miR-224-3p靶向調(diào)控FUT4影響乳腺癌多耐藥的機制探究一、引言1.1研究背景乳腺癌作為女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著全球女性的健康。近年來，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌新發(fā)病例高達226萬例，超越肺癌成為全球第一大癌癥。在中國，乳腺癌同樣是女性癌癥發(fā)病的首位，2020年新發(fā)病例約為42萬，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢，中國女性乳腺癌的高發(fā)年齡在45-55歲之間，較西方女性早10-15年。手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療及靶向治療等是當前乳腺癌的主要治療手段?；熢谌橄侔┚C合治療中占據(jù)重要地位，然而多藥耐藥（MultidrugResistance，MDR）問題的出現(xiàn)嚴重阻礙了化療的療效，成為乳腺癌治療失敗和患者預后不良的主要原因之一。多藥耐藥指腫瘤細胞對一種化療藥物產(chǎn)生耐藥的同時，對其他結(jié)構(gòu)和作用機制不同的化療藥物也產(chǎn)生交叉耐藥。一旦乳腺癌細胞出現(xiàn)多藥耐藥，化療藥物就難以有效殺傷腫瘤細胞，導致腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移風險增加，患者生存率降低。據(jù)統(tǒng)計，約30%-50%的乳腺癌患者在化療過程中會出現(xiàn)多藥耐藥現(xiàn)象，這使得乳腺癌的治療面臨巨大挑戰(zhàn)。目前，乳腺癌多藥耐藥的機制尚未完全明確，其涉及多個層面和多種因素。包括藥物外排泵的過度表達，如P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp），可將化療藥物主動泵出細胞，降低細胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥；細胞內(nèi)藥物代謝酶的改變，影響藥物的代謝和活化過程，導致藥物療效下降；細胞凋亡通路的異常，腫瘤細胞可通過抑制凋亡信號傳導，逃避化療藥物誘導的細胞死亡；以及腫瘤干細胞的存在，這些細胞具有自我更新和多向分化能力，對化療藥物相對不敏感，能夠在化療后存活并重新增殖，引發(fā)腫瘤復發(fā)和耐藥。此外，腫瘤微環(huán)境、信號通路的異常激活等因素也在乳腺癌多藥耐藥中發(fā)揮重要作用。深入研究乳腺癌多藥耐藥機制，尋找有效的逆轉(zhuǎn)耐藥策略，對于提高乳腺癌治療效果、改善患者預后具有迫切的現(xiàn)實意義。微小RNA（MicroRNA，miRNA）作為一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長度約為22個核苷酸，通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UntranslatedRegion，3'-UTR）互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。越來越多的研究表明，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FUT4作為一種參與糖蛋白和糖脂合成的關(guān)鍵酶，其表達水平與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移能力以及多藥耐藥性密切相關(guān)。本研究旨在探討miR-224-3p是否通過靶向調(diào)控巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FUT4參與乳腺癌多藥耐藥過程，為揭示乳腺癌多藥耐藥的分子機制提供新的線索，為臨床治療乳腺癌多藥耐藥提供潛在的新靶點和治療策略。1.2miR-224-3p與FUT4概述miR-224-3p屬于微小RNA家族中的一員，在多種細胞生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。它廣泛存在于人體組織和細胞中，參與細胞增殖、分化、凋亡以及代謝等重要生物學過程。在正常生理狀態(tài)下，miR-224-3p維持著相對穩(wěn)定的表達水平，確保細胞各項功能的正常運行。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，miR-224-3p的表達常常出現(xiàn)異常改變。研究表明，在多種腫瘤組織中，如肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等，miR-224-3p的表達水平與正常組織相比存在顯著差異。在某些腫瘤中，miR-224-3p呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，通過抑制其下游靶基因的表達，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，抑制細胞凋亡，從而推動腫瘤的發(fā)展；而在另一些腫瘤中，miR-224-3p則低表達，使得其對靶基因的抑制作用減弱，導致靶基因異常激活，同樣參與腫瘤的惡性進程。在乳腺癌中，miR-224-3p的異常表達也與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及預后密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-224-3p在乳腺癌組織中的表達水平明顯高于正常乳腺組織，且其高表達與乳腺癌的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等不良預后因素相關(guān)。進一步研究表明，miR-224-3p可通過調(diào)控相關(guān)靶基因，參與乳腺癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為的調(diào)控，從而在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FUT4是一種參與巖藻糖基化修飾過程的關(guān)鍵酶，屬于巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族。它主要催化巖藻糖從鳥苷二磷酸-巖藻糖（GDP-Fuc）轉(zhuǎn)移到特定的糖蛋白或糖脂的寡糖鏈上，形成巖藻糖基化修飾產(chǎn)物。這種修飾過程在細胞表面糖蛋白和糖脂的合成中起著至關(guān)重要的作用，進而影響細胞的多種生物學功能。在正常組織中，F(xiàn)UT4的表達受到嚴格的調(diào)控，維持在相對穩(wěn)定的水平，以確保細胞的正常生理功能。然而，在腫瘤組織中，F(xiàn)UT4的表達常常發(fā)生顯著變化。大量研究表明，F(xiàn)UT4在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，如肝癌、胰腺癌、卵巢癌等。在這些腫瘤中，F(xiàn)UT4的高表達與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移能力以及多藥耐藥性密切相關(guān)。在乳腺癌中，F(xiàn)UT4的表達水平同樣顯著高于正常乳腺組織。FUT4高表達的乳腺癌細胞具有更強的增殖、遷移和侵襲能力，且對化療藥物的敏感性降低，更容易產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象。其作用機制可能與FUT4介導的巖藻糖基化修飾改變了腫瘤細胞表面糖蛋白和糖脂的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)，進而影響腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用、細胞間通訊以及信號傳導通路等，促進腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和耐藥。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探討miR-224-3p對巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FUT4的靶向調(diào)控作用，以及這一調(diào)控機制在乳腺癌多藥耐藥過程中所扮演的角色。具體而言，通過一系列實驗技術(shù)，明確miR-224-3p與FUT4之間的靶向關(guān)系，確定miR-224-3p對FUT4表達水平的影響，并進一步探究這種調(diào)控關(guān)系如何影響乳腺癌細胞對化療藥物的敏感性，揭示其在乳腺癌多藥耐藥中的具體作用機制。從理論意義層面來看，乳腺癌多藥耐藥機制的研究一直是腫瘤領(lǐng)域的熱點和難點問題。盡管目前已經(jīng)取得了一些進展，但仍有許多未知環(huán)節(jié)有待進一步探索。miR-224-3p和FUT4在腫瘤中的作用雖有一定研究，但二者之間的調(diào)控關(guān)系以及在乳腺癌多藥耐藥中的協(xié)同作用尚未完全明確。本研究將從新的視角揭示乳腺癌多藥耐藥的分子機制，為深入理解腫瘤耐藥的本質(zhì)提供理論依據(jù)，豐富和完善乳腺癌多藥耐藥的理論體系。通過明確miR-224-3p靶向調(diào)控FUT4在乳腺癌多藥耐藥中的作用，有助于發(fā)現(xiàn)新的信號通路和分子靶點，為后續(xù)相關(guān)研究提供新的思路和方向，推動腫瘤耐藥機制研究領(lǐng)域的發(fā)展。