傳代細(xì)胞培養(yǎng)一、目的要求掌握動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理。掌握動(dòng)物細(xì)胞傳代培養(yǎng)的技術(shù)方法。

二、基本原理

細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture):即是把來自機(jī)體的組織經(jīng)分散成為單個(gè)細(xì)胞，放在類似于體內(nèi)的體外環(huán)境中生存，使其不斷生長(zhǎng)、繁殖或傳代，借以觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖、衰老等生命現(xiàn)象。

可分為原代和傳代培養(yǎng)兩種方式。知識(shí)簡(jiǎn)介：貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞必須貼附于底物才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。大部分二倍體動(dòng)物細(xì)胞。

懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞不需要附著于底物而于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)從體內(nèi)取出細(xì)胞接種培養(yǎng)到第一次傳代的階段，叫原代培養(yǎng)。方法：無菌操作取出組織（或器官）酶消化處理

分散成單個(gè)細(xì)胞

培養(yǎng)使其不斷地生長(zhǎng)和繁殖。動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)過程圖

細(xì)胞系的生長(zhǎng)過程原代培養(yǎng)期傳代期衰退期為新鮮組織自體內(nèi)取出并在體外培養(yǎng)生長(zhǎng)至第一次傳代的時(shí)期。原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間之后，貼附型細(xì)胞即融合成片而逐漸鋪滿底物的表面，便應(yīng)將原代細(xì)胞分開接種至2個(gè)或更多的新的培養(yǎng)器皿中，即傳代，此即成細(xì)胞系。一般有限細(xì)胞系在此期的細(xì)胞開始時(shí)雖仍然存活，但增殖已很緩慢并逐漸完全停止，進(jìn)而細(xì)胞發(fā)生衰退死亡。傳代細(xì)胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞在瓶壁相互匯合后，需要將其分開至多個(gè)新的培養(yǎng)瓶，叫傳代。否則因?yàn)榻佑|抑制和密度抑制現(xiàn)象，引起細(xì)胞衰老，停止生長(zhǎng)甚至死亡。三、實(shí)驗(yàn)材料

用具器材：移液槍，槍頭、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、倒置顯微鏡、酒精燈、液體儲(chǔ)存瓶、試管架等。實(shí)驗(yàn)藥品：0.25％胰酶，D－Hanks，1640培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)材料1、培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件

細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要

細(xì)胞的生存環(huán)境溫度:37℃O2CO2:5%pH:7.2-7.4

滲透壓無毒無污染培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿和組織提取液優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子；③激素；④促貼附物質(zhì)⑤各種生長(zhǎng)因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分缺點(diǎn)：（1）來源受限。（2）成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。（3）易發(fā)生支原體污染

血清的成分合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。主要成分：氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定，成本低缺點(diǎn)：只能維持細(xì)胞不死，不能促進(jìn)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)。使用時(shí)還要添加一定比例的天然培養(yǎng)基。例如血清。一般說來，含5％小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死，但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加10％血清。

CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃,5％CO2

。使用時(shí)注意：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒

③箱內(nèi)加滅菌蒸餾水于槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。細(xì)胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、6孔板、96孔板常用玻璃器皿清洗在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)微生物產(chǎn)品附帶雜物上次細(xì)胞殘留物非營(yíng)養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小時(shí)）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50℃烘干消毒細(xì)胞培養(yǎng)的最大危險(xiǎn)是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌、真菌和病毒等微生物的污染常見原因：操作間或周圍空間的不潔培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底嚴(yán)格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染2、

293T細(xì)胞293細(xì)胞是轉(zhuǎn)染腺病毒E1A基因的人腎上皮細(xì)胞系，293T細(xì)胞由293細(xì)胞派生，同時(shí)表達(dá)SV40大T抗原，含有SV40復(fù)制起始點(diǎn)與啟動(dòng)子區(qū)的質(zhì)粒可以復(fù)制。

實(shí)驗(yàn)中所用溶液的配制：D-Hanks工作液試劑配方氯化鈉8g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）0.132g

氯化鉀0.4g

NaHCO30.35gD-葡萄糖1g0.1%酚紅液1ml三蒸水800ml，溶解后定容到1000ml。113℃滅菌15min。消化液：胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用D－h(huán)anks配置。常用的濃度是0.25％。PH7.4用濾器過濾除菌。培養(yǎng)基：1640培養(yǎng)基（含10%小牛血清）四、實(shí)驗(yàn)步驟1．生長(zhǎng)良好的原代細(xì)胞，一般經(jīng)過3-5天左右可形成致密單層。2．倒去原瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液。3．消化。向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入0.25%的2ml胰蛋白酶消化液浸泡細(xì)胞，2分鐘后倒去多余消化液，剩余的酶液繼續(xù)作用。(也可以直接消化作用6min左右）。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化變化，當(dāng)觀察到大部分細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞變成圓球形、細(xì)胞間隙增大現(xiàn)象時(shí)需終止消化。消化數(shù)分鐘細(xì)胞基本皺縮變圓，此時(shí)細(xì)胞可吹打下4.終止消化：加培養(yǎng)液3-4ml，即可終止消化E作用。用吸管有序地吹打瓶壁細(xì)胞（從瓶底到瓶口，從瓶的一側(cè)到另一側(cè)，注意吹打邊角細(xì)胞）。打勻后分裝。中止消化、吹散細(xì)胞4．分瓶擴(kuò)大培養(yǎng)。每瓶再補(bǔ)加2.0毫升培養(yǎng)液，混勻細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。37℃、5％CO2培養(yǎng)分瓶培養(yǎng)5．觀察。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，即可進(jìn)行觀察，觀察的重點(diǎn)如下：⑴首先要觀察培養(yǎng)細(xì)胞是否污染。主要觀察培養(yǎng)