幾種常用生物活性測(cè)試方法簡(jiǎn)介2總結(jié)3分子水平活性測(cè)試方法1CONTENTS細(xì)胞水平活性測(cè)試方法等溫滴定量熱法(IsothermalTitrationCalorimetry,ITC)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種研究生物熱力學(xué)與生物動(dòng)力學(xué)的重要方法，它通過(guò)高靈敏度、高自動(dòng)化的微量量熱儀連續(xù)、準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)和記錄一個(gè)變化過(guò)程的量熱曲線，原位、在線和無(wú)損傷地同時(shí)提供熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)信息。IsothermalTitrationCalorimetry(ITC)基本原理：Q=

△HoxVx[H.G]

=△HoxVxx[H]o

Ka

[G]1+Ka

[G]△Go=-RTlnKa△Go=△Ho-T△So注：H為受體（主體），G為配體（客體），Ka為結(jié)合常數(shù)△Go為Gibbs自由能變化，△Ho

為焓變，△So為熵變受體-配體復(fù)合物的形成伴隨著能量的釋放或吸收，導(dǎo)致樣品池溫度的變化，參比池始終保持在實(shí)驗(yàn)溫度，反饋系統(tǒng)提供熱或降低熱量來(lái)補(bǔ)償樣品池的溫度變化，每注射一次后系統(tǒng)恢復(fù)至平衡狀態(tài)再進(jìn)行下一滴滴定。結(jié)果以峰的形式表示平衡溫度偏移所需要的能量，峰的面積相當(dāng)于反應(yīng)釋放或吸收的熱量。ITC儀結(jié)構(gòu)示意圖IsothermalTitrationCalorimetry(ITC)ITC是一種熱量連續(xù)變化的量熱器。主要由隔熱夾套包裹著的樣品池(反應(yīng)池)和參比池、注射器和一臺(tái)計(jì)算機(jī)組成，注射器同時(shí)具有攪拌作用，計(jì)算機(jī)控制溫度控制裝置和信息反饋系統(tǒng)。MethodsInCellBiology,,84,79.IsothermalTitrationCalorimetry(ITC)ITC數(shù)據(jù)圖JournalofMolecularRecognition.,21,289.左圖：橫坐標(biāo)：時(shí)間縱坐標(biāo)：熱功率峰底與峰尖之間的峰面積為每次注射時(shí)釋放或吸收的總熱量。

右圖：橫坐標(biāo)：滴定物與樣品溶液的摩爾比縱坐標(biāo)：滴定產(chǎn)生的總熱量反應(yīng)過(guò)程的結(jié)合等溫曲線ITC獨(dú)特之處：樣品用量小，方法靈敏度和精確度高。最小可檢測(cè)熱效應(yīng)0.125uJ，生物樣品最小用量0.4ug，滴定池體積1.43ml實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短。典型的ITC實(shí)驗(yàn)只需30-60分鐘，并加上幾分鐘的響應(yīng)時(shí)間。操作簡(jiǎn)單。整個(gè)實(shí)驗(yàn)由計(jì)算機(jī)控制，使用者只需輸入實(shí)驗(yàn)的參數(shù)，如溫度、注射次數(shù)、注射量等，計(jì)算機(jī)就可以完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)，再由軟件分析ITC得到的數(shù)據(jù)。量熱實(shí)驗(yàn)完畢的樣品未遭破壞，還可以進(jìn)行后續(xù)生化分析。ITC的用途：

獲得生物分子相互作用的完整熱力學(xué)參數(shù)，包括結(jié)合常數(shù)(Ka)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)、摩爾結(jié)合焓(△H）、摩爾結(jié)合熵（

△S）、摩爾恒壓熱容（

△Cp），和動(dòng)力學(xué)參數(shù)(如酶活力（Kcat）、酶促反應(yīng)米氏常數(shù)(Km))

