奶油的認知度和接受度逐漸提高，產(chǎn)品種類也日益豐富，除了傳統(tǒng)酸奶油，有機酸奶油等新型產(chǎn)品也逐漸受到消費者青睞。5.2乳酸菌在酸奶油發(fā)酵中的作用5.2.1酸化作用在酸奶油的發(fā)酵進程中，乳酸菌發(fā)揮著至關(guān)重要的酸化作用，這一作用對酸奶油的品質(zhì)和保質(zhì)期產(chǎn)生著深遠影響。乳酸菌在發(fā)酵過程中，能夠?qū)⑷橹械娜樘亲鳛樘荚?，通過一系列復(fù)雜的酶促反應(yīng)進行代謝。以德氏乳桿菌保加利亞亞種為例，其細胞內(nèi)含有豐富的β-半乳糖苷酶，這種酶能夠特異性地識別并水解乳糖分子，將其分解為葡萄糖和半乳糖。隨后，葡萄糖和半乳糖在細胞內(nèi)進一步通過糖酵解途徑進行代謝，最終生成乳酸。這一過程中，乳酸菌的代謝活動十分活躍，不斷消耗乳糖并產(chǎn)生乳酸，使得酸奶油中的乳酸含量逐漸增加。隨著乳酸的積累，酸奶油的pH值不斷下降。當(dāng)pH值降低到一定程度時，會對微生物的生長環(huán)境產(chǎn)生顯著影響。在酸性環(huán)境下，許多有害微生物，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等，其細胞內(nèi)的酶活性會受到抑制。這些酶參與了微生物的能量代謝、物質(zhì)合成等重要生理過程，酶活性的抑制導(dǎo)致微生物無法正常進行代謝活動，從而抑制了它們的生長和繁殖。當(dāng)酸奶油的pH值降至4.5左右時，大腸桿菌的生長速度明顯減緩，其細胞內(nèi)的多種酶，如呼吸鏈相關(guān)酶、蛋白質(zhì)合成酶等，活性降低了50%以上，使得大腸桿菌難以在這種環(huán)境中生存和繁殖。乳酸菌的酸化作用還能夠與酸奶油中的其他成分相互作用，進一步增強對有害微生物的抑制效果。乳酸能夠與乳中的蛋白質(zhì)結(jié)合，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和電荷分布，使蛋白質(zhì)形成更加緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而降低了微生物可利用的營養(yǎng)物質(zhì)的擴散速率，減少了有害微生物獲取營養(yǎng)的機會。乳酸還能夠調(diào)節(jié)酸奶油的氧化還原電位，創(chuàng)造一個不利于需氧有害微生物生長的環(huán)境。在酸奶油發(fā)酵過程中，通過乳酸菌的酸化作用，能夠有效地抑制有害微生物的生長，延長酸奶油的保質(zhì)期，同時賦予酸奶油獨特的酸味，提升其風(fēng)味品質(zhì)。5.2.2改善質(zhì)構(gòu)乳酸菌在酸奶油發(fā)酵過程中，通過自身的代謝活動對酸奶油的質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生多方面的影響，使其質(zhì)地更加均勻細膩，口感更加醇厚，穩(wěn)定性得到顯著提高，從而提升了酸奶油的整體品質(zhì)。乳酸菌在代謝過程中會分泌多種胞外多糖。這些多糖具有獨特的分子結(jié)構(gòu)，如線性或分支狀的大分子鏈，能夠在酸奶油體系中形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。以乳酸乳球菌為例，其分泌的胞外多糖主要由葡萄糖、半乳糖等單糖組成，這些單糖通過糖苷鍵連接形成長鏈結(jié)構(gòu)。在酸奶油中，這些多糖分子相互交織，與乳蛋白、乳脂肪等成分相互作用，增加了酸奶油的粘度。多糖分子的長鏈結(jié)構(gòu)能夠阻礙乳蛋白和乳脂肪顆粒的運動，使其分散更加均勻，從而有效地改善了酸奶油的質(zhì)地，使其更加濃稠、細膩。研究表明，添加含有豐富胞外多糖的乳酸菌發(fā)酵劑制作的酸奶油，其粘度比未添加的酸奶油提高了30%-50%，在涂抹過程中更加順滑，不易流淌。