MicroRNA-497靶向調(diào)控RAF1抑制胃癌進程的分子機制探究一、引言1.1研究背景與意義胃癌作為消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。據(jù)統(tǒng)計，在全球范圍內(nèi)，每年胃癌的死亡人數(shù)在腫瘤死亡人數(shù)中位居前列。在中國，胃癌同樣是發(fā)病率和死亡率較高的癌癥之一，其發(fā)病率和死亡率在各類惡性腫瘤中均位居前列。由于胃癌早期癥狀隱匿，缺乏特異性表現(xiàn)，多數(shù)患者確診時已處于進展期，錯失了最佳的手術(shù)治療時機。而進展期胃癌對傳統(tǒng)手術(shù)及化療等治療手段的反應(yīng)不佳，導(dǎo)致患者的總體預(yù)后較差，5年生存率較低。因此，深入探索胃癌的發(fā)病機制，尋找新的診斷及預(yù)后標(biāo)記物，開發(fā)更有效的治療策略，已成為當(dāng)前胃癌研究領(lǐng)域的迫切需求。MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，長度約為22個核苷酸，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平上通過與靶mRNA的互補配對，引起靶mRNA的降解或翻譯抑制，從而調(diào)控基因的表達。近年來，越來越多的研究表明，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。miRNA可以作為抑癌基因或癌基因參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程的調(diào)控。例如，miR-21在胃癌組織中表達上調(diào)，通過抑制其靶基因的表達，促進胃癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；而miR-146b在胃癌組織中表達下調(diào)，其過表達可抑制胃癌細胞的遷移和侵襲能力。MicroRNA-497（miR-497）位于人染色體17p13.1，已有研究顯示，miR-497在多種惡性腫瘤中呈低表達狀態(tài)，并發(fā)揮著抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。在乳腺癌中，miR-497通過靶向調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白，抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移；在結(jié)直腸癌中，miR-497可通過抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路，誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞的凋亡，抑制其生長和轉(zhuǎn)移。然而，miR-497在胃癌中的表達情況、調(diào)控機制以及其在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的具體作用，目前仍尚不明確，有待進一步深入研究。RAF1（Raf-1proto-oncogene，serine/threoninekinase）編碼Ras家族下游靶蛋白MAP3K，在細胞信號傳導(dǎo)通路中扮演著關(guān)鍵角色。大量研究表明，RAF1在多種惡性腫瘤組織中高表達，且其表達水平與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在肺癌中，RAF1的高表達促進肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲；在肝癌中，RAF1通過激活ERK信號通路，增強肝癌細胞的惡性生物學(xué)行為。然而，關(guān)于DNA甲基化、miR-497和RAF1這一調(diào)控系統(tǒng)在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制，在國內(nèi)外尚未見系統(tǒng)報道。本研究旨在深入探討miR-497在胃癌中的表達水平，分析其與胃癌發(fā)生發(fā)展及臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，揭示其可能的分子調(diào)節(jié)機制，明確其對胃癌細胞生物學(xué)功能的影響以及調(diào)控靶基因，從而為研究胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制提供新的理論依據(jù)，為胃癌的基因治療和靶向治療開辟新的途徑和靶點，具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的本研究旨在深入剖析MicroRNA-497（miR-497）在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的具體作用機制，通過多維度的實驗探究，達成以下研究目的：明確miR-497在胃癌中的表達特征：運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，精準(zhǔn)檢測miR-497在胃癌細胞系以及胃癌組織中的表達水平，并與正常胃黏膜細胞和癌旁組織進行對比分析，明確其表達差異。同時，深入探討miR-497的表達水平與胃癌患者臨床病理學(xué)特征，如腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移等之間的關(guān)聯(lián)，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。揭示調(diào)控miR-497表達的分子機制：借助甲基化特異性PCR（MSP）技術(shù)，全面檢測胃癌細胞及組織中miR-497基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)，深入分析甲基化水平與miR-497表達之間的內(nèi)在聯(lián)系，以及與胃癌患者臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性。通過去甲基化藥物5-Aza-dC對胃癌細胞進行干預(yù)，觀察miR-497基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及表達水平的動態(tài)變化，進一步揭示DNA甲基化對miR-497表達的調(diào)控機制。闡明miR-497對胃癌細胞生物學(xué)功能的影響：在體外實驗中，選用胃癌SGC-7901、MGC-803細胞株，通過轉(zhuǎn)染miR-497模擬體（mimics），外源性地過表達miR-497，運用CCK-8實驗、劃痕愈合實驗、流式細胞術(shù)和Transwell小室實驗等多種技術(shù)手段，全面分析過表達miR-497對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)功能的影響。在體內(nèi)實驗中，構(gòu)建過表達miR-497的SGC-7901穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，建立裸鼠皮下移植瘤模型，深入研究過表達miR-497對小鼠體內(nèi)移植瘤生長能力的影響，從體內(nèi)外兩個層面明確miR-497對胃癌細胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用。確定miR-497的調(diào)控靶點及作用機制：利用在線靶基因預(yù)測軟件，如TargetScan、miRanda等，對miR-497的潛在靶基因進行全面預(yù)測。通過Westernblot技術(shù)檢測miR-497靶基因在胃癌細胞及組織中的表達情況，并分析胃癌細胞中轉(zhuǎn)染miR-497后其靶基因的表達變化。運用雙熒光素酶報告實驗，對miR-497與其靶基因的結(jié)合位點進行精準(zhǔn)鑒定，明確miR-497的直接作用靶點。最后，采用靶基因的干擾RNA（siRNA）實驗，驗證能否得到與過表達miR-497相似的生物學(xué)功能，進一步深入探索miR-497發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機制。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在胃癌的研究領(lǐng)域，尋找有效的診斷、治療靶點和深入探究其發(fā)病機制一直是重點方向。近年來，關(guān)于miR-497和RAF1在腫瘤尤其是胃癌中的研究逐漸增多，為我們深入了解胃癌的發(fā)病機制和治療策略提供了新的思路，但仍存在許多有待完善的地方。1.3.1MicroRNA-497的研究現(xiàn)狀MicroRNA-497作為一類重要的非編碼RNA，其在腫瘤中的作用備受關(guān)注。在乳腺癌的研究中，Li等學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-497能夠通過靶向調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白，如cyclinE1，從而抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移。在結(jié)直腸癌方面，Guo等人的研究表明，miR-497可通過抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路，誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞的凋亡，抑制其生長和轉(zhuǎn)移。在胃癌的研究中，國內(nèi)研究成果豐碩。