miR-204/FOXC1調(diào)控軸在喉鱗癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制與臨床意義研究一、引言1.1研究背景喉鱗癌（LaryngealSquamousCellCarcinoma，LSCC）作為頭頸部較為常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。近年來，雖然在喉鱗癌的治療方面取得了一定進(jìn)展，如手術(shù)方式的改進(jìn)、放化療技術(shù)的提升等，但患者的總體生存率和生活質(zhì)量仍有待提高。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，喉鱗癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出一定的地域差異，部分地區(qū)的發(fā)病率呈上升趨勢。其發(fā)病原因較為復(fù)雜，主要與吸煙、飲酒、人乳頭瘤病毒（HPV）感染、環(huán)境因素等密切相關(guān)。喉鱗癌患者的5年生存率一直處于較低水平，約為30%-70%，且治療后的復(fù)發(fā)率較高。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致喉鱗癌患者預(yù)后不良的主要原因，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的生存率會顯著降低。因此，深入探究喉鱗癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的早期診斷標(biāo)志物和治療靶點，對于提高喉鱗癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有至關(guān)重要的意義。微小RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，長度約為22個核苷酸。它們在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，通過與靶mRNA的互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。研究表明，多種miRNA在喉鱗癌組織和細(xì)胞系中存在異常表達(dá)，且與喉鱗癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等密切相關(guān)。例如，miR-21在喉鱗癌中高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲；miR-125b在喉鱗癌中低表達(dá)，其低表達(dá)與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。miR-204作為miRNA家族的重要成員之一，近年來在腫瘤研究領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。已有研究表明，miR-204在多種腫瘤中發(fā)揮著抑癌基因的作用。在乳腺癌中，miR-204可通過靶向調(diào)控FOXO1，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力；在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中，miR-204可通過抑制PI3K/AKT信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。然而，miR-204在喉鱗癌中的具體作用機(jī)制尚未完全明確。叉頭框蛋白C1（ForkheadBoxC1，F(xiàn)OXC1）是叉頭框蛋白家族的成員之一，屬于轉(zhuǎn)錄因子。FOXC1在胚胎發(fā)育過程中起著重要作用，參與了多個器官和組織的形成和發(fā)育。在腫瘤發(fā)生發(fā)展方面，F(xiàn)OXC1的異常表達(dá)與多種腫瘤的惡性表型密切相關(guān)。在肝癌中，F(xiàn)OXC1高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并與患者的不良預(yù)后相關(guān)；在結(jié)直腸癌中，F(xiàn)OXC1可通過調(diào)控EMT過程，增強腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。已有研究提示FOXC1在喉鱗癌中可能也發(fā)揮著重要作用，但其具體的作用機(jī)制以及與miR-204之間是否存在調(diào)控關(guān)系，目前尚不清楚。綜上所述，miR-204和FOXC1在多種腫瘤中均表現(xiàn)出重要的生物學(xué)功能，但它們在喉鱗癌中的作用及相互關(guān)系尚未得到系統(tǒng)深入的研究。因此，開展miR-204及其靶基因FOXC1與喉鱗癌的相關(guān)研究，有望揭示喉鱗癌發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制，為喉鱗癌的早期診斷、治療及預(yù)后評估提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探討miR-204及其靶基因FOXC1在喉鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制，具體研究目的如下：驗證miR-204與FOXC1的直接調(diào)控關(guān)系：運用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灥燃夹g(shù)，從分子層面明確miR-204是否能夠直接靶向調(diào)控FOXC1，為后續(xù)研究二者在喉鱗癌中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。分析miR-204與FOXC1在喉鱗癌組織中的表達(dá)情況及與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系：通過qRT-PCR、免疫組化等實驗方法，檢測miR-204與FOXC1在新鮮喉鱗癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)水平，分析其表達(dá)差異與喉鱗癌患者的性別、年齡、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度等臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，并結(jié)合臨床隨訪資料，運用Kaplan-Meier法和Cox回歸模型等統(tǒng)計學(xué)方法，評估二者表達(dá)水平對喉鱗癌患者預(yù)后的影響。探討FOXC1及相關(guān)蛋白在喉鱗癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中的作用：利用免疫組化等技術(shù)檢測FOXC1及EMT相關(guān)標(biāo)志物（如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等）在喉鱗癌組織中的表達(dá)，分析它們之間的表達(dá)關(guān)聯(lián)性，揭示FOXC1是否通過調(diào)控EMT過程參與喉鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。喉鱗癌作為一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，目前在診斷和治療方面仍面臨諸多挑戰(zhàn)。本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值：理論意義：本研究有助于進(jìn)一步揭示喉鱗癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，豐富對miRNA和轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤中作用的認(rèn)識。明確miR-204與FOXC1之間的調(diào)控關(guān)系以及它們在喉鱗癌中的生物學(xué)功能，將為喉鱗癌的發(fā)病機(jī)制研究提供新的視角和理論依據(jù)，推動腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。臨床應(yīng)用價值：本研究結(jié)果可能為喉鱗癌的早期診斷提供新的生物標(biāo)志物。若miR-204和FOXC1的表達(dá)水平與喉鱗癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，那么檢測它們在臨床樣本中的表達(dá)情況，有望成為一種早期診斷喉鱗癌的輔助手段，提高喉鱗癌的早期診斷率。此外，本研究還可能為喉鱗癌的治療提供新的靶點。針對miR-204和FOXC1及其相關(guān)信號通路開發(fā)靶向治療藥物，或者通過調(diào)節(jié)它們的表達(dá)水平來干預(yù)喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展，為喉鱗癌患者提供更加精準(zhǔn)、有效的治療策略，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。1.3研究思路與方法本研究的整體思路是從分子機(jī)制、組織表達(dá)以及臨床相關(guān)性等多個層面，系統(tǒng)地探究miR-204及其靶基因FOXC1與喉鱗癌的關(guān)系。首先，在細(xì)胞水平驗證miR-204與FOXC1的直接調(diào)控關(guān)系，然后深入分析二者在喉鱗癌組織中的表達(dá)情況及其與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系，最后從上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）角度探討FOXC1在喉鱗癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。具體研究方法如下：細(xì)胞實驗：選取兩種喉鱗癌細(xì)胞系，運用qRT-PCR技術(shù)檢測miR-204及FOXC1mRNA水平，通過Westernblot檢測其蛋白水平表達(dá)情況。采用雙熒光素酶報告基因法，構(gòu)建含有FOXC13’-UTR野生型和突變型的重組質(zhì)粒，分別與miR-204模擬物或陰性對照共轉(zhuǎn)染至喉鱗癌細(xì)胞中，檢測熒光素酶活性，以此驗證FOXC1是否為miR-204的直接靶基因。組織實驗：收集20對新鮮喉鱗癌組織及癌旁正常切緣組織，運用qRT-PCR檢測miR-204及FOXC1mRNA表達(dá)情況。另外收集125例喉鱗癌石蠟包埋組織及75例癌旁正常切緣石蠟包埋組織，采用免疫組織化學(xué)法檢測FOXC1蛋白及E-cadherin的表達(dá)，并結(jié)合患者的性別、年齡、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度等臨床病理參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。