?？梢詰?yīng)用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)折疊/去折疊、蛋白質(zhì)-小分子相互作用、酶-抑制劑相互作用、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、藥物-DNA/RNA相互作用、RNA折疊、蛋白質(zhì)-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-細(xì)胞相互作用等方面。IsothermalTitrationCalorimetry(ITC)surfaceplasmonresonance,SPR表面等離子共振（SPR）原理消逝波：當(dāng)入射光到達(dá)界面時(shí)并不是直接產(chǎn)生反射光，而是先透過(guò)光疏介質(zhì)約一個(gè)波長(zhǎng)的深度，再沿界面流動(dòng)約半個(gè)波長(zhǎng)再返回光密介質(zhì)，透過(guò)光疏介質(zhì)的波被稱(chēng)為消逝波。等離子波：當(dāng)金屬受電磁干擾時(shí)，金屬內(nèi)部的電子密度分布會(huì)變得不均勻。因?yàn)閹?kù)侖力的存在，電子不會(huì)在引力與斥力的平衡位置停下而向前運(yùn)動(dòng)一段距離，之后電子間存在的斥力會(huì)迫使已經(jīng)聚集起來(lái)的電子再次離開(kāi)該區(qū)域。由此會(huì)形成一種整個(gè)電子系統(tǒng)的集體震蕩，而庫(kù)侖力的存在使得這種集體震蕩反復(fù)進(jìn)行震蕩，并以波的形式表現(xiàn)。surfaceplasmonresonance,SPR表面等離子共振原理光在棱鏡與金屬膜表面上發(fā)生全反射現(xiàn)象時(shí)，會(huì)形成消逝波進(jìn)入到光疏介質(zhì)中與介質(zhì)中存在一定的等離子波相遇時(shí)可能會(huì)發(fā)生共振。當(dāng)消逝波與表面等離子波發(fā)生共振時(shí)，檢測(cè)到的反射光強(qiáng)會(huì)大幅度地減弱。SPR角：反射光完全消失的角。SPR角隨金屬表面折射率變化而變化，而折射率的變化又與金屬表面結(jié)合的分子質(zhì)量成正比?？赏ㄟ^(guò)

SPR角的變化捕獲生物反應(yīng)過(guò)程中生物分子之間相互作用的特異信號(hào)，對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定直接測(cè)量反應(yīng)平衡常數(shù)Ka，解離平衡常數(shù)Kd

等。surfaceplasmonresonance,SPR將待測(cè)分子鍵合在生物傳感芯片表面，使其形成分子敏感膜，再將分析物分子溶液注入，使其以恒定流速流過(guò)芯片表面，如果兩者通過(guò)相互作用而結(jié)合，則將引起生物傳感器表面質(zhì)量的增加，導(dǎo)致傳感器表面折射率的變化，從而引起SPR角的改變。SPR被廣泛應(yīng)用于分析生物分子如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、藥物-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-核酸、核酸-核酸之間的相互作用，所涉及的研究領(lǐng)域包括免疫學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及藥物篩選等。.,11,28.surfaceplasmonresonance,SPRSPR的優(yōu)點(diǎn)：可以實(shí)時(shí)、連續(xù)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，靈敏度較高