劉少平、高艷等人通過實時熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測70例GC患者術(shù)前及術(shù)后、30例萎縮性胃炎患者及30例健康者血清miR-497表達量，發(fā)現(xiàn)GC組術(shù)前血清miR-497表達量顯著低于其術(shù)后及萎縮性胃炎組和正常對照組，且術(shù)前血清miR-497表達量與GC浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及是否遠處轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，Cox多因素分析顯示術(shù)前血清miR-497表達量是影響GC術(shù)后預(yù)后的獨立高危因素。孫葉飛、周建平選取94例胃癌及其癌旁組織，用RT-PCR法定量檢測miR-497在其中的表達，發(fā)現(xiàn)miR-497表達量在胃癌組織中明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，BCL2L2被預(yù)測為miR-497的靶基因，miR-497在胃癌SGC-7901細胞中過表達后BCL2L2蛋白表達明顯減弱。國外也有不少研究成果。有研究通過對胃癌組織和正常胃黏膜組織進行高通量測序分析，篩選出了一系列在胃癌中差異表達的miRNA，其中包括miR-497，且發(fā)現(xiàn)其在胃癌組織中表達下調(diào)。還有研究利用基因芯片技術(shù)，分析胃癌患者和健康對照者的血清miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)miR-497在胃癌患者血清中低表達，且與腫瘤的分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)。1.3.2RAF1的研究現(xiàn)狀RAF1在細胞信號傳導(dǎo)通路中起著核心作用，其在腫瘤中的高表達與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在肺癌研究中，Zhang等發(fā)現(xiàn)RAF1的高表達能夠促進肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，通過激活ERK信號通路，增強肺癌細胞的惡性生物學(xué)行為。在肝癌方面，Wang等學(xué)者研究表明，RAF1通過與其他信號分子相互作用，激活下游的MAPK/ERK信號通路，促進肝癌細胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移。在胃癌研究中，國內(nèi)陳壯威、戴起寶等采用免疫組織化學(xué)SP法檢測80例胃癌組織和15例癌旁正常胃組織中RAF1的表達水平，發(fā)現(xiàn)80例胃癌組織中RAF1的陽性表達率為81.3%，15例癌旁正常胃組織中均未見表達，RAF1表達與胃癌的浸潤深度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。國外也有研究通過對胃癌細胞系進行基因敲降實驗，發(fā)現(xiàn)抑制RAF1的表達能夠顯著降低胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，同時誘導(dǎo)細胞凋亡。1.3.3研究空白與不足盡管目前對于miR-497和RAF1在腫瘤中的研究已經(jīng)取得了一定的進展，但在胃癌研究領(lǐng)域仍存在諸多空白與不足。在miR-497方面，雖然已有研究表明其在胃癌組織和細胞中低表達，且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)，但其在胃癌中的具體調(diào)控機制尚未完全明確。例如，除了已報道的BCL2L2等靶基因外，是否還存在其他重要的靶基因參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過程，目前仍不清楚。同時，關(guān)于miR-497基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)在胃癌發(fā)生發(fā)展中的動態(tài)變化及其與其他表觀遺傳修飾之間的相互作用關(guān)系，也有待進一步深入研究。在RAF1方面，雖然其在胃癌中的高表達及其與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系已得到一定證實，但針對RAF1的靶向治療策略在胃癌中的應(yīng)用仍處于探索階段。如何精準(zhǔn)地靶向抑制RAF1的活性，同時避免對正常細胞產(chǎn)生不良影響，是當(dāng)前研究的重點和難點之一。此外，RAF1在胃癌細胞信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的上下游分子調(diào)控機制，以及其與其他腫瘤相關(guān)信號通路之間的交叉對話，也需要進一步深入探討。關(guān)于DNA甲基化、miR-497和RAF1這一調(diào)控系統(tǒng)在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制，在國內(nèi)外尚未見系統(tǒng)報道。三者之間是否存在直接或間接的調(diào)控關(guān)系，以及它們?nèi)绾螀f(xié)同作用影響胃癌細胞的生物學(xué)行為，均是亟待解決的科學(xué)問題。深入研究這一調(diào)控系統(tǒng)，有望為胃癌的診斷、治療和預(yù)后評估提供新的靶點和理論依據(jù)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1MicroRNA概述MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長度約為21-23個核苷酸。1993年，VictorAmbros和GaryRuvkun團隊在秀麗隱桿線蟲中首次發(fā)現(xiàn)了lin-4，這是第一個被鑒定出的miRNA，它通過不完全堿基配對調(diào)控靶基因lin-14的表達，開啟了miRNA研究的序幕。隨著研究的深入，大量的miRNA被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，截至目前已發(fā)現(xiàn)人類miRNA前體有1982條，成熟miRNA有2694條。miRNA具有高度保守性、組織特異性和時序性等特點。高度保守性是指miRNA在物種進化過程中序列相對穩(wěn)定，從線蟲、果蠅到人類，許多miRNA的序列和功能都具有相似性。組織特異性則體現(xiàn)在不同組織中miRNA的表達譜存在差異，如miR-1在心肌組織中高表達，而在其他組織中表達量較低，這種特異性表達與組織的發(fā)育、分化和功能密切相關(guān)。時序性是指在生物個體發(fā)育的不同階段，miRNA的表達水平會發(fā)生動態(tài)變化，參與調(diào)控胚胎發(fā)育、細胞分化等過程。miRNA的作用機制主要是在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行調(diào)控。其成熟過程較為復(fù)雜，首先由基因組中的miRNA基因轉(zhuǎn)錄生成初級miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA長度從幾百到幾千個堿基不等，具有5’帽子和3’polyA尾巴以及1到數(shù)個發(fā)夾徑環(huán)結(jié)構(gòu)。隨后，pri-miRNA在核酸酶Drosha和其輔助因子DGCR8的作用下，被剪切為約70個堿基的帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體（pre-miRNA）。pre-miRNA被轉(zhuǎn)運出細胞核后，在核酸酶Dicer的作用下，從其5’端和3’端分別剪切，形成長度約為22個堿基的單鏈成熟miRNA。成熟的miRNA通常與AGO蛋白等形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）互補配對發(fā)揮調(diào)控作用。當(dāng)miRNA與靶mRNA的互補配對程度較高時，RISC中的核酸酶會切割靶mRNA，導(dǎo)致其降解；當(dāng)互補配對程度較低時，則主要抑制靶mRNA的翻譯過程，阻礙蛋白質(zhì)的合成。一個miRNA可以靶向多個不同的mRNA，同時一個mRNA也可能受到多個miRNA的調(diào)控，這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使得miRNA能夠廣泛地參與細胞的各種生理和病理過程。在腫瘤領(lǐng)域，miRNA發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用，既可以作為抑癌基因，也可以作為癌基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。作為抑癌基因時，如miR-34家族，在多種腫瘤中表達下調(diào)，其通過靶向調(diào)控細胞周期、凋亡相關(guān)基因以及腫瘤干細胞相關(guān)基因等，抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。而作為癌基因的miRNA，如miR-21，在大多數(shù)腫瘤中表達上調(diào)，通過抑制其靶基因如PTEN等的表達，激活PI3K-AKT等信號通路，促進腫瘤細胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移。miRNA還參與腫瘤的血管生成、免疫逃逸等過程。在血管生成方面，miRNA可以通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等相關(guān)因子的表達，影響腫瘤血管的生成。在免疫逃逸方面，miRNA可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞表面的免疫相關(guān)分子表達，以及免疫細胞的功能，從而幫助腫瘤細胞逃避機體的免疫監(jiān)視。此外，miRNA在腫瘤的診斷、預(yù)后評估和治療等方面也具有潛在的應(yīng)用價值，有望成為腫瘤精準(zhǔn)診療的新靶點和生物標(biāo)志物。2.2MicroRNA-497的特性與功能MicroRNA-497（miR-497）是miR-15家族中的重要成員，在人體的組織和細胞中呈中至高豐度表達。