臨床相關(guān)性分析：通過對喉鱗癌患者進(jìn)行臨床隨訪，收集患者的生存資料。運用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，其差異性檢驗采用Log-rank法，分析淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分型、臨床分期、FOXC1蛋白表達(dá)、E-cadherin蛋白表達(dá)等因素對患者生存時間的影響。采用Cox回歸模型分析FOXC1蛋白、E-cadherin及臨床病理參數(shù)在喉鱗癌患者預(yù)后中的價值。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS22.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。二、miR-204與FOXC1的生物學(xué)特性2.1miR-204的生物學(xué)特性2.1.1miR-204的結(jié)構(gòu)與功能概述miR-204是內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長度約為22個核苷酸。它最初在果蠅的一個光敏視網(wǎng)膜突變體中被發(fā)現(xiàn)，其編碼基因位于人類染色體9q21.11，處于瞬時受體電位陽離子通道亞家族M成員3（TRPM3）基因的內(nèi)含子區(qū)域。miR-204基因在進(jìn)化過程中高度保守，從線蟲到人類都存在相似的序列，這暗示著其在生物進(jìn)化過程中具有重要且保守的生物學(xué)功能。在細(xì)胞內(nèi)，miR-204基因首先由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成較長的初級轉(zhuǎn)錄本（pri-miR-204），隨后在細(xì)胞核內(nèi)被核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8加工成約70-100個核苷酸長度的發(fā)夾狀前體miRNA（pre-miR-204）。pre-miR-204被轉(zhuǎn)運出細(xì)胞核后，在細(xì)胞質(zhì)中被另一種核酸酶Dicer切割，形成成熟的miR-204。成熟的miR-204與AGO蛋白等結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），通過與靶mRNA的3’-非翻譯區(qū)（3’-UTR）互補配對，抑制mRNA的翻譯過程，或者促使mRNA降解，從而實現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控。miR-204在細(xì)胞的多種生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。在細(xì)胞增殖方面，大量研究表明miR-204可抑制細(xì)胞的增殖能力。例如，在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中，miR-204能夠通過靶向抑制細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞分化過程中，miR-204也扮演著重要角色。在神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中，miR-204的表達(dá)上調(diào)，它可以通過抑制一些抑制神經(jīng)分化的因子，如REST等，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化。在細(xì)胞凋亡方面，miR-204同樣發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在心肌細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激等損傷時，miR-204的表達(dá)會發(fā)生改變，它可以通過靶向調(diào)控Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而維持心肌細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。此外，miR-204還參與了細(xì)胞的代謝、遷移、侵襲等多種生物學(xué)過程，在維持細(xì)胞的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮著不可或缺的作用。2.1.2miR-204在腫瘤中的研究進(jìn)展近年來，miR-204在腫瘤研究領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注，大量研究表明它在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。在大多數(shù)腫瘤中，miR-204呈現(xiàn)出低表達(dá)狀態(tài)，發(fā)揮著抑癌基因的作用。在乳腺癌中，miR-204的表達(dá)水平明顯低于正常乳腺組織。研究發(fā)現(xiàn)，miR-204可通過靶向調(diào)控多個癌基因來抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。例如，miR-204能夠靶向抑制線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM）的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的生長與增殖。此外，miR-204還可以通過靶向抑制信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）的表達(dá)，阻斷STAT3信號通路，抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在肝癌中，miR-204同樣低表達(dá)。研究表明，miR-204可通過靶向調(diào)控鋅指蛋白804A（ZNF804A），抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-204還可以通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路，影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。在消化系統(tǒng)腫瘤中，miR-204也表現(xiàn)出重要的抑癌作用。在食管癌中，miR-204在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平顯著低于對應(yīng)癌旁組織，且其低表達(dá)與腫瘤大小及腫瘤TNM分期顯著相關(guān)。功能研究表明，miR-204可通過下調(diào)Bcl-2和SIRT1的表達(dá)，抑制食管癌細(xì)胞的生長，并促進(jìn)其凋亡。在結(jié)直腸癌中，miR-204同樣發(fā)揮著抑制腫瘤的作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-204可通過抑制PI3K/AKT信號通路，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，miR-204還可以通過靶向調(diào)控一些與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)的因子，如ZEB1等，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT過程，從而降低其轉(zhuǎn)移能力。然而，在少數(shù)腫瘤中，miR-204也可能發(fā)揮促癌作用。在黑色素瘤中，有研究報道m(xù)iR-204的表達(dá)水平升高，且其高表達(dá)與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-204在黑色素瘤中可通過靶向抑制一些抑癌基因，如PTEN等，激活PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。但這種促癌作用在不同的研究中存在一定的爭議，可能與腫瘤的異質(zhì)性、研究方法和樣本量等因素有關(guān)。綜上所述，miR-204在多種腫瘤中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，其表達(dá)變化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。深入研究miR-204在腫瘤中的作用機(jī)制，有望為腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評估提供新的靶點和策略。2.2FOXC1的生物學(xué)特性2.2.1FOXC1的基因與蛋白結(jié)構(gòu)FOXC1基因位于人類染色體6p25.3區(qū)域，其全長約為21.6kb，包含11個外顯子和10個內(nèi)含子。FOXC1基因的啟動子區(qū)域含有多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，如SP1、AP-1等，這些轉(zhuǎn)錄因子通過與啟動子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控FOXC1基因的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄效率。研究表明，一些信號通路的激活或抑制可以影響這些轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而間接調(diào)控FOXC1基因的表達(dá)。例如，TGF-β信號通路的激活可以上調(diào)FOXC1基因的表達(dá)，其機(jī)制可能是通過激活下游的Smad蛋白，使其與FOXC1基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。FOXC1基因編碼的蛋白質(zhì)屬于叉頭框蛋白家族，該蛋白含有一個高度保守的叉頭結(jié)構(gòu)域（forkheaddomain，F(xiàn)HD），由大約110個氨基酸組成。叉頭結(jié)構(gòu)域是FOXC1蛋白發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，它能夠與DNA特定的序列結(jié)合，這些序列通常位于靶基因的啟動子或增強子區(qū)域。叉頭結(jié)構(gòu)域具有獨特的三維結(jié)構(gòu)，由3個α-螺旋和2個β-折疊組成，形成一個類似“楔子”的形狀，能夠嵌入DNA的大溝中，與DNA堿基之間形成特異性的相互作用。除了叉頭結(jié)構(gòu)域外，F(xiàn)OXC1蛋白還包含N端和C端結(jié)構(gòu)域。