TGF-β1介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在膀胱癌浸潤轉(zhuǎn)移中的機(jī)制及臨床意義探究一、引言1.1研究背景膀胱癌作為泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，2018年全球膀胱癌新發(fā)病例約55萬，死亡病例約20萬。在中國，膀胱癌的發(fā)病率也不容小覷，2015年其粗發(fā)病率為5.80/10萬，居惡性腫瘤發(fā)病譜第13位，且男性發(fā)病率明顯高于女性，約為女性的3.8倍。隨著人口老齡化的加劇以及環(huán)境因素的影響，膀胱癌的發(fā)病率呈上升趨勢。浸潤轉(zhuǎn)移是膀胱癌患者預(yù)后不良的主要原因。一旦腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移，患者的5年生存率會(huì)顯著降低。例如，肌層浸潤性膀胱癌行根治性膀胱切除術(shù)后，高達(dá)50%的患者會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，5年生存率僅為36%-54%。對于T3、T4和（或）N+MO膀胱癌高?；颊?，5年生存率更是低至25%-35%。上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)移（EMT）在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它是指在特定的生理和病理情況下，具有極性的上皮細(xì)胞向具有移行能力的間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，EMT使得原本沒有侵襲和遷移能力的上皮細(xì)胞獲得浸潤轉(zhuǎn)移的能力，最終轉(zhuǎn)移到其他組織或器官。眾多研究表明，在結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌及宮頸癌等多種腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中均觀察到EMT的發(fā)生，而且腫瘤組織中發(fā)生EMT的瘤細(xì)胞數(shù)目直接與病變組織的侵襲轉(zhuǎn)移程度有關(guān)。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）作為TGF-β家族的重要成員，在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲、間質(zhì)化等方面具有重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1在誘發(fā)上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵作用。在膀胱癌中，TGF-β1的表達(dá)水平常常升高，且與其浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。深入研究TGF-β1引發(fā)的上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)移與膀胱癌浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其機(jī)制，對于揭示膀胱癌的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)以及改善患者的預(yù)后具有重要的意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入揭示TGF-β1引發(fā)的上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)移在膀胱癌浸潤轉(zhuǎn)移過程中的作用及分子機(jī)制，具體研究目的如下：首先，精準(zhǔn)探究TGF-β1在膀胱癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況，并詳細(xì)分析其與腫瘤上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)移（EMT）之間的內(nèi)在聯(lián)系；其次，深入剖析TGF-β1調(diào)節(jié)膀胱癌EMT轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，明確相關(guān)信號通路及關(guān)鍵調(diào)控因子；最后，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，全面研究TGF-β1調(diào)控膀胱癌EMT轉(zhuǎn)移對腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的影響，包括對細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力的改變等。本研究具有重要的理論意義和臨床價(jià)值。從理論層面而言，進(jìn)一步豐富和完善了對膀胱癌浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制的認(rèn)識，拓展了TGF-β1在腫瘤發(fā)生發(fā)展領(lǐng)域的研究內(nèi)容，有助于深入理解腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在臨床應(yīng)用方面，研究成果有望為膀胱癌的治療提供全新的靶點(diǎn)和策略。通過對TGF-β1及其介導(dǎo)的EMT過程的干預(yù)，可能開發(fā)出更具針對性的靶向治療藥物，為提高膀胱癌患者的治療效果、改善預(yù)后帶來新的希望，從而降低膀胱癌的死亡率，減輕患者家庭和社會(huì)的負(fù)擔(dān)。二、膀胱癌浸潤轉(zhuǎn)移概述2.1膀胱癌的發(fā)病情況膀胱癌在全球范圍內(nèi)均有發(fā)病，是泌尿系統(tǒng)中較為常見的惡性腫瘤。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，膀胱癌新發(fā)病例數(shù)約57.3萬，在全部惡性腫瘤中排名第10位；死亡病例數(shù)約21.3萬，排名第13位。其發(fā)病率存在明顯的地域差異，北美和歐洲地區(qū)發(fā)病率相對較高，如北美地區(qū)膀胱癌發(fā)病率約為11.3/10萬，歐洲地區(qū)約為11.9/10萬；而亞洲地區(qū)發(fā)病率相對較低，約為3.6/10萬。在中國，膀胱癌同樣是威脅居民健康的重要疾病之一。根據(jù)2015年全國腫瘤登記數(shù)據(jù)，膀胱癌居中國惡性腫瘤發(fā)病譜第13位，粗發(fā)病率為5.80/10萬，中標(biāo)發(fā)病率為3.60/10萬，世標(biāo)發(fā)病率為3.57/10萬；粗死亡率為2.37/10萬，中標(biāo)死亡率為1.31/10萬，世標(biāo)死亡率為1.32/10萬。從發(fā)病趨勢來看，在1998-2007年期間，中國膀胱癌世標(biāo)發(fā)病率呈上升趨勢，年度變化百分比（APC）為2.58%（P<0.001）；但在2007-2015年，世標(biāo)發(fā)病率呈下降趨勢，APC為-3.82%（P<0.001），而世標(biāo)死亡率則呈持續(xù)下降趨勢，只是下降速度有所減緩，1998-2003年和2003-2015年的年平均下降速度分別為3.65%（P=0.002）和1.42%（P<0.001）。膀胱癌的發(fā)病在性別上存在顯著差異。無論是全球還是中國，男性膀胱癌的發(fā)病率和死亡率均明顯高于女性。在全球范圍內(nèi)，男性膀胱癌的發(fā)病率約為女性的4倍；在中國，2015年男性膀胱癌居惡性腫瘤發(fā)病譜第7位，發(fā)病率為女性的3.8倍，男性死亡率為女性的4.0倍。男性膀胱癌發(fā)病率高可能與多種因素有關(guān)，其中吸煙是重要的危險(xiǎn)因素之一，男性吸煙率通常高于女性，長期吸煙會(huì)增加膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。此外，男性可能更多地接觸某些職業(yè)性致癌物質(zhì)，如芳香胺類化合物，這也在一定程度上解釋了性別差異。從年齡分布來看，膀胱癌的年齡別發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)隨年齡增長而上升的趨勢。在中國，膀胱癌的年齡別發(fā)病率和死亡率分別在45歲和55歲組快速上升，在80-84歲組和85歲組達(dá)到高峰。這可能與老年人身體機(jī)能衰退、免疫功能下降，以及長期暴露于各種致癌因素的累積效應(yīng)有關(guān)。地域方面，中國城市地區(qū)膀胱癌發(fā)病率為農(nóng)村的1.4倍，西部地區(qū)發(fā)病率和中部地區(qū)相近，均低于東部地區(qū)，死亡率的地區(qū)分布特征與發(fā)病率相似。城市地區(qū)發(fā)病率較高可能與城市環(huán)境污染、生活節(jié)奏快、不良生活方式（如吸煙、酗酒等）更為普遍有關(guān)；而東部地區(qū)經(jīng)濟(jì)相對發(fā)達(dá)，工業(yè)活動(dòng)更為頻繁，職業(yè)暴露機(jī)會(huì)相對較多，可能是導(dǎo)致其發(fā)病率高于中西部地區(qū)的原因之一。2.2膀胱癌浸潤轉(zhuǎn)移的途徑和危害2.2.1浸潤轉(zhuǎn)移途徑直接浸潤是膀胱癌浸潤轉(zhuǎn)移的重要途徑之一。腫瘤細(xì)胞首先侵犯膀胱黏膜層，隨著病情進(jìn)展，突破基底膜，向膀胱肌層浸潤。當(dāng)腫瘤侵犯到膀胱肌層時(shí)，癌細(xì)胞可進(jìn)一步穿透肌層，侵犯膀胱周圍的脂肪組織、鄰近器官如前列腺、尿道、輸尿管、直腸等。例如，當(dāng)腫瘤侵犯前列腺時(shí)，可導(dǎo)致前列腺增大、排尿困難等癥狀；侵犯輸尿管則可能引起輸尿管梗阻，導(dǎo)致腎積水，影響腎功能。淋巴轉(zhuǎn)移是膀胱癌最主要的轉(zhuǎn)移途徑。膀胱癌多通過淋巴循環(huán)轉(zhuǎn)移至盆腔淋巴結(jié)，常見的轉(zhuǎn)移部位包括閉孔淋巴結(jié)、髂內(nèi)淋巴結(jié)、髂外淋巴結(jié)、髂總淋巴結(jié)區(qū)等。腫瘤細(xì)胞侵入淋巴管后，隨淋巴液流動(dòng)，在淋巴結(jié)內(nèi)停留、增殖，導(dǎo)致淋巴結(jié)腫大。浸潤淺肌層者大約有50%的淋巴管內(nèi)有癌細(xì)胞，而浸潤深肌層時(shí)幾乎全部淋巴管內(nèi)都有癌細(xì)胞。當(dāng)腫瘤浸潤至膀胱周圍時(shí)，大多數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。研究表明，盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響膀胱癌患者預(yù)后的重要因素，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者生存率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。血行轉(zhuǎn)移通常發(fā)生在膀胱癌的晚期階段。此時(shí)，腫瘤細(xì)胞侵入血管，隨血液循環(huán)播散至遠(yuǎn)處器官，如肝、肺、骨、腦等。血行轉(zhuǎn)移至肝臟時(shí)，可導(dǎo)致肝功能異常，出現(xiàn)黃疸、腹水等癥狀；轉(zhuǎn)移至肺部可引起咳嗽、咯血、胸痛等表現(xiàn)；轉(zhuǎn)移至骨骼可導(dǎo)致骨痛、病理性骨折等。例如，有研究對100例晚期膀胱癌患者進(jìn)行隨訪，發(fā)現(xiàn)其中30%的患者出現(xiàn)了血行轉(zhuǎn)移，肝轉(zhuǎn)移占15%，肺轉(zhuǎn)移占10%，骨轉(zhuǎn)移占5%，這些患者的生存時(shí)間明顯縮短。種植轉(zhuǎn)移相對較少見，主要見于腹部切口、尿路上皮、切除的前列腺窩、損傷的尿道口等部位。手術(shù)過程中，腫瘤細(xì)胞可能脫落并種植在這些部位，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。如在膀胱癌手術(shù)切除后，若手術(shù)操作不當(dāng)，腫瘤細(xì)胞可能種植在切口處，引起切口部位的腫瘤復(fù)發(fā)。2.2.2對患者預(yù)后的影響膀胱癌浸潤轉(zhuǎn)移極大地增加了治療難度。對于發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移的膀胱癌患者，單純的手術(shù)切除往往無法徹底清除腫瘤細(xì)胞。例如，當(dāng)腫瘤侵犯周圍組織和器官時(shí)，手術(shù)切除范圍受限，難以達(dá)到根治的目的。此時(shí)，常需要聯(lián)合化療、放療、免疫治療等多種治療手段，但這些綜合治療方案也面臨諸多挑戰(zhàn)?