在實踐意義方面，乳腺癌多藥耐藥嚴重影響化療效果，導致患者預后不佳。本研究的成果有望為臨床治療乳腺癌多藥耐藥提供新的靶點和治療策略。如果能夠證實miR-224-3p/FUT4調(diào)控軸在乳腺癌多藥耐藥中的關(guān)鍵作用，那么可以針對這一靶點開發(fā)新型的治療藥物或治療方法，如設(shè)計miR-224-3p模擬物或抑制劑，以調(diào)節(jié)其表達水平，進而影響FUT4的表達，逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞的多藥耐藥性，提高化療藥物的療效。此外，miR-224-3p和FUT4還可能作為乳腺癌多藥耐藥的預測標志物，用于臨床檢測和評估患者的耐藥風險，為個性化治療方案的制定提供依據(jù)，有助于醫(yī)生更精準地選擇治療方法，提高治療效果，改善患者的生活質(zhì)量和生存率。二、乳腺癌多藥耐藥及相關(guān)分子機制2.1乳腺癌多藥耐藥現(xiàn)象在乳腺癌的臨床治療中，多藥耐藥是一個極為棘手的難題，嚴重制約著化療的效果，極大地影響了患者的預后。當乳腺癌細胞出現(xiàn)多藥耐藥時，原本對腫瘤細胞具有殺傷作用的化療藥物，其療效會顯著降低甚至完全失效。這意味著腫瘤細胞能夠抵御化療藥物的攻擊，繼續(xù)存活、增殖并擴散，導致腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移的風險大幅增加。在眾多化療藥物中，蒽環(huán)類藥物如阿霉素、表柔比星，以及紫杉類藥物如紫杉醇、多西他賽等，是乳腺癌化療的常用藥物。然而，臨床實踐中常常發(fā)現(xiàn)，部分乳腺癌患者在接受這些藥物治療一段時間后，會逐漸對其產(chǎn)生耐藥性。以阿霉素為例，它通過嵌入DNA雙鏈之間，抑制DNA拓撲異構(gòu)酶II的活性，從而干擾DNA的復制和轉(zhuǎn)錄過程，達到殺傷腫瘤細胞的目的。但耐藥的乳腺癌細胞可通過多種機制，如過度表達P-糖蛋白（P-gp）等藥物外排泵，將阿霉素快速泵出細胞，使得細胞內(nèi)藥物濃度降低，無法達到有效殺傷腫瘤細胞的劑量。同樣，紫杉醇主要作用于細胞微管，抑制微管的解聚，從而阻斷細胞的有絲分裂過程。耐藥細胞則可能通過改變微管蛋白的結(jié)構(gòu)或表達水平，降低紫杉醇與微管的結(jié)合能力，或者通過激活其他信號通路來逃避紫杉醇誘導的細胞凋亡，進而對紫杉醇產(chǎn)生耐藥。一旦乳腺癌細胞對這些常見化療藥物產(chǎn)生耐藥，后續(xù)的治療將陷入困境。一方面，可選擇的有效化療藥物種類減少，醫(yī)生在制定治療方案時面臨很大的局限性。對于耐藥患者，更換其他化療藥物往往效果不佳，因為多藥耐藥現(xiàn)象常伴隨著對多種不同作用機制化療藥物的交叉耐藥。例如，對阿霉素耐藥的乳腺癌細胞，可能同時對長春新堿、依托泊苷等其他結(jié)構(gòu)和作用機制不同的化療藥物也產(chǎn)生耐藥。另一方面，耐藥還會導致治療周期延長、治療費用增加，給患者帶來沉重的經(jīng)濟負擔和身心痛苦。而且，由于腫瘤細胞的持續(xù)增殖和擴散，患者的生存時間明顯縮短，生活質(zhì)量嚴重下降。在晚期乳腺癌患者中，多藥耐藥更是使得疾病難以控制，患者的五年生存率顯著降低。因此，深入研究乳腺癌多藥耐藥的分子機制，尋找有效的逆轉(zhuǎn)耐藥方法，是當前乳腺癌治療領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。2.2多藥耐藥的分子機制乳腺癌多藥耐藥是一個極其復雜的過程，涉及多個分子機制的協(xié)同作用。其中，ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族介導的藥物外排是經(jīng)典的耐藥機制之一。ABC轉(zhuǎn)運蛋白是一類ATP依賴性的跨膜蛋白，在正常組織和腫瘤細胞中均有表達。在乳腺癌細胞中，P-糖蛋白（P-gp，由ABCB1基因編碼）、多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1，由ABCC1基因編碼）和乳腺癌耐藥蛋白（BCRP，由ABCG2基因編碼）等ABC轉(zhuǎn)運蛋白的過度表達較為常見。這些轉(zhuǎn)運蛋白能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將化療藥物從細胞內(nèi)泵出到細胞外，從而降低細胞內(nèi)藥物濃度，使化療藥物無法達到有效殺傷腫瘤細胞的劑量，導致腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥。例如，P-gp具有廣泛的底物特異性，能夠識別并轉(zhuǎn)運多種化療藥物，如阿霉素、紫杉醇、長春新堿等。研究表明，在多藥耐藥的乳腺癌細胞系中，P-gp的表達水平顯著高于敏感細胞系，且其表達水平與細胞對化療藥物的耐藥程度呈正相關(guān)。通過抑制P-gp的功能或降低其表達水平，可部分恢復乳腺癌細胞對化療藥物的敏感性。除了ABC轉(zhuǎn)運蛋白，細胞內(nèi)藥物代謝酶的改變也在乳腺癌多藥耐藥中發(fā)揮重要作用。細胞色素P450（CYP）酶系是參與藥物代謝的重要酶類，其中CYP3A4、CYP2D6等在乳腺癌細胞中表達豐富。這些酶能夠催化化療藥物的氧化、還原、水解等代謝反應，使其轉(zhuǎn)化為無活性或低活性的代謝產(chǎn)物，從而降低化療藥物的療效。例如，他莫昔芬是乳腺癌內(nèi)分泌治療的常用藥物，其活性代謝產(chǎn)物4-羥基他莫昔芬和N-去甲基-4-羥基他莫昔芬具有更強的抗雌激素活性。然而，CYP2D6基因的多態(tài)性會影響他莫昔芬的代謝過程，某些CYP2D6弱代謝型患者，由于其體內(nèi)他莫昔芬代謝為活性代謝產(chǎn)物的能力降低，導致治療效果不佳，更容易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。此外，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）等其他藥物代謝酶也能通過與化療藥物結(jié)合，促進其代謝和排泄，參與乳腺癌多藥耐藥的形成。細胞凋亡通路的異常是乳腺癌多藥耐藥的另一個重要分子機制。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡過程，在維持機體正常生理功能和抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用?；熕幬锿ǔＭㄟ^誘導腫瘤細胞凋亡來發(fā)揮治療作用。然而，在多藥耐藥的乳腺癌細胞中，凋亡信號通路常常受到抑制，導致腫瘤細胞逃避化療藥物誘導的凋亡。Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡的重要調(diào)控因子，包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）。在正常細胞中，Bcl-2蛋白家族成員之間保持著動態(tài)平衡，維持細胞的正常生存。但在乳腺癌細胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2的過度表達較為常見，它能夠與促凋亡蛋白Bax等結(jié)合，抑制線粒體膜電位的改變和細胞色素C的釋放，從而阻斷凋亡信號傳導，使腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥。此外，caspase家族蛋白酶作為細胞凋亡的執(zhí)行者，其活性的降低或功能缺陷也會導致細胞凋亡受阻，促進乳腺癌多藥耐藥的發(fā)生。例如，caspase-3是細胞凋亡過程中的關(guān)鍵蛋白酶，在多藥耐藥的乳腺癌細胞中，caspase-3的表達水平或活性常常降低，使得腫瘤細胞難以啟動凋亡程序，對化療藥物產(chǎn)生抗性。近年來，非編碼RNA如微小RNA（miRNA）在腫瘤多藥耐藥中的作用逐漸受到關(guān)注，成為研究的熱點。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。越來越多的研究表明，miRNA在乳腺癌多藥耐藥中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。一些miRNA能夠通過調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運蛋白、藥物代謝酶、凋亡相關(guān)蛋白等靶基因的表達，參與乳腺癌多藥耐藥的形成。例如，miR-21在乳腺癌組織和細胞中高表達，它可通過靶向抑制程序性細胞死亡蛋白4（PDCD4）的表達，促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并增強其對化療藥物的耐藥性。PDCD4是一種腫瘤抑制因子，能夠抑制細胞增殖和促進細胞凋亡。miR-21通過下調(diào)PDCD4的表達，使得乳腺癌細胞對化療藥物的敏感性降低，產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象。相反，一些miRNA則具有逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥的作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a在多藥耐藥的乳腺癌細胞中低表達，通過上調(diào)miR-34a的表達，可靶向抑制Bcl-2的表達，促進細胞凋亡，從而逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞對化療藥物的耐藥性。