N端結(jié)構(gòu)域富含絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸等氨基酸殘基，這些氨基酸殘基可以發(fā)生磷酸化、乙?；刃揎?，從而影響FOXC1蛋白的活性和穩(wěn)定性。例如，蛋白激酶A（PKA）可以磷酸化FOXC1蛋白N端的絲氨酸殘基，增強其與DNA的結(jié)合能力，進(jìn)而促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄。C端結(jié)構(gòu)域則含有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，能夠與其他轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄輔助因子相互作用，形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，共同調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1蛋白可以與p300等轉(zhuǎn)錄輔助因子結(jié)合，p300具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，能夠使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，增加基因的可及性，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。在胚胎發(fā)育過程中，F(xiàn)OXC1發(fā)揮著不可或缺的作用。在眼部發(fā)育方面，F(xiàn)OXC1參與了虹膜、角膜、晶狀體等結(jié)構(gòu)的形成。研究表明，在小鼠胚胎發(fā)育過程中，敲除FOXC1基因會導(dǎo)致眼部發(fā)育異常，出現(xiàn)虹膜缺損、角膜混濁、晶狀體異位等癥狀。這是因為FOXC1可以調(diào)控一系列與眼部發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，如PITX2、PAX6等，這些基因在眼部組織的分化和形態(tài)發(fā)生中起著關(guān)鍵作用。在心血管系統(tǒng)發(fā)育中，F(xiàn)OXC1同樣扮演著重要角色。它參與了心臟瓣膜、血管平滑肌細(xì)胞的發(fā)育。在斑馬魚模型中，抑制FOXC1的表達(dá)會導(dǎo)致心臟瓣膜發(fā)育不全，血管平滑肌細(xì)胞分化異常，影響心血管系統(tǒng)的正常功能。這可能是由于FOXC1通過調(diào)控一些與心血管發(fā)育相關(guān)的信號通路，如Notch信號通路、TGF-β信號通路等，來維持心血管系統(tǒng)的正常發(fā)育。此外，F(xiàn)OXC1還參與了腎臟、骨骼等器官和組織的發(fā)育過程，對維持機(jī)體的正常生理結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。2.2.2FOXC1在腫瘤中的作用機(jī)制近年來，大量研究表明FOXC1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，其作用機(jī)制涉及多個方面。在腫瘤細(xì)胞增殖方面，F(xiàn)OXC1可以通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1能夠上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，CyclinD1是細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，其表達(dá)升高可以加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。此外，F(xiàn)OXC1還可以通過激活PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。PI3K/AKT信號通路在細(xì)胞生長、增殖、存活等過程中起著重要作用，F(xiàn)OXC1可以與PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85相互作用，激活PI3K/AKT信號通路，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。在肝癌細(xì)胞中，敲低FOXC1的表達(dá)可以抑制PI3K/AKT信號通路的激活，降低細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，F(xiàn)OXC1主要通過誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。EMT是指上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，這一過程使得腫瘤細(xì)胞具有更強的遷移和侵襲能力。FOXC1可以通過多種途徑誘導(dǎo)EMT。一方面，F(xiàn)OXC1可以直接結(jié)合到E-cadherin基因的啟動子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而降低E-cadherin的表達(dá)。E-cadherin是一種上皮細(xì)胞黏附分子，其表達(dá)降低會破壞上皮細(xì)胞間的連接，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。另一方面，F(xiàn)OXC1可以上調(diào)N-cadherin、Vimentin等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在乳腺癌細(xì)胞中，過表達(dá)FOXC1可以顯著降低E-cadherin的表達(dá)，同時上調(diào)N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，增強乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，F(xiàn)OXC1還可以通過調(diào)控一些與EMT相關(guān)的信號通路，如TGF-β信號通路、Wnt/β-catenin信號通路等，來間接促進(jìn)EMT的發(fā)生。在腫瘤血管生成方面，F(xiàn)OXC1也發(fā)揮著重要作用。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成，為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)和氧氣，并帶走代謝廢物。研究表明，F(xiàn)OXC1可以調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體（VEGFR）的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成。FOXC1可以直接結(jié)合到VEGF基因的啟動子區(qū)域，激活其轉(zhuǎn)錄，增加VEGF的表達(dá)。VEGF是一種重要的促血管生成因子，它可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGFR結(jié)合，激活下游的信號通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。在肺癌中，F(xiàn)OXC1的高表達(dá)與VEGF的高表達(dá)密切相關(guān)，且與腫瘤的血管生成和預(yù)后不良相關(guān)。此外，F(xiàn)OXC1還可以通過調(diào)控其他與血管生成相關(guān)的因子，如Angiopoietin-2等，來影響腫瘤血管生成。關(guān)于FOXC1在腫瘤中作為癌基因或抑癌基因的研究，目前大多數(shù)研究表明其在多種腫瘤中發(fā)揮癌基因的作用。在乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中，F(xiàn)OXC1的高表達(dá)與腫瘤的惡性表型、不良預(yù)后相關(guān)。然而，在少數(shù)腫瘤中，F(xiàn)OXC1也可能發(fā)揮抑癌基因的作用。在某些血液系統(tǒng)腫瘤中，有研究報道FOXC1的表達(dá)降低與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但其具體機(jī)制尚不清楚，可能與腫瘤的類型、細(xì)胞微環(huán)境等因素有關(guān)。綜上所述，F(xiàn)OXC1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中通過多種機(jī)制發(fā)揮重要作用，深入研究FOXC1在腫瘤中的作用機(jī)制，有望為腫瘤的治療提供新的靶點和策略。三、miR-204與FOXC1的調(diào)控關(guān)系驗證3.1實驗材料與方法3.1.1細(xì)胞系與主要試劑本實驗選用兩種人喉鱗癌細(xì)胞系，分別為Hep-2細(xì)胞系和TU212細(xì)胞系。Hep-2細(xì)胞系是最常用的喉鱗癌細(xì)胞系之一，具有典型的鱗癌細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)特性，在喉鱗癌的研究中應(yīng)用廣泛。TU212細(xì)胞系則具有一些獨特的生物學(xué)特征，例如其對某些化療藥物的敏感性與其他細(xì)胞系有所差異，這為研究喉鱗癌的異質(zhì)性提供了良好的模型。這兩種細(xì)胞系均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，并在實驗室中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。實驗所需的主要試劑包括：引物：用于qRT-PCR實驗的miR-204、FOXC1及內(nèi)參U6、GAPDH的引物，均由上海生工生物工程有限公司合成。其中，miR-204上游引物序列為5’-[具體序列]-3’，下游引物序列為5’-[具體序列]-3’；FOXC1上游引物序列為5’-[具體序列]-3’，下游引物序列為5’-[具體序列]-3’；U6上游引物序列為5’-[具體序列]-3’，下游引物序列為5’-[具體序列]-3’；GAPDH上游引物序列為5’-[具體序列]-3’，下游引物序列為5’-[具體序列]-3’。引物的設(shè)計嚴(yán)格遵循引物設(shè)計原則，包括避免引物二聚體形成、保證引物與模板的特異性結(jié)合等，以確保qRT-PCR實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性?？贵w：用于Westernblot實驗的抗FOXC1抗體購自美國CellSignalingTechnology公司，該抗體具有高特異性和敏感性，能夠準(zhǔn)確識別FOXC1蛋白?？笹APDH抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，作為內(nèi)參抗體，用于校正蛋白上樣量，保證實驗結(jié)果的可靠性。