乳酸菌在發(fā)酵過程中，其代謝產(chǎn)物會與乳蛋白發(fā)生相互作用，影響乳蛋白的結(jié)構(gòu)和聚集狀態(tài)。乳酸菌產(chǎn)生的乳酸會降低酸奶油的pH值，當(dāng)pH值接近乳蛋白的等電點時，乳蛋白的電荷分布發(fā)生改變，分子間的靜電斥力減小，從而導(dǎo)致乳蛋白發(fā)生聚集和沉淀。在適宜的條件下，乳酸菌代謝產(chǎn)物能夠促進乳蛋白形成均勻、穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)。乳酸菌產(chǎn)生的某些多肽和氨基酸能夠與乳蛋白形成氫鍵和疏水相互作用，增強乳蛋白之間的交聯(lián)程度，使凝膠結(jié)構(gòu)更加緊密和穩(wěn)定。這種凝膠結(jié)構(gòu)不僅改善了酸奶油的持水性，使其能夠更好地保持水分，減少乳清析出，還賦予酸奶油良好的可塑性和彈性，使其在口感上更加醇厚、豐滿。乳酸菌的代謝活動還能夠影響酸奶油中乳脂肪的分布和聚集狀態(tài)。乳酸菌分泌的脂肪酶能夠分解乳脂肪，產(chǎn)生脂肪酸和甘油等小分子物質(zhì)。這些小分子物質(zhì)能夠改變?nèi)橹镜谋砻嫘再|(zhì)，使其更容易分散在酸奶油體系中。脂肪酸能夠降低乳脂肪顆粒的表面張力，減少脂肪顆粒之間的聚集和融合，使乳脂肪在酸奶油中分布更加均勻。乳酸菌代謝產(chǎn)生的其他物質(zhì)，如磷脂等，也能夠與乳脂肪相互作用，形成穩(wěn)定的乳化結(jié)構(gòu)，進一步增強酸奶油的穩(wěn)定性。在酸奶油的貯藏過程中，經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵的酸奶油，其乳脂肪的聚集和上浮現(xiàn)象明顯減少，保持了良好的質(zhì)地和外觀。5.2.3產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)乳酸菌在酸奶油發(fā)酵過程中，通過對乳中各種成分的代謝轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生了醛類、醇類、酮類、酯類等多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，這些物質(zhì)相互交織，共同構(gòu)成了酸奶油獨特而豐富的風(fēng)味。乳酸菌在代謝過程中，能夠?qū)⑷橹械臋幟仕岱纸鉃槎喾N物質(zhì)，其中雙乙酰是酸奶油風(fēng)味的關(guān)鍵成分之一。以乳酸乳球菌乳脂亞種為例，其細胞內(nèi)含有檸檬酸裂解酶，能夠?qū)幟仕崃呀鉃椴蒗Ｒ宜岷鸵宜?。草酰乙酸在一系列酶的作用下進一步轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸再經(jīng)過脫羧和氧化反應(yīng)生成雙乙酰。雙乙酰具有濃郁的奶油香氣，閾值極低，即使在極低的濃度下（通常在0.1-1mg/kg之間），也能被人體嗅覺感知，為酸奶油賦予了獨特的奶香和醇厚的風(fēng)味。學(xué)者Zhao等在《EffectofLactococcuslactissubsp.cremorisontheflavorandqualityofsourcream》中研究發(fā)現(xiàn)，在酸奶油發(fā)酵過程中，當(dāng)雙乙酰含量達到0.5mg/kg時，酸奶油的香氣濃郁度顯著提升，消費者對其風(fēng)味的接受度明顯提高。乳酸菌對乳脂肪的分解代謝也是產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的重要途徑。乳酸菌分泌的脂肪酶能夠?qū)⑷橹痉纸鉃橹舅岷透视?。脂肪酸在乳酸菌的進一步代謝作用下，通過β-氧化等途徑產(chǎn)生多種揮發(fā)性化合物。飽和脂肪酸中的丁酸、己酸等短鏈脂肪酸具有較強的揮發(fā)性和獨特的氣味，丁酸具有刺鼻的酸臭味，在酸奶油中適量存在時，能夠與其他風(fēng)味物質(zhì)相互協(xié)調(diào)，賦予酸奶油濃郁的發(fā)酵香氣；己酸則具有淡淡的果香氣味，為酸奶油增添了獨特的風(fēng)味層次。