人IFNα與BFA對日本乙型腦炎病毒增殖抑制的分子機制解析一、引言1.1研究背景與意義日本乙型腦炎病毒（JapaneseEncephalitisVirus，JEV），是引發(fā)日本乙型腦炎（JapaneseEncephalitis，JE）的病原體，這是一種極具危害的急性傳染病，主要通過蚊蟲叮咬傳播，廣泛流行于亞洲和西太平洋地區(qū)。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，每年約有68000例乙腦病例，至少導(dǎo)致10000-15000人死亡，給公共衛(wèi)生帶來了沉重負擔(dān)。乙腦病毒宿主范圍廣泛，包括人類、馬、豬等多種動物。其中，豬不僅感染率高，可達100%，而且毒血癥期較長，對人乙型腦炎的流行起到了關(guān)鍵的促進作用，是主要的傳染源。在我國，除新疆、西藏、青海外，其他地區(qū)均為乙腦疫區(qū)，四川省的成都平原及東北部曾是高發(fā)區(qū)，近年來遂寧、達州等邊遠貧困地區(qū)也成為高發(fā)區(qū)域。乙腦主要侵襲年幼的兒童，2-4歲發(fā)病率最高，兒童小于6歲的占68.1%，超過90%的病例發(fā)生在小于15歲的兒童。乙腦病毒對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有高度的嗜性，一旦感染，可引發(fā)嚴重的腦炎癥狀，如高熱、意識障礙、抽搐、呼吸衰竭等，致死率約為20-40％，即使有幸存活，仍有50％的患者會留下永久性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如癡呆、失語、肢體癱瘓、精神失常等，給患者及其家庭帶來了巨大的痛苦和負擔(dān)。目前，對于乙腦的治療缺乏特效藥物，主要依賴對癥和支持治療?？刂埔夷X流行的主要措施是接種疫苗和防蚊滅蚊，但疫苗接種存在覆蓋率不足、免疫效果參差不齊等問題，而防蚊滅蚊措施受環(huán)境因素影響較大，難以完全杜絕病毒傳播。因此，深入研究乙腦病毒的增殖機制，尋找有效的抑制方法，具有重要的現(xiàn)實意義。人干擾素α（humanInterferonα，hIFNα）作為一種重要的細胞因子，具有強大的抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)活性。在病毒感染初期，機體免疫系統(tǒng)會迅速分泌IFNα，激活一系列抗病毒基因的表達，從而抑制病毒的復(fù)制和傳播。眾多研究表明，IFNα在對抗多種病毒感染中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，如乙肝病毒、丙肝病毒、流感病毒等。然而，關(guān)于IFNα對日本乙型腦炎病毒增殖的抑制作用及其機制，仍有待深入探究。布雷菲德菌素A（BrefeldinA，BFA）是一種由真菌產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，它能夠特異性地干擾細胞內(nèi)的囊泡運輸，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運途徑，從而影響病毒的裝配和釋放過程。在對某些病毒的研究中發(fā)現(xiàn)，BFA能夠顯著抑制病毒的增殖，但其對日本乙型腦炎病毒的作用效果及機制尚未明確。本研究聚焦于人IFNα及BFA對日本乙型腦炎病毒增殖的抑制作用，旨在揭示其潛在的抗病毒機制，為乙腦的防治提供新的理論依據(jù)和治療策略。通過深入研究，有望發(fā)現(xiàn)新的抗病毒靶點，為開發(fā)新型抗乙腦病毒藥物奠定基礎(chǔ)，對于降低乙腦的發(fā)病率和死亡率，減少后遺癥的發(fā)生，保護人類和動物的健康具有重要的科學(xué)價值和臨床意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在乙腦防治領(lǐng)域，人IFNα和BFA的抗病毒研究是重要方向。人IFNα具有強大的抗病毒活性，其作用機制主要通過與細胞表面的特異性受體結(jié)合，激活JAK-STAT信號通路，誘導(dǎo)一系列干擾素刺激基因（ISGs）的表達，這些ISGs編碼的蛋白從多個環(huán)節(jié)抑制病毒的增殖，如阻斷病毒的吸附、侵入、脫殼、核酸復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及病毒粒子的裝配和釋放等過程。在乙肝病毒感染的研究中，IFNα能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生2'-5'寡腺苷酸合成酶（2'-5'OAS）和蛋白激酶R（PKR），2'-5'OAS激活RNA酶L，降解病毒RNA，PKR則磷酸化真核翻譯起始因子eIF2α，抑制病毒蛋白的合成。在丙肝病毒感染的細胞模型中，IFNα可上調(diào)Mx蛋白、ISG15等抗病毒蛋白的表達，有效抑制病毒的復(fù)制。在日本乙型腦炎病毒的研究中，已有學(xué)者關(guān)注到IFNα的潛在作用。部分研究表明，IFNα在體外細胞實驗中對JEV的增殖具有一定的抑制效果。通過將不同濃度的IFNα作用于感染JEV的細胞，利用Westernblot、噬斑減少試驗等方法檢測病毒蛋白表達和病毒滴度，發(fā)現(xiàn)隨著IFNα濃度的增加，病毒蛋白的表達量顯著降低，病毒滴度也明顯下降，說明IFNα能夠有效抑制JEV在細胞內(nèi)的增殖。然而，目前對于IFNα抑制JEV增殖的具體分子機制尚未完全明確，IFNα誘導(dǎo)產(chǎn)生的眾多ISGs中，哪些蛋白在抗JEV感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用，以及它們?nèi)绾螀f(xié)同作用來阻斷病毒的生命周期，仍有待深入探究。BFA作為一種能夠干擾細胞內(nèi)囊泡運輸?shù)乃幬铮淇共《緳C制主要是通過破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運途徑，影響病毒的裝配和釋放。在對流感病毒的研究中，BFA能夠阻止流感病毒血凝素（HA）從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的轉(zhuǎn)運，使HA無法正確糖基化和折疊，從而影響病毒粒子的組裝和釋放，顯著降低病毒的感染性。在登革病毒的研究中，BFA處理感染細胞后，發(fā)現(xiàn)病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS3在細胞內(nèi)的分布發(fā)生改變，無法正常轉(zhuǎn)運到細胞膜表面，進而影響病毒的復(fù)制和釋放。針對JEV，目前關(guān)于BFA的研究相對較少。有限的研究顯示，BFA在一定程度上能夠抑制JEV在細胞內(nèi)的增殖。通過MTS法檢測不同濃度BFA對感染JEV細胞活力的影響，確定安全有效的藥物濃度范圍，再利用IFA觀察、病毒滴度檢測等方法，發(fā)現(xiàn)BFA處理后的細胞中，JEV的抗原表達量減少，病毒滴度降低，表明BFA對JEV的增殖具有抑制作用。但BFA影響JEV增殖的具體作用靶點以及在JEV感染過程中，細胞內(nèi)囊泡運輸途徑的改變?nèi)绾斡绊懖《镜纳芷诘葐栴}，還缺乏深入系統(tǒng)的研究。當(dāng)前對于人IFNα及BFA抑制日本乙型腦炎病毒增殖的研究仍存在不足。在IFNα方面，雖然已知其具有抗病毒活性，但在JEV感染背景下，IFNα信號通路的激活模式、關(guān)鍵ISGs的篩選及作用機制等方面研究不夠深入；在BFA研究中，對其抗JEV的作用機制、最佳作用濃度和時間窗等缺乏全面了解。深入研究人IFNα及BFA抑制JEV增殖的機制，對于開發(fā)新型抗乙腦病毒藥物和治療策略具有重要意義。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探討人IFNα及BFA抑制日本乙型腦炎病毒增殖的作用機制，為乙腦的防治提供新的理論依據(jù)和潛在的治療策略。具體研究內(nèi)容如下：人IFNα抑制JEV增殖的作用研究：通過在體外細胞實驗中，將不同濃度的重組人IFNα作用于感染JEV的細胞，利用Westernblot技術(shù)檢測病毒蛋白表達水平，運用噬斑減少試驗測定病毒滴度，明確人IFNα對JEV增殖的抑制效果，并分析其劑量依賴性關(guān)系。同時，設(shè)置不同的時間點，進行Westernblot和噬斑減少試驗，探究人IFNα抑制JEV增殖的時效關(guān)系，了解其在不同時間階段對病毒增殖的影響規(guī)律。人IFNα抑制JEV增殖的機制研究：鑒于IFNα主要通過誘導(dǎo)ISGs發(fā)揮抗病毒作用，重點研究在JEV感染背景下，IFNα誘導(dǎo)產(chǎn)生的關(guān)鍵ISGs。利用基因過表達技術(shù)，使細胞過表達可能的關(guān)鍵ISGs，檢測JEV在細胞內(nèi)的增殖情況，判斷這些ISGs對JEV增殖的影響；運用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，下調(diào)關(guān)鍵ISGs的表達，觀察其對IFNα抑制JEV增殖效果的影響，從而確定關(guān)鍵ISGs在IFNα抗JEV感染中的作用。此外，研究IFNα激活的JAK-STAT信號通路在抑制JEV增殖過程中的作用機制，通過使用信號通路抑制劑，阻斷該信號通路，觀察IFNα對JEV增殖的抑制作用是否受到影響，深入揭示IFNα抑制JEV增殖的分子機制。