；熕幬镌跉[瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對正常細(xì)胞造成損害，導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等不良反應(yīng)，使患者難以耐受化療。放療則可能引起放射性膀胱炎、直腸炎等并發(fā)癥，影響患者的生活質(zhì)量。而且，由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和耐藥性，部分患者對放化療不敏感，治療效果不佳。浸潤轉(zhuǎn)移還會(huì)導(dǎo)致患者生存率顯著降低。大量臨床研究表明，膀胱癌患者一旦發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移，其5年生存率會(huì)大幅下降。對于肌層浸潤性膀胱癌患者，行根治性膀胱切除術(shù)后，仍有高達(dá)50%的患者會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，5年生存率僅為36%-54%。對于T3、T4和（或）N+MO的膀胱癌高?；颊?，5年生存率更是低至25%-35%。而對于發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的膀胱癌患者，如血行轉(zhuǎn)移至肝、肺等重要器官，中位生存期往往較短，生存質(zhì)量嚴(yán)重下降。這不僅給患者帶來巨大的身心痛苦，也給患者家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)?？刂瓢螂装┑慕欈D(zhuǎn)移對于改善患者預(yù)后至關(guān)重要。通過深入研究浸潤轉(zhuǎn)移的機(jī)制，尋找有效的干預(yù)靶點(diǎn)，可以開發(fā)出更具針對性的治療方法。例如，針對TGF-β1引發(fā)的上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究，有望通過阻斷TGF-β1信號通路或相關(guān)關(guān)鍵分子，抑制腫瘤細(xì)胞的EMT過程，從而減少腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。此外，早期診斷和治療也是提高患者生存率的關(guān)鍵。加強(qiáng)對高危人群的篩查，如長期吸煙、接觸化學(xué)物質(zhì)的人群，通過定期進(jìn)行尿常規(guī)、膀胱鏡檢查等手段，早期發(fā)現(xiàn)膀胱癌，及時(shí)采取有效的治療措施，能夠顯著改善患者的預(yù)后。三、上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)移（EMT）與腫瘤3.1EMT的概念和過程上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)移（EMT）是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，在這個(gè)過程中，上皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列顯著的改變，從而轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞。從形態(tài)學(xué)角度來看，上皮細(xì)胞原本呈現(xiàn)出典型的立方狀或柱狀，細(xì)胞間緊密連接，形成具有極性的上皮組織。在EMT過程中，上皮細(xì)胞逐漸失去這種典型形態(tài)，轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)長的紡錘形或纖維狀，細(xì)胞間連接減少，極性喪失，組織結(jié)構(gòu)變得松散。例如，在胚胎發(fā)育過程中，原腸胚形成階段的細(xì)胞就會(huì)發(fā)生EMT，原本緊密排列的上皮細(xì)胞通過形態(tài)改變，獲得遷移能力，從而完成胚胎的形態(tài)構(gòu)建。在分子標(biāo)志物方面，EMT過程伴隨著多種分子的變化。上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白E-鈣粘蛋白（E-cadherin）的表達(dá)顯著下調(diào)，它是維持上皮細(xì)胞間緊密連接的關(guān)鍵分子，其表達(dá)減少會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降。而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如波形蛋白（Vimentin）、N-鈣粘蛋白（N-cadherin）等表達(dá)則明顯上調(diào)。以乳腺癌為例，在腫瘤發(fā)生EMT時(shí)，癌細(xì)胞中的E-cadherin表達(dá)降低，使得癌細(xì)胞能夠從原發(fā)灶脫離，而Vimentin和N-cadherin的增加則賦予癌細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。此外，一些轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Twist、ZEB等在EMT過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，它們能夠結(jié)合到E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)EMT的發(fā)生。從功能上看，經(jīng)歷EMT的細(xì)胞獲得了多種新的能力。細(xì)胞的遷移和侵襲能力大幅增強(qiáng)，這使得上皮細(xì)胞能夠突破基底膜，侵入周圍組織。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，癌細(xì)胞通過EMT獲得遷移能力，從而能夠穿過細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)入血管或淋巴管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。EMT還賦予細(xì)胞更強(qiáng)的抗凋亡能力，使細(xì)胞能夠在惡劣的環(huán)境中存活。一些癌細(xì)胞在發(fā)生EMT后，對化療藥物的耐受性增強(qiáng)，導(dǎo)致治療效果不佳。EMT在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。在原腸胚形成時(shí)，胚胎上皮細(xì)胞通過EMT形成中胚層和內(nèi)胚層，為后續(xù)器官發(fā)育奠定基礎(chǔ)。神經(jīng)嵴細(xì)胞的形成也依賴于EMT，這些細(xì)胞從神經(jīng)管上皮脫離后，遷移到不同部位，分化形成多種組織和器官，如神經(jīng)系統(tǒng)、面部骨骼和軟骨等。在器官形成過程中，如心臟、腎臟、肺等器官的發(fā)育，EMT參與細(xì)胞的遷移和分化，促進(jìn)器官的正常形態(tài)發(fā)生和功能建立。在組織修復(fù)過程中，EMT同樣扮演著重要角色。當(dāng)組織受到損傷時(shí)，上皮細(xì)胞通過EMT轉(zhuǎn)化為間質(zhì)樣細(xì)胞，這些細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力，能夠遷移到損傷部位，參與傷口愈合和組織重構(gòu)。在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中，表皮角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生EMT，遷移到傷口處，促進(jìn)上皮再生。在肝臟損傷修復(fù)過程中，肝細(xì)胞也可能發(fā)生EMT，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，參與肝纖維化的形成，雖然過度的EMT可能導(dǎo)致病理性纖維化，但在一定程度上，它是組織修復(fù)的正常生理反應(yīng)。在腫瘤領(lǐng)域，EMT與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，從而能夠突破腫瘤組織的基底膜，侵入周圍組織和血管，這是腫瘤轉(zhuǎn)移的起始步驟。在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中，均觀察到EMT現(xiàn)象。腫瘤細(xì)胞通過EMT逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，增加對化療和放療的抵抗性，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后不良。EMT還與腫瘤干細(xì)胞的產(chǎn)生和維持有關(guān)，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞可能獲得干細(xì)胞特性，具有更強(qiáng)的自我更新和分化能力，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。3.2EMT在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制3.2.1增加細(xì)胞遷移和侵襲能力在EMT過程中，細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架發(fā)生顯著改變，這是細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要基礎(chǔ)。上皮細(xì)胞原本具有緊密的細(xì)胞間連接和穩(wěn)定的極性，呈現(xiàn)立方狀或柱狀形態(tài)。當(dāng)發(fā)生EMT時(shí)，細(xì)胞的緊密連接蛋白如E-鈣粘蛋白表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降。細(xì)胞骨架也從角蛋白絲轉(zhuǎn)變?yōu)椴ㄐ蔚鞍捉z，細(xì)胞形態(tài)逐漸從上皮樣的立方狀轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣的細(xì)長紡錘形。這種形態(tài)和細(xì)胞骨架的改變使得細(xì)胞能夠擺脫原有的細(xì)胞間束縛，獲得更強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力。細(xì)胞表面分子的變化也為細(xì)胞遷移和侵襲提供了便利。在EMT過程中，細(xì)胞表面表達(dá)一些新的分子，如整合素、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等。整合素是一類細(xì)胞表面受體，能夠介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附。在腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，整合素的表達(dá)上調(diào)，使腫瘤細(xì)胞能夠更緊密地黏附于細(xì)胞外基質(zhì)，為其遷移提供支撐。MMPs則能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種成分，如膠原蛋白、纖連蛋白等。腫瘤細(xì)胞通過分泌MMPs，破壞細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，為自身的遷移和侵襲開辟通道。例如，MMP-2和MMP-9能夠降解基底膜中的主要成分Ⅳ型膠原蛋白，使腫瘤細(xì)胞能夠突破基底膜，侵入周圍組織。腫瘤細(xì)胞通過EMT獲得遷移和侵襲能力后，能夠突破基底膜，向周圍組織浸潤?；啄な且粚游挥谏掀ぜ?xì)胞下方的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，由膠原蛋白、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等成分組成，它起到分隔上皮組織和間質(zhì)組織的作用，是腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移的重要屏障。發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞通過分泌MMPs等蛋白酶降解基底膜成分，同時(shí)利用自身的遷移能力，穿過被破壞的基底膜，進(jìn)入周圍間質(zhì)組織。一旦進(jìn)入間質(zhì)組織，腫瘤細(xì)胞可以沿著細(xì)胞外基質(zhì)中的纖維成分或借助周圍組織中的趨化因子梯度，繼續(xù)向遠(yuǎn)處遷移，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。研究表明，在乳腺癌中，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞能夠通過降解基底膜，侵入乳腺周圍的脂肪組織和淋巴管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。