不飽和脂肪酸在氧化過程中會產(chǎn)生醛類、酮類等揮發(fā)性物質(zhì)，油酸在氧化過程中會產(chǎn)生己醛、庚醛等醛類物質(zhì)，這些醛類物質(zhì)具有清新的果香和青草香氣，為酸奶油的風(fēng)味增添了清新的氣息。乳酸菌在代謝糖類和氨基酸的過程中，也會產(chǎn)生多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。在糖類代謝方面，乳酸菌發(fā)酵葡萄糖等糖類除了產(chǎn)生乳酸外，還會產(chǎn)生乙醇、乙酸乙酯等物質(zhì)。乙醇具有淡淡的酒香氣味，乙酸乙酯具有水果香氣，它們的存在為酸奶油賦予了獨特的風(fēng)味。在氨基酸代謝方面，乳酸菌能夠?qū)被嵬ㄟ^脫氨基、脫羧等反應(yīng)轉(zhuǎn)化為胺類、有機酸和醛類等物質(zhì)。纈氨酸經(jīng)過乳酸菌的代謝可以產(chǎn)生3-甲基丁醛，具有濃郁的麥芽香氣；亮氨酸可以轉(zhuǎn)化為異戊醛，具有果香和花香氣味，這些物質(zhì)豐富了酸奶油的風(fēng)味組成。5.3現(xiàn)有應(yīng)用中存在的問題在當(dāng)前酸奶油生產(chǎn)中，乳酸菌的應(yīng)用雖然取得了一定成效，但仍存在諸多問題，制約著酸奶油品質(zhì)的進一步提升和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。產(chǎn)酸能力不穩(wěn)定是一個突出問題。乳酸菌在發(fā)酵過程中，其產(chǎn)酸能力受多種因素影響，導(dǎo)致不同批次酸奶油的酸度存在較大差異。溫度的波動對乳酸菌產(chǎn)酸能力影響顯著，當(dāng)發(fā)酵溫度在25-45℃范圍內(nèi)波動時，乳酸菌的代謝活性會發(fā)生變化，產(chǎn)酸速率和最終產(chǎn)酸量也隨之改變。在25℃時，乳酸菌的代謝速率相對較低，產(chǎn)酸量較少，可能導(dǎo)致酸奶油的酸度不足，無法有效抑制有害微生物生長，影響產(chǎn)品保質(zhì)期；而在45℃時，過高的溫度可能使乳酸菌細胞內(nèi)的酶活性受到抑制，甚至導(dǎo)致細胞死亡，同樣會影響產(chǎn)酸能力，使酸奶油的酸度不穩(wěn)定。發(fā)酵時間的長短也會影響乳酸菌的產(chǎn)酸量，發(fā)酵時間過短，乳酸菌未能充分代謝乳糖產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致酸度不夠；發(fā)酵時間過長，可能會使乳酸菌進入衰退期，產(chǎn)酸能力下降，同時還可能產(chǎn)生其他不良代謝產(chǎn)物，影響酸奶油的風(fēng)味和品質(zhì)。風(fēng)味不足也是現(xiàn)有酸奶油生產(chǎn)中面臨的問題之一。目前常用的乳酸菌發(fā)酵劑在風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生上存在局限性，使得酸奶油的風(fēng)味不夠濃郁和豐富。某些乳酸菌在發(fā)酵過程中，對乳脂肪和蛋白質(zhì)的分解代謝能力較弱，無法產(chǎn)生足夠的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，如醛類、醇類、酮類、酯類等。一些乳酸菌雖然能夠產(chǎn)生乳酸，但在代謝過程中產(chǎn)生的雙乙酰等關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)含量較低，導(dǎo)致酸奶油的奶香和醇厚風(fēng)味不足。不同乳酸菌發(fā)酵劑之間的協(xié)同作用不理想，也會影響風(fēng)味物質(zhì)的合成。