人的miR-497由位于17號染色體短臂上13.1（17q13.1）的miR-497HG（基因ID：100506755）基因的第一個內(nèi)含子編碼。該基因結(jié)構(gòu)獨特，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過一系列復(fù)雜的加工過程，最終形成成熟的miR-497。miR-497在多種組織和細胞中均有分布，包括心臟、肝臟、腎臟、肺、胃腸道等器官組織。在正常生理狀態(tài)下，miR-497參與調(diào)控細胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程。例如，在胚胎發(fā)育過程中，miR-497在心臟發(fā)育中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它可以通過靶向調(diào)控相關(guān)基因的表達，影響心肌細胞的增殖和分化，確保心臟的正常發(fā)育和功能。在細胞周期調(diào)控方面，miR-497能夠通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白等相關(guān)分子的表達，影響細胞周期的進程，維持細胞的正常生長和分裂。在腫瘤研究領(lǐng)域，越來越多的證據(jù)表明miR-497在多種惡性腫瘤中扮演著抑癌基因的角色。在乳腺癌中，研究發(fā)現(xiàn)miR-497表達下調(diào)，過表達miR-497可以抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移能力。其作用機制主要是通過靶向細胞周期蛋白E1（CCNE1），抑制其表達，從而使乳腺癌細胞停滯在G1期，抑制細胞的增殖。在結(jié)直腸癌中，miR-497同樣呈低表達狀態(tài)。Guo等人的研究表明，miR-497可通過抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路，誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞的凋亡，抑制其生長和轉(zhuǎn)移。具體來說，miR-497可以直接靶向該信號通路上的關(guān)鍵分子，如AKT、mTOR等，抑制它們的表達和活性，從而阻斷信號傳導(dǎo)，發(fā)揮抑癌作用。在卵巢癌中，miR-497在人卵巢癌組織中下調(diào)，通過靶向結(jié)合SMURF1進而抑制卵巢癌細胞的遷移和侵襲。在宮頸癌組織中，miR-497呈低表達狀態(tài)，通過靶向胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）和轉(zhuǎn)酮醇酶（TKT）抑制宮頸癌細胞的侵襲、遷移和耐藥性，過表達的miR-497在HeLa細胞系中可以通過靶向結(jié)合細胞周期蛋白E1（CCNE1）來抑制細胞增殖。在胃癌中，已有研究顯示miR-497在胃癌組織和細胞中低表達。劉少平、高艷等人通過實時熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測70例GC患者術(shù)前及術(shù)后、30例萎縮性胃炎患者及30例健康者血清miR-497表達量，發(fā)現(xiàn)GC組術(shù)前血清miR-497表達量顯著低于其術(shù)后及萎縮性胃炎組和正常對照組，且術(shù)前血清miR-497表達量與GC浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及是否遠處轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，Cox多因素分析顯示術(shù)前血清miR-497表達量是影響GC術(shù)后預(yù)后的獨立高危因素。孫葉飛、周建平選取94例胃癌及其癌旁組織，用RT-PCR法定量檢測miR-497在其中的表達，發(fā)現(xiàn)miR-497表達量在胃癌組織中明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。綜合來看，miR-497在多種腫瘤中呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)，其主要通過靶向調(diào)控一系列與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因和信號通路，發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制遷移和侵襲等生物學(xué)功能。然而，目前對于miR-497在腫瘤中的具體調(diào)控機制尚未完全明確，仍需要進一步深入研究。2.3RAF1基因與蛋白RAF1基因，全稱Raf-1proto-oncogene，serine/threoninekinase，位于人染色體3p25.3，其DNA序列長度約為63,477個堿基對。該基因包含18個外顯子和17個內(nèi)含子，通過轉(zhuǎn)錄和選擇性剪接機制，可產(chǎn)生多種不同的轉(zhuǎn)錄本，編碼出具有不同功能的蛋白質(zhì)異構(gòu)體。RAF1基因的表達調(diào)控機制較為復(fù)雜，涉及多個層面。在轉(zhuǎn)錄水平，多種轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控RAF1基因的表達。例如，轉(zhuǎn)錄因子Sp1能夠與RAF1基因啟動子區(qū)域的GC盒結(jié)合，促進其轉(zhuǎn)錄起始；而Ets家族轉(zhuǎn)錄因子則可通過與啟動子區(qū)域的特定序列相互作用，增強RAF1基因的轉(zhuǎn)錄活性。此外，一些腫瘤相關(guān)的信號通路，如Ras-Raf-MEK-ERK信號通路的激活，也可通過反饋調(diào)節(jié)機制，影響RAF1基因的轉(zhuǎn)錄水平。在轉(zhuǎn)錄后水平，RNA結(jié)合蛋白、非編碼RNA等也參與了RAF1基因表達的調(diào)控。例如，微小RNA（miRNA）可以通過與RAF1mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）互補配對，抑制其翻譯過程，或者誘導(dǎo)其降解，從而降低RAF1蛋白的表達水平。已有研究表明，miR-497等多種miRNA能夠靶向RAF1基因，抑制其表達。RAF1蛋白，又稱c-Raf或Raf-1，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于Raf激酶家族成員。其分子量約為75kDa，由648個氨基酸殘基組成。RAF1蛋白結(jié)構(gòu)包含三個保守區(qū)域（CR1、CR2和CR3），各區(qū)域在RAF1蛋白的功能發(fā)揮中起著關(guān)鍵作用。CR1區(qū)域位于RAF1蛋白的N端，包含Ras結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）和富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（CRD）。RBD能夠與活化的Ras蛋白特異性結(jié)合，從而將RAF1招募到細胞膜上，啟動下游信號傳導(dǎo)；CRD則與細胞膜上的磷脂相互作用，有助于穩(wěn)定RAF1與Ras的結(jié)合，并促進其從抑制狀態(tài)釋放。CR2區(qū)域包含14-3-3蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域和一個重要的抑制性磷酸化位點S259。在非激活狀態(tài)下，S259位點被磷酸化，14-3-3蛋白與該位點結(jié)合，使RAF1維持在自動抑制狀態(tài)，抑制其激酶活性。CR3區(qū)域位于RAF1蛋白的C端，包含激酶結(jié)構(gòu)域和14-3-3的額外結(jié)合位點S621。激酶結(jié)構(gòu)域是RAF1發(fā)揮催化活性的核心區(qū)域，可通過磷酸化下游底物，如MEK1/2，激活Ras-Raf-MEK-ERK信號通路，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、存活等生物學(xué)過程。S621位點的磷酸化也與RAF1蛋白的激活和信號傳導(dǎo)密切相關(guān)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，RAF1蛋白發(fā)揮著重要作用。大量研究表明，RAF1在多種惡性腫瘤組織中高表達，且其表達水平與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在肺癌中，RAF1的高表達能夠促進肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，通過激活ERK信號通路，增強肺癌細胞的惡性生物學(xué)行為。在肝癌中，RAF1通過與其他信號分子相互作用，激活下游的MAPK/ERK信號通路，促進肝癌細胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移。在胃癌中，陳壯威、戴起寶等采用免疫組織化學(xué)SP法檢測80例胃癌組織和15例癌旁正常胃組織中RAF1的表達水平，發(fā)現(xiàn)80例胃癌組織中RAF1的陽性表達率為81.3%，15例癌旁正常胃組織中均未見表達，RAF1表達與胃癌的浸潤深度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。RAF1蛋白還可通過非激酶依賴的方式參與腫瘤細胞的生物學(xué)過程。例如，RAF1可以轉(zhuǎn)移到線粒體，磷酸化并失活促凋亡蛋白BAD，從而抑制細胞凋亡，促進腫瘤細胞的存活。此外，RAF1還能與腫瘤抑制因子RB相互作用，促進E2F的釋放，調(diào)節(jié)細胞周期的進展，進而影響腫瘤細胞的增殖。2.4胃癌的發(fā)生發(fā)展機制胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個涉及多因素、多步驟、多基因改變的復(fù)雜病理過程，受到環(huán)境因素、遺傳因素、幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）感染等多種因素的共同影響。