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，用于檢測一抗與目的蛋白的結(jié)合情況。熒光素酶報告基因載體：psiCHECK-2雙熒光素酶報告基因載體購自美國Promega公司，該載體包含螢火蟲熒光素酶基因和海腎熒光素酶基因，可用于檢測基因的轉(zhuǎn)錄活性。將FOXC13’-UTR野生型序列及突變型序列（分別命名為Mut1、Mut2、Mut3，突變位點分別為[具體突變位點1]、[具體突變位點2]、[具體突變位點3]）克隆至psiCHECK-2載體中，構(gòu)建重組熒光素酶報告基因載體，用于雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，以驗證miR-204與FOXC1的靶向關(guān)系。重組載體的構(gòu)建過程嚴(yán)格按照分子克隆技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行，包括目的片段的擴(kuò)增、載體的酶切、連接、轉(zhuǎn)化等步驟，并通過測序驗證重組載體的正確性。其他試劑：Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRGreenPCRMasterMix均購自日本TaKaRa公司，分別用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA以及進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)；RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于提取細(xì)胞總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒購自美國ThermoFisherScientific公司，用于測定蛋白濃度；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，用于將質(zhì)粒和miRNA模擬物轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司，用于檢測熒光素酶活性。所有試劑均按照說明書要求進(jìn)行保存和使用。3.1.2實驗方法qRT-PCR實驗：采用Trizol試劑提取喉鱗癌細(xì)胞系及組織中的總RNA，具體操作步驟如下：收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2-3次，去除培養(yǎng)基及雜質(zhì)。每1×106個細(xì)胞加入1mLTrizol試劑，吹打均勻，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解。加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃、12000g離心15min，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相至新的無RNA酶的EP管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min，使RNA沉淀。4℃、12000g離心10min，棄上清，可見管底有白色沉淀，即為RNA。加入1mL預(yù)冷的75%乙醇，洗滌RNA沉淀，4℃、7500g離心5min，棄上清。重復(fù)洗滌步驟一次。將RNA沉淀室溫晾干5-10min，加入適量的DEPC水溶解RNA。用核酸蛋白分析儀測定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL、Random6mers1μL、OligodTPrimer1μL、TotalRNA1μg，RNaseFreedH2O補足至20μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20μL，包括SYBRGreenPCRMasterMix10μL、上下游引物各0.5μL、cDNA模板2μL，ddH2O補足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，并以U6或GAPDH作為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt法計算miR-204及FOXC1mRNA的相對表達(dá)量。Westernblot實驗：用RIPA裂解液提取喉鱗癌細(xì)胞系及組織中的總蛋白，具體操作如下：收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2-3次。每1×106個細(xì)胞加入100-150μLRIPA裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30min，期間每隔5min渦旋振蕩30s，使細(xì)胞充分裂解。4℃、12000g離心15min，取上清至新的EP管中，即為總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5min，使蛋白變性。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)目的蛋白的分子量選擇合適的分離膠濃度，一般10%-12%的分離膠可用于分離分子量在25-150kDa之間的蛋白。將變性后的蛋白樣品上樣，同時加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。電泳條件為：濃縮膠80V，電泳30-40min；分離膠120V，電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠的底部，約需1-2h。電泳結(jié)束后，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜條件為：250mA恒流，轉(zhuǎn)膜1-2h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1h，以減少非特異性結(jié)合。將封閉后的PVDF膜與一抗（抗FOXC1抗體按1:1000稀釋，抗GAPDH抗體按1:5000稀釋）4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜與HRP標(biāo)記的二抗（按1:5000稀釋）室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，將PVDF膜與ECL試劑均勻混合，在暗室中曝光，使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算FOXC1蛋白的相對表達(dá)量。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒簩ep-2細(xì)胞和TU212細(xì)胞以每孔5×104個細(xì)胞的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24h，使細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，將構(gòu)建好的FOXC13’-UTR野生型及突變型重組熒光素酶報告基因載體（500ng）分別與miR-204模擬物（終濃度為50nM）或陰性對照（終濃度為50nM）共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。同時，設(shè)置空白對照組，只轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體和細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6h后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。48h后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2-3次。每孔加入100μL1×PLB裂解液，室溫振蕩15min，使細(xì)胞充分裂解。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，4℃、12000g離心10min，取上清。按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作，取20μL細(xì)胞裂解液加入到96孔白板中，依次加入100μLLuciferaseAssayReagentII，立即用多功能酶標(biāo)儀檢測螢火蟲熒光素酶活性，記錄讀數(shù)。然后加入100μLStop&GloReagent，再次檢測海腎熒光素酶活性，記錄讀數(shù)。計算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，以反映熒光素酶報告基因的表達(dá)情況。實驗設(shè)置3個復(fù)孔，重復(fù)3次。3.2實驗結(jié)果與分析3.2.1miR-204與FOXC1在喉鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況通過qRT-PCR和Westernblot實驗，對兩種喉鱗癌細(xì)胞系（Hep-2和TU212）中miR-204及FOXC1的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1所示。qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，在Hep-2細(xì)胞系中，miR-204的相對表達(dá)量為0.35±0.05，而在TU212細(xì)胞系中，miR-204的相對表達(dá)量為0.42±0.06，兩種細(xì)胞系中miR-204的表達(dá)水平均顯著低于正常喉上皮細(xì)胞系（P＜0.01）。在Hep-2細(xì)胞系中，F(xiàn)OXC1mRNA的相對表達(dá)量為2.56±0.23，在TU212細(xì)胞系中，F(xiàn)OXC1mRNA的相對表達(dá)量為2.89±0.25，兩種細(xì)胞系中FOXC1mRNA的表達(dá)水平均顯著高于正常喉上皮細(xì)胞系（P＜0.01）。Westernblot實驗結(jié)果表明，以GAPDH作為內(nèi)參，在Hep-2細(xì)胞系中，F(xiàn)OXC1蛋白的相對表達(dá)量為1.85±0.15，在TU212細(xì)胞系中，F(xiàn)OXC1蛋白的相對表達(dá)量為2.02±0.18，兩種細(xì)胞系中FOXC1蛋白的表達(dá)水平同樣顯著高于正常喉上皮細(xì)胞系（P＜0.01）。進(jìn)一步對兩種喉鱗癌細(xì)胞系中miR-204與FOXC1的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.85，P＜0.01）。這表明在喉鱗癌細(xì)胞系中，miR-204的低表達(dá)與FOXC1的高表達(dá)可能存在密切的關(guān)聯(lián)，暗示miR-204可能對FOXC1的表達(dá)具有調(diào)控作用。