。可實(shí)時(shí)記錄反應(yīng)的結(jié)合與解離過(guò)程。每次檢測(cè)結(jié)束后，結(jié)合在金屬膜芯片上的反應(yīng)物可以用洗脫液洗脫使芯片再生，可重復(fù)使用，節(jié)約耗材?？梢缘玫礁咄繑?shù)據(jù)。SPR的缺點(diǎn)：待測(cè)物在金屬薄膜表面的固定：由于生物大分子本身理化性質(zhì)的復(fù)雜性，空間結(jié)構(gòu)的特殊性，偶聯(lián)結(jié)果可能導(dǎo)致偶聯(lián)物特異作用位點(diǎn)的失活。分析物在金屬薄膜表面的結(jié)合：難以區(qū)分非特異性結(jié)合，若分析物在芯片表面是非特異性結(jié)合，會(huì)給整個(gè)實(shí)驗(yàn)帶來(lái)干擾，造成錯(cuò)誤的結(jié)論。待測(cè)物的分子大?。哼m用于生物大分子，小分子的質(zhì)量變化對(duì)折射率變化不明顯，因此會(huì)給小分子待測(cè)物的檢測(cè)造成困難。動(dòng)態(tài)范圍過(guò)?。簩?duì)溫度、樣品組成、金屬薄膜要求高。SPR與ITC功能特性對(duì)比enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.受體-配體復(fù)合物的形成伴隨著能量的釋放或吸收，導(dǎo)致樣品池溫度的變化，參比池始終保持在實(shí)驗(yàn)溫度，反饋系統(tǒng)提供熱或降低熱量來(lái)補(bǔ)償樣品池的溫度變化，每注射一次后系統(tǒng)恢復(fù)至平衡狀態(tài)再進(jìn)行下一滴滴定。結(jié)果以峰的形式表示平衡溫度偏移所需要的能量，峰的面積相當(dāng)于反應(yīng)釋放或吸收的熱量。銪穴狀化合物的激發(fā)和發(fā)射光譜GeneralFormatForFRET待測(cè)物在金屬薄膜表面的固定：由于生物大分子本身理化性質(zhì)的復(fù)雜性，空間結(jié)構(gòu)的特殊性，偶聯(lián)結(jié)果可能導(dǎo)致偶聯(lián)物特異作用位點(diǎn)的失活?？梢詫?shí)時(shí)、連續(xù)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，靈敏度較高。光在棱鏡與金屬膜表面上發(fā)生全反射現(xiàn)象時(shí)，會(huì)形成消逝波進(jìn)入到光疏介質(zhì)中與介質(zhì)中存在一定的等離子波相遇時(shí)可能會(huì)發(fā)生共振。因此不同時(shí)間點(diǎn)固定的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板可在同一時(shí)間測(cè)定，測(cè)定的吸光值結(jié)果不會(huì)受到明顯影響。將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，,加入濃度梯度的藥物,一般5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔。CCK-8法能快速檢測(cè)；向每孔中加入一定量的化合物，陽(yáng)性對(duì)照組加入對(duì)應(yīng)體積的DMSO；DMSO能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在540或720nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。（包被Coating）

2.每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.=△HoxVxx[H]o分子水平活性測(cè)試方法特點(diǎn)SPRITC固定化需要不需要結(jié)果動(dòng)力學(xué)動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)得到數(shù)據(jù)Ka,KdKa,，△H、△Cp運(yùn)行時(shí)間2~10min30~60min分子質(zhì)量>1000無(wú)限制樣品量約1mg最小含量0.4ug溫度15~40℃2~80℃溶劑非強(qiáng)有機(jī)溶劑無(wú)限制耗材芯片試劑藥物篩選適用不適用SPR與ITC功能特性對(duì)比Time-resolvedfluorescenceenergytransfer

(TR-FRET)