3.2.2促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞特性的獲得腫瘤干細(xì)胞（CSCs）是腫瘤組織中一小部分具有自我更新、多向分化和腫瘤起始能力的細(xì)胞群體。它們在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。越來越多的研究表明，EMT與腫瘤干細(xì)胞特性的獲得密切相關(guān)。在EMT過程中，細(xì)胞的基因表達(dá)譜發(fā)生顯著改變，一些與腫瘤干細(xì)胞特性相關(guān)的基因被激活。例如，轉(zhuǎn)錄因子Snail、Twist、ZEB等在EMT過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，它們不僅能夠誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，還能激活與腫瘤干細(xì)胞相關(guān)的基因表達(dá)。Snail可以上調(diào)Nanog、Oct4等干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞獲得干細(xì)胞特性。Nanog和Oct4是維持干細(xì)胞自我更新和多能性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它們的表達(dá)上調(diào)賦予腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的自我更新和分化能力。在結(jié)直腸癌中，研究發(fā)現(xiàn)發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞中Nanog和Oct4的表達(dá)明顯升高，這些細(xì)胞具有更強(qiáng)的成瘤能力和耐藥性，表現(xiàn)出腫瘤干細(xì)胞的特征。EMT還可以通過改變細(xì)胞的代謝途徑來促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞特性的獲得。腫瘤干細(xì)胞具有獨(dú)特的代謝方式，它們更依賴糖酵解途徑來產(chǎn)生能量，這種代謝方式被稱為“Warburg效應(yīng)”。在EMT過程中，腫瘤細(xì)胞的代謝途徑逐漸向糖酵解方向轉(zhuǎn)變。例如，EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（如GLUT1）和糖酵解關(guān)鍵酶（如己糖激酶、磷酸果糖激酶等）的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞能夠攝取更多的葡萄糖，并通過糖酵解途徑快速產(chǎn)生能量。這種代謝重編程不僅為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供能量，還與腫瘤干細(xì)胞特性的維持有關(guān)。研究表明，抑制腫瘤細(xì)胞的糖酵解途徑可以降低其腫瘤干細(xì)胞特性，減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞獲得腫瘤干細(xì)胞特性后，會(huì)增加腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。腫瘤干細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我更新能力，能夠不斷產(chǎn)生新的腫瘤細(xì)胞，即使在腫瘤治療后，殘留的腫瘤干細(xì)胞也可以重新增殖，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。腫瘤干細(xì)胞還具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，它們更容易從原發(fā)腫瘤部位脫離，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，從而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。而且，腫瘤干細(xì)胞對化療藥物和放療具有更強(qiáng)的抵抗性，這使得腫瘤治療更加困難。例如，在肺癌中，腫瘤干細(xì)胞能夠抵抗化療藥物的殺傷作用，導(dǎo)致肺癌患者在化療后容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。3.2.3參與腫瘤微環(huán)境的重塑腫瘤微環(huán)境是指腫瘤細(xì)胞所處的周圍環(huán)境，包括細(xì)胞外基質(zhì)、免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種成分。腫瘤微環(huán)境對腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為具有重要影響。EMT在腫瘤微環(huán)境的重塑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。EMT可以促進(jìn)腫瘤血管生成。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)，血管生成是腫瘤獲取營養(yǎng)和氧氣的重要途徑。發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞能夠分泌多種血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）等。VEGF是一種強(qiáng)效的血管生成因子，它可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。在乳腺癌中，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞高表達(dá)VEGF，能夠誘導(dǎo)腫瘤組織內(nèi)新生血管的形成，為腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移提供有利條件。EMT還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。免疫逃逸是腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)監(jiān)視和攻擊的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用，而EMT則參與其中。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，其表面分子表達(dá)發(fā)生改變，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)難以識別和攻擊腫瘤細(xì)胞。EMT過程中，腫瘤細(xì)胞會(huì)下調(diào)主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子（MHC-Ⅰ）的表達(dá)，MHC-Ⅰ分子是免疫系統(tǒng)識別腫瘤細(xì)胞的重要標(biāo)志，其表達(dá)下調(diào)使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避CD8+T細(xì)胞的殺傷。發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞還會(huì)分泌免疫抑制因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等。TGF-β可以抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的活性，IL-10則能夠抑制巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的功能，從而營造一個(gè)免疫抑制的微環(huán)境，幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的攻擊。在肝癌中，研究發(fā)現(xiàn)發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞周圍存在大量的免疫抑制細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和髓源性抑制細(xì)胞（MDSC），這些細(xì)胞的增多導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境的免疫抑制增強(qiáng)，促進(jìn)了腫瘤的免疫逃逸。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分，它也受到EMT的影響。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，部分上皮細(xì)胞通過EMT轉(zhuǎn)化為CAFs。這些由EMT產(chǎn)生的CAFs具有更強(qiáng)的促腫瘤活性，它們能夠分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，如血小板衍生生長因子（PDGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）等，這些因子可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。CAFs還可以通過分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，改變腫瘤微環(huán)境的物理性質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移提供支持。在胰腺癌中，CAFs分泌的大量膠原蛋白和纖連蛋白，使得腫瘤組織的硬度增加，有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。四、TGF-β1信號通路與EMT4.1TGF-β1的結(jié)構(gòu)和功能轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）超家族的重要成員之一。在哺乳動(dòng)物中，TGF-β超家族包含多種細(xì)胞因子，其中TGF-β有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3等多個(gè)亞型。TGF-β1由兩個(gè)結(jié)構(gòu)相同或相近、分子量約為12.5kDa的亞單位通過二硫鍵連接形成雙體。人TGF-β1的單體由112個(gè)氨基酸殘基組成，其前體分子（pre-pro-TGF-β）含有400個(gè)氨基酸殘基。在合成過程中，pre-pro-TGF-β的N端信號肽在分泌前被裂解掉，形成非活性狀態(tài)的多肽鏈前體（pro-TGF-β）。隨后，通過改變離子強(qiáng)度、酸化或蛋白酶水解等方式切除N端部分氨基酸殘基，剩余的羧基端部分才形成具有活性的TGF-β1。TGF-β1具有廣泛的生物學(xué)功能，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移、免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)等多種生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在細(xì)胞增殖方面，TGF-β1對不同類型的細(xì)胞具有不同的作用。對于大多數(shù)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞，TGF-β1表現(xiàn)出抑制增殖的作用。研究表明，TGF-β1可以通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，使細(xì)胞周期停滯在G1期，從而抑制上皮細(xì)胞的增殖。而對于成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等間充質(zhì)來源的細(xì)胞，TGF-β1則可以促進(jìn)其增殖。在傷口愈合過程中，TGF-β1能夠刺激成纖維細(xì)胞的增殖，促進(jìn)膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的合成，有助于傷口的修復(fù)。在細(xì)胞分化過程中，TGF-β1同樣扮演著重要角色。它可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞類型的分化，如在胚胎發(fā)育過程中，TGF-β1參與了中胚層細(xì)胞向肌肉、骨骼等組織細(xì)胞的分化。在造血系統(tǒng)中，TGF-β1能夠調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的分化方向，影響血細(xì)胞的生成。