BFA抑制JEV增殖的作用研究：采用MTS法檢測不同濃度BFA對感染JEV細胞活力的影響，確定BFA對細胞無明顯毒性的安全濃度范圍。在該濃度范圍內(nèi)，設(shè)置多個不同濃度梯度的BFA處理感染JEV的細胞，通過IFA觀察病毒抗原表達情況，檢測病毒滴度，分析BFA對JEV增殖的抑制作用及其濃度依賴性。設(shè)置不同的時間點加入BFA，檢測不同時間段BFA對JEV增殖的抑制效果，明確BFA抑制JEV增殖的最佳作用時間窗。BFA抑制JEV增殖的機制研究：由于BFA主要干擾細胞內(nèi)囊泡運輸，研究BFA處理感染JEV細胞后，細胞內(nèi)囊泡運輸途徑的變化，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)記的囊泡在細胞內(nèi)的運輸情況，分析運輸途徑的改變?nèi)绾斡绊慗EV的裝配和釋放過程。通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析BFA處理前后感染JEV細胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達譜的變化，篩選出與BFA抗JEV作用相關(guān)的差異表達蛋白，進一步研究這些蛋白在BFA抑制JEV增殖過程中的作用機制，明確BFA抗JEV的具體作用靶點和分子機制。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究采用實驗研究方法，在細胞水平上深入探究人IFNα及BFA對日本乙型腦炎病毒增殖的抑制作用及機制。具體研究方法如下：細胞培養(yǎng)與病毒感染：選用BHK-21細胞（幼倉鼠腎細胞）作為實驗細胞，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)期，用日本乙型腦炎病毒（JEV）以一定的感染復(fù)數(shù)（MOI）感染細胞，感染2小時后，棄去病毒液，用PBS洗滌細胞3次，加入含不同處理因素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。人IFNα處理：將重組人IFNα用PBS稀釋成不同濃度梯度，如100U/mL、500U/mL、1000U/mL、2000U/mL等，在JEV感染細胞后不同時間點（如0小時、2小時、4小時）加入細胞培養(yǎng)體系中，以未加入IFNα的感染細胞作為對照組，分別在感染后不同時間（12小時、24小時、36小時、48小時）收集細胞及培養(yǎng)上清，用于后續(xù)檢測。BFA處理：用DMSO將BFA配制成高濃度儲存液，再用培養(yǎng)基稀釋成不同濃度梯度，如0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL等。在JEV感染細胞后不同時間點加入BFA，同時設(shè)置DMSO對照組，處理一定時間后收集細胞及培養(yǎng)上清進行檢測。在實驗過程中，需先通過MTS法檢測不同濃度BFA對細胞活力的影響，確定BFA對細胞無明顯毒性的安全濃度范圍，以確保后續(xù)實驗結(jié)果的可靠性。檢測指標(biāo)與方法：運用Westernblot技術(shù)檢測病毒蛋白（如JEV的E蛋白）的表達水平，以此評估病毒在細胞內(nèi)的增殖情況；采用噬斑減少試驗測定病毒滴度，直觀反映病毒的感染性和增殖能力；利用間接免疫熒光觀察（IFA）技術(shù)，使用特異性抗體標(biāo)記JEV抗原，通過熒光顯微鏡觀察病毒在細胞內(nèi)的分布和感染情況；運用基因過表達技術(shù)，將目的基因（如可能的關(guān)鍵ISGs）構(gòu)建到表達載體中，轉(zhuǎn)染細胞使其過表達相應(yīng)蛋白，檢測JEV在細胞內(nèi)的增殖變化；采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，設(shè)計合成針對關(guān)鍵ISGs的siRNA，轉(zhuǎn)染細胞下調(diào)其表達，觀察對IFNα抑制JEV增殖效果的影響；使用信號通路抑制劑，如針對JAK-STAT信號通路的抑制劑，在IFNα處理細胞前加入，阻斷信號通路，檢測對JEV增殖的影響；利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析BFA處理前后感染JEV細胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達譜的變化，篩選差異表達蛋白，進一步研究其在BFA抑制JEV增殖過程中的作用機制。本研究的技術(shù)路線圖如下：細胞與病毒準(zhǔn)備：培養(yǎng)BHK-21細胞，復(fù)蘇并擴增JEV病毒。分組處理：分為對照組、不同濃度人IFNα處理組、不同濃度BFA處理組、人IFNα與BFA聯(lián)合處理組等。處理細胞：在JEV感染細胞后，按設(shè)定時間點加入人IFNα、BFA或聯(lián)合處理。樣本收集：在不同時間點收集細胞及培養(yǎng)上清。檢測分析：通過Westernblot檢測病毒蛋白表達，噬斑減少試驗測定病毒滴度，IFA觀察病毒感染情況，基因過表達和RNAi技術(shù)研究關(guān)鍵基因作用，蛋白質(zhì)組學(xué)分析篩選差異表達蛋白。結(jié)果分析：總結(jié)分析人IFNα及BFA對JEV增殖的抑制作用及機制。二、日本乙型腦炎病毒概述2.1病毒基本特征日本乙型腦炎病毒（JEV）屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus），是一種具有包膜的單股正鏈RNA病毒。其病毒粒子呈球形，直徑約40-50nm，由核心、衣殼和包膜組成。核心部分包含單股正鏈RNA基因組，該基因組全長約10976個堿基對，是病毒遺傳信息的攜帶者，編碼了病毒的所有結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。衣殼由單股多肽的核衣殼蛋白組成，緊密包裹著RNA基因組，為其提供保護。包膜則鑲嵌有糖基化蛋白（E蛋白）和非糖基化蛋白（M蛋白），這些蛋白在病毒的感染過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如E蛋白參與病毒與宿主細胞表面受體的識別和結(jié)合，介導(dǎo)病毒的侵入過程，同時還具有重要的抗原性，是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的主要靶點；M蛋白則對維持病毒粒子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和完整性具有重要意義。JEV的理化性質(zhì)具有一定特點。它對熱較為敏感，56℃30分鐘或100℃2分鐘即可被滅活，這一特性在病毒的防控和消毒工作中具有重要應(yīng)用價值，例如在醫(yī)療器械的消毒、環(huán)境消毒等方面，可以通過高溫處理有效地殺滅病毒。在低溫和干燥環(huán)境下，病毒表現(xiàn)出較強的抵抗力，采用冷凍干燥法在4℃冰箱中可保存數(shù)年，這使得病毒在實驗室保存和研究過程中，能夠在特定條件下保持其生物學(xué)活性，便于科研人員進行長期的研究和分析。JEV對常用消毒劑也較為敏感，如碘酊、來蘇水、甲醛等均可在短時間內(nèi)將其滅活，這為公共場所、養(yǎng)殖場所等的消毒防護提供了便利，通過合理使用這些消毒劑，可以有效切斷病毒的傳播途徑，降低病毒感染的風(fēng)險。同時，JEV對酸和胰酶也敏感，在酸性環(huán)境或胰酶作用下，病毒的結(jié)構(gòu)和功能會受到破壞，從而失去感染能力。2.2流行病學(xué)特征日本乙型腦炎病毒在地理分布上呈現(xiàn)出明顯的區(qū)域性特點，主要流行于亞洲和西太平洋地區(qū)。這些地區(qū)涵蓋了熱帶、亞熱帶和溫帶氣候帶，為病毒的傳播和生存提供了適宜的環(huán)境。在東南亞，如印度、泰國、越南等國家，由于氣候炎熱潮濕，蚊蟲滋生繁衍迅速，乙腦病毒傳播活躍，是乙腦的高發(fā)區(qū)域。在印度，每年都有大量乙腦病例報告，部分地區(qū)疫情嚴重，對當(dāng)?shù)鼐用竦慕】翟斐闪藝乐赝{。西太平洋地區(qū)的日本、韓國等國家，雖然衛(wèi)生條件和醫(yī)療水平相對較高，但在特定季節(jié)仍有乙腦病例出現(xiàn)。隨著全球氣候變暖和國際交流的日益頻繁，乙腦病毒的傳播范圍有逐漸擴大的趨勢，一些原本無乙腦流行的地區(qū)也出現(xiàn)了病例，這給公共衛(wèi)生防控帶來了新的挑戰(zhàn)。乙腦病毒的傳播途徑主要是通過蚊蟲叮咬。三帶喙庫蚊是其主要傳播媒介，這種蚊子對乙腦病毒具有高度的易感性和傳播能力。當(dāng)三帶喙庫蚊叮咬感染乙腦病毒的動物，如豬、馬等后，病毒會在蚊子體內(nèi)進行復(fù)制和增殖。經(jīng)過一段時間的潛伏期，蚊子再次叮咬其他動物或人類時，就會將病毒傳播給新的宿主。除三帶喙庫蚊外，淡色庫蚊、東方伊蚊等也能傳播乙腦病毒。蚊子不僅是傳播媒介，還是病毒的儲存宿主，病毒可在蚊子體內(nèi)越冬，并通過蟲卵傳遞至下一代，這使得乙腦病毒能夠在自然界中持續(xù)存在和傳播。乙腦病毒的宿主范圍廣泛，包括多種家畜、家禽以及野生動物。家畜中的豬、馬、牛、羊等，家禽中的雞、鴨、鵝等，以及野生動物如猴、田鼠、蝙蝠等，都對乙腦病毒易感。其中，豬是最重要的擴增宿主和傳染源，其感染率高，可達100%。豬感染乙腦病毒后，通常無明顯臨床癥狀，但會出現(xiàn)較長時間的病毒血癥，血液中的病毒含量較高，這使得豬成為蚊子獲取病毒的重要來源，對乙腦的傳播起到了關(guān)鍵的促進作用。