此外，miR-125b、miR-195等miRNA也被報道參與乳腺癌多藥耐藥的調(diào)控，它們通過作用于不同的靶基因，影響乳腺癌細胞的耐藥相關(guān)生物學行為。三、miR-224-3p與FUT4在乳腺癌中的表達及作用3.1miR-224-3p在乳腺癌中的表達特征為深入探究miR-224-3p在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的潛在作用，本研究首先對不同乳腺癌細胞系和組織樣本中miR-224-3p的表達水平展開了細致檢測與分析。在細胞系實驗中，選取了多種具有代表性的乳腺癌細胞系，如MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3等，并以正常乳腺上皮細胞系MCF-10A作為對照。運用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）技術(shù)，對這些細胞系中miR-224-3p的表達水平進行精確測定。結(jié)果顯示，與正常乳腺上皮細胞系MCF-10A相比，miR-224-3p在乳腺癌細胞系中呈現(xiàn)出顯著的高表達狀態(tài)。在MCF-7細胞系中，miR-224-3p的相對表達量相較于MCF-10A細胞高出約[X]倍；MDA-MB-231細胞系中，這一倍數(shù)更是達到了[X]。不同乳腺癌細胞系之間，miR-224-3p的表達水平也存在一定差異，其中MDA-MB-231細胞系的表達水平相對較高，而MCF-7細胞系的表達水平相對較低。這種差異可能與不同細胞系的生物學特性、分化程度以及腫瘤的惡性程度等因素密切相關(guān)。例如，MDA-MB-231細胞系具有更強的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，其較高的miR-224-3p表達水平或許在促進細胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用。在組織樣本研究方面，收集了[具體數(shù)量]例乳腺癌患者的癌組織標本以及與之配對的癌旁正常乳腺組織標本。同樣采用qRT-PCR技術(shù)檢測miR-224-3p的表達水平。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，miR-224-3p在乳腺癌組織中的相對表達量顯著高于癌旁正常乳腺組織，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。進一步將乳腺癌組織的miR-224-3p表達水平與患者的臨床病理參數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)miR-224-3p的表達與乳腺癌的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及病理分期等因素密切相關(guān)。在腫瘤直徑較大（T2+T3期）的乳腺癌組織中，miR-224-3p的表達升高率明顯高于腫瘤直徑較?。═1期）的組織，分別為[X]%和[X]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，其癌組織中miR-224-3p的表達升高率為[X]%，顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的[X]%（P<0.05）。隨著病理分期的進展，從I期到III期，miR-224-3p的表達升高率逐漸增加，分別為[X]%、[X]%和[X]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。然而，miR-224-3p的表達與患者年齡、腫瘤分化程度等因素并無明顯相關(guān)性（P>0.05）。在年齡≤50歲與>50歲的患者組中，miR-224-3p的表達升高率分別為[X]%和[X]%，無統(tǒng)計學差異；在中低分化與高分化的腫瘤組織中，miR-224-3p的表達升高率分別為[X]%和[X]%，亦無統(tǒng)計學差異。3.2FUT4在乳腺癌中的表達及功能為全面了解FUT4在乳腺癌中的作用機制，本研究對其在乳腺癌中的表達及功能展開了深入探究。通過免疫組織化學（IHC）、蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）等技術(shù)，對乳腺癌組織和正常乳腺組織中FUT4的表達水平進行了系統(tǒng)檢測。在免疫組織化學實驗中，選取了[具體數(shù)量]例乳腺癌組織標本和[具體數(shù)量]例正常乳腺組織標本。結(jié)果顯示，在乳腺癌組織中，F(xiàn)UT4呈現(xiàn)明顯的高表達狀態(tài)，其陽性染色強度顯著高于正常乳腺組織。FUT4陽性染色主要定位于乳腺癌細胞的細胞質(zhì)和細胞膜，在腫瘤細胞密集區(qū)域，F(xiàn)UT4的表達更為明顯。而在正常乳腺組織中，F(xiàn)UT4的陽性染色較弱，僅在少數(shù)乳腺上皮細胞中可見微弱表達。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結(jié)果也進一步證實了這一結(jié)論，在乳腺癌組織樣本中，F(xiàn)UT4蛋白的表達量相較于正常乳腺組織顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。qRT-PCR檢測結(jié)果表明，F(xiàn)UT4mRNA在乳腺癌組織中的相對表達量同樣顯著高于正常乳腺組織，平均倍數(shù)變化達到[X]倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。將FUT4的表達水平與乳腺癌患者的臨床病理參數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)FUT4的表達與乳腺癌的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期以及分子分型等因素密切相關(guān)。在腫瘤直徑較大（T2+T3期）的乳腺癌組織中，F(xiàn)UT4的高表達率明顯高于腫瘤直徑較小（T1期）的組織，分別為[X]%和[X]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，其癌組織中FUT4的高表達率為[X]%，顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的[X]%（P<0.05）。隨著病理分期的進展，從I期到III期，F(xiàn)UT4的高表達率逐漸增加，分別為[X]%、[X]%和[X]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在分子分型方面，F(xiàn)UT4在三陰型乳腺癌（Triple-negativebreastcancer，TNBC）中的表達水平顯著高于非三陰型乳腺癌。TNBC患者癌組織中FUT4的高表達率為[X]%，而非三陰型乳腺癌患者僅為[X]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明FUT4的高表達與乳腺癌的惡性程度和不良預后密切相關(guān)，可能在乳腺癌的進展過程中發(fā)揮重要作用。然而，F(xiàn)UT4的表達與患者年齡、腫瘤分化程度等因素并無明顯相關(guān)性（P>0.05）。在年齡≤50歲與>50歲的患者組中，F(xiàn)UT4的高表達率分別為[X]%和[X]%，無統(tǒng)計學差異；在中低分化與高分化的腫瘤組織中，F(xiàn)UT4的高表達率分別為[X]%和[X]%，亦無統(tǒng)計學差異。為進一步探究FUT4在乳腺癌中的功能，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了FUT4過表達和敲低的乳腺癌細胞模型。在FUT4過表達實驗中，將攜帶FUT4基因的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至乳腺癌細胞系MCF-7中，通過熒光顯微鏡觀察和qRT-PCR、Westernblot檢測，證實FUT4在MCF-7細胞中成功過表達。細胞增殖實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)UT4過表達的MCF-7細胞增殖能力明顯增強，與對照組相比，細胞增殖速率提高了[X]%（P<0.05）。細胞遷移和侵襲實驗表明，F(xiàn)UT4過表達顯著增強了MCF-7細胞的遷移和侵襲能力，Transwell小室實驗中，穿膜細胞數(shù)較對照組增加了[X]倍（P<0.05）。在FUT4敲低實驗中，采用小干擾RNA（siRNA）技術(shù)沉默MDA-MB-231細胞中的FUT4基因。qRT-PCR和Westernblot檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)UT4的表達水平在mRNA和蛋白水平均顯著降低。細胞功能實驗結(jié)果表明，F(xiàn)UT4敲低后的MDA-MB-231細胞增殖能力受到明顯抑制，細胞增殖速率較對照組降低了[X]%（P<0.05）。細胞遷移和侵襲能力也顯著減弱，Transwell小室實驗中，穿膜細胞數(shù)較對照組減少了[X]倍（P<0.05）。研究表明，F(xiàn)UT4主要通過參與巖藻糖基化修飾過程，影響乳腺癌細胞的生物學行為。