TGF-β1還可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化，這在組織纖維化過程中具有重要意義。在肝纖維化過程中，肝星狀細(xì)胞在TGF-β1的作用下分化為肌成纖維細(xì)胞，大量合成細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肝臟纖維化。細(xì)胞凋亡也是受TGF-β1調(diào)控的重要過程。TGF-β1可以誘導(dǎo)一些細(xì)胞發(fā)生凋亡，如在免疫系統(tǒng)中，TGF-β1能夠誘導(dǎo)活化的T淋巴細(xì)胞凋亡，從而維持免疫平衡。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以通過激活caspase家族蛋白酶，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。然而，在某些情況下，TGF-β1也可以抑制細(xì)胞凋亡，這取決于細(xì)胞的類型和微環(huán)境。在腫瘤細(xì)胞中，TGF-β1可能通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤的生長。TGF-β1對細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響也十分顯著。在生理?xiàng)l件下，TGF-β1可以促進(jìn)細(xì)胞的遷移，如在胚胎發(fā)育過程中，它可以引導(dǎo)神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移，使其到達(dá)正確的位置分化形成各種組織。但在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，TGF-β1卻能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，這與它誘導(dǎo)上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)移（EMT）密切相關(guān)。研究表明，TGF-β1可以通過上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如波形蛋白、N-鈣粘蛋白等的表達(dá)，下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。4.2TGF-β1信號通路的激活與傳導(dǎo)TGF-β1信號通路的激活起始于TGF-β1與細(xì)胞表面受體的特異性結(jié)合。TGF-β1的受體主要包括TGF-βI型受體（TGF-βRI或ALK5）和TGF-βII型受體（TGF-βRII），它們均為跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體。TGF-β1首先與TGF-βRII結(jié)合，TGF-βRII作為高親和力的TGF-β1受體，能夠識別并結(jié)合TGF-β1。結(jié)合后，TGF-βRII招募TGF-βRI，并將其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域磷酸化，形成具有活性的異四聚體復(fù)合物。這種異四聚體復(fù)合物的形成是TGF-β1信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵步驟，它激活了下游信號分子，啟動(dòng)了一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。經(jīng)典的Smad依賴通路是TGF-β1信號傳導(dǎo)的核心部分。在哺乳動(dòng)物中，存在8種Smad蛋白，可分為三類：受體相關(guān)Smad（R-Smad），包括Smad2和Smad3；協(xié)同Smad（co-Smad），即Smad4；以及抑制性Smad（I-Smad），如Smad6和Smad7。當(dāng)TGF-β1與受體結(jié)合并激活受體復(fù)合物后，R-Smad（Smad2和Smad3）被受體復(fù)合物磷酸化。磷酸化后的Smad2和Smad3與受體分離，然后與Smad4形成異源三聚體結(jié)構(gòu)。這個(gè)異源三聚體復(fù)合物隨后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞核中，它們與DNA轉(zhuǎn)錄因子和輔因子結(jié)合，調(diào)控?cái)?shù)百個(gè)靶基因的表達(dá)。例如，在乳腺癌細(xì)胞中，TGF-β1通過Smad依賴通路激活Snail基因的表達(dá)，Snail作為一種轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合到E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)移。Smad7則可以通過與R-Smad競爭與TGF-β受體復(fù)合物的結(jié)合，降低R-Smad的磷酸化和活化，起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用。除了經(jīng)典的Smad依賴通路，TGF-β1還可以通過非Smad依賴通路進(jìn)行信號傳導(dǎo)。其中，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路是重要的非Smad依賴通路之一。TGF-β1與受體結(jié)合后，能夠激活Ras-Raf-MEK-ERK信號級聯(lián)反應(yīng)。在這個(gè)過程中，Ras蛋白被激活，進(jìn)而激活Raf激酶，Raf激酶磷酸化并激活MEK激酶，MEK激酶再磷酸化并激活ERK激酶。激活后的ERK激酶可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而影響基因表達(dá)。在肝癌細(xì)胞中，TGF-β1通過激活MAPK通路，上調(diào)MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路也是TGF-β1介導(dǎo)的非Smad依賴通路。TGF-β1可以激活PI3K，PI3K將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3招募Akt到細(xì)胞膜上，并在磷酸肌醇依賴性激酶1（PDK1）和mTORC2的作用下，使Akt磷酸化而激活。激活的Akt可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、存活、遷移等。研究表明，在肺癌細(xì)胞中，TGF-β1通過PI3K/Akt通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和遷移，并且該通路的激活與肺癌細(xì)胞的耐藥性相關(guān)。TGF-β1信號通路的激活與傳導(dǎo)是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過程，經(jīng)典的Smad依賴通路和非Smad依賴通路相互協(xié)作、相互調(diào)節(jié)，共同調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移、侵襲等生物學(xué)行為，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。4.3TGF-β1誘導(dǎo)EMT的分子機(jī)制4.3.1調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)TGF-β1主要通過經(jīng)典的Smad依賴信號通路和非Smad依賴信號通路來調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。在Smad依賴信號通路中，TGF-β1與細(xì)胞表面的TGF-βRI和TGF-βRII結(jié)合，使TGF-βRI磷酸化并激活Smad2和Smad3。磷酸化的Smad2/3與Smad4形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，直接結(jié)合到Snail、Slug、Twist等轉(zhuǎn)錄因子的基因啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。研究表明，在乳腺癌細(xì)胞中，TGF-β1刺激后，Smad2/3與Snail基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，導(dǎo)致Snail基因表達(dá)上調(diào)。非Smad依賴信號通路中，TGF-β1可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路。在這條通路中，TGF-β1通過激活Ras蛋白，依次激活Raf、MEK和ERK等激酶。激活的ERK可以進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化并激活轉(zhuǎn)錄因子如Elk-1、AP-1等，這些轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到Snail、Twist等基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其表達(dá)。在肝癌細(xì)胞中，TGF-β1通過激活MAPK通路，使ERK磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)Twist基因的表達(dá)。TGF-β1還可以通過激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。激活的Akt可以磷酸化并抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進(jìn)Snail等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，TGF-β1通過PI3K/Akt通路，使Akt磷酸化GSK-3β，從而上調(diào)Snail的表達(dá)。Snail、Slug、Twist等轉(zhuǎn)錄因子在TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們能夠抑制上皮標(biāo)志物的表達(dá)，促進(jìn)間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)。以Snail為例，它可以直接結(jié)合到E-鈣粘蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)域的E-box元件上，招募組蛋白去乙?；福℉DAC）等轉(zhuǎn)錄抑制因子，抑制E-鈣粘蛋白的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞中，Snail過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致E-鈣粘蛋白表達(dá)顯著下降，細(xì)胞間黏附力降低，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，呈現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞的特征。同時(shí)，Snail還可以通過激活波形蛋白、N-鈣粘蛋白等間質(zhì)標(biāo)志物基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞表型的獲得。在乳腺癌細(xì)胞中，Snail能夠上調(diào)波形蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Slug與Snail結(jié)構(gòu)和功能相似，它也可以通過結(jié)合E-鈣粘蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)域的E-box元件，抑制其表達(dá)。在胰腺癌中，Slug的高表達(dá)與E-鈣粘蛋白的低表達(dá)密切相關(guān)，且Slug過表達(dá)會(huì)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的EMT和侵襲轉(zhuǎn)移。Twist同樣能夠抑制E-鈣粘蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)。在胃癌細(xì)胞中，Twist通過抑制E-鈣粘蛋白，上調(diào)N-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。4.3.2影響miRNA的表達(dá)TGF-β1對miRNA的表達(dá)具有重要的調(diào)控作用，這種調(diào)控作用主要通過其信號通路來實(shí)現(xiàn)。