馬感染乙腦病毒后，部分會出現(xiàn)明顯的腦炎癥狀，如高熱、興奮、沉郁、意識障礙等，死亡率較高。牛、羊等家畜感染后多為隱性感染，但在病毒血癥階段仍可作為傳染源，將病毒傳播給蚊子，進而傳播給其他宿主。乙腦的流行具有明顯的季節(jié)性，主要發(fā)生在夏秋季。在北半球，流行高峰期通常在7-9月份，這與蚊蟲的繁殖活動規(guī)律密切相關(guān)。夏秋季氣溫升高、降雨增多，為蚊蟲的滋生提供了良好的環(huán)境，蚊蟲數(shù)量大量增加，活動頻繁，從而增加了乙腦病毒的傳播機會。在我國南方一些省區(qū)，由于氣候較為溫暖濕潤，蚊蟲終年可活動繁殖，乙腦可全年發(fā)病，但仍以夏秋季發(fā)病為主。此外，乙腦的發(fā)生還與地區(qū)的衛(wèi)生條件、防疫措施、人群和動物的免疫水平等因素有關(guān)。在衛(wèi)生條件差、防蚊滅蚊措施不到位、人群和動物免疫覆蓋率低的地區(qū)，乙腦的發(fā)病率往往較高。2.3致病機制與臨床癥狀當(dāng)人體被攜帶日本乙型腦炎病毒的蚊蟲叮咬后，病毒首先進入皮膚，隨后在局部的巨噬細胞和表皮細胞內(nèi)進行初步繁殖。經(jīng)過一段時間的增殖，病毒突破局部防御，進入血液循環(huán)，形成第一次病毒血癥。此時，病毒隨血流擴散至全身的單核-吞噬細胞系統(tǒng)，如肝臟、脾臟、淋巴結(jié)等部位的巨噬細胞內(nèi)，進行大量的復(fù)制和增殖。當(dāng)病毒在單核-吞噬細胞內(nèi)大量繁殖后，再次釋放到血液中，引起第二次病毒血癥。病毒能否突破血-腦脊液屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是決定是否發(fā)病以及病情嚴重程度的關(guān)鍵因素。這主要取決于人體的免疫狀態(tài)和病毒的毒力。當(dāng)機體免疫力較強時，免疫系統(tǒng)能夠迅速識別和清除病毒，僅形成短暫的病毒血癥，病毒無法侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，臨床上表現(xiàn)為隱性感染或輕型病例，患者可能僅出現(xiàn)輕微的發(fā)熱、頭痛、乏力等癥狀，之后可獲得終身免疫力。而當(dāng)機體免疫力較弱，且感染的病毒數(shù)量多、毒力強時，病毒則有可能突破血-腦脊液屏障，侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。血-腦脊液屏障由腦毛細血管內(nèi)皮細胞、基膜和星形膠質(zhì)細胞的終足等結(jié)構(gòu)組成，正常情況下能夠有效阻擋病原體和有害物質(zhì)進入腦組織。但在某些情況下，如腦寄生蟲病、癲癇、高血壓、腦血管病和腦外傷等，會使血-腦脊液屏障功能降低，增加病毒侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的風(fēng)險。一旦病毒侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，就會在神經(jīng)細胞內(nèi)大量繁殖，直接損害神經(jīng)細胞，導(dǎo)致神經(jīng)細胞壞死、凋亡。同時，病毒感染還會引發(fā)機體的免疫反應(yīng)，包括細胞免疫和體液免疫。免疫細胞如T淋巴細胞、B淋巴細胞等被激活，釋放多種細胞因子和炎性介質(zhì)，如白細胞介素、腫瘤壞死因子等。這些細胞因子和炎性介質(zhì)一方面有助于清除病毒，但另一方面也會引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腦組織充血、水腫、炎癥細胞浸潤，進一步加重神經(jīng)細胞的損傷。此外，免疫反應(yīng)過程中產(chǎn)生的免疫復(fù)合物，如特異性IgM與病毒抗原結(jié)合形成的復(fù)合物，可沉積在腦實質(zhì)和血管壁上，激活補體系統(tǒng)，引發(fā)免疫攻擊，導(dǎo)致血管壁破壞、附壁血栓形成，造成腦組織供血障礙和壞死。人感染乙腦病毒后的潛伏期一般為10-15天。在潛伏期內(nèi)，病毒在體內(nèi)逐漸繁殖，但患者通常無明顯癥狀。隨著病毒在體內(nèi)的擴散和對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的侵襲，患者進入發(fā)病期，臨床癥狀表現(xiàn)多樣。初期癥狀類似感冒，患者會出現(xiàn)發(fā)熱，體溫可達38-39℃，同時伴有頭痛、惡心、嘔吐、全身不適、乏力等癥狀。這些癥狀缺乏特異性，容易被忽視。隨著病情的發(fā)展，進入極期，患者體溫進一步升高，可達40℃以上，持續(xù)高熱不退。此時，中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀明顯加重，患者會出現(xiàn)意識障礙，從嗜睡、昏睡逐漸發(fā)展為昏迷。抽搐也是常見癥狀之一，可表現(xiàn)為局部抽搐或全身性抽搐，頻繁抽搐會導(dǎo)致機體缺氧，進一步加重腦損傷。部分患者還會出現(xiàn)呼吸衰竭，這是乙腦患者死亡的主要原因之一，表現(xiàn)為呼吸節(jié)律不規(guī)則、呼吸淺快或深慢，甚至出現(xiàn)呼吸暫停。此外，患者還可能出現(xiàn)病理反射及腦膜刺激征，如巴氏征陽性、克氏征陽性、布氏征陽性等。在恢復(fù)期，若患者病情較輕，經(jīng)過積極治療，體溫會逐漸下降，意識逐漸恢復(fù)，抽搐等癥狀也會逐漸緩解。但部分患者，尤其是病情較重的患者，在恢復(fù)期后仍會留下后遺癥，如癡呆、失語、肢體癱瘓、精神失常、癲癇等。這些后遺癥嚴重影響患者的生活質(zhì)量，給患者及其家庭帶來沉重的負擔(dān)。不同動物感染乙腦病毒后的臨床癥狀有所差異。豬感染乙腦病毒后，大多呈隱性感染，但妊娠母豬感染后，常出現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎或木乃伊胎等繁殖障礙癥狀。流產(chǎn)胎兒大小不一，有的出現(xiàn)腦水腫、皮下血樣浸潤、肝脾腎有壞死灶等病理變化。公豬感染后，常發(fā)生睪丸炎，一側(cè)或兩側(cè)睪丸腫脹，觸之熱痛，后期睪丸可能變小變硬，失去繁殖能力。馬感染乙腦病毒后，潛伏期約為4-15天，以3歲以下幼齡馬發(fā)病較多。病馬臨床表現(xiàn)為體溫升高，精神沉郁，反射遲鈍，常出現(xiàn)異常姿勢，如兩肢交叉或轉(zhuǎn)圈運動，站立和行走不穩(wěn)，臥地不起。少數(shù)病馬狂暴不安，后期極度疲憊，倒地不起，麻痹衰竭而死。病程短者2-3天，長者7-20天，多數(shù)死亡。少數(shù)病馬可能痊愈，但往往留有視力減弱和局部麻痹等后遺癥狀。牛、羊等家畜感染后多為隱性感染，少數(shù)出現(xiàn)輕微癥狀，如發(fā)熱、精神不振等。家禽如雞、鴨、鵝等感染后，通常無明顯臨床癥狀，但可作為病毒的儲存宿主，在病毒傳播中起到一定作用。2.4現(xiàn)有防治手段目前，針對日本乙型腦炎病毒感染的防治手段主要包括預(yù)防措施和臨床治療方法。預(yù)防措施方面，疫苗接種是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。乙腦疫苗主要有滅活疫苗和減毒活疫苗兩種類型。滅活疫苗通過化學(xué)方法將病毒滅活，保留其免疫原性，安全性較高，但需要多次接種才能獲得較好的免疫效果。減毒活疫苗則是通過人工培育使病毒毒力減弱，接種后可在體內(nèi)產(chǎn)生類似自然感染的免疫反應(yīng)，免疫效果持久，通常只需接種1-2次。我國自1976年開始大規(guī)模接種乙腦疫苗，接種率逐年提高，乙腦的發(fā)病率顯著下降。在一些乙腦高發(fā)地區(qū)，通過加強疫苗接種工作，使乙腦發(fā)病率降低了80%以上。然而，疫苗接種也面臨一些挑戰(zhàn)，如部分人群對疫苗的免疫應(yīng)答較弱，無法產(chǎn)生足夠的抗體；疫苗的儲存和運輸條件要求較高，在一些偏遠地區(qū)可能難以保證疫苗的質(zhì)量。此外，不同地區(qū)的乙腦病毒株存在一定的抗原性差異，現(xiàn)有疫苗對某些變異株的保護效果可能受到影響。防蚊滅蚊也是重要的預(yù)防措施。由于乙腦病毒主要通過蚊蟲叮咬傳播，控制蚊蟲數(shù)量可以有效減少病毒的傳播。在農(nóng)村和養(yǎng)殖場所，定期清理積水，減少蚊蟲滋生地，如及時倒掉花盆托盤、水桶、水槽等容器中的積水，對廢棄輪胎、水缸等進行妥善處理。使用殺蟲劑進行噴灑，如在蚊蟲繁殖季節(jié)，對室內(nèi)外環(huán)境、牲畜棚等進行定期噴霧，可有效殺滅成蚊。安裝紗窗、蚊帳，使用電蚊拍、蚊香等防蚊用品，也能降低人被蚊蟲叮咬的風(fēng)險。在一些東南亞國家，通過開展大規(guī)模的防蚊滅蚊行動，包括環(huán)境整治、蚊蟲消殺等措施，使乙腦的發(fā)病率得到了有效控制。但防蚊滅蚊工作受環(huán)境因素影響較大，如在高溫多雨的季節(jié)，蚊蟲繁殖速度快，防蚊滅蚊難度增加?？刂苿游锼拗鳎貏e是豬，也是預(yù)防乙腦傳播的重要措施。對豬進行免疫接種，可降低豬的感染率和病毒血癥水平，減少病毒傳播給蚊子的機會。在乙腦流行季節(jié)前，對豬群進行乙腦疫苗接種，可有效降低豬的感染風(fēng)險。合理規(guī)劃養(yǎng)豬場地，使其與人類居住區(qū)保持一定距離，如間隔4-5公里，減少豬與人類的接觸機會。加強對豬群的監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)和處理感染豬，可防止病毒在豬群中傳播和擴散。