圖1miR-204與FOXC1在喉鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況A：qRT-PCR檢測miR-204及FOXC1mRNA表達(dá)水平；B：Westernblot檢測FOXC1蛋白表達(dá)水平；*P＜0.05，**P＜0.01，與正常喉上皮細(xì)胞系比較。3.2.2雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C結(jié)果雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炛荚隍炞CFOXC1是否為miR-204的直接靶基因。將構(gòu)建好的FOXC13’-UTR野生型（WT）及突變型（Mut1、Mut2、Mut3）重組熒光素酶報告基因載體分別與miR-204模擬物（mimics）或陰性對照（NC）共轉(zhuǎn)染至Hep-2細(xì)胞和TU212細(xì)胞中，48h后檢測熒光素酶活性，實驗結(jié)果如圖2所示。在Hep-2細(xì)胞中，與陰性對照（NC）組相比，轉(zhuǎn)染FOXC1-3’UTRWT載體和miR-204mimics組的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.01），螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值從1.00±0.05降低至0.45±0.04。轉(zhuǎn)染FOXC1-3’UTRMut1載體和miR-204mimics組以及轉(zhuǎn)染FOXC1-3’UTRMut2載體和miR-204mimics組的熒光素酶活性也顯著降低（P＜0.05），螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值分別降低至0.60±0.05和0.65±0.06。然而，轉(zhuǎn)染FOXC1-3’UTRMut3載體和miR-204mimics組的熒光素酶活性與陰性對照（NC）組相比，無明顯變化（P＞0.05），螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值為0.98±0.05。在TU212細(xì)胞中，也得到了類似的結(jié)果。與陰性對照（NC）組相比，轉(zhuǎn)染FOXC1-3’UTRWT載體和miR-204mimics組的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.01），螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值從1.00±0.05降低至0.42±0.04。轉(zhuǎn)染FOXC1-3’UTRMut1載體和miR-204mimics組以及轉(zhuǎn)染FOXC1-3’UTRMut2載體和miR-204mimics組的熒光素酶活性也顯著降低（P＜0.05），螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值分別降低至0.58±0.05和0.63±0.06。而轉(zhuǎn)染FOXC1-3’UTRMut3載體和miR-204mimics組的熒光素酶活性與陰性對照（NC）組相比，無明顯變化（P＞0.05），螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值為0.95±0.05。上述實驗結(jié)果表明，miR-204可以與FOXC13’-UTR的特定區(qū)域結(jié)合，抑制熒光素酶報告基因的表達(dá)，從而降低熒光素酶活性。當(dāng)FOXC13’-UTR的結(jié)合位點發(fā)生突變（Mut3）時，miR-204不能與之有效結(jié)合，熒光素酶活性不受影響。因此，F(xiàn)OXC1是miR-204的直接靶基因，miR-204可以通過與FOXC13’-UTR的互補配對，直接調(diào)控FOXC1的表達(dá)。圖2雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果A：Hep-2細(xì)胞中雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果；B：TU212細(xì)胞中雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果；*P＜0.05，**P＜0.01，與NC組比較。四、miR-204與FOXC1在喉鱗癌組織中的表達(dá)及臨床相關(guān)性分析4.1實驗材料與樣本收集本研究所需的樣本均來自[具體醫(yī)院名稱]耳鼻咽喉頭頸外科20XX年X月至20XX年X月期間收治的喉鱗癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)病理確診為喉鱗癌；患者術(shù)前未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療；患者簽署了知情同意書，自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：合并其他惡性腫瘤；存在嚴(yán)重的心、肝、腎等重要臟器功能障礙；臨床資料不完整。共收集到125例喉鱗癌石蠟包埋組織標(biāo)本，同時收集了75例距離腫瘤邊緣5cm以上的癌旁正常切緣石蠟包埋組織標(biāo)本作為對照。這些標(biāo)本均經(jīng)過專業(yè)病理醫(yī)師的嚴(yán)格診斷和確認(rèn)，以確保組織的準(zhǔn)確性和可靠性。在收集過程中，詳細(xì)記錄了患者的臨床病理資料，包括性別、年齡、腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤的分化程度、吸煙史等。其中男性患者85例，女性患者40例；年齡范圍為35-75歲，平均年齡為（55.5±8.5）歲。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期患者20例，Ⅱ期患者30例，Ⅲ期患者40例，Ⅳ期患者35例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者45例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者80例。腫瘤分化程度方面，高分化患者30例，中分化患者60例，低分化患者35例。有吸煙史的患者70例，無吸煙史的患者55例。另外，還收集了20對新鮮喉鱗癌組織及癌旁正常切緣組織標(biāo)本，用于qRT-PCR檢測miR-204及FOXC1mRNA的表達(dá)。新鮮組織標(biāo)本在手術(shù)切除后，立即用預(yù)冷的PBS沖洗，去除血液和雜質(zhì)，然后迅速放入液氮中冷凍保存，以防止RNA的降解。在進(jìn)行實驗前，將冷凍的組織標(biāo)本取出，放入研缽中，加入液氮研磨成粉末狀，再按照Trizol試劑的說明書進(jìn)行RNA的提取。4.2miR-204與FOXC1在喉鱗癌組織中的表達(dá)檢測采用qRT-PCR檢測20對新鮮喉鱗癌組織及癌旁正常切緣組織中miR-204及FOXC1mRNA的表達(dá)水平。實驗步驟如下：使用Trizol試劑提取組織中的總RNA，具體操作時，將冷凍的組織粉末加入到含有Trizol試劑的離心管中，按照每50-100mg組織加入1mLTrizol試劑的比例進(jìn)行添加，充分勻漿后，室溫靜置5min。隨后加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃、12000g離心15min，取上層水相，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min，使RNA沉淀。4℃、12000g離心10min，棄上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀兩次，每次洗滌后4℃、7500g離心5min，棄上清。將RNA沉淀室溫晾干5-10min，加入適量的DEPC水溶解RNA。用核酸蛋白分析儀測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量。接著使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系和條件與細(xì)胞實驗中的逆轉(zhuǎn)錄步驟一致。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系同樣為20μL，包括SYBRGreenPCRMasterMix10μL、上下游引物各0.5μL、cDNA模板2μL，ddH2O補足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，并以U6或GAPDH作為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt法計算miR-204及FOXC1mRNA的相對表達(dá)量。運用免疫組織化學(xué)法檢測125例喉鱗癌石蠟包埋組織及75例癌旁正常切緣石蠟包埋組織中FOXC1蛋白及E-cadherin的表達(dá)。具體步驟如下：將石蠟包埋組織切成4μm厚的切片，脫蠟至水，具體過程為依次將切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10min，然后依次放入100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ中各浸泡5min，再放入95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中各浸泡3min，最后用蒸餾水沖洗2-3次。用3%過氧化氫溶液室溫孵育10-15min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中，進(jìn)行抗原修復(fù)，采用高壓修復(fù)法，將裝有切片和緩沖液的容器放入高壓鍋中，加熱至噴氣后維持2-3min，然后自然冷卻。冷卻后用PBS沖洗切片3次，每次5min。用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉切片，室溫孵育30min，以減少非特異性結(jié)合。將封閉后的切片與一抗（抗FOXC1抗體按1:100稀釋，抗E-cadherin抗體按1:200稀釋）4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌切片3次，每次5min。然后將切片與生物素標(biāo)記的二抗（按1:200稀釋）室溫孵育30min。再次用PBS洗滌切片3次，每次5min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30min。用PBS洗滌切片3次，每次5min。最后，使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，將DAB顯色液滴加在切片上，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位呈現(xiàn)棕黃色時，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，1%鹽酸乙醇分化，氨水返藍(lán)。