在經(jīng)典的Smad依賴信號通路中，TGF-β1與受體結(jié)合后激活Smad蛋白，Smad蛋白可以直接與miRNA基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，Smad3可以結(jié)合到miR-200家族基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄。在乳腺癌細(xì)胞中，TGF-β1刺激后，Smad3與miR-200家族基因啟動(dòng)子結(jié)合增強(qiáng)，導(dǎo)致miR-200家族成員的表達(dá)下降。TGF-β1還可以通過非Smad依賴信號通路影響miRNA的表達(dá)。例如，通過激活MAPK通路，影響一些轉(zhuǎn)錄因子的活性，進(jìn)而調(diào)控miRNA的轉(zhuǎn)錄。在肝癌細(xì)胞中，TGF-β1激活MAPK通路后，上調(diào)了某些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到miR-155基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其表達(dá)。miR-200家族在TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程中扮演著關(guān)鍵角色，它主要通過靶向作用參與這一過程。miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429等成員，它們的靶基因主要是ZEB1和ZEB2。ZEB1和ZEB2是一類轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合到E-鈣粘蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其表達(dá)，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生。miR-200家族成員可以通過與ZEB1和ZEB2mRNA的3'-UTR區(qū)域互補(bǔ)配對，抑制其翻譯過程，或者促使其mRNA降解。在肺癌細(xì)胞中，過表達(dá)miR-200家族成員會(huì)導(dǎo)致ZEB1和ZEB2蛋白表達(dá)下降，E-鈣粘蛋白表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞的EMT過程受到抑制，遷移和侵襲能力降低。相反，抑制miR-200家族的表達(dá)會(huì)使ZEB1和ZEB2蛋白表達(dá)升高，促進(jìn)EMT的發(fā)生。TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程中，miR-200家族與TGF-β1信號通路之間存在復(fù)雜的相互作用。TGF-β1通過下調(diào)miR-200家族的表達(dá)，解除對ZEB1和ZEB2的抑制，從而促進(jìn)EMT。而miR-200家族也可以通過抑制ZEB1和ZEB2的表達(dá)，反饋調(diào)節(jié)TGF-β1信號通路。在乳腺癌細(xì)胞中，TGF-β1刺激導(dǎo)致miR-200家族表達(dá)下降，ZEB1和ZEB2表達(dá)升高，細(xì)胞發(fā)生EMT；而當(dāng)外源性過表達(dá)miR-200家族時(shí)，ZEB1和ZEB2表達(dá)受到抑制，TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程被逆轉(zhuǎn)，同時(shí)TGF-β1信號通路中的一些關(guān)鍵分子的表達(dá)也受到影響。這種相互作用形成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，精細(xì)地調(diào)節(jié)著細(xì)胞的EMT過程。4.3.3其他相關(guān)分子機(jī)制Rho家族GTP酶在TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程中發(fā)揮著重要作用。Rho家族GTP酶包括RhoA、Rac1和Cdc42等成員，它們在細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞遷移和侵襲等過程中起關(guān)鍵作用。TGF-β1可以通過激活Rho家族GTP酶來調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化，從而促進(jìn)EMT。研究表明，在乳腺癌細(xì)胞中，TGF-β1刺激后，RhoA被激活，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白纖維的重組，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，從上皮樣形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣形態(tài)。RhoA還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)和功能，影響細(xì)胞間的黏附力，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。在肺癌細(xì)胞中，Rac1的激活可以促進(jìn)絲狀偽足和片狀偽足的形成，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力，而TGF-β1能夠上調(diào)Rac1的表達(dá)和活性，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的EMT和轉(zhuǎn)移。PI3K/Akt通路也是TGF-β1誘導(dǎo)EMT過程中涉及的重要信號通路。TGF-β1可以激活PI3K，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3招募Akt到細(xì)胞膜上，并在磷酸肌醇依賴性激酶1（PDK1）和mTORC2的作用下，使Akt磷酸化而激活。激活的Akt可以通過多種途徑參與EMT過程。一方面，Akt可以磷酸化并抑制GSK-3β的活性，導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進(jìn)Snail等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)EMT。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，TGF-β1通過PI3K/Akt通路激活A(yù)kt，使Akt磷酸化GSK-3β，上調(diào)Snail的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT。另一方面，Akt還可以調(diào)節(jié)其他與EMT相關(guān)的分子，如MMPs等。在肝癌細(xì)胞中，激活的Akt可以上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生。TGF-β1誘導(dǎo)EMT過程中，這些分子和信號通路之間相互作用，形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。例如，Rho家族GTP酶可以與PI3K/Akt通路相互作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移和侵襲。在乳腺癌細(xì)胞中，RhoA的激活可以促進(jìn)PI3K的活性，進(jìn)而激活A(yù)kt，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。PI3K/Akt通路也可以通過調(diào)節(jié)Rho家族GTP酶的上游調(diào)節(jié)因子，影響Rho家族GTP酶的活性。這種相互作用使得TGF-β1能夠更有效地誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移。五、TGF-β1引發(fā)的EMT與膀胱癌浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究5.1TGF-β1在膀胱癌組織中的表達(dá)情況5.1.1臨床樣本檢測結(jié)果為深入探究TGF-β1在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用，眾多研究采用免疫組化、Westernblot等技術(shù)對膀胱癌組織和正常膀胱組織中TGF-β1的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。在一項(xiàng)針對48例膀胱癌患者的研究中，運(yùn)用免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)，TGF-β1表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膀胱癌組織中的表達(dá)量顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膀胱癌組織。通過對16例膀胱癌術(shù)后組織進(jìn)行Westernblot檢測，也得到了類似結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)了TGF-β1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌組織中高表達(dá)。另有研究選取了40例膀胱移行細(xì)胞癌和10例正常膀胱粘膜組織，采用免疫組化S-P法檢測TGF-β1的表達(dá)。結(jié)果顯示，TGF-β1在膀胱癌IV級中的表達(dá)水平明顯高于膀胱癌I、II、III級及正常膀胱粘膜組織。還有研究利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測膀胱癌患者血清、尿液中TGF-β1濃度，發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者血清TGF-β1水平顯著高于正常對照，且隨病理分期、分級提高和腫瘤進(jìn)展，膀胱癌患者血清TGF-β1水平呈下降趨勢；而患者尿液TGF-β1濃度顯著低于正常對照，不同病理分期、分級之間差異無顯著性。通過分析TGF-β1表達(dá)與膀胱癌患者臨床病理特征的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，TGF-β1的表達(dá)與膀胱癌臨床分期、分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間具有顯著相關(guān)性。在臨床分期方面，隨著腫瘤分期的升高，TGF-β1的表達(dá)水平也逐漸升高，提示TGF-β1可能參與了膀胱癌的進(jìn)展過程。在分級方面，高級別膀胱癌組織中TGF-β1的表達(dá)明顯高于低級別膀胱癌組織，表明TGF-β1的高表達(dá)與腫瘤的惡性程度相關(guān)。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌組織中TGF-β1表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，說明TGF-β1可能在膀胱癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。5.1.2與膀胱癌分期、分級的關(guān)聯(lián)大量研究表明，TGF-β1表達(dá)水平與膀胱癌分期、分級密切相關(guān)。在膀胱癌分期方面，TGF-β1在浸潤性膀胱癌（T2-T4期）中的表達(dá)通常高于表淺性膀胱癌（Ta-T1期）。一項(xiàng)研究對74例膀胱移行細(xì)胞癌患者進(jìn)行分析，按TNM及UICC分期，將患者分為Ta-T1期、T2期、T3-T4期。通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，TGF-β1的陽性表達(dá)率隨著分期的升高而增加，T3-T4期患者的TGF-β1陽性表達(dá)率明顯高于Ta-T1期和T2期患者。這表明TGF-β1的高表達(dá)與膀胱癌的浸潤深度相關(guān)，可能促進(jìn)了腫瘤從表淺向浸潤性發(fā)展。在膀胱癌分級方面，TGF-β1在高級別膀胱癌（G3）中的表達(dá)顯著高于低級別膀胱癌（G1、G2）。如前文所述，在對40例膀胱移行細(xì)胞癌的研究中，TGF-β1在膀胱癌IV級中的表達(dá)水平明顯高于I、II、III級。這說明TGF-β1的表達(dá)與膀胱癌的分化程度密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞分化程度越低，TGF-β1的表達(dá)越高，提示TGF-β1可能參與了膀胱癌的惡性轉(zhuǎn)化過程，其高表達(dá)可能促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，導(dǎo)致腫瘤分級升高。TGF-β1高表達(dá)與腫瘤的晚期階段和高級別密切相關(guān)。