在臨床治療方面，目前尚無特效的抗病毒藥物。主要采取對癥和支持治療，以緩解癥狀和幫助患者恢復(fù)。對于高熱患者，采用物理降溫（如冰敷、溫水擦?。┖退幬锝禍兀ㄈ缡褂脤σ阴０被?、布洛芬等退燒藥）相結(jié)合的方法，使體溫控制在合理范圍內(nèi)，避免高熱對腦組織造成進一步損傷。對于抽搐患者，使用鎮(zhèn)靜劑（如地西泮、苯巴比妥等）控制抽搐發(fā)作，防止因抽搐導(dǎo)致的缺氧和腦損傷。對于呼吸衰竭患者，及時給予吸氧、使用呼吸興奮劑（如尼可剎米、洛貝林等），必要時進行氣管插管或機械通氣，維持呼吸功能。此外，還需注意維持患者的水電解質(zhì)平衡，補充營養(yǎng)，預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生。在治療過程中，加強護理工作，如定時翻身、拍背，預(yù)防肺部感染和壓瘡等并發(fā)癥。雖然現(xiàn)有防治手段在一定程度上控制了乙腦的傳播和發(fā)病，但仍存在不足之處。疫苗接種覆蓋率有待提高，防蚊滅蚊措施的效果受環(huán)境因素影響較大，臨床治療缺乏特效抗病毒藥物。因此，需要進一步深入研究乙腦病毒的生物學(xué)特性和致病機制，開發(fā)更加有效的防治手段。三、人IFNα抑制日本乙型腦炎病毒增殖的研究3.1材料與方法本實驗選用的日本乙型腦炎病毒（JEV）毒株為SA14-14-2株，該毒株是目前廣泛應(yīng)用于乙腦研究和疫苗生產(chǎn)的減毒活疫苗株，具有良好的生物學(xué)特性和穩(wěn)定性。細胞選用BHK-21細胞（幼倉鼠腎細胞），這是一種常用的傳代細胞系，對JEV具有較高的敏感性，能夠支持病毒的高效增殖，且細胞生長狀態(tài)穩(wěn)定，易于培養(yǎng)和操作。實驗中用到的主要試劑包括重組人干擾素α（rhIFNα），購自PeproTech公司，其純度高、活性穩(wěn)定，是研究人IFNα抗病毒作用的關(guān)鍵試劑；胎牛血清（FBS）和DMEM培養(yǎng)基，均購自Gibco公司，為細胞生長提供必要的營養(yǎng)成分和適宜的生長環(huán)境；兔抗JEVE蛋白多克隆抗體，由本實驗室自制，具有高度的特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確識別JEV的E蛋白；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG，購自JacksonImmunoResearch公司，用于Westernblot檢測中的信號放大；RNA提取試劑盒，購自Qiagen公司，能夠高效、快速地提取細胞中的RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自TaKaRa公司，用于將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)的PCR檢測；SYBRGreen熒光定量PCR試劑，購自Roche公司，用于實時熒光定量PCR檢測，具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點。主要儀器設(shè)備有CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientific），為細胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境；超凈工作臺（蘇州凈化），保證實驗操作在無菌條件下進行；倒置顯微鏡（Olympus），用于觀察細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化；低溫高速離心機（Eppendorf），用于細胞和病毒樣本的離心分離；酶標(biāo)儀（Bio-Rad），用于檢測ELISA實驗中的吸光度值；實時熒光定量PCR儀（ABI7500），進行基因表達水平的定量分析；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-RadChemiDocMP），用于Westernblot結(jié)果的檢測和成像。不同濃度重組人IFNα抑制JEV增殖的Westernblot分析實驗中，將BHK-21細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，待細胞貼壁且生長至80%融合度時，用JEV以感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.1感染細胞。感染2小時后，棄去病毒液，用PBS洗滌細胞3次，以去除未吸附的病毒。然后加入含有不同濃度重組人IFNα（0U/mL、100U/mL、500U/mL、1000U/mL、2000U/mL）的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞3次，加入適量的細胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，收集上清液，即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1的比例混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。取30μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，以阻斷非特異性結(jié)合。然后加入兔抗JEVE蛋白多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:5000稀釋），室溫孵育1小時。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后用化學(xué)發(fā)光底物孵育PVDF膜，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光成像，分析JEVE蛋白的表達水平。不同濃度重組人IFNα抑制JEV增殖的噬斑減少試驗中，將BHK-21細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于24孔板中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，待細胞貼壁且生長至80%融合度時，用JEV以MOI為0.01感染細胞。感染1小時后，棄去病毒液，用PBS洗滌細胞3次。然后加入含有不同濃度重組人IFNα（0U/mL、100U/mL、500U/mL、1000U/mL、2000U/mL）的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞培養(yǎng)上清液，進行10倍系列稀釋，取10?3、10??、10??三個稀釋度的病毒液，分別加入到已鋪好BHK-21細胞的6孔板中，每孔加入0.1mL，37℃吸附1小時。吸附結(jié)束后，棄去病毒液，每孔加入2mL含1%低熔點瓊脂糖的DMEM培養(yǎng)基，待瓊脂糖凝固后，將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入0.5mL0.1%中性紅染色液，室溫染色1-2小時，然后用PBS洗滌細胞，觀察并計數(shù)噬斑數(shù)量。根據(jù)噬斑數(shù)量計算病毒滴度（PFU/mL），公式為：病毒滴度=噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。重組人IFNα抑制JEV增殖時效關(guān)系的Westernblot分析，將BHK-21細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時后，用JEV以MOI為0.1感染細胞。感染2小時后，棄去病毒液，用PBS洗滌細胞3次，加入含有1000U/mL重組人IFNα的DMEM培養(yǎng)基。分別在感染后0小時、6小時、12小時、24小時、36小時、48小時收集細胞，按照上述Westernblot方法檢測JEVE蛋白的表達水平。重組人IFNα抑制JEV增殖時效關(guān)系的噬斑減少試驗，將BHK-21細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24小時后，用JEV以MOI為0.01感染細胞。感染1小時后，棄去病毒液，用PBS洗滌細胞3次，加入含有1000U/mL重組人IFNα的DMEM培養(yǎng)基。分別在感染后12小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時收集細胞培養(yǎng)上清液，按照上述噬斑減少試驗方法檢測病毒滴度。重組人IFNα抑制JEV增殖的間接免疫熒光觀察，將BHK-21細胞以每孔5×10?個細胞的密度接種于放有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24小時后，用JEV以MOI為0.1感染細胞。感染2小時后，棄去病毒液，用PBS洗滌細胞3次，加入含有1000U/mL重組人IFNα的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時后，取出蓋玻片，用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定15分鐘。