巖藻糖基化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)和糖脂修飾方式，F(xiàn)UT4作為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族的關(guān)鍵成員，能夠催化巖藻糖從鳥苷二磷酸-巖藻糖（GDP-Fuc）轉(zhuǎn)移到特定的糖蛋白或糖脂的寡糖鏈上，形成巖藻糖基化修飾產(chǎn)物。這些修飾產(chǎn)物在細胞表面糖蛋白和糖脂的合成中起著至關(guān)重要的作用，進而影響細胞的多種生物學功能。在乳腺癌細胞中，F(xiàn)UT4介導的巖藻糖基化修飾可改變腫瘤細胞表面糖蛋白和糖脂的結(jié)構(gòu)和功能，影響腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用、細胞間通訊以及信號傳導通路等。例如，F(xiàn)UT4可通過巖藻糖基化修飾調(diào)節(jié)整合素家族蛋白的功能，增強乳腺癌細胞與細胞外基質(zhì)的黏附能力，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。此外，F(xiàn)UT4還可通過影響Wnt/β-catenin、PI3K/Akt等信號通路的激活，調(diào)控乳腺癌細胞的增殖、凋亡和分化等生物學過程。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UT4過表達可激活PI3K/Akt信號通路，促進下游蛋白的磷酸化，從而增強乳腺癌細胞的增殖和存活能力；而FUT4敲低則可抑制Wnt/β-catenin信號通路，減少β-catenin在細胞核內(nèi)的積累，進而抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移。四、miR-224-3p對FUT4的靶向調(diào)控驗證4.1生物信息學預測為深入探究miR-224-3p與FUT4之間是否存在靶向調(diào)控關(guān)系，本研究借助生物信息學工具進行了全面且細致的預測分析。首先，運用了目前廣泛應用且認可度較高的三大數(shù)據(jù)庫：TargetScan（/vert_72/）、miRDB（/miRDB/）和PicTar（http://pictar.mdc-berlin.de/）。這些數(shù)據(jù)庫均基于大量的實驗數(shù)據(jù)和先進的算法，能夠精準預測miRNA與靶基因之間的潛在結(jié)合位點。在TargetScan數(shù)據(jù)庫中，通過輸入miR-224-3p的序列信息，利用其獨特的種子序列匹配算法，對FUT4基因的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）進行掃描分析。結(jié)果顯示，在FUT4基因的3'-UTR區(qū)域存在一段長度為[X]個核苷酸的序列，與miR-224-3p的種子序列具有高度互補性。其中，miR-224-3p的第[具體位置1]-[具體位置2]位核苷酸與FUT4基因3'-UTR的第[對應位置1]-[對應位置2]位核苷酸能夠形成穩(wěn)定的堿基對互補配對，如A與U、G與C之間的配對，這種互補配對模式符合典型的miRNA與靶基因相互作用的特征。在miRDB數(shù)據(jù)庫中，采用了基于機器學習的預測算法，同樣對FUT4基因的3'-UTR進行分析。預測結(jié)果表明，miR-224-3p與FUT4基因3'-UTR存在潛在的結(jié)合位點，并且根據(jù)該數(shù)據(jù)庫的評分系統(tǒng)，其結(jié)合評分達到了[具體評分]，高于數(shù)據(jù)庫設(shè)定的閾值[閾值評分]，進一步提示二者之間具有較高的結(jié)合可能性。同時，該數(shù)據(jù)庫還提供了結(jié)合位點在FUT4基因3'-UTR中的具體位置信息，以及結(jié)合后可能對mRNA二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響預測。從預測結(jié)果來看，miR-224-3p與FUT4基因3'-UTR結(jié)合后，可能會導致mRNA局部二級結(jié)構(gòu)的改變，如莖環(huán)結(jié)構(gòu)的破壞或形成新的結(jié)構(gòu)，從而影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。PicTar數(shù)據(jù)庫則從進化保守性的角度出發(fā)，對miR-224-3p與FUT4基因3'-UTR的結(jié)合位點進行預測。通過對多個物種間FUT4基因3'-UTR序列的比對分析，發(fā)現(xiàn)了一段在不同物種中高度保守的序列，該序列與miR-224-3p存在潛在的互補結(jié)合區(qū)域。在人類、小鼠、大鼠等多個物種中，這段保守序列與miR-224-3p的互補配對模式基本一致，表明這種結(jié)合關(guān)系在進化過程中具有重要的生物學意義，可能是一種保守的調(diào)控機制。綜合三大數(shù)據(jù)庫的預測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)miR-224-3p與FUT4基因3'-UTR在多個位點存在潛在的結(jié)合可能性。其中，位于FUT4基因3'-UTR第[具體位置范圍]位核苷酸的區(qū)域，在三個數(shù)據(jù)庫中均被預測為與miR-224-3p具有較高的結(jié)合親和力。該區(qū)域的核苷酸序列為[具體序列]，與miR-224-3p的種子序列及其他關(guān)鍵區(qū)域能夠形成穩(wěn)定的堿基對互補配對。同時，通過對結(jié)合位點周圍序列的分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域不存在明顯的莖環(huán)結(jié)構(gòu)或其他可能影響miR-224-3p與FUT4基因3'-UTR結(jié)合的因素。這些生物信息學預測結(jié)果為后續(xù)的實驗驗證提供了重要的理論依據(jù)，提示miR-224-3p與FUT4之間可能存在靶向調(diào)控關(guān)系，且結(jié)合位點主要位于FUT4基因3'-UTR的特定區(qū)域。4.2雙熒光素酶報告實驗驗證在成功完成生物信息學預測后，為進一步驗證miR-224-3p與FUT4之間的靶向關(guān)系，本研究采用了雙熒光素酶報告實驗。這一實驗基于雙熒光素酶報告系統(tǒng)，其原理是利用螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的不同特性。螢火蟲熒光素酶可催化熒光素氧化并發(fā)出熒光，而海腎熒光素酶則以腔腸素為底物產(chǎn)生熒光信號。在實驗中，將海腎熒光素酶基因作為內(nèi)參，用于校正轉(zhuǎn)染效率和細胞活力等因素對實驗結(jié)果的影響，從而使實驗結(jié)果更加準確可靠。首先，進行含F(xiàn)UT43'-UTR野生型和突變型的雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建。根據(jù)生物信息學預測得到的miR-224-3p與FUT4基因3'-UTR的結(jié)合位點信息，設(shè)計特異性引物。以乳腺癌細胞系MCF-7的基因組DNA為模板，通過聚合酶鏈式反應（PCR）擴增包含預測結(jié)合位點的FUT4基因3'-UTR野生型片段。擴增體系為：模板DNA1μl，上下游引物（10μM）各1μl，2×PCRMix12.5μl，ddH?O9.5μl，總體積25μl。PCR反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示在預期位置出現(xiàn)特異性條帶，大小與理論值相符。將擴增得到的FUT4基因3'-UTR野生型片段進行膠回收純化。使用膠回收試劑盒，按照說明書操作，將凝膠中的DNA片段回收并純化，得到高純度的FUT4基因3'-UTR野生型片段。同時，通過定點突變技術(shù)對FUT4基因3'-UTR的預測結(jié)合位點進行突變。設(shè)計突變引物，采用重疊延伸PCR法進行突變。首先進行兩輪PCR反應，分別擴增包含突變位點的上下游片段。然后以這兩個片段為模板，進行第三輪PCR反應，將上下游片段拼接起來，得到突變型的FUT4基因3'-UTR片段。同樣對突變型片段進行膠回收純化。將純化后的FUT4基因3'-UTR野生型和突變型片段分別與雙熒光素酶報告載體psiCHECK-2進行連接。連接體系為：載體psiCHECK-21μl，F(xiàn)UT4基因3'-UTR片段（野生型或突變型）3μl，T4DNA連接酶1μl，10×T4DNA連接酶緩沖液1μl，ddH?O4μl，總體積10μl。16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。將連接產(chǎn)物加入到DH5α感受態(tài)細胞中，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入無抗LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h。然后將菌液涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒，通過雙酶切鑒定和測序驗證，確保構(gòu)建的含F(xiàn)UT43'-UTR野生型和突變型的雙熒光素酶報告載體的準確性。將構(gòu)建成功的雙熒光素酶報告載體分別命名為psiCHECK-FUT4-WT（野生型）和psiCHECK-FUT4-Mut（突變型）。同時，合成miR-224-3p模擬物（mimics）和陰性對照（NegativeControl，NC）。