在混合發(fā)酵中，若不同乳酸菌之間不能相互促進代謝，反而產(chǎn)生競爭或抑制作用，就無法充分發(fā)揮各自的優(yōu)勢，導(dǎo)致風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量減少，無法滿足消費者對多樣化和濃郁風(fēng)味酸奶油的需求。在酸奶油發(fā)酵過程中，乳酸菌的益生功能難以充分發(fā)揮。酸奶油的發(fā)酵環(huán)境較為復(fù)雜，高脂肪含量和較低的pH值等因素可能會抑制乳酸菌的生長和代謝，使其益生功能受到影響。乳酸菌在酸奶油中的存活數(shù)量和活性在貯藏過程中下降較快，無法在人體腸道內(nèi)有效定植和發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道菌群、增強免疫力等益生作用。酸奶油在加工和貯藏過程中，可能會受到氧化、微生物污染等因素的影響，進一步降低乳酸菌的活性和益生功能。在酸奶油的加工過程中，熱處理、均質(zhì)等工藝可能會對乳酸菌造成損傷，使其細胞結(jié)構(gòu)破壞，代謝能力下降，從而影響益生功能的發(fā)揮。六、篩選出的乳酸菌在酸奶油中的應(yīng)用研究6.1酸奶油的制備6.1.1原料選擇與預(yù)處理選用脂肪含量為30%-40%的稀奶油作為主要原料，這種稀奶油富含乳脂肪，能夠為酸奶油提供豐富的口感和營養(yǎng)，其來源為優(yōu)質(zhì)新鮮牛奶，經(jīng)過離心分離等工藝獲得，具有良好的品質(zhì)和穩(wěn)定性。為了增加酸奶油的甜度和風(fēng)味，選用白砂糖作為甜味劑，其純度高，雜質(zhì)少，能夠均勻溶解在稀奶油中，為酸奶油增添適度的甜味。白砂糖的添加量一般為稀奶油質(zhì)量的5%-10%，具體添加量可根據(jù)產(chǎn)品的目標(biāo)甜度和風(fēng)味要求進行調(diào)整。為了提高酸奶油的穩(wěn)定性和質(zhì)地，選用羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）作為穩(wěn)定劑，它能夠與乳蛋白和乳脂肪相互作用，形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，防止乳清析出和脂肪上浮。其添加量為稀奶油質(zhì)量的0.3%-0.5%，在添加前，需將CMC-Na預(yù)先溶解在適量的溫水中，攪拌均勻，使其充分溶解，形成均勻的溶液后再加入稀奶油中。稀奶油在使用前需要進行預(yù)處理，以確保其質(zhì)量和安全性。采用巴氏殺菌法對稀奶油進行殺菌處理，將稀奶油加熱至85-90℃，保持15-30s，然后迅速冷卻至4℃以下，以殺滅稀奶油中的有害微生物，同時盡可能保留其營養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)。殺菌后的稀奶油進行均質(zhì)處理，使用高壓均質(zhì)機，在15-20MPa的壓力下，將稀奶油中的脂肪球破碎成細小的顆粒，使其均勻分散在乳液中，從而提高酸奶油的穩(wěn)定性和口感，使其質(zhì)地更加細膩均勻。白砂糖在添加前需進行篩選和溶解處理，去除其中的雜質(zhì)和異物，然后將其溶解在適量的熱水中，配制成濃度為50%-60%的糖漿，經(jīng)過過濾后備用，以確保白砂糖能夠均勻地分散在酸奶油中，避免出現(xiàn)顆粒狀沉淀。CMC-Na溶液在添加到稀奶油中時，需緩慢加入，并不斷攪拌，使其與稀奶油充分混合，避免出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象。6.1.2發(fā)酵工藝優(yōu)化接種量是影響酸奶油發(fā)酵的重要因素之一。在發(fā)酵過程中，接種量過少，乳酸菌的生長繁殖速度緩慢，發(fā)酵時間延長，可能導(dǎo)致酸奶油的酸度不足，風(fēng)味不佳；接種量過多，乳酸菌生長過快，可能會產(chǎn)生過多的代謝產(chǎn)物，影響酸奶油的口感和質(zhì)地。本研究將接種量設(shè)置為1%、2%、3%、4%、5%