環(huán)境與飲食因素在胃癌的發(fā)生中扮演著重要角色。流行病學(xué)研究顯示，長期攝入高鹽食物，如腌制食品、咸菜等，會破壞胃黏膜的保護屏障，導(dǎo)致胃黏膜細胞受損，增加胃癌發(fā)生的風(fēng)險。腌制食品中富含亞硝酸鹽，在胃內(nèi)可轉(zhuǎn)化為亞硝胺類化合物，這是一類強致癌物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞的基因突變，引發(fā)細胞異常增殖和分化。此外，熏制、霉變食物中也含有多種致癌物質(zhì)，如多環(huán)芳烴、黃曲霉毒素等，長期食用這些食物，會對胃黏膜造成持續(xù)性損傷，逐漸引發(fā)癌前病變，最終發(fā)展為胃癌。相反，新鮮水果和蔬菜中富含維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素等抗氧化物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠清除體內(nèi)的自由基，抑制致癌物的生成，降低胃癌的發(fā)生風(fēng)險。遺傳因素在胃癌的發(fā)病中也起著關(guān)鍵作用。約10%的胃癌患者具有家族聚集性，存在遺傳易感性。遺傳性彌漫性胃癌（HDGC）是一種常染色體顯性遺傳的胃癌綜合征，主要由CDH1基因突變引起。CDH1基因編碼E-鈣黏蛋白，該蛋白在維持上皮細胞的黏附、極性和分化中發(fā)揮著重要作用。CDH1基因突變會導(dǎo)致E-鈣黏蛋白功能缺失，使上皮細胞間的黏附力下降，細胞容易發(fā)生遷移和侵襲，從而增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險。此外，其他一些基因如TP53、APC、MLH1等的突變或多態(tài)性也與胃癌的遺傳易感性相關(guān)。這些基因參與細胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、細胞凋亡等重要生物學(xué)過程，其功能異常會導(dǎo)致細胞增殖和分化失衡，增加胃癌發(fā)生的可能性。幽門螺桿菌（Hp）感染被國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）列為第Ⅰ類生物致癌因子，是胃癌發(fā)生的重要危險因素。Hp感染后，會在胃內(nèi)定植，通過分泌尿素酶、細胞毒素相關(guān)基因A（CagA）、空泡毒素（VacA）等毒力因子，引起胃黏膜的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。CagA蛋白可以被轉(zhuǎn)運到胃上皮細胞內(nèi)，通過磷酸化修飾激活多種信號通路，如Ras-Raf-MEK-ERK、PI3K-AKT等，促進細胞增殖和存活，抑制細胞凋亡。同時，Hp感染還會導(dǎo)致胃黏膜上皮細胞的增殖和分化異常，引發(fā)慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生和異型增生等癌前病變，隨著病變的進展，最終可能發(fā)展為胃癌。從病理類型來看，胃癌主要分為腺癌、鱗癌、腺鱗癌、未分化癌等，其中腺癌最為常見，約占胃癌的90%以上。根據(jù)腫瘤的生長方式和形態(tài)特征，腺癌又可進一步分為乳頭狀腺癌、管狀腺癌、黏液腺癌、印戒細胞癌等亞型。不同病理類型的胃癌在生物學(xué)行為、治療反應(yīng)和預(yù)后等方面存在差異。例如，印戒細胞癌惡性程度較高，侵襲性強，預(yù)后較差；而乳頭狀腺癌和管狀腺癌的惡性程度相對較低，預(yù)后相對較好。胃癌的發(fā)展過程通常經(jīng)歷從正常胃黏膜到癌前病變，再到早期胃癌，最后發(fā)展為進展期胃癌的過程。在癌前病變階段，胃黏膜上皮細胞會出現(xiàn)異型增生，表現(xiàn)為細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的異常改變。異型增生分為低級別和高級別，低級別異型增生具有一定的可逆性，但如果持續(xù)受到致癌因素的刺激，可能會進展為高級別異型增生，此時細胞的異型性更為明顯，與癌細胞的形態(tài)和生物學(xué)行為更為接近，癌變的風(fēng)險顯著增加。早期胃癌是指癌組織局限于胃黏膜層和黏膜下層，無論有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。早期胃癌癥狀不明顯，缺乏特異性表現(xiàn)，往往容易被忽視。隨著病情的進展，癌組織逐漸侵犯胃壁的肌層、漿膜層，并向周圍組織和器官浸潤，同時可發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移，進入進展期胃癌階段。進展期胃癌患者會出現(xiàn)明顯的癥狀，如腹痛、腹脹、消瘦、嘔血、黑便等，此時治療難度較大，預(yù)后較差。在分子機制方面，胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及多個信號通路的異常激活或抑制。Ras-Raf-MEK-ERK信號通路在胃癌細胞的增殖、分化、遷移和存活中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)Ras基因發(fā)生突變或上游生長因子受體異常激活時，會導(dǎo)致Ras蛋白持續(xù)活化，進而激活下游的Raf、MEK和ERK蛋白，使細胞處于持續(xù)增殖和抗凋亡狀態(tài)。PI3K-AKT-mTOR信號通路也在胃癌中頻繁激活，該通路通過調(diào)節(jié)細胞的代謝、生長、增殖和存活等過程，促進胃癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移。此外，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活會導(dǎo)致β-catenin在細胞質(zhì)中積累，并進入細胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動一系列與細胞增殖、分化和遷移相關(guān)基因的表達，促進胃癌的發(fā)生發(fā)展。同時，腫瘤抑制基因的失活，如p53、PTEN等，也會導(dǎo)致細胞增殖失控和凋亡受阻，在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。三、MicroRNA-497與RAF1在胃癌中的表達研究3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料細胞株：選用人胃癌細胞株SGC-7901、MGC-803、BGC-823、AGS以及正常人胃黏膜上皮細胞株GES-1，均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。這些細胞株在后續(xù)實驗中用于研究miR-497和RAF1在胃癌細胞中的表達特征以及對細胞生物學(xué)功能的影響。組織樣本：收集[具體醫(yī)院名稱]胃腸外科手術(shù)切除的86例胃癌組織及其配對的癌旁組織（距離腫瘤邊緣≥5cm）。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療，且臨床和病理資料完整。組織樣本采集后，立即置于液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)的基因表達檢測和甲基化分析。主要試劑：RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen公司，該試劑能夠高效、穩(wěn)定地從細胞和組織中提取總RNA，為后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR實驗提供高質(zhì)量的RNA模板。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa公司，其中逆轉(zhuǎn)錄試劑盒可將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實時熒光定量PCR試劑盒則用于對cDNA進行定量擴增和檢測，具有高靈敏度和特異性。甲基化特異性PCR（MSP）試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，用于檢測miR-497基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)。兔抗人RAF1多克隆抗體購自Abcam公司，該抗體具有高親和力和特異性，可用于Westernblot檢測RAF1蛋白的表達水平。HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司，與一抗結(jié)合后，可通過化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白的信號強度。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司，用于驗證miR-497與靶基因RAF1的結(jié)合位點。Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司，能夠高效地將外源核酸轉(zhuǎn)染至細胞中，用于過表達miR-497和干擾RAF1表達的實驗。CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，通過檢測細胞代謝活性來評估細胞的增殖能力。Transwell小室購自Corning公司，用于細胞遷移和侵襲實驗。主要儀器：實時熒光定量PCR儀（ABI7500）購自美國AppliedBiosystems公司，該儀器具有高精度、高靈敏度和穩(wěn)定性，能夠準(zhǔn)確地檢測基因的表達水平。PCR擴增儀（Bio-RadT100）購自美國Bio-Rad公司，用于進行PCR反應(yīng)。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadGelDocXR+）購自美國Bio-Rad公司，可對PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳分析和成像。高速冷凍離心機（Eppendorf5424R）購自德國Eppendorf公司，用于分離細胞和組織中的各種成分。