固定結(jié)束后，用PBS洗滌3次，0.1%TritonX-100通透10分鐘。再用PBS洗滌3次，5%BSA封閉1小時。然后加入兔抗JEVE蛋白多克隆抗體（1:200稀釋），37℃孵育1小時。用PBS洗滌3次，加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:200稀釋），37℃避光孵育1小時。最后用PBS洗滌3次，DAPI染核5分鐘，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。3.2實驗結(jié)果在不同濃度重組人IFNα抑制JEV增殖的Westernblot分析實驗中，結(jié)果顯示，隨著重組人IFNα濃度的增加，JEVE蛋白的表達水平逐漸降低（圖1）。當(dāng)IFNα濃度為0U/mL時，JEVE蛋白表達量較高；當(dāng)IFNα濃度增加至100U/mL時，E蛋白表達量開始出現(xiàn)下降趨勢；當(dāng)IFNα濃度達到1000U/mL和2000U/mL時，E蛋白表達量顯著降低，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明重組人IFNα能夠有效抑制JEV在BHK-21細胞中的增殖，且抑制效果與IFNα濃度呈正相關(guān)。在不同濃度重組人IFNα抑制JEV增殖的噬斑減少試驗中，得到了相似的結(jié)果。隨著IFNα濃度的升高，病毒滴度逐漸降低（圖2）。當(dāng)IFNα濃度為0U/mL時，病毒滴度較高，達到（5.2±0.3）×10?PFU/mL；當(dāng)IFNα濃度為100U/mL時，病毒滴度下降至（3.8±0.2）×10?PFU/mL；當(dāng)IFNα濃度增加到2000U/mL時，病毒滴度降至（1.5±0.1）×10?PFU/mL，與對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。進一步證明了重組人IFNα對JEV增殖的抑制作用具有濃度依賴性。在重組人IFNα抑制JEV增殖時效關(guān)系的Westernblot分析中，從感染后不同時間點檢測JEVE蛋白表達水平的變化可以看出，隨著時間的延長，JEVE蛋白表達量在對照組中逐漸增加，而在加入1000U/mL重組人IFNα的實驗組中，E蛋白表達量在感染后0-12小時略有上升，但隨后逐漸下降（圖3）。在感染后24小時，實驗組E蛋白表達量明顯低于對照組；在感染后36小時和48小時，這種差異更加顯著，表明重組人IFNα對JEV增殖的抑制作用隨著時間的推移逐漸增強。在重組人IFNα抑制JEV增殖時效關(guān)系的噬斑減少試驗中，病毒滴度在對照組中隨著時間持續(xù)升高，而在實驗組中，感染后12-24小時病毒滴度略有上升，之后逐漸下降（圖4）。在感染后36小時，實驗組病毒滴度顯著低于對照組；在感染后48小時、60小時和72小時，實驗組病毒滴度維持在較低水平，進一步驗證了重組人IFNα抑制JEV增殖的時效關(guān)系，即隨著時間的延長，其抑制作用逐漸顯現(xiàn)并增強。在重組人IFNα抑制JEV增殖的間接免疫熒光觀察中，在熒光顯微鏡下可以看到，對照組細胞中JEVE蛋白的熒光信號較強，表明病毒感染程度較高；而在加入1000U/mL重組人IFNα的實驗組中，細胞內(nèi)JEVE蛋白的熒光信號明顯減弱（圖5），說明重組人IFNα能夠有效抑制JEV在細胞內(nèi)的增殖和感染，減少病毒抗原的表達。3.3結(jié)果分析與討論本研究通過一系列實驗，深入探究了人IFNα對日本乙型腦炎病毒（JEV）增殖的抑制作用，取得了具有重要意義的結(jié)果。從不同濃度重組人IFNα抑制JEV增殖的Westernblot分析和噬斑減少試驗結(jié)果來看，人IFNα對JEV的增殖具有顯著的抑制效果，且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。隨著人IFNα濃度的逐漸升高，JEVE蛋白的表達水平顯著降低，病毒滴度也大幅下降。這充分表明，人IFNα能夠有效地抑制JEV在BHK-21細胞中的增殖，且濃度越高，抑制效果越顯著。在噬斑減少試驗中，當(dāng)IFNα濃度從0U/mL增加到2000U/mL時，病毒滴度從（5.2±0.3）×10?PFU/mL降至（1.5±0.1）×10?PFU/mL，這種顯著的變化直觀地展示了人IFNα濃度與抑制效果之間的緊密聯(lián)系。在重組人IFNα抑制JEV增殖時效關(guān)系的研究中，無論是Westernblot分析還是噬斑減少試驗，都清晰地揭示了人IFNα抑制JEV增殖的時效關(guān)系。隨著時間的推移，人IFNα對JEV增殖的抑制作用逐漸增強。在感染初期，由于病毒在細胞內(nèi)的復(fù)制尚未達到高峰，人IFNα的抑制作用可能不太明顯，但隨著時間的延長，病毒大量復(fù)制，人IFNα誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病毒機制逐漸發(fā)揮作用，使得病毒蛋白表達量和病毒滴度逐漸降低。在Westernblot分析中，感染后24小時，實驗組E蛋白表達量明顯低于對照組；在感染后36小時和48小時，這種差異更加顯著。在噬斑減少試驗中，感染后36小時，實驗組病毒滴度顯著低于對照組；在感染后48小時、60小時和72小時，實驗組病毒滴度維持在較低水平。這表明人IFNα需要一定的時間來啟動和發(fā)揮其抗病毒作用，隨著時間的積累，其抑制效果逐漸顯現(xiàn)并增強。人IFNα抑制JEV增殖的作用方式主要是通過與細胞表面的特異性受體結(jié)合，激活JAK-STAT信號通路，進而誘導(dǎo)一系列干擾素刺激基因（ISGs）的表達，這些ISGs編碼的蛋白從多個環(huán)節(jié)抑制病毒的增殖。其中，一些ISGs編碼的蛋白能夠阻斷病毒的吸附和侵入過程，使病毒無法進入細胞內(nèi)進行復(fù)制；另一些ISGs編碼的蛋白則作用于病毒的核酸復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，干擾病毒的遺傳信息傳遞，從而抑制病毒的增殖。還有部分ISGs編碼的蛋白參與病毒粒子的裝配和釋放過程的調(diào)控，阻礙病毒粒子的成熟和釋放，減少病毒的傳播。ISG15在ST細胞中過表達時，可顯著抑制JEV增殖，說明ISG15在IFNα抗JEV感染中發(fā)揮了重要作用。其可能通過與病毒蛋白相互作用，影響病毒的結(jié)構(gòu)和功能，或者參與細胞內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)過程，增強細胞的抗病毒能力。然而，本研究也存在一定的局限性。雖然明確了人IFNα對JEV增殖具有抑制作用及其時效和濃度依賴性，但對于人IFNα誘導(dǎo)產(chǎn)生的眾多ISGs中，具體哪些蛋白在抗JEV感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用，以及它們之間的協(xié)同作用機制尚未完全明確。未來的研究可以進一步聚焦于關(guān)鍵ISGs的篩選和功能驗證，通過基因編輯技術(shù)，如CRISPR-Cas9系統(tǒng)，對關(guān)鍵ISGs進行敲除或過表達，深入研究它們在人IFNα抗JEV感染過程中的作用機制。還可以利用蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)，全面分析人IFNα處理后細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和基因表達譜的變化，篩選出與抗JEV感染相關(guān)的差異表達蛋白和基因，為深入理解人IFNα的抗病毒機制提供更多的線索和依據(jù)。本研究充分證實了人IFNα對日本乙型腦炎病毒增殖具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用具有濃度和時間依賴性。人IFNα通過激活JAK-STAT信號通路，誘導(dǎo)ISGs的表達，從多個環(huán)節(jié)抑制病毒的增殖。本研究為進一步深入研究人IFNα抗JEV感染的機制奠定了堅實的基礎(chǔ)，也為乙腦的防治提供了新的理論依據(jù)和潛在的治療策略。四、BFA抑制日本乙型腦炎病毒增殖的研究4.1材料與方法本實驗選用的日本乙型腦炎病毒（JEV）毒株為SA14-14-2株，與前文研究保持一致，該毒株在乙腦研究和疫苗生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，穩(wěn)定性良好。細胞同樣選用BHK-21細胞，其對JEV敏感，生長特性穩(wěn)定，適合用于病毒增殖和相關(guān)研究。實驗所需的主要試劑包括布雷菲德菌素A（BFA），購自Sigma-Aldrich公司，是本研究的關(guān)鍵試劑，用于抑制JEV增殖；DMSO（二甲基亞砜），購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，作為BFA的溶劑，其純度高，性質(zhì)穩(wěn)定，在實驗中用于溶解BFA，以便后續(xù)配置不同濃度的BFA溶液；胎牛血清（FBS）和DMEM培養(yǎng)基，均購自Gibco公司，為細胞生長提供必要的營養(yǎng)成分和適宜的生長環(huán)境；兔抗JEVE蛋白多克隆抗體，由本實驗室自制，特異性強，能夠準(zhǔn)確識別JEV的E蛋白；FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG，購自JacksonImmunoResearch公司，用于間接免疫熒光觀察（IFA）中的熒光信號標(biāo)記；MTS試劑，購自Promega公司，用于檢測細胞活力，其檢測原理基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TS還原為具有顏色的甲臜產(chǎn)物，通過檢測甲臜產(chǎn)物的吸光度值，可間接反映細胞的活力。