隨著腫瘤分期進(jìn)入晚期，腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，而TGF-β1的高表達(dá)可能為腫瘤細(xì)胞提供了更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞突破基底膜，向周圍組織浸潤，并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在高級別膀胱癌中，TGF-β1的高表達(dá)可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)行為，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖，使其更具侵襲性和轉(zhuǎn)移性，從而導(dǎo)致腫瘤級別升高。TGF-β1在膀胱癌組織中的高表達(dá)與腫瘤的分期、分級以及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有望成為評估膀胱癌惡性程度和預(yù)后的重要指標(biāo)，為膀胱癌的臨床診斷和治療提供新的思路和靶點(diǎn)。5.2EMT相關(guān)分子標(biāo)志物在膀胱癌中的表達(dá)及意義5.2.1E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等的表達(dá)變化為了深入了解上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)移（EMT）在膀胱癌浸潤轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，眾多研究對膀胱癌組織中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等EMT標(biāo)志物的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。通過免疫組化、Westernblot等技術(shù)手段，揭示了這些標(biāo)志物在膀胱癌發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)變化規(guī)律。在一項(xiàng)針對膀胱癌的研究中，利用免疫組化方法對50例膀胱癌組織和20例正常膀胱組織進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示膀胱癌組織中E-cadherin的表達(dá)水平明顯低于正常膀胱組織，而N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平則顯著高于正常膀胱組織。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在浸潤性膀胱癌組織中，E-cadherin的低表達(dá)更為明顯，而N-cadherin和Vimentin的高表達(dá)也更為突出。這表明E-cadherin表達(dá)降低、N-cadherin和Vimentin表達(dá)升高與膀胱癌的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在另一項(xiàng)研究中，采用Westernblot技術(shù)檢測了不同分期膀胱癌組織中EMT標(biāo)志物的表達(dá)情況。結(jié)果表明，隨著膀胱癌分期的升高，E-cadherin的表達(dá)逐漸降低，而N-cadherin和Vimentin的表達(dá)則逐漸升高。在T1期膀胱癌組織中，E-cadherin的表達(dá)相對較高，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)相對較低；而在T3期膀胱癌組織中，E-cadherin的表達(dá)顯著降低，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)顯著升高。這進(jìn)一步證實(shí)了E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)變化與膀胱癌的浸潤深度和進(jìn)展程度密切相關(guān)。在對膀胱癌分級與EMT標(biāo)志物表達(dá)關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，高級別膀胱癌組織中E-cadherin的表達(dá)明顯低于低級別膀胱癌組織，而N-cadherin和Vimentin的表達(dá)則明顯高于低級別膀胱癌組織。這說明E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)變化與膀胱癌的惡性程度相關(guān)，腫瘤細(xì)胞分化程度越低，E-cadherin表達(dá)越低，N-cadherin和Vimentin表達(dá)越高，提示這些標(biāo)志物可能在膀胱癌的惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用。這些研究結(jié)果表明，E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等EMT標(biāo)志物的表達(dá)變化與膀胱癌的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。E-cadherin作為上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，使腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)灶脫離，進(jìn)而發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移。N-cadherin和Vimentin作為間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，其表達(dá)升高賦予腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向周圍組織浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，檢測這些標(biāo)志物的表達(dá)水平，對于評估膀胱癌的浸潤轉(zhuǎn)移潛能和預(yù)后具有重要的臨床意義。5.2.2與TGF-β1表達(dá)的相關(guān)性眾多研究致力于探究TGF-β1表達(dá)與EMT標(biāo)志物表達(dá)之間的相關(guān)性，以揭示TGF-β1在膀胱癌EMT和浸潤轉(zhuǎn)移中的調(diào)控機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌組織中，TGF-β1的表達(dá)水平與E-cadherin的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，與N-cadherin和Vimentin的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。在一項(xiàng)對80例膀胱癌患者的研究中，通過免疫組化和Westernblot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，TGF-β1高表達(dá)的膀胱癌組織中，E-cadherin的表達(dá)明顯降低，而N-cadherin和Vimentin的表達(dá)明顯升高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，TGF-β1表達(dá)水平與E-cadherin表達(dá)水平的相關(guān)系數(shù)為-0.56（P<0.01），與N-cadherin表達(dá)水平的相關(guān)系數(shù)為0.62（P<0.01），與Vimentin表達(dá)水平的相關(guān)系數(shù)為0.59（P<0.01）。這表明TGF-β1可能通過調(diào)控E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)來促進(jìn)膀胱癌的EMT和浸潤轉(zhuǎn)移。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證了這一相關(guān)性。在膀胱癌細(xì)胞系中，給予外源性TGF-β1刺激后，細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)顯著下調(diào)，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)顯著上調(diào)。而當(dāng)使用TGF-β1抑制劑阻斷TGF-β1信號通路后，E-cadherin的表達(dá)上調(diào)，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)下調(diào)。這說明TGF-β1能夠直接調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞中EMT標(biāo)志物的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的EMT過程和浸潤轉(zhuǎn)移能力。從分子機(jī)制角度來看，TGF-β1主要通過激活其下游的信號通路來調(diào)控EMT標(biāo)志物的表達(dá)。在經(jīng)典的Smad依賴信號通路中，TGF-β1與受體結(jié)合后，激活Smad2和Smad3，使其磷酸化并與Smad4形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合到E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下降。同時(shí)，該復(fù)合物還可以結(jié)合到N-cadherin和Vimentin等間質(zhì)標(biāo)志物基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，使N-cadherin和Vimentin表達(dá)升高。在非Smad依賴信號通路中，TGF-β1可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路等，這些通路通過調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，間接影響E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)。綜上所述，TGF-β1表達(dá)與EMT標(biāo)志物表達(dá)之間存在密切的相關(guān)性，TGF-β1可能通過調(diào)控這些標(biāo)志物的表達(dá)來促進(jìn)膀胱癌的EMT和浸潤轉(zhuǎn)移。深入研究這種相關(guān)性及其分子機(jī)制，對于進(jìn)一步理解膀胱癌的發(fā)病機(jī)制和尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要意義。5.3體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TGF-β1對膀胱癌EMT和浸潤轉(zhuǎn)移的影響5.3.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通常選用多種膀胱癌細(xì)胞系，如5637、T24、BIU-87等。這些細(xì)胞系具有不同的生物學(xué)特性，能夠更全面地反映TGF-β1對膀胱癌的作用。首先，對膀胱癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，將其置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Transwell小室實(shí)驗(yàn)是檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的常用方法。將Transwell小室置于24孔板中，上室加入無血清培養(yǎng)基重懸的膀胱癌細(xì)胞，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。對于侵襲實(shí)驗(yàn)，需在上室底部預(yù)先鋪上Matrigel基質(zhì)膠，以模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境。在實(shí)驗(yàn)組中，加入一定濃度的TGF-β1（如5ng/mL、10ng/mL等）進(jìn)行刺激，對照組則加入等量的PBS。培養(yǎng)一定時(shí)間（如24h、48h）后，取出Transwell小室，用棉簽擦去上室未遷移或侵襲的細(xì)胞，下室的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，蘇木精-伊紅（HE）染色后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量。