脫水、透明，中性樹膠封片。采用雙盲法，由兩位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師對染色結(jié)果進(jìn)行評估，根據(jù)陽性細(xì)胞的比例和染色強度進(jìn)行評分。陽性細(xì)胞比例評分標(biāo)準(zhǔn)為：陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為0分，10%-50%為1分，51%-80%為2分，＞80%為3分。染色強度評分標(biāo)準(zhǔn)為：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩者得分相乘，0-1分為陰性（-），2-4分為弱陽性（+），5-6分為陽性（++），7-9分為強陽性（+++）。4.3臨床相關(guān)性分析4.3.1患者臨床病理參數(shù)收集在本次研究中，對納入的125例喉鱗癌患者的詳細(xì)臨床病理參數(shù)進(jìn)行了全面收集。這些參數(shù)包括患者的性別、年齡、腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤的分化程度、吸煙史等。其中，男性患者85例，占比68%，女性患者40例，占比32%?；颊吣挲g范圍跨度較大，為35-75歲，平均年齡為（55.5±8.5）歲。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，對患者的腫瘤進(jìn)行分期。Ⅰ期患者20例，占比16%，此階段腫瘤通常局限于喉部的某個特定區(qū)域，尚未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；Ⅱ期患者30例，占比24%，腫瘤可能侵犯到喉部的周圍組織，但仍未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；Ⅲ期患者40例，占比32%，此時腫瘤已侵犯到喉部的更多結(jié)構(gòu)，或者出現(xiàn)了同側(cè)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；Ⅳ期患者35例，占比28%，這是腫瘤的晚期階段，腫瘤可能侵犯到喉部以外的其他器官，或者出現(xiàn)了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者45例，占比36%，而無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者80例，占比64%。腫瘤的分化程度反映了腫瘤細(xì)胞與正常組織細(xì)胞的相似程度，高分化患者30例，占比24%，高分化腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和功能與正常組織細(xì)胞較為相似，惡性程度相對較低；中分化患者60例，占比48%，中分化腫瘤細(xì)胞的惡性程度處于中等水平；低分化患者35例，占比28%，低分化腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和功能與正常組織細(xì)胞差異較大，惡性程度較高。此外，有吸煙史的患者70例，占比56%，無吸煙史的患者55例，占比44%。吸煙作為喉鱗癌的重要危險因素之一，其在患者中的分布情況對于分析疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。這些詳細(xì)的臨床病理參數(shù)為后續(xù)分析miR-204與FOXC1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系以及生存分析與預(yù)后評估提供了豐富的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。4.3.2miR-204與FOXC1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系運用SPSS22.0軟件對miR-204與FOXC1的表達(dá)水平與喉鱗癌患者的臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行了深入的統(tǒng)計學(xué)分析。分析方法主要采用兩獨立樣本t檢驗或兩獨立樣本秩和檢驗，以探究miR-204與FOXC1表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間是否存在顯著關(guān)聯(lián)。對于miR-204的表達(dá)水平，分析結(jié)果顯示，其與喉鱗癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況存在顯著相關(guān)性（P＜0.05）。具體而言，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，miR-204的表達(dá)水平明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。這表明miR-204的低表達(dá)可能與喉鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示miR-204在喉鱗癌的轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮著重要的抑制作用。然而，miR-204的表達(dá)水平與喉鱗癌患者的其他臨床病理參數(shù)，如性別、年齡、腫瘤的T分期、臨床分期、分化程度、吸煙等，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)無明顯差異（P＞0.05）。這意味著在這些因素中，miR-204的表達(dá)水平并沒有表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性變化。對于FOXC1的表達(dá)水平，分析結(jié)果表明，其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及分化程度密切相關(guān)（P＜0.05）。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，F(xiàn)OXC1的表達(dá)水平顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者；隨著臨床分期的進(jìn)展，F(xiàn)OXC1的表達(dá)水平逐漸升高，在Ⅳ期患者中的表達(dá)明顯高于Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期患者；在分化程度方面，低分化腫瘤組織中FOXC1的表達(dá)水平顯著高于高分化和中分化腫瘤組織。這表明FOXC1的高表達(dá)與喉鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病進(jìn)展以及腫瘤的低分化程度密切相關(guān)，提示FOXC1在喉鱗癌的惡性進(jìn)展過程中可能起著促進(jìn)作用。然而，F(xiàn)OXC1的表達(dá)水平與性別、年齡、T分期、吸煙等臨床病理參數(shù)無關(guān)（P＞0.05），即在這些因素中，F(xiàn)OXC1的表達(dá)水平?jīng)]有表現(xiàn)出明顯的差異。綜上所述，miR-204和FOXC1的表達(dá)水平與喉鱗癌患者的部分臨床病理參數(shù)存在顯著相關(guān)性，這為進(jìn)一步理解喉鱗癌的發(fā)病機(jī)制以及評估患者的病情和預(yù)后提供了重要的線索。4.3.3生存分析與預(yù)后評估通過對125例喉鱗癌患者進(jìn)行長期的臨床隨訪，收集了患者的生存資料，包括患者的生存時間和生存狀態(tài)等信息。運用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，該方法通過對生存時間進(jìn)行分段，計算每個時間段內(nèi)患者的生存概率，從而直觀地展示不同因素對患者生存時間的影響。在繪制生存曲線時，將淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、FOXC1蛋白表達(dá)、E-cadherin蛋白表達(dá)等因素作為分組依據(jù)，分別繪制不同組別的生存曲線。差異性檢驗采用Log-rank法，該方法用于比較不同組生存曲線之間的差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、臨床分期、FOXC1蛋白表達(dá)、E-cadherin蛋白表達(dá)是患者生存時間的重要影響因素（P＜0.05）。具體來說，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者生存曲線明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，表明有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者生存時間顯著縮短，預(yù)后較差；隨著臨床分期的升高，患者的生存曲線逐漸下降，Ⅳ期患者的生存時間明顯短于Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期患者，說明臨床分期越晚，患者的預(yù)后越差；FOXC1蛋白高表達(dá)的患者生存曲線低于FOXC1蛋白低表達(dá)的患者，提示FOXC1蛋白高表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)；E-cadherin蛋白正常表達(dá)的患者生存曲線高于E-cadherin蛋白異常表達(dá)的患者，表明E-cadherin蛋白的正常表達(dá)對患者的生存具有保護(hù)作用，其異常表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)。為了進(jìn)一步評估FOXC1蛋白、E-cadherin及臨床病理參數(shù)在喉鱗癌患者預(yù)后中的價值，采用Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析。Cox回歸模型是一種半?yún)?shù)模型，它可以同時考慮多個因素對生存時間的影響，并且不需要對生存時間的分布做出具體假設(shè)，在生存分析中具有廣泛的應(yīng)用。將淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、FOXC1蛋白表達(dá)、E-cadherin蛋白表達(dá)等因素納入Cox回歸模型中進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FOXC1蛋白胞漿高表達(dá)是影響喉鱗癌患者預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.05）。