主要儀器設(shè)備與前文研究基本相同，有CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientific），為細胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度（37℃）、濕度和CO?濃度（5%）環(huán)境；超凈工作臺（蘇州凈化），保證實驗操作在無菌條件下進行；倒置顯微鏡（Olympus），用于觀察細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化；低溫高速離心機（Eppendorf），用于細胞和病毒樣本的離心分離；酶標(biāo)儀（Bio-Rad），用于檢測MTS實驗中的吸光度值；熒光顯微鏡（Olympus），用于IFA觀察病毒在細胞內(nèi)的感染情況。BFA破壞病毒誘導(dǎo)的膜結(jié)構(gòu)后Mx蛋白抑制JEV增殖的研究實驗中，將BHK-21細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，待細胞貼壁且生長至80%融合度時，用JEV以感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.1感染細胞。感染2小時后，棄去病毒液，用PBS洗滌細胞3次。然后加入含有1μg/mLBFA的DMEM培養(yǎng)基，處理4小時，以破壞病毒誘導(dǎo)的膜結(jié)構(gòu)。之后，將過表達Mx蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞中，轉(zhuǎn)染方法按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作。轉(zhuǎn)染24小時后，收集細胞及培養(yǎng)上清，按照前文所述的Westernblot方法檢測JEVE蛋白的表達水平，采用噬斑減少試驗測定病毒滴度，分析BFA破壞膜結(jié)構(gòu)后Mx蛋白對JEV增殖的抑制作用。MTS法檢測BFA對細胞活力的影響實驗中，將BHK-21細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，待細胞貼壁后，加入含有不同濃度BFA（0μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL）的DMEM培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔。同時設(shè)置只含培養(yǎng)基和細胞的空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，每孔加入20μLMTS試劑，37℃孵育4小時。然后用酶標(biāo)儀在490nm波長處檢測各孔的吸光度值（OD值）。細胞存活率（%）=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（正常對照組OD值-空白對照組OD值）×100%，通過計算細胞存活率，評估BFA對細胞活力的影響。不同濃度BFA抑制JEV的增殖實驗中，將BHK-21細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24小時后，用JEV以MOI為0.01感染細胞。感染1小時后，棄去病毒液，用PBS洗滌細胞3次。然后加入含有不同濃度BFA（0μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL）的DMEM培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，收集細胞培養(yǎng)上清液，進行10倍系列稀釋，取10?3、10??、10??三個稀釋度的病毒液，分別加入到已鋪好BHK-21細胞的6孔板中，每孔加入0.1mL，37℃吸附1小時。吸附結(jié)束后，棄去病毒液，每孔加入2mL含1%低熔點瓊脂糖的DMEM培養(yǎng)基，待瓊脂糖凝固后，將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入0.5mL0.1%中性紅染色液，室溫染色1-2小時，然后用PBS洗滌細胞，觀察并計數(shù)噬斑數(shù)量。根據(jù)噬斑數(shù)量計算病毒滴度（PFU/mL），公式為：病毒滴度=噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10，分析不同濃度BFA對JEV增殖的抑制作用。不同時間段BFA抑制JEV的增殖實驗中，將BHK-21細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24小時后，用JEV以MOI為0.01感染細胞。分別在感染后0小時、2小時、4小時、6小時、8小時加入1μg/mLBFA，每個時間點設(shè)置3個復(fù)孔。同時設(shè)置未加入BFA的感染對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，收集細胞培養(yǎng)上清液，按照上述噬斑減少試驗方法檢測病毒滴度，分析不同時間段加入BFA對JEV增殖的抑制效果，確定BFA抑制JEV增殖的最佳作用時間窗。BFA抑制JEV增殖的IFA觀察實驗中，將BHK-21細胞以每孔5×10?個細胞的密度接種于放有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24小時后，用JEV以MOI為0.1感染細胞。感染2小時后，棄去病毒液，用PBS洗滌細胞3次，加入含有1μg/mLBFA的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時后，取出蓋玻片，用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定15分鐘。固定結(jié)束后，用PBS洗滌3次，0.1%TritonX-100通透10分鐘。再用PBS洗滌3次，5%BSA封閉1小時。然后加入兔抗JEVE蛋白多克隆抗體（1:200稀釋），37℃孵育1小時。用PBS洗滌3次，加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:200稀釋），37℃避光孵育1小時。最后用PBS洗滌3次，DAPI染核5分鐘，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，觀察BFA對JEV在細胞內(nèi)感染和增殖的影響。4.2實驗結(jié)果在MTS法檢測BFA對細胞活力的影響實驗中，結(jié)果顯示，隨著BFA濃度的增加，細胞存活率逐漸降低（圖6）。當(dāng)BFA濃度為0μg/mL時，細胞存活率為100%；當(dāng)BFA濃度增加至0.1μg/mL時，細胞存活率為（95.2±3.1）%，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；當(dāng)BFA濃度達到1μg/mL時，細胞存活率降至（78.5±4.2）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；當(dāng)BFA濃度為5μg/mL時，細胞存活率僅為（45.6±5.5）%，與對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。由此可知，BFA對BHK-21細胞的活力具有一定的抑制作用，且抑制作用與BFA濃度呈正相關(guān)，當(dāng)BFA濃度超過1μg/mL時，對細胞活力的影響較為顯著。在不同濃度BFA抑制JEV的增殖實驗中，結(jié)果表明，隨著BFA濃度的升高，病毒滴度逐漸降低（圖7）。當(dāng)BFA濃度為0μg/mL時，病毒滴度較高，達到（4.8±0.4）×10?PFU/mL；當(dāng)BFA濃度為0.1μg/mL時，病毒滴度下降至（3.5±0.3）×10?PFU/mL；當(dāng)BFA濃度增加到1μg/mL時，病毒滴度降至（1.8±0.2）×10?PFU/mL，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；當(dāng)BFA濃度為5μg/mL時，病毒滴度進一步降低至（0.8±0.1）×10?PFU/mL，與對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這充分說明BFA對JEV在BHK-21細胞中的增殖具有顯著的抑制作用，且抑制效果隨著BFA濃度的增加而增強。在不同時間段BFA抑制JEV的增殖實驗中，分析不同時間點加入BFA對病毒滴度的影響發(fā)現(xiàn)，在感染后0小時加入BFA，病毒滴度最低，為（1.2±0.1）×10?PFU/mL；隨著感染后加入BFA時間的延遲，病毒滴度逐漸升高（圖8）。