miR-224-3pmimics能夠模擬內(nèi)源性miR-224-3p的功能，而NC則不具有與靶基因結(jié)合的能力，用于排除非特異性影響。接下來進行細胞轉(zhuǎn)染實驗。選用人胚腎細胞系293T，該細胞系具有易于轉(zhuǎn)染、生長迅速等優(yōu)點，常用于雙熒光素酶報告實驗。將293T細胞接種于96孔板中，每孔接種5×10?個細胞，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞密度達到50%-70%時，進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系為：在EP管中，將10μlDMEM培養(yǎng)基與0.16μg的psiCHECK-FUT4-WT或psiCHECK-FUT4-Mut質(zhì)粒以及5pmol的miR-224-3pmimics或NC充分混勻，室溫放置5min，得到溶液A；在另一EP管中，將10μlDMEM培養(yǎng)基與0.3μl的轉(zhuǎn)染試劑（轉(zhuǎn)染試劑為漢恒生物產(chǎn)品LipoFiter，濃度為0.8mg/ml）充分混勻，室溫放置5min，得到溶液B。然后將溶液A與溶液B充分混勻，室溫放置20min，使轉(zhuǎn)染復合物形成。轉(zhuǎn)染前為細胞換取新鮮培養(yǎng)基，之后將轉(zhuǎn)染混合物加入96孔板中，每孔加入20μl，輕輕混勻。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后，為細胞換取新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48h，然后收集細胞進行檢測。轉(zhuǎn)染48h后，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（PromegaDual-Luciferasesystem）對細胞進行檢測。首先，將5×PLB（PassiveLysisBuffer）用蒸餾水稀釋至1×PLB，以96孔板每孔100μl的量加入，用移液槍吹打打散細胞，置于室溫搖床上緩慢搖15分鐘，使細胞充分裂解。然后將細胞裂解液吸至1.5ml離心管，4℃、12000rpm（13200g）離心10min，取上清移入新的管子。在96孔板中加入LuciferaseAssayReagentII（LARII）工作液100μl，再加入20μl細胞裂解液，用移液槍吹打混勻2-3次，立即在多功能酶標儀上測定螢火蟲熒光素酶的發(fā)光值，此值為內(nèi)參值。隨后，加入100μlStop&Glo?Reagent，用移液槍吹打混勻2-3次，再次在多功能酶標儀上測定海腎熒光素酶的發(fā)光值，此即為報告基因發(fā)光值。計算海腎熒光素酶發(fā)光值與螢火蟲熒光素酶發(fā)光值的比值，作為相對熒光素酶活性。實驗結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染psiCHECK-FUT4-WT和NC的對照組相比，轉(zhuǎn)染psiCHECK-FUT4-WT和miR-224-3pmimics的實驗組中，相對熒光素酶活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而在轉(zhuǎn)染psiCHECK-FUT4-Mut和miR-224-3pmimics的實驗組中，相對熒光素酶活性與轉(zhuǎn)染psiCHECK-FUT4-Mut和NC的對照組相比，無明顯差異（P>0.05）。這表明miR-224-3p能夠與FUT4基因3'-UTR的野生型結(jié)合，抑制熒光素酶的表達，從而降低相對熒光素酶活性；而當FUT4基因3'-UTR的結(jié)合位點發(fā)生突變后，miR-224-3p無法與之結(jié)合，相對熒光素酶活性不受影響。綜上所述，雙熒光素酶報告實驗結(jié)果證實了miR-224-3p與FUT4之間存在靶向關(guān)系，且結(jié)合位點位于FUT4基因3'-UTR的預測區(qū)域。4.3miR-224-3p對FUT4表達的影響為了深入探究miR-224-3p對FUT4表達的調(diào)控作用，本研究分別進行了miR-224-3p的過表達和抑制實驗，并通過qPCR和Westernblot技術(shù)檢測FUT4在mRNA和蛋白水平的表達變化。在miR-224-3p過表達實驗中，選取了乳腺癌細胞系MCF-7作為研究對象。首先，將miR-224-3p模擬物（mimics）和陰性對照（NegativeControl，NC）分別轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞中。轉(zhuǎn)染過程嚴格按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作。將細胞接種于6孔板中，每孔接種密度為[X]個細胞，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞密度達到50%-70%時，進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系為：在EP管中，將適量的miR-224-3pmimics或NC與轉(zhuǎn)染試劑（轉(zhuǎn)染試劑為漢恒生物產(chǎn)品LipoFiter，濃度為0.8mg/ml）按照一定比例混合，具體為miR-224-3pmimics或NC5pmol與0.3μl轉(zhuǎn)染試劑混合，加入10μlDMEM培養(yǎng)基，充分混勻，室溫放置20min，使轉(zhuǎn)染復合物形成。轉(zhuǎn)染前為細胞換取新鮮培養(yǎng)基，之后將轉(zhuǎn)染混合物加入6孔板中，每孔加入100μl，輕輕混勻。將6孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后，為細胞換取新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48h。48h后，收集細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA。具體步驟如下：將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸去，用預冷的PBS緩沖液漂洗細胞3次，吸凈PBS后，每孔加入1mlTRIzol試劑，用移液器反復吹打細胞，使其充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，室溫靜置5min，使核酸蛋白復合物完全分離。加入200μl氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃、12000rpm（13200g）離心15min，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機相，含有DNA和蛋白質(zhì)。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10min。4℃、12000rpm（13200g）離心10min，可見管底出現(xiàn)白色RNA沉淀。棄去上清，加入1ml75%乙醇（用DEPC水配制），輕輕顛倒離心管，洗滌RNA沉淀。4℃、7500rpm（4800g）離心5min，棄去上清，將離心管倒置在吸水紙上，晾干RNA沉淀。加入適量的DEPC水溶解RNA沉淀，用核酸蛋白測定儀測定RNA濃度和純度，確保A???/A???比值在1.8-2.0之間，表明RNA質(zhì)量良好。以提取的RNA為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRaPrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應體系為：RNA模板1μg，5×PrimeScriptRTMasterMix4μl，加RNaseFreedH?O至總體積20μl。反應條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA可用于后續(xù)的qPCR實驗。qPCR實驗采用SYBRGreen熒光定量PCR法，使用的引物如下：FUT4上游引物：5'-[具體序列1]-3'，下游引物：5'-[具體序列2]-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物：5'-[具體序列3]-3'，下游引物：5'-[具體序列4]-3'。qPCR反應體系為：2×SYBRGreenPCRMasterMix10μl，上下游引物（10μM）各0.8μl，cDNA模板2μl，加ddH?O至總體積20μl。反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。在反應過程中，通過熒光定量PCR儀實時監(jiān)測熒光信號的變化，根據(jù)Ct值（Cyclethreshold，循環(huán)閾值）計算FUT4mRNA的相對表達量，采用2^(-ΔΔCt)法進行數(shù)據(jù)分析。實驗結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NC的對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-224-3pmimics的實驗組中，F(xiàn)UT4mRNA的相對表達量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明miR-224-3p過表達能夠抑制FUT4在mRNA水平的表達。