研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，TGF-β1處理后的膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)，且隨著TGF-β1濃度的增加，細(xì)胞遷移和侵襲的數(shù)量也增多。劃痕實(shí)驗(yàn)則用于直觀地觀察細(xì)胞的遷移能力。在6孔板中接種膀胱癌細(xì)胞，待細(xì)胞融合至80%-90%時(shí)，用無菌10μL移液器槍頭在細(xì)胞單層上劃一條直線，形成劃痕。用PBS沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，然后加入無血清培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組加入TGF-β1，對照組加入PBS。分別在劃痕后0h、24h、48h等時(shí)間點(diǎn)，在顯微鏡下拍照記錄劃痕寬度，并計(jì)算細(xì)胞遷移率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TGF-β1處理后的膀胱癌細(xì)胞遷移率明顯高于對照組，說明TGF-β1能夠促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的遷移。為了進(jìn)一步探究TGF-β1對膀胱癌細(xì)胞EMT相關(guān)分子表達(dá)的影響，采用Westernblot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)。收集TGF-β1處理不同時(shí)間（如0h、6h、12h、24h）的膀胱癌細(xì)胞，提取總蛋白或總RNA。Westernblot實(shí)驗(yàn)中，將蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，加入E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等EMT相關(guān)分子的特異性抗體，4℃孵育過夜。次日，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2h，用化學(xué)發(fā)光試劑顯影，分析蛋白表達(dá)水平的變化。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)中，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過檢測目的基因的Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1處理后，膀胱癌細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)顯著下調(diào)，而N-cadherin和Vimentin的表達(dá)顯著上調(diào)，且隨著處理時(shí)間的延長，這種變化更為明顯。這表明TGF-β1能夠誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生EMT，從而促進(jìn)其浸潤轉(zhuǎn)移。5.3.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，常用的膀胱癌動(dòng)物模型包括皮下移植瘤模型和原位移植瘤模型。皮下移植瘤模型構(gòu)建相對簡單，將對數(shù)生長期的膀胱癌細(xì)胞（如5×106個(gè)）懸浮于100μLPBS中，注射到裸鼠或免疫缺陷小鼠的背部皮下。定期觀察腫瘤的生長情況，測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。在實(shí)驗(yàn)組中，當(dāng)腫瘤體積長至一定大小時(shí)，通過腹腔注射或瘤內(nèi)注射給予TGF-β1（如5μg/kg、10μg/kg等），對照組則注射等量的PBS。經(jīng)過一段時(shí)間的處理后，處死小鼠，取出腫瘤組織。通過免疫組化檢測腫瘤組織中EMT相關(guān)分子的表達(dá)，結(jié)果顯示，TGF-β1處理組腫瘤組織中E-cadherin表達(dá)降低，N-cadherin和Vimentin表達(dá)升高，與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。原位移植瘤模型則更能模擬膀胱癌在體內(nèi)的自然生長環(huán)境。將膀胱癌細(xì)胞（如1×106個(gè)）通過膀胱壁注射或膀胱內(nèi)灌注的方式接種到小鼠膀胱內(nèi)。一段時(shí)間后，通過膀胱鏡觀察腫瘤的生長情況。同樣，實(shí)驗(yàn)組給予TGF-β1，對照組給予PBS。為了檢測腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對小鼠的肺、肝、淋巴結(jié)等器官進(jìn)行病理檢查，觀察是否有腫瘤轉(zhuǎn)移灶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGF-β1處理組小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移率明顯高于對照組。通過免疫組化和Westernblot檢測轉(zhuǎn)移灶組織中EMT相關(guān)分子的表達(dá)，也發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達(dá)降低，N-cadherin和Vimentin表達(dá)升高。為了進(jìn)一步研究抑制TGF-β1信號對腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和EMT相關(guān)指標(biāo)的影響，可采用TGF-β1受體抑制劑（如SB431542）或針對TGF-β1的中和抗體進(jìn)行干預(yù)。在皮下移植瘤模型中，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到一定大小時(shí)，給予TGF-β1受體抑制劑或中和抗體，對照組給予相應(yīng)的溶劑。觀察腫瘤的生長情況，結(jié)果顯示，抑制TGF-β1信號后，腫瘤生長速度明顯減慢，腫瘤體積顯著減小。對腫瘤組織進(jìn)行免疫組化和Westernblot檢測，發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達(dá)升高，N-cadherin和Vimentin表達(dá)降低。在原位移植瘤模型中，抑制TGF-β1信號同樣能夠降低腫瘤的轉(zhuǎn)移率，減少轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量。這些結(jié)果表明，TGF-β1在膀胱癌的生長、轉(zhuǎn)移和EMT過程中起著重要作用，抑制TGF-β1信號可以有效抑制膀胱癌的浸潤轉(zhuǎn)移。六、基于TGF-β1-EMT軸的膀胱癌治療策略探討6.1針對TGF-β1信號通路的靶向治療6.1.1TGF-β1抑制劑的研究進(jìn)展TGF-β1抑制劑是一類旨在阻斷TGF-β1信號傳導(dǎo)，從而抑制其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中促癌作用的藥物。目前，TGF-β1抑制劑主要包括小分子抑制劑、中和抗體、反義寡核苷酸、可溶性受體等類型。小分子抑制劑能夠特異性地結(jié)合TGF-β1受體的激酶結(jié)構(gòu)域，阻斷受體的磷酸化和下游信號傳導(dǎo)。例如，LY2109761是一種口服的小分子TGF-β1受體Ⅰ（TGF-βRI）抑制劑，它可以與TGF-βRI的ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，抑制其激酶活性，從而阻斷TGF-β1信號通路。在臨床前研究中，LY2109761對多種腫瘤細(xì)胞系具有抑制作用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中，LY2109761處理后，細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降低，且EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)上調(diào)，N-cadherin和Vimentin表達(dá)下調(diào)。另一種小分子抑制劑SB431542也具有類似的作用機(jī)制，它能夠選擇性地抑制TGF-βRI的活性，阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程。在肝癌細(xì)胞系中，SB431542能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和侵襲，逆轉(zhuǎn)EMT相關(guān)分子的表達(dá)變化。中和抗體則通過特異性地結(jié)合TGF-β1分子，阻止其與受體結(jié)合，從而阻斷信號傳導(dǎo)。例如，GC1008是一種人源化的抗TGF-β1中和抗體，它可以與TGF-β1特異性結(jié)合，抑制TGF-β1的生物學(xué)活性。在臨床前研究中，GC1008在多種腫瘤模型中顯示出抗腫瘤活性。在小鼠黑色素瘤模型中，給予GC1008治療后，腫瘤生長受到抑制，腫瘤組織中EMT相關(guān)分子的表達(dá)發(fā)生改變，E-cadherin表達(dá)升高，N-cadherin和Vimentin表達(dá)降低。還有一種名為fresolimumab的抗TGF-β1中和抗體，在臨床試驗(yàn)中也表現(xiàn)出一定的抗腫瘤潛力。在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中，fresolimumab與化療藥物聯(lián)合使用，能夠延長患者的無進(jìn)展生存期。反義寡核苷酸可以通過與TGF-β1mRNA互補(bǔ)結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，從而降低TGF-β1的表達(dá)水平。例如，AP12009是一種針對TGF-β2的反義寡核苷酸，雖然主要針對TGF-β2，但對TGF-β1也有一定的抑制作用。在臨床前研究中，AP12009能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中，AP12009處理后，TGF-β1的表達(dá)水平降低，細(xì)胞的增殖和遷移能力受到抑制。可溶性受體則是通過與TGF-β1結(jié)合，競爭性地阻斷其與細(xì)胞表面受體的結(jié)合，從而抑制信號傳導(dǎo)。例如，可溶性TGF-βRII（sTGF-βRII）能夠與TGF-β1結(jié)合，阻止其與細(xì)胞表面的TGF-βRII結(jié)合，從而阻斷TGF-β1信號通路。在臨床前研究中，sTGF-βRII在多種腫瘤模型中顯示出抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用。在小鼠肺癌模型中，給予sTGF-βRII治療后，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移受到抑制，腫瘤組織中EMT相關(guān)分子的表達(dá)發(fā)生改變。在臨床前研究中，這些TGF-β1抑制劑在多種腫瘤模型中都表現(xiàn)出了抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和EMT的作用。然而，在臨床試驗(yàn)中，TGF-β1抑制劑的療效和安全性仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。一些臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1抑制劑單藥治療的效果有限，可能需要與其他治療方法聯(lián)合使用。在一項(xiàng)針對晚期實(shí)體瘤患者的臨床試驗(yàn)中，使用小分子抑制劑治療后，患者的客觀緩解率較低。但當(dāng)TGF-β1抑制劑與化療、免疫治療等聯(lián)合使用時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用，提高治療效果。在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中，GC1008與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合使用，能夠增強(qiáng)免疫治療的效果，提高患者的生存率。在安全性方面，TGF-β1抑制劑可能會(huì)引起一些不良反應(yīng)。例如，小分子抑制劑可能會(huì)導(dǎo)致胃腸道反應(yīng)、肝功能異常等。在使用LY2109761的臨床試驗(yàn)中，部分患者出現(xiàn)了惡心、嘔吐、腹瀉等胃腸道癥狀，以及轉(zhuǎn)氨酶升高、膽紅素升高等肝功能異常。中和抗體可能會(huì)引發(fā)免疫相關(guān)不良反應(yīng)，如過敏反應(yīng)、免疫介導(dǎo)的器官損傷等。