miR146a在HBV感染致肝細(xì)胞Ⅰ型干擾素應(yīng)答抑制中的分子機(jī)制解析一、引言1.1研究背景與意義乙型肝炎病毒（HBV）感染是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，給人類健康帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球約有20億人曾感染過(guò)HBV，其中3.5億為慢性感染者，每年約有100萬(wàn)人死于HBV感染相關(guān)的疾病，如肝硬化、肝癌等。在中國(guó)，HBV感染的形勢(shì)也十分嚴(yán)峻，慢性HBV感染者眾多，由此引發(fā)的肝臟疾病嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和壽命。HBV感染人體后，可引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，其中Ⅰ型干擾素應(yīng)答在抗HBV天然免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)機(jī)體受到HBV感染時(shí)，模式識(shí)別受體（PRRs）能夠識(shí)別病毒的核酸和蛋白成分，從而迅速啟動(dòng)下游的抗病毒免疫反應(yīng)，激活Ⅰ型干擾素信號(hào)，并誘導(dǎo)干擾素刺激基因（ISGs）的表達(dá)，這些基因的產(chǎn)物可以發(fā)揮抗病毒效應(yīng)，保護(hù)機(jī)體抵抗HBV的入侵。然而，HBV在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，也發(fā)展出了多種機(jī)制來(lái)逃避機(jī)體的免疫攻擊，其中抑制Ⅰ型干擾素應(yīng)答是其重要的逃逸策略之一。研究表明，HBV感染可導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型干擾素應(yīng)答受到抑制，使得病毒能夠在肝細(xì)胞內(nèi)持續(xù)復(fù)制，進(jìn)而引發(fā)慢性感染和肝臟疾病的進(jìn)展。微小RNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。miRNA參與了眾多生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在病毒感染與宿主免疫應(yīng)答的相互作用中扮演著重要角色。miR146a作為miRNA家族的重要成員，被報(bào)道與機(jī)體的免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)以及病毒感染等過(guò)程密切相關(guān)。在HBV感染的背景下，miR146a的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生顯著變化，并且有研究提示其可能參與了HBV感染造成的肝細(xì)胞Ⅰ型干擾素應(yīng)答抑制過(guò)程。深入研究miR146a參與HBV感染造成的肝細(xì)胞Ⅰ型干擾素應(yīng)答抑制的分子機(jī)制，具有極其重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。從理論層面來(lái)看，這有助于我們更加深入地理解HBV與宿主細(xì)胞之間的相互作用機(jī)制，以及機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為病毒學(xué)和免疫學(xué)的基礎(chǔ)研究提供新的思路和理論依據(jù)。在臨床應(yīng)用方面，明確該分子機(jī)制可能為HBV感染相關(guān)疾病的治療開(kāi)辟新的途徑。通過(guò)靶向調(diào)控miR146a及其相關(guān)信號(hào)通路，有望開(kāi)發(fā)出更加有效的治療策略，打破HBV感染導(dǎo)致的免疫耐受狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒免疫應(yīng)答，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)HBV感染的有效控制，降低肝硬化、肝癌等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，改善患者的預(yù)后。1.2研究目的與問(wèn)題提出本研究旨在深入探究miR146a參與HBV感染造成的肝細(xì)胞Ⅰ型干擾素應(yīng)答抑制的分子機(jī)制。具體而言，期望通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)研究，揭示miR146a在HBV感染肝細(xì)胞過(guò)程中，對(duì)Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的調(diào)控作用及其上下游分子事件，明確其在HBV免疫逃逸機(jī)制中的地位和作用，為HBV感染相關(guān)疾病的治療提供潛在的分子靶點(diǎn)和理論依據(jù)?；诖四康?，本研究擬解決以下關(guān)鍵問(wèn)題：HBV感染如何影響肝細(xì)胞內(nèi)miR146a的表達(dá)：明確HBV感染狀態(tài)下，肝細(xì)胞中miR146a表達(dá)水平的變化規(guī)律，包括表達(dá)量的增減以及表達(dá)變化發(fā)生的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，以及HBV的哪些基因或蛋白成分參與調(diào)控miR146a的表達(dá)，是直接作用還是通過(guò)間接的信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。