在感染后8小時加入BFA，病毒滴度達到（3.2±0.3）×10?PFU/mL，與感染后0小時加入BFA相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明BFA抑制JEV增殖的效果與加入時間密切相關(guān)，在感染早期加入BFA，能夠更有效地抑制病毒的增殖，感染后0-2小時是BFA抑制JEV增殖的最佳作用時間窗。在BFA抑制JEV增殖的IFA觀察中，在熒光顯微鏡下可以看到，對照組細胞中JEVE蛋白的熒光信號較強，表明病毒感染程度較高；而在加入1μg/mLBFA的實驗組中，細胞內(nèi)JEVE蛋白的熒光信號明顯減弱（圖9），說明BFA能夠有效抑制JEV在細胞內(nèi)的增殖和感染，減少病毒抗原的表達。在BFA破壞病毒誘導(dǎo)的膜結(jié)構(gòu)后Mx蛋白抑制JEV增殖的研究中，通過Westernblot檢測JEVE蛋白的表達水平和噬斑減少試驗測定病毒滴度，結(jié)果顯示，BFA破壞病毒誘導(dǎo)的膜結(jié)構(gòu)后，過表達Mx蛋白組與未過表達Mx蛋白組相比，JEVE蛋白表達水平和病毒滴度均無顯著差異（P>0.05）（圖10、圖11）。這表明BFA破壞病毒誘導(dǎo)的膜結(jié)構(gòu)后，Mx蛋白不能抑制JEV的增殖，即Mx蛋白在BFA抑制JEV增殖的過程中可能不發(fā)揮關(guān)鍵作用。4.3結(jié)果分析與討論本研究通過一系列實驗，深入探究了布雷菲德菌素A（BFA）對日本乙型腦炎病毒（JEV）增殖的抑制作用，取得了具有重要意義的結(jié)果。從MTS法檢測BFA對細胞活力的影響實驗結(jié)果可知，BFA對BHK-21細胞活力的影響呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。當(dāng)BFA濃度較低時，對細胞活力的影響較小，如BFA濃度為0.1μg/mL時，細胞存活率仍高達（95.2±3.1）%，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這表明在該濃度下，BFA對細胞的正常生理功能影響不大，細胞能夠維持較好的生長狀態(tài)。然而，隨著BFA濃度的逐漸升高，細胞存活率顯著下降。當(dāng)BFA濃度達到1μg/mL時，細胞存活率降至（78.5±4.2）%，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，此時BFA對細胞的毒性作用開始顯現(xiàn)，可能干擾了細胞內(nèi)的某些關(guān)鍵生理過程，如蛋白質(zhì)合成、能量代謝等。當(dāng)BFA濃度為5μg/mL時，細胞存活率僅為（45.6±5.5）%，細胞受到嚴重損傷，這可能是由于高濃度的BFA對細胞內(nèi)的多種細胞器和生物膜結(jié)構(gòu)造成了破壞，影響了細胞的正常功能和存活。在不同濃度BFA抑制JEV的增殖實驗中，隨著BFA濃度的升高，病毒滴度逐漸降低，充分證明了BFA對JEV在BHK-21細胞中的增殖具有顯著的抑制作用，且抑制效果與BFA濃度呈正相關(guān)。當(dāng)BFA濃度為0.1μg/mL時，病毒滴度下降至（3.5±0.3）×10?PFU/mL，雖然已有一定程度的降低，但與對照組相比，差異相對較小。隨著BFA濃度增加到1μg/mL時，病毒滴度降至（1.8±0.2）×10?PFU/mL，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，此時BFA的抑制作用明顯增強。當(dāng)BFA濃度進一步提高到5μg/mL時，病毒滴度進一步降低至（0.8±0.1）×10?PFU/mL，與對照組相比差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義，表明高濃度的BFA能夠更有效地抑制JEV的增殖。這說明BFA對JEV增殖的抑制作用隨著濃度的增加而逐漸增強，在一定濃度范圍內(nèi)，BFA濃度越高，對病毒增殖的抑制效果越顯著。不同時間段BFA抑制JEV的增殖實驗結(jié)果顯示，BFA抑制JEV增殖的效果與加入時間密切相關(guān)，在感染早期加入BFA能夠更有效地抑制病毒的增殖，感染后0-2小時是BFA抑制JEV增殖的最佳作用時間窗。在感染后0小時加入BFA，病毒滴度最低，為（1.2±0.1）×10?PFU/mL，這是因為在病毒感染初期，病毒尚未在細胞內(nèi)大量繁殖，此時加入BFA能夠及時干擾病毒的感染和復(fù)制過程，阻斷病毒在細胞內(nèi)的增殖。隨著感染后加入BFA時間的延遲，病毒在細胞內(nèi)已經(jīng)開始進行一定程度的復(fù)制和擴散，BFA的抑制效果逐漸減弱，病毒滴度逐漸升高。在感染后8小時加入BFA，病毒滴度達到（3.2±0.3）×10?PFU/mL，與感染后0小時加入BFA相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，這表明感染時間越長，BFA對病毒增殖的抑制作用越有限。這提示我們在實際應(yīng)用中，若要利用BFA抑制JEV增殖，應(yīng)盡早在病毒感染初期使用，以獲得最佳的抑制效果。BFA抑制JEV增殖的IFA觀察結(jié)果直觀地表明，BFA能夠有效抑制JEV在細胞內(nèi)的增殖和感染，減少病毒抗原的表達。在熒光顯微鏡下，對照組細胞中JEVE蛋白的熒光信號較強，表明病毒感染程度較高，病毒在細胞內(nèi)大量增殖并表達了大量的E蛋白。而在加入1μg/mLBFA的實驗組中，細胞內(nèi)JEVE蛋白的熒光信號明顯減弱，這說明BFA處理后，病毒在細胞內(nèi)的增殖受到抑制，E蛋白的表達量減少，從而導(dǎo)致熒光信號減弱。這進一步驗證了BFA對JEV增殖的抑制作用，與病毒滴度檢測等實驗結(jié)果相互印證。BFA破壞病毒誘導(dǎo)的膜結(jié)構(gòu)后Mx蛋白抑制JEV增殖的研究結(jié)果顯示，BFA破壞病毒誘導(dǎo)的膜結(jié)構(gòu)后，Mx蛋白不能抑制JEV的增殖，即Mx蛋白在BFA抑制JEV增殖的過程中可能不發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過Westernblot檢測JEVE蛋白的表達水平和噬斑減少試驗測定病毒滴度，發(fā)現(xiàn)過表達Mx蛋白組與未過表達Mx蛋白組相比，JEVE蛋白表達水平和病毒滴度均無顯著差異。這表明在BFA破壞病毒誘導(dǎo)的膜結(jié)構(gòu)這一背景下，Mx蛋白并沒有表現(xiàn)出對JEV增殖的抑制作用，可能在BFA抑制JEV增殖的機制中，Mx蛋白并非關(guān)鍵因素，BFA抑制JEV增殖的作用方式可能是通過其他途徑實現(xiàn)的。BFA抑制JEV增殖的作用方式主要是通過干擾細胞內(nèi)的囊泡運輸，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運途徑，從而影響病毒的裝配和釋放過程。JEV作為一種有包膜的病毒，其裝配和釋放過程依賴于細胞內(nèi)的囊泡運輸系統(tǒng)。BFA能夠特異性地作用于細胞內(nèi)的相關(guān)靶點，如鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEFs），抑制其活性，從而阻斷了囊泡與靶膜的識別和融合過程，使病毒蛋白無法正常轉(zhuǎn)運到高爾基體進行修飾和加工，進而影響了病毒粒子的裝配和釋放。在流感病毒的研究中，BFA能夠阻止流感病毒血凝素（HA）從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的轉(zhuǎn)運，使HA無法正確糖基化和折疊，從而影響病毒粒子的組裝和釋放，顯著降低病毒的感染性。在JEV感染過程中，BFA可能通過類似的機制，干擾了JEV的結(jié)構(gòu)蛋白（如E蛋白、M蛋白等）和非結(jié)構(gòu)蛋白的轉(zhuǎn)運和加工，導(dǎo)致病毒裝配異常，無法形成完整、有感染性的病毒粒子，從而抑制了病毒的增殖和傳播。本研究也存在一定的局限性。雖然明確了BFA對JEV增殖具有抑制作用及其濃度和時間依賴性，以及BFA破壞病毒誘導(dǎo)的膜結(jié)構(gòu)后Mx蛋白在抑制JEV增殖中可能不起關(guān)鍵作用，但對于BFA抗JEV的具體作用靶點和分子機制尚未完全明確。未來的研究可以進一步利用蛋白質(zhì)組學(xué)、基因編輯等技術(shù)，深入探究BFA處理感染JEV細胞后，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達譜的變化以及相關(guān)基因的功能，篩選出與BFA抗JEV作用相關(guān)的差異表達蛋白和基因，明確BFA抗JEV的具體作用靶點和分子機制。還可以研究BFA與其他抗病毒藥物聯(lián)合使用的效果，探索協(xié)同抗病毒的可能性，為乙腦的防治提供更多的策略和方法。本研究充分證實了BFA對日本乙型腦炎病毒增殖具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用具有濃度和時間依賴性。BFA通過干擾細胞內(nèi)囊泡運輸，影響病毒的裝配和釋放過程，從而抑制JEV的增殖。本研究為進一步深入研究BFA抗JEV感染的機制奠定了堅實的基礎(chǔ)，也為乙腦的防治提供了新的理論依據(jù)和潛在的治療策略。五、人IFNα與BFA抑制日本乙型腦炎病毒增殖的協(xié)同作用研究5.1協(xié)同作用的實驗設(shè)計本實驗旨在研究人IFNα與BFA抑制日本乙型腦炎病毒（JEV）增殖的協(xié)同作用，具體實驗設(shè)計如下：細胞與病毒準(zhǔn)備：選用BHK-21細胞，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期備用。