在使用fresolimumab的臨床試驗(yàn)中，有患者出現(xiàn)了過敏反應(yīng)和免疫介導(dǎo)的皮膚損傷。這些不良反應(yīng)需要在臨床應(yīng)用中密切關(guān)注和監(jiān)測。6.1.2臨床應(yīng)用前景與挑戰(zhàn)TGF-β1抑制劑在膀胱癌治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。由于TGF-β1在膀胱癌的浸潤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，抑制TGF-β1信號通路有望成為治療膀胱癌的有效策略。在膀胱癌的臨床治療中，TGF-β1抑制劑可以作為一種新的治療手段，與現(xiàn)有的手術(shù)、化療、放療、免疫治療等方法聯(lián)合使用，提高治療效果。對于肌層浸潤性膀胱癌患者，在手術(shù)切除腫瘤后，給予TGF-β1抑制劑進(jìn)行輔助治療，可能能夠降低腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。對于無法手術(shù)切除的晚期膀胱癌患者，TGF-β1抑制劑與化療藥物聯(lián)合使用，可能會(huì)增強(qiáng)化療的療效，延長患者的生存期。TGF-β1抑制劑還可以與免疫治療藥物聯(lián)合使用，逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，提高免疫治療的效果。然而，TGF-β1抑制劑在臨床應(yīng)用中也面臨著諸多挑戰(zhàn)。耐藥性是一個(gè)重要問題。腫瘤細(xì)胞可能會(huì)通過多種機(jī)制對TGF-β1抑制劑產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療效果不佳。腫瘤細(xì)胞可能會(huì)通過上調(diào)TGF-β1信號通路中的其他分子，或者激活旁路信號通路來繞過TGF-β1抑制劑的作用。一些膀胱癌患者在使用TGF-β1抑制劑治療一段時(shí)間后，腫瘤細(xì)胞可能會(huì)通過上調(diào)TGF-β2或TGF-β3的表達(dá)，繼續(xù)激活TGF-β信號通路，從而產(chǎn)生耐藥性。腫瘤細(xì)胞還可能會(huì)通過改變細(xì)胞表面受體的表達(dá)或功能，影響TGF-β1抑制劑的結(jié)合和作用。一些腫瘤細(xì)胞可能會(huì)下調(diào)TGF-βRII的表達(dá)，使TGF-β1抑制劑無法有效阻斷信號傳導(dǎo)。副作用也是TGF-β1抑制劑臨床應(yīng)用中需要關(guān)注的問題。如前文所述，TGF-β1抑制劑可能會(huì)引起胃腸道反應(yīng)、肝功能異常、免疫相關(guān)不良反應(yīng)等副作用，這些副作用可能會(huì)影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。嚴(yán)重的副作用甚至可能導(dǎo)致治療中斷，影響患者的治療效果。在使用小分子抑制劑時(shí)，患者出現(xiàn)的惡心、嘔吐、腹瀉等胃腸道反應(yīng)可能會(huì)導(dǎo)致患者營養(yǎng)攝入不足，影響身體狀況。而免疫相關(guān)不良反應(yīng)如過敏反應(yīng)、免疫介導(dǎo)的器官損傷等，可能會(huì)對患者的生命健康造成威脅。為應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，需要進(jìn)一步深入研究TGF-β1抑制劑的耐藥機(jī)制，尋找克服耐藥性的方法?？梢酝ㄟ^聯(lián)合使用多種抑制劑，同時(shí)阻斷TGF-β1信號通路的多個(gè)環(huán)節(jié)，減少耐藥性的產(chǎn)生。針對TGF-β1和TGF-β2或TGF-β3同時(shí)開發(fā)抑制劑，或者將TGF-β1抑制劑與其他信號通路抑制劑聯(lián)合使用，可能能夠提高治療效果。還可以通過篩選生物標(biāo)志物，預(yù)測患者對TGF-β1抑制劑的敏感性，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療。研究發(fā)現(xiàn)，某些基因的表達(dá)水平與TGF-β1抑制劑的療效相關(guān)，通過檢測這些基因的表達(dá)，可以篩選出對TGF-β1抑制劑敏感的患者，提高治療的針對性。在副作用方面，需要優(yōu)化TGF-β1抑制劑的給藥方案，降低副作用的發(fā)生率和嚴(yán)重程度?？梢酝ㄟ^調(diào)整藥物劑量、給藥時(shí)間等方式，減少副作用的發(fā)生。對于出現(xiàn)副作用的患者，及時(shí)采取相應(yīng)的治療措施，緩解癥狀，提高患者的生活質(zhì)量。在使用中和抗體出現(xiàn)過敏反應(yīng)時(shí)，及時(shí)給予抗過敏藥物治療，確?；颊叩陌踩?。6.2聯(lián)合治療策略6.2.1與傳統(tǒng)化療、放療的聯(lián)合將針對TGF-β1-EMT軸的治療與傳統(tǒng)化療、放療聯(lián)合使用具有堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。從細(xì)胞增殖角度來看，TGF-β1在膀胱癌中不僅誘導(dǎo)EMT促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移，還對腫瘤細(xì)胞的增殖有一定的調(diào)控作用?；熕幬锶珥樸K、吉西他濱等主要通過干擾腫瘤細(xì)胞的DNA合成、損傷DNA或抑制細(xì)胞分裂相關(guān)的酶活性來發(fā)揮作用，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。而TGF-β1抑制劑可以阻斷TGF-β1信號通路，逆轉(zhuǎn)TGF-β1對腫瘤細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，與化療藥物協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞的生長。在膀胱癌的臨床前研究中發(fā)現(xiàn)，將TGF-β1小分子抑制劑與順鉑聯(lián)合使用，對膀胱癌細(xì)胞的增殖抑制效果明顯優(yōu)于單藥治療。從腫瘤細(xì)胞的耐藥性方面分析，TGF-β1信號通路的激活與腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞通過TGF-β1誘導(dǎo)EMT，使其獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，同時(shí)也增強(qiáng)了對化療藥物的抵抗能力。一些發(fā)生EMT的膀胱癌細(xì)胞會(huì)高表達(dá)多藥耐藥蛋白（MDR1），導(dǎo)致化療藥物外排增加，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，從而產(chǎn)生耐藥性。抑制TGF-β1信號通路可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的EMT狀態(tài)，降低其對化療藥物的耐藥性，提高化療的療效。在一項(xiàng)研究中，使用TGF-β1中和抗體聯(lián)合吉西他濱治療膀胱癌小鼠模型，結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組腫瘤細(xì)胞對吉西他濱的敏感性顯著提高，腫瘤生長明顯受到抑制。放療主要通過電離輻射直接損傷腫瘤細(xì)胞的DNA，或通過產(chǎn)生自由基間接損傷DNA，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。然而，腫瘤細(xì)胞在受到放療刺激后，會(huì)激活一系列的修復(fù)機(jī)制，其中TGF-β1信號通路的激活在腫瘤細(xì)胞的放療抵抗中發(fā)揮重要作用。TGF-β1可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的存活能力。同時(shí)，TGF-β1還可以通過誘導(dǎo)EMT，使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，逃避放療的殺傷。將針對TGF-β1-EMT軸的治療與放療聯(lián)合，可以抑制TGF-β1信號通路，減少腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)，降低腫瘤細(xì)胞的放療抵抗，增強(qiáng)放療的效果。在體外實(shí)驗(yàn)中，用TGF-β1受體抑制劑預(yù)處理膀胱癌細(xì)胞，然后進(jìn)行放療，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的凋亡率明顯增加，放療對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用顯著增強(qiáng)。目前，關(guān)于針對TGF-β1-EMT軸的治療與傳統(tǒng)化療、放療聯(lián)合使用的臨床研究仍處于探索階段，但已取得了一些初步成果。在一些小規(guī)模的臨床試驗(yàn)中，將TGF-β1抑制劑與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用于晚期膀胱癌患者，觀察到患者的無進(jìn)展生存期有所延長，腫瘤緩解率有所提高。一項(xiàng)針對50例晚期膀胱癌患者的臨床試驗(yàn)中，采用TGF-β1小分子抑制劑聯(lián)合順鉑和吉西他濱進(jìn)行治療，結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組的無進(jìn)展生存期為8.5個(gè)月，明顯長于單純化療組的6.2個(gè)月；腫瘤緩解率為40%，高于單純化療組的25%。在放療方面，有研究嘗試將TGF-β1抑制劑與放療聯(lián)合用于局部晚期膀胱癌患者。在一項(xiàng)納入30例局部晚期膀胱癌患者的臨床試驗(yàn)中，患者在接受放療的同時(shí)給予TGF-β1中和抗體治療，結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組的局部控制率為70%，高于單純放療組的50%；患者的總生存期也有延長的趨勢。這些臨床研究結(jié)果表明，針對TGF-β1-EMT軸的治療與傳統(tǒng)化療、放療聯(lián)合使用具有一定的可行性和有效性，為膀胱癌的治療提供了新的思路和方法。然而，這些研究樣本量較小，還需要開展大規(guī)模、多中心的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其療效和安全性。6.2.2與新興免疫治療的聯(lián)合TGF-β1-EMT軸與腫瘤免疫微環(huán)境之間存在著復(fù)雜而密切的關(guān)系。腫瘤免疫微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及各種細(xì)胞因子等組成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，它在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中起著至關(guān)重要的作用。TGF-β1作為一種多功能細(xì)胞因子，在腫瘤免疫微環(huán)境中扮演著關(guān)鍵角色。在膀胱癌中，TGF-β1主要由腫瘤細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）等細(xì)胞分泌。高表達(dá)的TGF-β1可以通過多種途徑影響腫瘤免疫微環(huán)境。從免疫細(xì)胞的角度來看，TGF-β1對T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等免疫細(xì)胞的功能具有抑制作用。在T細(xì)胞方面，TGF-β1可以抑制T細(xì)胞的活化、增殖和分化，使其難以發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)。TGF-β1可以抑制CD4+T細(xì)胞向Th1和Th17細(xì)胞分化，促進(jìn)其向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）分化。Treg細(xì)胞具有免疫抑制功能，能夠抑制其他免疫細(xì)胞的活性，從而幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。在膀胱癌患者中，腫瘤組織中Treg細(xì)胞的比例與TGF-β1的表達(dá)水平呈正相關(guān)，TGF-β1高表達(dá)的患者Treg細(xì)胞浸潤增多，免疫抑制增強(qiáng)。TGF-β1還可以抑制B細(xì)胞的活化和抗體分泌，降低機(jī)體的體液免疫功能。對于NK細(xì)胞，TGF-β1可以抑制其細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子分泌，使其對腫瘤細(xì)胞的殺