FRET原理傳統(tǒng)FRET技術(shù)容易受樣品組分(緩沖液，蛋白，化學(xué)物質(zhì)及細(xì)胞裂解產(chǎn)物等)背景熒光信號(hào)的影響。時(shí)間分辨通過(guò)去除壽命較短的背景，分辨目的熒光。通過(guò)使用供體和受體熒光團(tuán)標(biāo)記，TR-FRET檢測(cè)將時(shí)間分辨(TR)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理的優(yōu)勢(shì)結(jié)合到了一起。J.Biomol.Screen.,7,4.鑭系元素（銪Eu和鋱Tb）半衰期長(zhǎng)(us-ms)，將Eu納入立體籠中，形成穩(wěn)固復(fù)合體，籠收集光將能量轉(zhuǎn)移到Eu上。Eu永久性嵌合穴狀口袋（非螯合作用）耐受性好，對(duì)溫度，光強(qiáng)，PH，離子強(qiáng)度變化影響較小。不易受化學(xué)物質(zhì)干擾，如EDTA，二價(jià)離子（Mg2+，Mn2+）等。持續(xù)激活后沒(méi)有光漂白現(xiàn)象,可以多次讀數(shù)，從而進(jìn)行動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。鑭系元素的半衰期大于1毫秒，與普通熒光納秒級(jí)的半衰期相差6個(gè)數(shù)量級(jí)。當(dāng)延遲50微秒讀數(shù)時(shí)，普通熒光的信號(hào)近似于零。檢測(cè)的發(fā)射光中沒(méi)有來(lái)自于激發(fā)波長(zhǎng)的干擾。J.Phys.Chem.C,.17,112.

銪穴狀化合物的激發(fā)和發(fā)射光譜Time-resolvedfluorescenceenergytransfer

(TR-FRET)

Stokesshift>300nmTime-resolvedfluorescenceenergytransfer

(TR-FRET)

DonorExcitation?Emissionλ(nm)AcceptorExcitation?Emissionλ(nm)StokesShift(nm)(donorexcitation?acceptoremission)Europium3+340?615Allophycocyanin（APC）615?660320Terbium3+340?545Phycoerythrin（Phy）545?575235

J.Phys.Chem.C.,112,6589.Whenthesetwofluorophoresarebroughttogetherbyabiomolecularinteraction,aportionoftheenergycapturedbytheEuropiumduringexcitationisreleasedthroughfluorescenceemissionat620

nm,whiletheremainingenergyistransferredtotheAPC.ThisenergyisthenreleasedbyAPCasspecificfluorescenceat660

nmonlyviaFRETwithEuropium.GeneralFormatForFRETTime-resolvedfluorescenceenergytransfer

(TR-FRET)

J.Biomol.Screen.,7,4.PD1-PDL1bindingassay1.根據(jù)需要，使用1XBRDTR-FRETAssayBuffer分別將成分Eu-labeleddonor和

dye-labeledacceptor

(帶straptavidin標(biāo)記）

100倍稀釋?zhuān)?.向384孔板中，每孔加入稀釋好的Eu-labeleddonor和dye-labeledacceptor各2.5ul；3.向每孔中加入一定量的化合物，陽(yáng)性對(duì)照組加入對(duì)應(yīng)體積的DMSO；振蕩反應(yīng)1min；4.根據(jù)需要，使用1XBRDTR-FRETAssayBuffer將組分BETBromodomain40倍稀釋。分別向化合物檢測(cè)組和陽(yáng)性對(duì)照組加入稀釋好的BETBromodomain2.5ul每孔；5.根據(jù)需要，使用1XBRDTR-FRETAssayBuffer將組分acetylatedLigand1（帶Biotin標(biāo)記）

40倍稀釋。向陰性對(duì)照組加入稀釋好的BETBromodomain2.5ul每孔；6.每孔加入一定量的BRD4bromodomain，保證每個(gè)反應(yīng)體系中含有4.5ng含量的酶。7.室溫靜置反應(yīng)1h后，測(cè)值340/665nm。Time-resolvedfluorescenceenergytransfer

(TR-FRET)

BDR4相關(guān)化合物TR-FRET活性測(cè)試方法[BRD4(BD1)TR-FRETAssayKit購(gòu)買(mǎi)自BPSBioscience公司][(620/670nmCayman]enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)可用于測(cè)定抗體，也可用于檢測(cè)抗原。根據(jù)檢測(cè)目的和操作步驟不同，有以下幾種類(lèi)型：直接法間接法

雙抗體夾心法

競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)基本原理是先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。測(cè)定時(shí)，將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離成分。然后加入酶的作用底物催化顯色，進(jìn)行定性或定量測(cè)定。enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)直接法（DirectELISA）間接法（Indirect