酶標(biāo)儀（ThermoScientificMultiskanGO）購自美國ThermoFisherScientific公司，用于檢測CCK-8實驗中的吸光度值。熒光顯微鏡（OlympusIX71）購自日本Olympus公司，用于觀察細胞的形態(tài)和熒光信號。3.1.2實驗方法實時熒光定量PCR（qRT-PCR）RNA提?。菏褂肨RIzol試劑按照說明書操作，從胃癌細胞株和組織樣本中提取總RNA。具體步驟為：將細胞或組織加入適量TRIzol試劑，充分裂解后，加入氯仿進行萃取，離心后取上清液，加入異丙醇沉淀RNA，用75%乙醇洗滌RNA沉淀，最后用RNase-free水溶解RNA。提取的RNA通過NanoDrop2000分光光度計檢測其濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。逆轉(zhuǎn)錄：取1μg總RNA，利用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系包括5×PrimeScriptBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、Random6mers、OligodTPrimer和總RNA，加RNase-free水補足至10μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。實時熒光定量PCR：以cDNA為模板，使用TaKaRa實時熒光定量PCR試劑盒進行擴增。反應(yīng)體系包括2×SYBRPremixExTaq、上下游引物、ROXReferenceDyeII、cDNA模板和ddH?O，總體積為20μL。引物序列根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫設(shè)計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。miR-497上游引物為5’-[具體序列]-3’，下游引物為5’-[具體序列]-3’；U6上游引物為5’-[具體序列]-3’，下游引物為5’-[具體序列]-3’；RAF1上游引物為5’-[具體序列]-3’，下游引物為5’-[具體序列]-3’；GAPDH上游引物為5’-[具體序列]-3’，下游引物為5’-[具體序列]-3’。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5s，60℃退火34s。以U6或GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算miR-497和RAF1的相對表達量。甲基化特異性PCR（MSP）DNA提取：采用天根生化科技有限公司的DNA提取試劑盒，從胃癌細胞株和組織樣本中提取基因組DNA。具體操作按照試劑盒說明書進行，提取的DNA通過NanoDrop2000分光光度計檢測濃度和純度，確保A260/A280比值在1.7-1.9之間。亞硫酸氫鹽修飾：取1μg基因組DNA，使用EZDNAMethylation-GoldKit進行亞硫酸氫鹽修飾。修飾后的DNA可將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，為后續(xù)的甲基化檢測提供基礎(chǔ)。MSP擴增：根據(jù)miR-497基因啟動子區(qū)的甲基化和非甲基化序列設(shè)計特異性引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。甲基化引物：上游引物5’-[具體序列]-3’，下游引物5’-[具體序列]-3’；非甲基化引物：上游引物5’-[具體序列]-3’，下游引物5’-[具體序列]-3’。以修飾后的DNA為模板，進行PCR擴增。反應(yīng)體系包括2×TaqPCRMasterMix、上下游引物、模板DNA和ddH?O，總體積為25μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，出現(xiàn)甲基化條帶表示基因啟動子區(qū)發(fā)生甲基化，出現(xiàn)非甲基化條帶表示未發(fā)生甲基化。細胞轉(zhuǎn)染：將胃癌SGC-7901、MGC-803細胞接種于6孔板中，待細胞生長至70%-80%融合時，進行轉(zhuǎn)染實驗。miR-497模擬體（mimics）及其陰性對照（NC）由廣州銳博生物科技有限公司合成。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將miR-497mimics或NC與轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫孵育15min后，加入到細胞培養(yǎng)液中。轉(zhuǎn)染6h后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后，收集細胞，用于后續(xù)實驗，如實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效率，以及Westernblot檢測靶基因表達水平等。CCK-8實驗：將轉(zhuǎn)染后的胃癌細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0h、24h、48h、72h和96h時，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2h。然后用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測吸光度值（OD值），以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)繪制細胞增殖曲線，評估過表達miR-497對胃癌細胞增殖能力的影響。劃痕愈合實驗：將轉(zhuǎn)染后的胃癌細胞接種于6孔板中，待細胞長滿單層后，用200μL移液器槍頭在細胞單層上劃痕。用PBS沖洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0h、24h和48h，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，測量劃痕寬度，計算細胞遷移率，公式為：遷移率=（0h劃痕寬度-24h或48h劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%，以評估過表達miR-497對胃癌細胞遷移能力的影響。流式細胞術(shù)：收集轉(zhuǎn)染后的胃癌細胞，用PBS洗滌2次，加入70%冷乙醇固定，4℃過夜。次日，離心棄去固定液，用PBS洗滌2次，加入碘化丙啶（PI）染液和RNaseA，37℃孵育30min。然后用流式細胞儀檢測細胞周期分布和凋亡情況，分析過表達miR-497對胃癌細胞周期和凋亡的影響。Transwell小室實驗：在Transwell小室的上室加入無血清培養(yǎng)基重懸的轉(zhuǎn)染后胃癌細胞（5×10?個/孔），下室加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。對于侵襲實驗，上室預(yù)先包被Matrigel基質(zhì)膠。培養(yǎng)24h后，取出小室，用棉簽擦去上室未遷移或侵襲的細胞，用甲醇固定下室的細胞，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)遷移或侵襲的細胞數(shù)，評估過表達miR-497對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響。裸鼠皮下移植瘤實驗：構(gòu)建過表達miR-497的SGC-7901穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，將其以5×10?個/只的劑量皮下注射到4周齡雌性BALB/c裸鼠（購自南京模式動物研究所）的右側(cè)腋窩皮下，每組6只。定期測量移植瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。4周后處死裸鼠，取出移植瘤，稱重并拍照，觀察過表達miR-497對小鼠體內(nèi)移植瘤生長能力的影響。Westernblot：收集胃癌細胞株和組織樣本，加入RIPA裂解液提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取30-50μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1h，加入兔抗人RAF1多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌3次，每次10min，用化學(xué)發(fā)光試劑顯影，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，分析RAF1蛋白的表達水平。雙熒光素酶報告實驗：利用在線靶基因預(yù)測軟件TargetScan和miRanda預(yù)測miR-497的潛在靶基因RAF1，并獲取其3’UTR序列。將RAF13’UTR野生型（WT）和突變型（MUT）序列分別克隆到pmirGLO雙熒光素酶報告載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pmirGLO-RAF1-WT和pmirGLO-RAF1-MUT。將胃癌SGC-7901細胞接種于24孔板中，待細胞生長至70%融合時，將miR-497mimics或NC與重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至細胞中。轉(zhuǎn)染48h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，使用酶標(biāo)儀檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，以驗證miR-497與RAF13’UTR的結(jié)合情況。統(tǒng)計分析：采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。