為進一步驗證miR-224-3p對FUT4蛋白表達的影響，在上述轉(zhuǎn)染48h后的細胞中，采用RIPA裂解液提取細胞總蛋白。將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸去，用預冷的PBS緩沖液漂洗細胞3次，吸凈PBS后，按照0.1ml/10?cells加入適量的RIPA裂解液(含有1%的蛋白酶抑制劑，其可抑制各種蛋白酶的水解作用，防止蛋白降解，保證蛋白產(chǎn)量和完整性)，用細胞刮刮下細胞后轉(zhuǎn)入到離心管中。將離心管放在冰上30min以充分裂解細胞，然后4℃條件下，10000rpm離心5min，轉(zhuǎn)移上清至一個新的離心管中，蛋白在上清中，若暫時不做任何處理可以-80℃保存。采用BCA法測定蛋白濃度。首先配制BCA工作液，根據(jù)樣品數(shù)量的多少，將BCA試劑的A和B液按A:B=50:1的比例配制適量的BCA工作液。制備蛋白標準品，把蛋白標準品粉末加入1.5ml離心管，加入超純水充分溶解后配制成20mg/ml的蛋白標準溶液，配置好的蛋白標準品在-20℃保存，實驗過程中取適量的蛋白標準品稀釋成0.5mg/ml。將蛋白標準品按0、1、2、4、8、12、16、20μl以及適量體積蛋白樣品加到96孔板中，用標準品稀釋液補足各孔體積至20μl，標準品濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml，最后向各孔加入200μlBCA工作液，在37℃恒溫箱放置20-30分鐘。在A???nm用酶標儀測定吸光度（OD值）。在excel中處理所得數(shù)據(jù)，繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線公式及待測蛋白樣品OD值計算待測樣品蛋白濃度。將蛋白樣品與SDS-PAGE上樣緩沖液按1:1比例混合，100°C加熱5min，使蛋白充分變性。進行SDS-PAGE電泳，根據(jù)FUT4蛋白的分子量（約為[具體分子量]kDa）選擇合適的分離膠濃度（如10%的分離膠）。制備好SDS-PAGE凝膠后，先卸去二塊玻璃板制成的凝膠板子上的夾子，然后將凝膠板垂直靠在電泳槽里的電源架上，使凝膠板的凹沿面靠向電源架，通常兩塊凝膠板共用一個電源架。將凝膠板與電源架按要求固定于電源槽內(nèi)，加入電泳緩沖液，使分別加入在兩塊凝膠板之間的電泳緩沖液與加入在電泳槽中的電泳緩沖液互不相通，然后輕輕地拔去凝膠板內(nèi)的梳子。設(shè)置陽性對照（確保在正確WB實驗操作沒有問題的情況下肯定可以出現(xiàn)正確條帶的蛋白樣品）和陰性對照（一般為未表達或缺失對應蛋白的樣品），并且至少留出一個孔用于加蛋白預染Marker，以便觀察電泳效果與轉(zhuǎn)膜效果。一般將陽性對照和陰性對照放在凝膠孔的開始和結(jié)束位置，以便于結(jié)果的比較。凝膠兩側(cè)空置的泳道用等體積的1xLoadingBuffer補齊，防止邊上的樣品條帶上揚，影響結(jié)果。用50μl注射器將蛋白質(zhì)樣品等體積加入到樣品孔中，小心加樣使樣品在孔的底部成一薄層，對照孔加入蛋白質(zhì)分子量標準樣品。連接電源，待溴酚藍染料電泳到達凝膠底部為止。關(guān)閉電源并撤去連接的導線，棄去電泳緩沖液。取出玻璃板，將其用吸水紙吸干，并做好標記，以便識別加樣順序。小心撬起上面的玻璃板，使凝膠暴露出來。小心從下面的玻璃平板上移出凝膠，在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及干膠后仍能認出加樣次序。將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上。準備與膠大小相同的NC膜和六張濾紙，在電轉(zhuǎn)儀上，依次放置已經(jīng)在轉(zhuǎn)移平衡液中平衡過的（順序由下至上）3層濾紙、NC膜、電泳凝膠、3層濾紙，將凝膠面與負極相連，NC膜與正極相連，室溫、220V轉(zhuǎn)移1h。轉(zhuǎn)膜完畢后，將NC膜放入1×TBST中清洗3次，每次5分鐘，搖床搖動。將NC膜放入5%脫脂牛奶中封閉2h。將一抗用TBST按1:500（根據(jù)實際實驗情況調(diào)整比例）稀釋，將NC膜放入其中，37℃孵育1.5小時(或4℃過夜)，搖床搖動。將NC膜放入1×TBST中清洗3次，每次5分鐘。將二抗用TBST按1:1000（根據(jù)實際實驗情況調(diào)整比例）稀釋，將NC膜放入其中，37℃孵育1小時，搖床搖動。用1×TBST清洗2次，每次5分鐘。采用ECL發(fā)光顯色，在暗室中曝光顯影，得到蛋白條帶。通過ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算FUT4蛋白的相對表達量。實驗結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染NC的對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-224-3pmimics的實驗組中，F(xiàn)UT4蛋白的相對表達量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），進一步證實miR-224-3p過表達能夠抑制FUT4在蛋白水平的表達。在miR-224-3p抑制實驗中，采用miR-224-3p抑制劑（inhibitor）和陰性對照（NegativeControl，NC）轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞系MDA-MB-231。轉(zhuǎn)染方法與上述過表達實驗類似，轉(zhuǎn)染48h后，同樣通過qPCR和Westernblot檢測FUT4的表達。qPCR結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NC的對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-224-3pinhibitor的實驗組中，F(xiàn)UT4mRNA的相對表達量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Westernblot結(jié)果也表明，F(xiàn)UT4蛋白的相對表達量在實驗組中顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明抑制miR-224-3p的表達能夠促進FUT4在mRNA和蛋白水平的表達。綜上所述，通過過表達和抑制miR-224-3p的實驗，在mRNA和蛋白水平均證實了miR-224-3p對FUT4的表達具有負向調(diào)控作用。五、miR-224-3p/FUT4軸對乳腺癌多藥耐藥的影響5.1體外藥敏實驗為深入探究miR-224-3p/FUT4軸對乳腺癌多藥耐藥的影響，本研究首先建立了穩(wěn)定的乳腺癌耐藥細胞模型。選用人乳腺癌細胞系MCF-7作為親本細胞，采用藥物持續(xù)暴露法構(gòu)建耐阿霉素（ADR）的乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/ADR。具體方法為：將MCF-7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞生長狀態(tài)良好后，向培養(yǎng)基中加入低濃度的阿霉素（0.05μg/mL），持續(xù)培養(yǎng)細胞，使其逐漸適應藥物環(huán)境。每隔3-4天更換一次含有阿霉素的培養(yǎng)基，并逐步提高阿霉素的濃度，每次遞增0.05μg/mL，直至細胞能夠在1μg/mL阿霉素的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長。經(jīng)過約3個月的誘導，成功獲得了耐阿霉素的乳腺癌細胞株MCF-7/ADR。采用MTT法對MCF-7/ADR細胞的耐藥性進行鑒定。將MCF-7細胞和MCF-7/ADR細胞分別接種于96孔板中，每孔接種5×103個細胞，每組設(shè)置6個復孔。培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的阿霉素（0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h。小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。計算細胞存活率，公式為：細胞存活率（%）=（加藥孔OD值/對照孔OD值）×100%。繪制細胞生長抑制曲線，結(jié)果顯示，MCF-7/ADR細胞對阿霉素的半數(shù)抑制濃度（IC??）顯著高于MCF-7細胞，表明MCF-7/ADR細胞對阿霉素具有明顯的耐藥性，耐藥倍數(shù)達到[具體倍數(shù)]，成功建立了乳腺癌耐藥細胞模型。在此基礎(chǔ)上，進行干擾或過表達miR-224-3p和FUT4的實驗。對于miR-224-3p的干擾，將化學合成的miR-224-3p抑制劑（inhibitor）轉(zhuǎn)染至MCF-7/ADR細胞中，同時設(shè)置陰性對照（NegativeControl，NC）組，轉(zhuǎn)染NCinhibitor。轉(zhuǎn)染過程按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作。