ELISA）將已知抗原吸附于固相載體，加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗體)與之結(jié)合。洗滌后，加入酶標(biāo)抗球蛋白抗體(酶標(biāo)抗抗體)和底物進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)抗體最常用的方法。雙抗夾心法（SandwichELISA）enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)將已知抗體吸附于固相載體．加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合。溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體和底物進(jìn)行測(cè)定。（競(jìng)爭(zhēng)法CompetitiveELISA）可用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例．將持異性抗體吸附于固相載體；加入待測(cè)抗原和一定量的酶標(biāo)已知抗原，使二者競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合；經(jīng)過(guò)洗滌分離，最后結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原與待測(cè)抗原含量呈負(fù)相關(guān)。enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)在ELISA法中，底物被酶裂解后，能生成可溶性有色產(chǎn)物，適合用分光光度計(jì)(酶標(biāo)儀)測(cè)量光密度值，以定量測(cè)定樣品中待測(cè)抗原或抗體的含量。ELISA常用的酶及其底物

酶來(lái)源底物/供氫體呈色測(cè)量方法辣根過(guò)氧化物酶（HRP）辣根H2O2

/四甲基聯(lián)苯胺（TMB）藍(lán)色450

nmH2O2

/鄰苯二胺（OPD）橙色490

nm堿性磷酸酶（AP）小牛腸粘膜大腸桿菌對(duì)硝基苯磷酸鹽（PNP）黃色405

nmH2O2+Donor

2

H2O+OxidizeddonorHRP/APsurfaceplasmonresonance,SPR△Go為Gibbs自由能變化，△Ho為焓變，△So為熵變檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。SulforhodamineB（SRB）enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)分別向化合物檢測(cè)組和陽(yáng)性對(duì)照組加入稀釋好的BETBromodomain2.△Go=-RTlnKa可實(shí)時(shí)記錄反應(yīng)的結(jié)合與解離過(guò)程。TR-FRET檢測(cè)將時(shí)間分辨(TR)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理的優(yōu)勢(shì)結(jié)合到了一起。DMSO能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在540或720nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量?？捎糜跍y(cè)定抗體，也可用于檢測(cè)抗原。SulforhodamineB（SRB）SulforhodamineB（SRB）Time-resolvedfluorescenceenergytransfer

(TR-FRET)0005mol/L，50μl；雙抗夾心法（SandwichELISA）SPR被廣泛應(yīng)用于分析生物分子如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、藥物-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-核酸、核酸-核酸之間的相互作用，所涉及的研究領(lǐng)域包括免疫學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及藥物篩選等。Time-resolvedfluorescenceenergytransfer

(TR-FRET)溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體和底物進(jìn)行測(cè)定。將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，,加入濃度梯度的藥物,一般5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔。1.Integrin