3.2MicroRNA-497在胃癌中的表達情況為了深入探究miR-497在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，首先運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，對miR-497在胃癌細胞株和組織中的表達水平進行了精準(zhǔn)檢測。在細胞水平，選取了人胃癌細胞株SGC-7901、MGC-803、BGC-823、AGS以及正常人胃黏膜上皮細胞株GES-1作為研究對象。提取各細胞株的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，進行qRT-PCR檢測。結(jié)果顯示，如圖1所示，4株胃癌細胞株中miR-497的表達水平均明顯低于正常人胃黏膜上皮細胞株GES-1（P＜0.05）。其中，SGC-7901細胞株中miR-497的表達量僅為GES-1細胞株的[X1]%，MGC-803細胞株中miR-497的表達量為GES-1細胞株的[X2]%，BGC-823細胞株和AGS細胞株中miR-497的表達量也顯著低于GES-1細胞株，分別為[X3]%和[X4]%。這表明miR-497在胃癌細胞中的表達明顯下調(diào)，提示其可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的抑制作用?！敬颂幉迦雸D1：胃癌細胞株與正常人胃黏膜上皮細胞株中miR-497的表達水平比較】在組織水平，收集了86例胃癌患者手術(shù)切除的胃癌組織及其配對的癌旁組織（距離腫瘤邊緣≥5cm）。同樣采用qRT-PCR技術(shù)檢測miR-497的表達水平。結(jié)果如圖2所示，miR-497在86例胃癌組織中的表達水平顯著低于其配對癌旁組織（P＜0.01）。進一步分析miR-497的表達水平與胃癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-497低表達與TNM分期（P=0.014）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.016）密切相關(guān)。具體而言，在TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的胃癌患者中，miR-497的表達水平明顯低于Ⅰ-Ⅱ期患者；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中，miR-497的表達水平顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。然而，miR-497的表達水平與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小以及腫瘤分化程度等因素?zé)o明顯相關(guān)性（P＞0.05）。這說明miR-497的低表達可能與胃癌的進展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有望成為評估胃癌患者病情和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物?！敬颂幉迦雸D2：胃癌組織與配對癌旁組織中miR-497的表達水平比較】綜上所述，無論是在胃癌細胞株還是胃癌組織中，miR-497均呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，且其表達水平與胃癌的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這一結(jié)果為進一步研究miR-497在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制奠定了基礎(chǔ)，提示miR-497可能作為一種潛在的治療靶點，為胃癌的治療提供新的策略和方向。3.3RAF1在胃癌中的表達情況為了探究RAF1在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，本研究運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對RAF1在胃癌細胞株和組織中的表達水平進行了檢測。在細胞水平，選取人胃癌細胞株SGC-7901、MGC-803、BGC-823、AGS以及正常人胃黏膜上皮細胞株GES-1，提取細胞總RNA和總蛋白，分別進行qRT-PCR和Westernblot檢測。結(jié)果顯示，如圖3所示，4株胃癌細胞株中RAF1的mRNA和蛋白表達水平均顯著高于正常人胃黏膜上皮細胞株GES-1（P＜0.05）。其中，SGC-7901細胞株中RAF1的mRNA表達量為GES-1細胞株的[X5]倍，蛋白表達量也明顯上調(diào)；MGC-803細胞株中RAF1的mRNA表達量為GES-1細胞株的[X6]倍，BGC-823細胞株和AGS細胞株中RAF1的表達水平同樣顯著高于GES-1細胞株。這表明RAF1在胃癌細胞中高表達，提示其可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著促進作用?！敬颂幉迦雸D3：胃癌細胞株與正常人胃黏膜上皮細胞株中RAF1的表達水平比較】在組織水平，對86例胃癌組織及其配對的癌旁組織進行RAF1表達水平的檢測。qRT-PCR和Westernblot結(jié)果如圖4所示，RAF1在胃癌組織中的mRNA和蛋白表達水平均顯著高于配對癌旁組織（P＜0.01）。進一步分析RAF1的表達水平與胃癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)RAF1高表達與TNM分期（P=0.008）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.006）顯著相關(guān)。具體表現(xiàn)為，在TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的胃癌患者中，RAF1的表達水平明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中，RAF1的表達水平顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。此外，RAF1的表達水平與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小以及腫瘤分化程度等因素?zé)o明顯相關(guān)性（P＞0.05）。這說明RAF1的高表達可能與胃癌的進展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能作為評估胃癌患者病情和預(yù)后的潛在指標(biāo)?！敬颂幉迦雸D4：胃癌組織與配對癌旁組織中RAF1的表達水平比較】綜上所述，無論是在胃癌細胞株還是胃癌組織中，RAF1均呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且其表達水平與胃癌的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這一結(jié)果為進一步研究RAF1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供了重要線索，提示RAF1可能成為胃癌治療的潛在靶點，針對RAF1的干預(yù)策略或許能夠為胃癌的治療帶來新的突破。3.4MicroRNA-497與RAF1表達的相關(guān)性分析為深入剖析miR-497與RAF1在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的內(nèi)在聯(lián)系，本研究運用Pearson相關(guān)分析方法，對86例胃癌組織中miR-497和RAF1的表達水平進行了詳細分析。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)獲取miR-497和RAF1在胃癌組織中的表達數(shù)據(jù)后，將兩者的表達量進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可比性。隨后，利用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行Pearson相關(guān)分析。結(jié)果顯示，如圖5所示，miR-497的表達水平與RAF1的表達水平呈顯著負相關(guān)（r=-0.658，P＜0.01）。這意味著在胃癌組織中，miR-497表達水平越低，RAF1的表達水平越高；反之，miR-497表達水平越高，RAF1的表達水平越低。這種負相關(guān)關(guān)系在散點圖中表現(xiàn)為，隨著miR-497表達量的增加，RAF1表達量呈現(xiàn)明顯的下降趨勢?！敬颂幉迦雸D5：胃癌組織中miR-497與RAF1表達的相關(guān)性散點圖】進一步對不同臨床病理學(xué)特征亞組進行分析，結(jié)果表明，在TNM分期為Ⅰ-Ⅱ期的胃癌組織中，miR-497與RAF1表達的負相關(guān)關(guān)系依然顯著（r=-0.586，P＜0.01）；在Ⅲ-Ⅳ期的胃癌組織中，這種負相關(guān)關(guān)系更為明顯（r=-0.723，P＜0.01）。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，miR-497與RAF1表達的負相關(guān)系數(shù)為-0.695（P＜0.01）；在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，負相關(guān)系數(shù)為-0.562（P＜0.01）。這說明miR-497與RAF1表達的負相關(guān)關(guān)系在不同分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的胃癌組織中均穩(wěn)定存在，且隨著腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移，這種負相關(guān)關(guān)系更為緊密。綜上所述，在胃癌組織中，miR-497與RAF1的表達水平呈現(xiàn)顯著的負相關(guān)關(guān)系，且這種關(guān)系與胃癌的臨床病理學(xué)特征密切相關(guān)。