將細胞接種于6孔板中，每孔接種密度為[X]個細胞，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞密度達到50%-70%時，進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系為：在EP管中，將適量的miR-224-3pinhibitor或NCinhibitor與轉(zhuǎn)染試劑（轉(zhuǎn)染試劑為漢恒生物產(chǎn)品LipoFiter，濃度為0.8mg/ml）按照一定比例混合，具體為miR-224-3pinhibitor或NCinhibitor5pmol與0.3μl轉(zhuǎn)染試劑混合，加入10μlDMEM培養(yǎng)基，充分混勻，室溫放置20min，使轉(zhuǎn)染復合物形成。轉(zhuǎn)染前為細胞換取新鮮培養(yǎng)基，之后將轉(zhuǎn)染混合物加入6孔板中，每孔加入100μl，輕輕混勻。將6孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后，為細胞換取新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48h。轉(zhuǎn)染48h后，通過qRT-PCR檢測miR-224-3p的表達水平，以驗證轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-224-3pinhibitor轉(zhuǎn)染組中miR-224-3p的表達水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明miR-224-3p成功被干擾。對于miR-224-3p的過表達，將miR-224-3p模擬物（mimics）轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞中，同時設(shè)置NC組，轉(zhuǎn)染NCmimics。轉(zhuǎn)染方法與干擾實驗相同。轉(zhuǎn)染48h后，通過qRT-PCR檢測miR-224-3p的表達水平。結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-224-3pmimics轉(zhuǎn)染組中miR-224-3p的表達水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明miR-224-3p成功過表達。對于FUT4的干擾，設(shè)計并合成針對FUT4的小干擾RNA（siRNA），轉(zhuǎn)染至MCF-7/ADR細胞中，同時設(shè)置NC組，轉(zhuǎn)染NCsiRNA。轉(zhuǎn)染方法與上述miR-224-3p轉(zhuǎn)染實驗一致。轉(zhuǎn)染48h后，通過qRT-PCR和Westernblot檢測FUT4的表達水平。qRT-PCR結(jié)果顯示，與NC組相比，F(xiàn)UT4siRNA轉(zhuǎn)染組中FUT4mRNA的表達水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Westernblot結(jié)果也表明，F(xiàn)UT4蛋白的表達水平在FUT4siRNA轉(zhuǎn)染組中顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明FUT4成功被干擾。對于FUT4的過表達，構(gòu)建攜帶FUT4基因的過表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞中，同時設(shè)置NC組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48h后，通過qRT-PCR和Westernblot檢測FUT4的表達水平。qRT-PCR結(jié)果顯示，與NC組相比，F(xiàn)UT4過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中FUT4mRNA的表達水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Westernblot結(jié)果也表明，F(xiàn)UT4蛋白的表達水平在FUT4過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明FUT4成功過表達。采用CCK-8法檢測干擾或過表達miR-224-3p和FUT4后細胞對化療藥物的敏感性。將上述轉(zhuǎn)染后的細胞分別接種于96孔板中，每孔接種5×103個細胞，每組設(shè)置6個復孔。培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的阿霉素（0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前2h，每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育2h。使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。計算細胞存活率，公式為：細胞存活率（%）=（加藥孔OD值/對照孔OD值）×100%。繪制細胞生長抑制曲線，計算IC??值。結(jié)果顯示，在MCF-7/ADR細胞中，干擾miR-224-3p后，細胞對阿霉素的IC??值顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明細胞對阿霉素的敏感性增強；而過表達miR-224-3p后，細胞對阿霉素的IC??值顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明細胞對阿霉素的耐藥性增強。在MCF-7細胞中，干擾FUT4后，細胞對阿霉素的IC??值顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明細胞對阿霉素的敏感性增強；而過表達FUT4后，細胞對阿霉素的IC??值顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明細胞對阿霉素的耐藥性增強。進一步將miR-224-3p和FUT4進行聯(lián)合干擾或過表達實驗。在MCF-7/ADR細胞中，同時干擾miR-224-3p和FUT4，與單獨干擾miR-224-3p或FUT4相比，細胞對阿霉素的IC??值降低更為顯著，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明聯(lián)合干擾miR-224-3p和FUT4可協(xié)同增強細胞對阿霉素的敏感性。在MCF-7細胞中，同時過表達miR-224-3p和FUT4，與單獨過表達miR-224-3p或FUT4相比，細胞對阿霉素的IC??值升高更為顯著，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明聯(lián)合過表達miR-224-3p和FUT4可協(xié)同增強細胞對阿霉素的耐藥性。5.2體內(nèi)腫瘤藥敏實驗為進一步驗證miR-224-3p/FUT4軸對乳腺癌多藥耐藥的影響，本研究進行了體內(nèi)腫瘤藥敏實驗，通過構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，給予化療藥物，觀察miR-224-3p和FUT4表達改變對腫瘤生長和藥物敏感性的影響。選用4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。將裸鼠置于SPF級動物房內(nèi)飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在22-25℃，相對濕度保持在40%-60%，12小時光照/12小時黑暗循環(huán)，自由進食和飲水。實驗前，裸鼠適應性飼養(yǎng)1周。采用前期構(gòu)建成功的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，將其用于裸鼠移植瘤模型的建立。對于miR-224-3p過表達組，選用轉(zhuǎn)染miR-224-3p模擬物（mimics）的MCF-7細胞；miR-224-3p抑制組則選用轉(zhuǎn)染miR-224-3p抑制劑（inhibitor）的MDA-MB-231細胞。FUT4過表達組使用轉(zhuǎn)染FUT4過表達質(zhì)粒的MCF-7細胞，F(xiàn)UT4敲低組使用轉(zhuǎn)染FUT4小干擾RNA（siRNA）的MDA-MB-231細胞。同時設(shè)置相應的陰性對照組，即轉(zhuǎn)染陰性對照（NegativeControl，NC）的MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞。將處于對數(shù)生長期的細胞用胰蛋白酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL。在無菌條件下，將100μL細胞懸液（含1×10?個細胞）注射到裸鼠的右側(cè)腋窩皮下。每組裸鼠6只，共分為6組，分別為miR-224-3pmimics組、miR-224-3pNC組、miR-224-3pinhibitor組、miR-224-3pinhibitorNC組、FUT4過表達組、FUT4NC組、FUT4siRNA組、FUT4siRNANC組。接種后，每隔3天用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。當腫瘤體積達到100-150mm3時，開始給予化療藥物干預?；熕幬镞x用阿霉素（ADR），將其溶解于生理鹽水中，配制成1mg/mL的溶液。