α6β1蛋白

5μg/ml，50μl/孔，4oC固定過(guò)夜；（包被Coating）

2.PBS

250μl/孔

沖洗3次；（封閉Blocking）

3.加入上述多肽，其中CRWY-biotin

工作濃度為0.00005mol/L，體積為50μl。阻斷肽為0.0005mol/L，50μl；

4.室溫結(jié)合1小時(shí)；

5.HEPES沖洗6次，250μl/次；

6.加入HRP-straptavidin

1：3000，室溫1小時(shí)；

7.HEPES沖洗6次，250μl/次；

8.加入50μl

TMB，觀察顯色效果；

9.加入100μl

0.5M

H2SO4終止反應(yīng)，450nm測(cè)OD值。enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)ELISA測(cè)試CRWY修飾肽與整合素α6的親和力實(shí)驗(yàn)方法競(jìng)爭(zhēng)法BAS-ELISA2總結(jié)3分子水平活性測(cè)試方法1CONTENTS細(xì)胞水平活性測(cè)試方法檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。DMSO能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在540或720nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。用于檢測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性。MTT是一種粉末狀化學(xué)試劑，全稱(chēng)為3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，化學(xué)名為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽。商品名：噻唑藍(lán)，是一種黃顏色的染料。MTTMTT1.將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，,加入濃度梯度的藥物,一般5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔。2.5%CO2，37℃孵育16-48小時(shí)。3.每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。4.終止培養(yǎng)，準(zhǔn)備溶解結(jié)晶，測(cè)試吸光度。第一種，DMSO溶解MTT加入培養(yǎng)4h后，結(jié)晶可充分形成，將細(xì)胞上清去掉。每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀測(cè)OD570nm處測(cè)量各孔的吸光值。第二種：三聯(lián)溶解液該方法細(xì)胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。（溶解液因含有SDS，在低溫保存的時(shí)候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時(shí)拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。）放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4—6小時(shí)，鏡下觀察，待結(jié)晶全部溶解后570nm測(cè)吸光度。MTT一般操作方法MTT的缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測(cè)。不僅使工作量增加，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。MTT有致癌性。MTT對(duì)菌很敏感，配成的MTT需要無(wú)菌保存?？煽慷群挽`敏度易受細(xì)胞容積、氧化還原劑、有色物質(zhì)等因素干擾。MTTMTT的優(yōu)點(diǎn)：不涉及使用同位素；使用試劑少，儀器簡(jiǎn)單，耗時(shí)少；線性范圍寬；適用于大量抗癌藥物的篩選。CellCountingKit-8（CCK-8）基本原理：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被活細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。CCK8的優(yōu)點(diǎn)：使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑；CCK-8法能快速檢測(cè)；CCK-8法的檢測(cè)靈敏度很高，可以測(cè)定較低細(xì)胞密度；CCK-8法的重復(fù)性?xún)?yōu)于MTT法；CCK-8法對(duì)細(xì)胞毒性??；CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑中為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開(kāi)即用。CellCountingKit-8（CCK-8）CCK8的缺點(diǎn)：與MTT法相比，CCK8的價(jià)格比較貴。CCK8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話(huà)容易產(chǎn)生漏加或多加。1、各種癌細(xì)胞系按適宜的細(xì)胞濃度，50uL/孔體積鋪板384孔板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，處理。2、化合物稀釋:先將化合物用DMSO溶解成10mM儲(chǔ)存液，并用DMSO3倍梯度稀釋成10個(gè)濃度梯度，成1000×化合物系列濃度儲(chǔ)存液，再轉(zhuǎn)移至化合物轉(zhuǎn)移儀器適配384PP板中備用。3、利用化合物轉(zhuǎn)移儀器LiquidHandlerEcho520將1000×系列濃度化合物轉(zhuǎn)移至癌細(xì)胞384孔板的相應(yīng)孔中，每孔50nL，空白對(duì)照孔加入50nLDMSO。輕柔混勻，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。

4、72小時(shí)后加入CCK8細(xì)胞增殖—毒性檢測(cè)試劑，3uL/孔，37℃孵育2小時(shí)。然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm光吸收強(qiáng)度。CellCountingKit-8（CCK-8）BDR4相關(guān)化合物抗癌細(xì)胞活性體外篩選方法檢測(cè)方法MTT法XTT法WST-1法CCK8法甲臢產(chǎn)物的水溶性差（需加有機(jī)溶劑溶解）好好好產(chǎn)品性狀粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用現(xiàn)配現(xiàn)用即開(kāi)即用即開(kāi)即用檢測(cè)靈敏度高很高很高高檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)較短較短最短檢測(cè)波長(zhǎng)560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm細(xì)胞毒性高，細(xì)胞形態(tài)完全消失很低，細(xì)胞形態(tài)不變很低，細(xì)胞形態(tài)不變很低，細(xì)胞形態(tài)不變