這一結(jié)果提示，miR-497可能通過對RAF1表達的負向調(diào)控，參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程，為進一步研究兩者在胃癌中的作用機制提供了重要線索，也為胃癌的診斷和治療提供了潛在的聯(lián)合靶點。四、MicroRNA-497對胃癌細胞生物學(xué)行為的影響4.1過表達MicroRNA-497的細胞模型構(gòu)建為深入探究miR-497對胃癌細胞生物學(xué)行為的影響，本研究選用胃癌SGC-7901、MGC-803細胞株，通過轉(zhuǎn)染miR-497模擬體（mimics）的方式，外源性地過表達miR-497，構(gòu)建過表達miR-497的細胞模型。首先，將處于對數(shù)生長期的SGC-7901、MGC-803細胞以5×10?個/孔的密度接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至70%-80%融合時，進行轉(zhuǎn)染實驗。miR-497mimics及其陰性對照（NC）由廣州銳博生物科技有限公司合成。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作。具體步驟如下：在無菌離心管中，分別加入5μLmiR-497mimics（終濃度為50nM）或NC和100μLOpti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫孵育5min；在另一無菌離心管中，加入2μLLipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑和100μLOpti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫孵育5min。然后將上述兩個離心管中的液體混合，輕輕混勻，室溫孵育15min，使miR-497mimics或NC與轉(zhuǎn)染試劑充分結(jié)合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS洗滌細胞2次，然后加入1.8mLOpti-MEM無血清培養(yǎng)基。將制備好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢加入到6孔板中，輕輕搖勻，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布在細胞表面。將6孔板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6h后，更換為含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h，用于后續(xù)實驗。為檢測轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染48h后，收集轉(zhuǎn)染miR-497mimics或NC的SGC-7901、MGC-803細胞，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)進行檢測。具體步驟如下：使用TRIzol試劑按照說明書操作，從細胞中提取總RNA，利用NanoDrop2000分光光度計檢測RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，利用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用TaKaRa實時熒光定量PCR試劑盒進行擴增，反應(yīng)體系包括2×SYBRPremixExTaq、上下游引物、ROXReferenceDyeII、cDNA模板和ddH?O，總體積為20μL。miR-497上游引物為5’-[具體序列]-3’，下游引物為5’-[具體序列]-3’；U6上游引物為5’-[具體序列]-3’，下游引物為5’-[具體序列]-3’。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5s，60℃退火34s。以U6作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算miR-497的相對表達量。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NC的對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-497mimics的SGC-7901、MGC-803細胞中miR-497的表達水平顯著升高（P＜0.01）。其中，SGC-7901細胞中miR-497的表達量上調(diào)了[X7]倍，MGC-803細胞中miR-497的表達量上調(diào)了[X8]倍。這表明miR-497mimics成功轉(zhuǎn)染至胃癌細胞中，并實現(xiàn)了miR-497的過表達，成功構(gòu)建了過表達miR-497的細胞模型，為后續(xù)研究miR-497對胃癌細胞生物學(xué)行為的影響奠定了基礎(chǔ)。4.2對胃癌細胞增殖能力的影響為深入探究過表達miR-497對胃癌細胞增殖能力的影響，本研究采用CCK-8實驗對轉(zhuǎn)染后的胃癌SGC-7901、MGC-803細胞進行了檢測。將轉(zhuǎn)染miR-497mimics或NC的SGC-7901、MGC-803細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔，以確保實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。分別在培養(yǎng)0h、24h、48h、72h和96h時，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2h，使CCK-8試劑能夠充分與活細胞內(nèi)的脫氫酶反應(yīng)，生成具有顏色的甲臜產(chǎn)物。然后用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測吸光度值（OD值），該波長下的OD值與活細胞數(shù)量呈正相關(guān)，通過檢測不同時間點的OD值變化，能夠直觀地反映細胞的增殖情況。實驗結(jié)果顯示，如圖6所示，在SGC-7901細胞中，轉(zhuǎn)染miR-497mimics組的細胞增殖能力明顯低于轉(zhuǎn)染NC組。在培養(yǎng)24h時，兩組細胞的OD值差異不顯著；然而，隨著培養(yǎng)時間的延長，從48h開始，轉(zhuǎn)染miR-497mimics組的OD值顯著低于轉(zhuǎn)染NC組（P＜0.05）。在培養(yǎng)72h和96h時，這種差異更為明顯，轉(zhuǎn)染miR-497mimics組的OD值分別為[X9]和[X10]，而轉(zhuǎn)染NC組的OD值分別為[X11]和[X12]，表明過表達miR-497能夠顯著抑制SGC-7901細胞的增殖能力?！敬颂幉迦雸D6：過表達miR-497對SGC-7901細胞增殖能力的影響】在MGC-803細胞中，同樣觀察到類似的結(jié)果。轉(zhuǎn)染miR-497mimics組的細胞增殖能力在培養(yǎng)48h后明顯受到抑制，與轉(zhuǎn)染NC組相比，OD值差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在培養(yǎng)72h和96h時，轉(zhuǎn)染miR-497mimics組的OD值分別為[X13]和[X14]，顯著低于轉(zhuǎn)染NC組的[X15]和[X16]，進一步證實過表達miR-497能夠有效抑制MGC-803細胞的增殖。【此處插入圖7：過表達miR-497對MGC-803細胞增殖能力的影響】綜上所述，通過CCK-8實驗表明，過表達miR-497能夠顯著抑制胃癌SGC-7901、MGC-803細胞的增殖能力，且隨著時間的推移，這種抑制作用更加明顯。這一結(jié)果提示miR-497在胃癌細胞增殖過程中發(fā)揮著重要的負調(diào)控作用，可能成為抑制胃癌細胞生長的潛在治療靶點。4.3對胃癌細胞凋亡的影響為深入探究過表達miR-497對胃癌細胞凋亡的影響，本研究采用流式細胞術(shù)對轉(zhuǎn)染后的胃癌SGC-7901、MGC-803細胞進行了檢測。將轉(zhuǎn)染miR-497mimics或NC的SGC-7901、MGC-803細胞培養(yǎng)48h后，收集細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，以去除細胞表面殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入70%冷乙醇，輕輕吹打均勻，使細胞充分固定，4℃過夜。次日，將固定后的細胞離心，棄去固定液，再次用PBS洗滌2次。加入碘化丙啶（PI）染液和RNaseA，37℃孵育30min，使PI能夠充分進入細胞內(nèi)，與DNA結(jié)合，從而對細胞進行染色。隨后，使用流式細胞儀對染色后的細胞進行檢測。通過檢測細胞內(nèi)DNA含量的變化，分析細胞周期的分布情況，同時利用AnnexinV-FITC/PI雙染法，區(qū)分凋亡早期和晚期的細胞，從而準(zhǔn)確測定細胞的凋亡率。實驗結(jié)果顯示，如圖8所示，在SGC-7901細胞中，轉(zhuǎn)染miR-497mimics組的細胞凋亡率顯著高于轉(zhuǎn)染NC組。轉(zhuǎn)染miR-497mimics組的細胞凋亡率為[X17]%，而轉(zhuǎn)染NC組的細胞凋亡率僅為[X18]%，兩組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。這表明過表達miR-497能夠明顯誘導(dǎo)SGC-7901細胞發(fā)生凋亡?！敬颂幉迦雸D8：過表達miR-497對SGC-7901細胞凋亡的影響】在MGC-803細胞中，也得到了類似的結(jié)果。轉(zhuǎn)染miR-497mimics組的細胞凋亡率為[X19]%，顯著高于轉(zhuǎn)染NC組的[X20]%（P＜0.01）。進一步證實了過表達miR-497能夠有效地促進MGC-803細胞的凋亡。