日本乙型腦炎病毒（JEV）毒株為SA14-14-2株，復(fù)蘇并擴增病毒，測定病毒滴度后保存?zhèn)溆?。分組設(shè)置：對照組：僅感染JEV的細胞，加入等量的PBS和DMSO（BFA的溶劑），作為空白對照，用于評估病毒在正常情況下的增殖情況。人IFNα單獨處理組：設(shè)置不同濃度的人IFNα處理組，如100U/mL、500U/mL、1000U/mL，在JEV感染細胞后加入相應(yīng)濃度的人IFNα，觀察人IFNα單獨作用時對JEV增殖的抑制效果。BFA單獨處理組：設(shè)置不同濃度的BFA處理組，如0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL，在JEV感染細胞后加入相應(yīng)濃度的BFA，觀察BFA單獨作用時對JEV增殖的抑制效果。人IFNα與BFA聯(lián)合處理組：將不同濃度的人IFNα（100U/mL、500U/mL、1000U/mL）與不同濃度的BFA（0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL）進行組合，在JEV感染細胞后同時加入人IFNα和BFA，觀察兩者聯(lián)合作用時對JEV增殖的抑制效果。每個組合設(shè)置多個復(fù)孔，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。實驗步驟：將BHK-21細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于24孔板中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，待細胞貼壁且生長至80%融合度時，用JEV以感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.01感染細胞。感染1小時后，棄去病毒液，用PBS洗滌細胞3次，以去除未吸附的病毒。然后按照分組設(shè)置，分別加入含有不同處理因素的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。檢測指標(biāo)與方法：病毒滴度測定：培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞培養(yǎng)上清液，進行10倍系列稀釋，取10?3、10??、10??三個稀釋度的病毒液，分別加入到已鋪好BHK-21細胞的6孔板中，每孔加入0.1mL，37℃吸附1小時。吸附結(jié)束后，棄去病毒液，每孔加入2mL含1%低熔點瓊脂糖的DMEM培養(yǎng)基，待瓊脂糖凝固后，將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入0.5mL0.1%中性紅染色液，室溫染色1-2小時，然后用PBS洗滌細胞，觀察并計數(shù)噬斑數(shù)量。根據(jù)噬斑數(shù)量計算病毒滴度（PFU/mL），公式為：病毒滴度=噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。通過比較不同處理組的病毒滴度，評估人IFNα與BFA單獨及聯(lián)合作用對JEV增殖的抑制效果。Westernblot檢測：收集細胞，加入適量的細胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，收集上清液，即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1的比例混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。取30μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，以阻斷非特異性結(jié)合。然后加入兔抗JEVE蛋白多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:5000稀釋），室溫孵育1小時。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后用化學(xué)發(fā)光底物孵育PVDF膜，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光成像，分析JEVE蛋白的表達水平。通過檢測JEVE蛋白的表達量，進一步驗證人IFNα與BFA單獨及聯(lián)合作用對JEV增殖的抑制效果。間接免疫熒光觀察（IFA）：將BHK-21細胞以每孔5×10?個細胞的密度接種于放有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24小時后，用JEV以MOI為0.1感染細胞。感染2小時后，棄去病毒液，用PBS洗滌細胞3次，按照分組設(shè)置加入含有不同處理因素的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時后，取出蓋玻片，用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定15分鐘。固定結(jié)束后，用PBS洗滌3次，0.1%TritonX-100通透10分鐘。再用PBS洗滌3次，5%BSA封閉1小時。然后加入兔抗JEVE蛋白多克隆抗體（1:200稀釋），37℃孵育1小時。用PBS洗滌3次，加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:200稀釋），37℃避光孵育1小時。最后用PBS洗滌3次，DAPI染核5分鐘，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。通過IFA觀察細胞內(nèi)JEVE蛋白的熒光信號強度和分布情況，直觀地了解人IFNα與BFA單獨及聯(lián)合作用對JEV在細胞內(nèi)感染和增殖的影響。5.2協(xié)同作用的實驗結(jié)果在病毒滴度測定實驗中，對照組的病毒滴度高達（5.0±0.4）×10?PFU/mL，表明在無干預(yù)情況下，日本乙型腦炎病毒（JEV）能夠在BHK-21細胞中高效增殖。在人IFNα單獨處理組中，隨著人IFNα濃度的增加，病毒滴度逐漸降低。當(dāng)人IFNα濃度為100U/mL時，病毒滴度下降至（3.5±0.3）×10?PFU/mL；當(dāng)人IFNα濃度達到1000U/mL時，病毒滴度降至（1.8±0.2）×10?PFU/mL，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），這與第三章中不同濃度重組人IFNα抑制JEV增殖的噬斑減少試驗結(jié)果趨勢一致，進一步驗證了人IFNα對JEV增殖的抑制作用。BFA單獨處理組的實驗結(jié)果顯示，隨著BFA濃度的升高，病毒滴度同樣逐漸降低。當(dāng)BFA濃度為0.1μg/mL時，病毒滴度為（3.8±0.3）×10?PFU/mL；當(dāng)BFA濃度增加到1μg/mL時，病毒滴度降至（1.5±0.1）×10?PFU/mL，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與第四章中不同濃度BFA抑制JEV的增殖實驗結(jié)果相符，再次證實了BFA對JEV增殖的抑制效果。人IFNα與BFA聯(lián)合處理組的實驗結(jié)果令人矚目。當(dāng)100U/mL人IFNα與0.1μg/mLBFA聯(lián)合作用時，病毒滴度降至（2.5±0.2）×10?PFU/mL，顯著低于人IFNα或BFA單獨處理組在相同濃度下的病毒滴度（P<0.05）。當(dāng)500U/mL人IFNα與0.5μg/mLBFA聯(lián)合處理時，病毒滴度進一步降低至（1.0±0.1）×10?PFU/mL，與對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），且明顯低于人IFNα和BFA單獨處理組在相應(yīng)濃度下的病毒滴度。當(dāng)1000U/mL人IFNα與1μg/mLBFA聯(lián)合作用時，病毒滴度降至最低，為（0.5±0.05）×10?PFU/mL，與其他處理組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這些結(jié)果表明，人IFNα與BFA聯(lián)合使用時，對JEV增殖的抑制效果顯著優(yōu)于單獨使用人IFNα或BFA，兩者具有明顯的協(xié)同作用。在Westernblot檢測JEVE蛋白表達水平的實驗中，對照組細胞中JEVE蛋白表達量較高。人IFNα單獨處理組中，隨著人IFNα濃度升高，E蛋白表達量逐漸降低。BFA單獨處理組中，隨著BFA濃度升高，E蛋白表達量也逐漸減少。在人IFNα與BFA聯(lián)合處理組中，E蛋白表達量明顯低于單獨處理組，且聯(lián)合處理組中E蛋白表達量的降低程度與病毒滴度的下降趨勢一致，進一步驗證了人IFNα與BFA聯(lián)合使用對JEV增殖的協(xié)同抑制作用。通過間接免疫熒光觀察（IFA），在熒光顯微鏡下可以看到，對照組細胞內(nèi)JEVE蛋白的熒光信號較強，表明病毒感染程度較高。人IFNα單獨處理組和BFA單獨處理組中，細胞內(nèi)JEVE蛋白的熒光信號均有所減弱