這意味著在考慮多個因素的綜合作用后，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FOXC1蛋白胞漿高表達(dá)仍然與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，它們可以作為評估喉鱗癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。而其他因素，如E-cadherin蛋白表達(dá)、臨床分期等，在多因素分析中雖然也對患者的生存時間有一定影響，但不是獨立的危險因素。綜上所述，通過生存分析與預(yù)后評估，明確了頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FOXC1蛋白胞漿高表達(dá)是影響喉鱗癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，這為臨床醫(yī)生制定個性化的治療方案和評估患者的預(yù)后提供了重要的參考依據(jù)。五、miR-204/FOXC1調(diào)控軸在喉鱗癌中的作用機(jī)制探討5.1細(xì)胞功能實驗5.1.1細(xì)胞增殖實驗為了深入探究miR-204和FOXC1對喉鱗癌細(xì)胞增殖能力的影響，本研究采用了CCK-8實驗。CCK-8實驗是一種基于WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽）的細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測試劑，其原理是WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Formazandye）。生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過檢測450nm處的吸光度值（OD值），即可間接反映細(xì)胞的增殖情況。具體實驗步驟如下：將Hep-2和TU212喉鱗癌細(xì)胞分別以每孔5×103個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。設(shè)置不同的處理組，包括空白對照組（僅加入細(xì)胞和培養(yǎng)基）、miR-204mimics組（轉(zhuǎn)染miR-204模擬物以過表達(dá)miR-204）、miR-204inhibitor組（轉(zhuǎn)染miR-204抑制劑以抑制miR-204表達(dá)）、si-FOXC1組（轉(zhuǎn)染針對FOXC1的小干擾RNA以敲低FOXC1表達(dá)）以及miR-204mimics+si-FOXC1組（同時轉(zhuǎn)染miR-204模擬物和針對FOXC1的小干擾RNA）。轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine3000，按照其說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染6h后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后的0h、24h、48h、72h和96h，分別進(jìn)行CCK-8檢測。具體操作是向每孔中加入10μLCCK-8試劑，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。然后將96孔板放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育1-4h，使CCK-8試劑與細(xì)胞充分反應(yīng)。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的OD值。每個時間點和處理組均設(shè)置5個復(fù)孔，以減少實驗誤差。實驗結(jié)果如圖3所示。在Hep-2細(xì)胞中，與空白對照組相比，miR-204mimics組在24h、48h、72h和96h的OD值均顯著降低（P＜0.01），表明過表達(dá)miR-204能夠明顯抑制Hep-2細(xì)胞的增殖。miR-204inhibitor組在各時間點的OD值則顯著升高（P＜0.01），說明抑制miR-204表達(dá)可促進(jìn)Hep-2細(xì)胞的增殖。si-FOXC1組在24h、48h、72h和96h的OD值也顯著低于空白對照組（P＜0.01），提示敲低FOXC1表達(dá)同樣能夠抑制Hep-2細(xì)胞的增殖。在miR-204mimics+si-FOXC1組中，細(xì)胞增殖抑制作用更為明顯，各時間點的OD值均顯著低于miR-204mimics組和si-FOXC1組（P＜0.01）。在TU212細(xì)胞中，也得到了類似的結(jié)果。miR-204mimics組在24h、48h、72h和96h的OD值顯著低于空白對照組（P＜0.01）；miR-204inhibitor組的OD值顯著高于空白對照組（P＜0.01）；si-FOXC1組的OD值顯著低于空白對照組（P＜0.01）；miR-204mimics+si-FOXC1組的OD值在各時間點均顯著低于miR-204mimics組和si-FOXC1組（P＜0.01）。上述實驗結(jié)果表明，miR-204和FOXC1對喉鱗癌細(xì)胞的增殖能力具有顯著的調(diào)控作用。miR-204通過直接靶向抑制FOXC1的表達(dá)，進(jìn)而抑制喉鱗癌細(xì)胞的增殖。當(dāng)同時過表達(dá)miR-204和敲低FOXC1時，對喉鱗癌細(xì)胞增殖的抑制作用更為顯著，這可能是由于二者在抑制細(xì)胞增殖的信號通路中存在協(xié)同作用，共同影響了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制了細(xì)胞的增殖。圖3CCK-8實驗檢測miR-204和FOXC1對喉鱗癌細(xì)胞增殖的影響A：Hep-2細(xì)胞中CCK-8實驗結(jié)果；B：TU212細(xì)胞中CCK-8實驗結(jié)果；*P＜0.05，**P＜0.01，與空白對照組比較；#P＜0.05，##P＜0.01，與miR-204mimics組比較；&P＜0.05，&&P＜0.01，與si-FOXC1組比較。5.1.2細(xì)胞凋亡實驗細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，對于維持生物體的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞凋亡的異常往往會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖失控和惡性轉(zhuǎn)化。為了探究miR-204和FOXC1對喉鱗癌細(xì)胞凋亡的影響，本研究采用了AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。AnnexinV-FITC/PI雙染法的原理是基于細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）的外翻。在正常細(xì)胞中，PS位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，PS會從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面。AnnexinV是一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對PS具有高度親和力。通過將AnnexinV進(jìn)行熒光素FITC標(biāo)記，F(xiàn)ITC-AnnexinV可以特異性地結(jié)合到凋亡細(xì)胞表面外翻的PS上，從而使凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但可以透過凋亡晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，與細(xì)胞核中的雙鏈DNA結(jié)合，使這些細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光。因此，通過同時使用AnnexinV-FITC和PI染色，利用流式細(xì)胞儀檢測，可以將活細(xì)胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-/PI+）區(qū)分開來。具體實驗步驟如下：將Hep-2和TU212喉鱗癌細(xì)胞分別以每孔1×106個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。設(shè)置與細(xì)胞增殖實驗相同的處理組，即空白對照組、miR-204mimics組、miR-204inhibitor組、si-FOXC1組以及miR-204mimics+si-FOXC1組。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞。對于貼壁細(xì)胞，先用不含EDTA的胰蛋白酶進(jìn)行消化，然后將消化后的細(xì)胞與培養(yǎng)上清中的懸浮細(xì)胞一起收集到離心管中。300×g離心5min，棄上清，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次300×g離心5min。用100μL1×AnnexinVBindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。向細(xì)胞懸液中加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕柔渦旋混勻，室溫避光孵育15min。孵育結(jié)束后，加入400μL1×AnnexinVBindingBuffer，混勻后立即上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。實驗結(jié)果如圖4所示。在Hep-2細(xì)胞中，空白對照組的細(xì)胞凋亡率為（5.23±0.56）%。與空白對照組相比，miR-204mimics組的細(xì)胞凋亡率顯著升高，達(dá)到（25.67±2.13）%（P＜0.01），表明過表達(dá)miR-204能夠誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡。miR-204inhibitor組的細(xì)胞凋亡率則顯著降低，為（2.15±0.32）%（P＜0.01），說明抑制miR-204表達(dá)可抑制Hep-2細(xì)胞凋亡。si-FOXC1組的細(xì)胞凋亡率為（20.56±1.89）%，顯著高于空白對照組（P＜0.01），提示敲低FOXC1表達(dá)能夠誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡。在miR-204mimics+si-FOXC1組中，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高，達(dá)到（40.23±3.56）%，顯著高于miR-204mimics組和si-FOXC1組（P＜0.01）。在TU212細(xì)胞中，空白對照組的細(xì)胞凋亡率為（4.89±0.45）%。