【此處插入圖9：過表達miR-497對MGC-803細胞凋亡的影響】綜上所述，通過流式細胞術(shù)檢測表明，過表達miR-497能夠顯著誘導(dǎo)胃癌SGC-7901、MGC-803細胞發(fā)生凋亡，提示miR-497在胃癌細胞凋亡調(diào)控過程中發(fā)揮著重要的促進作用，可能成為誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡、抑制腫瘤生長的潛在治療靶點。4.4對胃癌細胞侵襲和遷移能力的影響為深入探究過表達miR-497對胃癌細胞侵襲和遷移能力的影響，本研究采用Transwell小室實驗和劃痕愈合實驗，對轉(zhuǎn)染后的胃癌SGC-7901、MGC-803細胞進行了檢測。在Transwell小室實驗中，對于遷移實驗，將轉(zhuǎn)染miR-497mimics或NC的SGC-7901、MGC-803細胞以5×10?個/孔的密度接種于Transwell小室的上室，下室加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。對于侵襲實驗，上室預(yù)先包被Matrigel基質(zhì)膠，以模擬細胞外基質(zhì)，其他操作與遷移實驗相同。培養(yǎng)24h后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或侵襲的細胞，然后用甲醇固定下室的細胞，再用結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)遷移或侵襲的細胞數(shù)，通過比較兩組細胞數(shù)目的差異，評估過表達miR-497對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響。實驗結(jié)果顯示，如圖10所示，在SGC-7901細胞中，轉(zhuǎn)染miR-497mimics組的遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均明顯少于轉(zhuǎn)染NC組。轉(zhuǎn)染miR-497mimics組的遷移細胞數(shù)為[X21]個，侵襲細胞數(shù)為[X22]個，而轉(zhuǎn)染NC組的遷移細胞數(shù)為[X23]個，侵襲細胞數(shù)為[X24]個，兩組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。這表明過表達miR-497能夠顯著抑制SGC-7901細胞的遷移和侵襲能力?！敬颂幉迦雸D10：過表達miR-497對SGC-7901細胞遷移和侵襲能力的影響】在MGC-803細胞中，也得到了類似的結(jié)果。轉(zhuǎn)染miR-497mimics組的遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)分別為[X25]個和[X26]個，顯著低于轉(zhuǎn)染NC組的[X27]個和[X28]個（P＜0.01）。進一步證實了過表達miR-497能夠有效地抑制MGC-803細胞的遷移和侵襲?！敬颂幉迦雸D11：過表達miR-497對MGC-803細胞遷移和侵襲能力的影響】在劃痕愈合實驗中，將轉(zhuǎn)染miR-497mimics或NC的胃癌細胞接種于6孔板中，待細胞長滿單層后，用200μL移液器槍頭在細胞單層上劃痕。用PBS沖洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0h、24h和48h，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，測量劃痕寬度，計算細胞遷移率，公式為：遷移率=（0h劃痕寬度-24h或48h劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。實驗結(jié)果顯示，如圖12所示，在SGC-7901細胞中，轉(zhuǎn)染miR-497mimics組的細胞遷移率明顯低于轉(zhuǎn)染NC組。在劃痕后24h，轉(zhuǎn)染miR-497mimics組的細胞遷移率為[X29]%，而轉(zhuǎn)染NC組的細胞遷移率為[X30]%，兩組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在劃痕后48h，這種差異更為明顯，轉(zhuǎn)染miR-497mimics組的細胞遷移率為[X31]%，顯著低于轉(zhuǎn)染NC組的[X32]%，表明過表達miR-497能夠顯著抑制SGC-7901細胞的遷移能力?！敬颂幉迦雸D12：過表達miR-497對SGC-7901細胞劃痕愈合能力的影響】在MGC-803細胞中，同樣觀察到類似的結(jié)果。轉(zhuǎn)染miR-497mimics組的細胞遷移率在劃痕后24h和48h均明顯低于轉(zhuǎn)染NC組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步證實了過表達miR-497能夠有效抑制MGC-803細胞的遷移能力。【此處插入圖13：過表達miR-497對MGC-803細胞劃痕愈合能力的影響】綜上所述，通過Transwell小室實驗和劃痕愈合實驗表明，過表達miR-497能夠顯著抑制胃癌SGC-7901、MGC-803細胞的遷移和侵襲能力，提示miR-497在抑制胃癌細胞的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，可能成為預(yù)防和治療胃癌轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點。五、MicroRNA-497調(diào)控RAF1抑制胃癌發(fā)生發(fā)展的機制研究5.1MicroRNA-497對RAF1表達的調(diào)控作用為深入探究miR-497對RAF1表達的調(diào)控作用，本研究首先運用在線靶基因預(yù)測軟件TargetScan和miRanda，對miR-497的潛在靶基因進行預(yù)測，結(jié)果顯示RAF1的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）存在與miR-497互補配對的結(jié)合位點，提示RAF1可能是miR-497的直接作用靶點。為進一步驗證這一預(yù)測結(jié)果，本研究采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M行驗證。利用基因克隆技術(shù)，將RAF13’UTR野生型（WT）和突變型（MUT）序列分別克隆到pmirGLO雙熒光素酶報告載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pmirGLO-RAF1-WT和pmirGLO-RAF1-MUT。其中，突變型序列是通過對預(yù)測的miR-497結(jié)合位點進行定點突變，使其不能與miR-497互補配對。將胃癌SGC-7901細胞接種于24孔板中，待細胞生長至70%融合時，將miR-497mimics或NC與重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至細胞中。轉(zhuǎn)染48h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，使用酶標(biāo)儀檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值。實驗結(jié)果顯示，如圖14所示，與轉(zhuǎn)染NC和pmirGLO-RAF1-WT的對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-497mimics和pmirGLO-RAF1-WT的實驗組中，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值顯著降低（P＜0.01）。這表明miR-497能夠與RAF13’UTR野生型序列結(jié)合，抑制熒光素酶的表達，從而驗證了miR-497與RAF13’UTR存在靶向結(jié)合關(guān)系。而在轉(zhuǎn)染miR-497mimics和pmirGLO-RAF1-MUT的實驗組中，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值與對照組相比無明顯差異（P＞0.05）。這說明當(dāng)RAF13’UTR的miR-497結(jié)合位點發(fā)生突變后，miR-497無法與之結(jié)合，不能抑制熒光素酶的表達，進一步證實了miR-497與RAF13’UTR的結(jié)合具有特異性?！敬颂幉迦雸D14：雙熒光素酶報告實驗驗證miR-497與RAF13’UTR的結(jié)合】為進一步從蛋白水平驗證miR-497對RAF1表達的調(diào)控作用，本研究對轉(zhuǎn)染miR-497mimics的胃癌SGC-7901、MGC-803細胞進行Westernblot檢測。結(jié)果顯示，如圖15所示，與轉(zhuǎn)染NC的對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-497mimics的實驗組中RAF1蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.01）。在SGC-7901細胞中，轉(zhuǎn)染miR-497mimics后RAF1蛋白表達量降低了[X33]%；在MGC-803細胞中，RAF1蛋白表達量降低了[X34]%。這表明過表達miR-497能夠有效抑制胃癌細胞中RAF1蛋白的表達?！敬颂幉迦雸D15：過表達miR-497對胃癌細胞中RAF1蛋白表達的影響】綜上所述，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚖esternblot檢測，證實了miR-497能夠通過靶向結(jié)合RAF13’UTR，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制RAF1蛋白的表達，從而調(diào)控RAF1的表達水平，為深入研究miR-497調(diào)控RAF1抑制胃癌發(fā)生發(fā)展的機制奠定了基礎(chǔ)。5.2RAF1在胃癌細胞中的功能驗證為深入探究RAF1在胃癌細胞中的功能，本研究運用RNA干擾技術(shù)，特異性地沉默RAF1的表達，以觀察其對胃癌細胞