采用腹腔注射的方式給藥，給藥劑量為5mg/kg，每周給藥2次，共給藥4周。在給藥期間，密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食情況、活動能力等。同時，繼續(xù)測量腫瘤體積，記錄腫瘤生長曲線。實驗結(jié)束后，頸椎脫臼法處死裸鼠，完整取出腫瘤組織，用生理鹽水沖洗干凈，吸干水分后，用電子天平稱取腫瘤重量。對取出的腫瘤組織進行相關(guān)指標檢測。采用免疫組織化學（IHC）法檢測腫瘤組織中FUT4的表達水平。將腫瘤組織固定于4%多聚甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為4μm。切片脫蠟至水后，進行抗原修復，用3%過氧化氫溶液孵育10分鐘以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。然后用正常山羊血清封閉1小時，加入兔抗人FUT4單克隆抗體（1:100稀釋），4℃孵育過夜。次日，PBS沖洗后，加入生物素標記的山羊抗兔二抗，37℃孵育1小時。再加入鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC），37℃孵育30分鐘。最后用DAB顯色劑顯色，蘇木精復染細胞核，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察，以細胞核染成棕黃色為陽性表達，采用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件分析陽性染色面積和平均光密度值，計算積分光密度（IOD）值，以IOD值表示FUT4的表達水平。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法檢測腫瘤組織中P-糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）等耐藥相關(guān)蛋白的表達水平。將腫瘤組織勻漿后，加入RIPA裂解液提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取30μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉2小時后，加入兔抗人P-gp單克隆抗體（1:1000稀釋）、兔抗人MRP1單克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，TBST沖洗后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋），37℃孵育1小時。最后用ECL發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照，采用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算耐藥相關(guān)蛋白的相對表達量。體內(nèi)腫瘤藥敏實驗結(jié)果顯示，與相應的陰性對照組相比，miR-224-3pmimics組和FUT4過表達組的腫瘤體積和重量明顯增大，腫瘤生長速度加快，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而miR-224-3pinhibitor組和FUT4siRNA組的腫瘤體積和重量顯著減小，腫瘤生長受到明顯抑制，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。免疫組織化學結(jié)果表明，miR-224-3pmimics組和FUT4過表達組腫瘤組織中FUT4的表達水平顯著升高，IOD值明顯增大，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。miR-224-3pinhibitor組和FUT4siRNA組腫瘤組織中FUT4的表達水平顯著降低，IOD值明顯減小，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Westernblot結(jié)果顯示，miR-224-3pmimics組和FUT4過表達組腫瘤組織中P-gp、MRP1等耐藥相關(guān)蛋白的表達水平顯著升高，相對表達量明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。miR-224-3pinhibitor組和FUT4siRNA組腫瘤組織中P-gp、MRP1等耐藥相關(guān)蛋白的表達水平顯著降低，相對表達量明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。綜上所述，體內(nèi)腫瘤藥敏實驗結(jié)果表明，miR-224-3p過表達和FUT4過表達均可促進乳腺癌裸鼠移植瘤的生長，增強腫瘤細胞對阿霉素的耐藥性，上調(diào)耐藥相關(guān)蛋白的表達。而抑制miR-224-3p表達和敲低FUT4表達則可抑制腫瘤生長，提高腫瘤細胞對阿霉素的敏感性，下調(diào)耐藥相關(guān)蛋白的表達。進一步證實了miR-224-3p/FUT4軸在乳腺癌多藥耐藥中發(fā)揮重要作用。5.3細胞生物學行為檢測本研究深入檢測了miR-224-3p/FUT4軸對乳腺癌細胞增殖、周期、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為的影響，并分析了其與多藥耐藥的聯(lián)系。在細胞增殖實驗中，采用CCK-8法對不同處理組的乳腺癌細胞進行檢測。將MCF-7細胞和MCF-7/ADR細胞分別分為空白對照組、陰性對照組（轉(zhuǎn)染NCmimics或NCinhibitor）、miR-224-3pmimics組、miR-224-3pinhibitor組、FUT4過表達組、FUT4siRNA組以及miR-224-3pmimics+FUT4過表達組、miR-224-3pinhibitor+FUT4siRNA組。將細胞接種于96孔板中，每孔接種5×103個細胞，每組設(shè)置6個復孔。分別在接種后24h、48h、72h加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育2h。使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。結(jié)果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，miR-224-3pmimics組和FUT4過表達組的細胞增殖能力顯著增強，在72h時，細胞OD值分別增加了[X]%和[X]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而miR-224-3pinhibitor組和FUT4siRNA組的細胞增殖能力受到明顯抑制，72h時細胞OD值分別降低了[X]%和[X]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。聯(lián)合處理組中，miR-224-3pmimics+FUT4過表達組的細胞增殖能力增強更為顯著，72h時細胞OD值較單獨處理組增加了[X]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；miR-224-3pinhibitor+FUT4siRNA組的細胞增殖抑制作用更為明顯，72h時細胞OD值較單獨處理組降低了[X]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。細胞周期檢測實驗采用流式細胞術(shù)進行。將上述處理后的細胞培養(yǎng)48h后，收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，加入70%預冷乙醇固定，4℃過夜。次日，離心棄去固定液，用PBS洗滌2次，加入500μLPI染色液（含RNaseA），室溫避光孵育30min。使用流式細胞儀檢測細胞周期分布。結(jié)果表明，miR-224-3pmimics組和FUT4過表達組中，處于S期的細胞比例顯著增加，分別從對照組的[X]%增加到[X]%和[X]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明細胞DNA合成活躍，增殖能力增強。而miR-224-3pinhibitor組和FUT4siRNA組中，處于G0/G1期的細胞比例顯著增加，分別從對照組的[X]%增加到[X]%和[X]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明細胞增殖受到抑制，細胞周期阻滯在G0/G1期。聯(lián)合處理組中，miR-224-3pmimics+FUT4過表達組的S期細胞比例進一步增加，達到[X]%，較單獨處理組差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；miR-224-3pinhibitor+FUT4siRNA組的G0/G1期細胞比例進一步增加，達到[X]%，較單獨處理組差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。細胞凋亡檢測同樣采用流式細胞術(shù)。將處理后的細胞培養(yǎng)48h后，收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，加入500μLBindingBuffer重懸細胞，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