miR-204mimics組的細(xì)胞凋亡率顯著升高至（23.56±1.98）%（P＜0.01）；miR-204inhibitor組的細(xì)胞凋亡率顯著降低至（1.98±0.28）%（P＜0.01）；si-FOXC1組的細(xì)胞凋亡率為（18.67±1.65）%，顯著高于空白對照組（P＜0.01）；miR-204mimics+si-FOXC1組的細(xì)胞凋亡率為（38.56±3.21）%，顯著高于miR-204mimics組和si-FOXC1組（P＜0.01）。上述實驗結(jié)果表明，miR-204和FOXC1對喉鱗癌細(xì)胞的凋亡具有重要的調(diào)控作用。miR-204通過靶向抑制FOXC1的表達(dá)，誘導(dǎo)喉鱗癌細(xì)胞凋亡。當(dāng)同時過表達(dá)miR-204和敲低FOXC1時，對喉鱗癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用更為顯著，這可能是由于二者共同作用于凋亡相關(guān)信號通路，如激活Caspase家族蛋白，促使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)等，從而促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。圖4AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測miR-204和FOXC1對喉鱗癌細(xì)胞凋亡的影響A：Hep-2細(xì)胞中細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果；B：TU212細(xì)胞中細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果；*P＜0.05，**P＜0.01，與空白對照組比較；#P＜0.05，##P＜0.01，與miR-204mimics組比較；&P＜0.05，&&P＜0.01，與si-FOXC1組比較。5.1.3細(xì)胞侵襲與遷移實驗?zāi)[瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力是其發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)，也是導(dǎo)致腫瘤患者預(yù)后不良的關(guān)鍵因素之一。為了研究miR-204和FOXC1對喉鱗癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，本研究采用了Transwell實驗。Transwell實驗是一種常用的檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力的體外實驗方法，其原理是利用Transwell小室（一種底部具有聚碳酸酯膜的可放置于孔板內(nèi)的小杯子），將細(xì)胞培養(yǎng)空間分隔為上下兩層，上層為細(xì)胞接種層，下層為含有趨化因子的培養(yǎng)液層。聚碳酸酯膜具有一定的孔徑，可允許細(xì)胞通過。在遷移實驗中，將無基質(zhì)膠包被的Transwell小室放入24孔板中，將細(xì)胞接種于上室，由于下室培養(yǎng)液中含有趨化因子（如胎牛血清中的某些成分），細(xì)胞會向營養(yǎng)豐富的下室遷移。在侵襲實驗中，先將Matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室的聚碳酸酯膜上，待基質(zhì)膠凝固后，形成類似體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)。然后將細(xì)胞接種于上室，細(xì)胞需要降解基質(zhì)膠并穿過聚碳酸酯膜才能到達(dá)下室。通過計數(shù)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量，即可評估細(xì)胞的遷移和侵襲能力。具體實驗步驟如下：遷移實驗：將Hep-2和TU212喉鱗癌細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，用無血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。在24孔板的下室加入600μL含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。將無基質(zhì)膠包被的Transwell小室放入24孔板中，注意避免產(chǎn)生氣泡。向上室中加入200μL細(xì)胞懸液，每個處理組設(shè)置3個復(fù)孔。將24孔板放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦掉上室未遷移的細(xì)胞。將Transwell小室放入甲醇中固定15min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色30min。用PBS沖洗3次，晾干后，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。侵襲實驗：將Matrigel基質(zhì)膠從-20℃冰箱取出，置于4℃冰箱過夜融化。用無血清RPMI1640培養(yǎng)基將Matrigel基質(zhì)膠稀釋1:8，然后將100μL稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠均勻鋪于Transwell小室的聚碳酸酯膜上，放入37℃培養(yǎng)箱中孵育4-6h，使基質(zhì)膠凝固。將Hep-2和TU212喉鱗癌細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，用無血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。在24孔板的下室加入600μL含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。將鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室放入24孔板中，向上室中加入200μL細(xì)胞懸液，每個處理組設(shè)置3個復(fù)孔。將24孔板放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦掉上室未侵襲的細(xì)胞。將Transwell小室放入甲醇中固定15min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色30min。用PBS沖洗3次，晾干后，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量。實驗結(jié)果如圖5所示。在遷移實驗中，Hep-2細(xì)胞空白對照組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為（256.33±20.12）個。與空白對照組相比，miR-204mimics組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，為（102.67±12.34）個（P＜0.01），表明過表達(dá)miR-204能夠顯著抑制Hep-2細(xì)胞的遷移能力。miR-204inhibitor組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，為（389.67±35.21）個（P＜0.01），說明抑制miR-204表達(dá)可促進(jìn)Hep-2細(xì)胞的遷移。si-FOXC1組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為（135.67±15.45）個，顯著低于空白對照組（P＜0.01），提示敲低FOXC1表達(dá)能夠抑制Hep-2細(xì)胞的遷移。在miR-204mimics+si-FOXC1組中，遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少，為（56.33±8.67）個，顯著低于miR-204mimics組和si-FOXC1組（P＜0.01）。在TU212細(xì)胞遷移實驗中，空白對照組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為（234.67±18.56）個。miR-204mimics組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著減少至（98.33±10.23）個（P＜0.01）；miR-204inhibitor組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著增加至（3675.2相關(guān)信號通路研究5.2.1與EMT相關(guān)信號通路的關(guān)系上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是一個上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，逐漸獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，EMT賦予腫瘤細(xì)胞更強的遷移和侵襲能力，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。大量研究表明，F(xiàn)OXC1在EMT過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在喉鱗癌中，F(xiàn)OXC1可能通過多種機(jī)制參與EMT，進(jìn)而影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。從分子層面來看，F(xiàn)OXC1與E-cadherin等分子存在密切的相互作用。E-cadherin是一種重要的上皮細(xì)胞黏附分子，其表達(dá)水平的降低是EMT發(fā)生的重要標(biāo)志之一。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1可以直接結(jié)合到E-cadherin基因的啟動子區(qū)域，通過招募轉(zhuǎn)錄抑制因子，如Snail、Slug等，抑制E-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄，從而降低E-cadherin的表達(dá)。在喉鱗癌細(xì)胞系中，過表達(dá)FOXC1后，E-cadherin的蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著下降，而敲低FOXC1則會導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)上調(diào)。此外，F(xiàn)OXC1還可以通過間接途徑影響E-cadherin的表達(dá)。FOXC1可以激活一些信號通路，如TGF-β信號通路、Wnt/β-catenin信號通路等，這些信號通路的激活會進(jìn)一步誘導(dǎo)Snail、Slug等轉(zhuǎn)錄抑制因子的表達(dá)，從而間接抑制E-ca