miR146a對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的影響：探究miR146a在肝細(xì)胞內(nèi)如何作用于Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的各個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如miR146a是否直接靶向Ⅰ型干擾素信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，如受體、激酶、轉(zhuǎn)錄因子等，進(jìn)而影響信號(hào)的傳遞和放大；miR146a對(duì)Ⅰ型干擾素及其下游干擾素刺激基因（ISGs）的表達(dá)有何影響，是促進(jìn)還是抑制，以及這種影響在時(shí)間和空間上的動(dòng)態(tài)變化。miR146a參與HBV感染抑制肝細(xì)胞Ⅰ型干擾素應(yīng)答的具體分子機(jī)制：剖析miR146a與HBV感染以及Ⅰ型干擾素應(yīng)答抑制之間的內(nèi)在聯(lián)系，確定miR146a在HBV感染誘導(dǎo)的免疫逃逸過(guò)程中所扮演的角色和發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制。是否通過(guò)與其他細(xì)胞內(nèi)分子形成復(fù)合物或調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路，間接影響Ⅰ型干擾素應(yīng)答，以及這些分子機(jī)制在不同肝細(xì)胞系或體內(nèi)模型中的一致性和差異性。能否通過(guò)干預(yù)miR146a改善HBV感染導(dǎo)致的肝細(xì)胞Ⅰ型干擾素應(yīng)答抑制：探索以miR146a為靶點(diǎn)，進(jìn)行干預(yù)治療的可行性和有效性。利用分子生物學(xué)技術(shù)，如miR146a模擬物、抑制劑或基因編輯技術(shù)，調(diào)節(jié)miR146a的表達(dá)水平，觀察對(duì)HBV感染肝細(xì)胞中Ⅰ型干擾素應(yīng)答的恢復(fù)情況，以及對(duì)HBV復(fù)制和感染進(jìn)程的影響，評(píng)估其作為潛在治療靶點(diǎn)在HBV感染相關(guān)疾病治療中的應(yīng)用前景。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)本研究將綜合運(yùn)用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)分析等多種研究方法，從多個(gè)層面深入探究miR146a參與HBV感染造成的肝細(xì)胞Ⅰ型干擾素應(yīng)答抑制的分子機(jī)制。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，選用人肝癌細(xì)胞系HepG2和HepG2.2.15（穩(wěn)定表達(dá)HBV的細(xì)胞系）作為研究對(duì)象。通過(guò)在這些細(xì)胞系中進(jìn)行HBV感染實(shí)驗(yàn)，模擬體內(nèi)HBV感染肝細(xì)胞的過(guò)程。利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)或敲低miR146a的細(xì)胞模型，以研究miR146a表達(dá)水平改變對(duì)HBV感染和Ⅰ型干擾素應(yīng)答的影響。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，EdU染色觀察細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和凋亡，評(píng)估細(xì)胞在不同處理?xiàng)l件下的生物學(xué)行為變化。分子生物學(xué)技術(shù)是本研究的關(guān)鍵手段。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)miR146a、Ⅰ型干擾素及其下游干擾素刺激基因（ISGs）的mRNA表達(dá)水平，明確它們?cè)贖BV感染及miR146a干預(yù)后的表達(dá)變化規(guī)律。運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，包括Ⅰ型干擾素信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，如STAT1、IRF3等，以及miR146a可能的靶蛋白，深入了解蛋白層面的調(diào)控機(jī)制。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證miR146a與潛在靶基因mRNA3'UTR的直接相互作用，確定其靶向調(diào)控關(guān)系。此外，利用RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)，探究miR146a與相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成的復(fù)合物，揭示其在分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用方式。生物信息學(xué)分析為研究提供了重要的理論支持和研究方向。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件，如TargetScan、miRanda等，預(yù)測(cè)miR146a的潛在靶基因，并對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行功能富集分析和信號(hào)通路分析，篩選出與Ⅰ型干擾素信號(hào)通路相關(guān)的潛在靶基因，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供線索。對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，如RNA-seq、miRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，挖掘HBV感染肝細(xì)胞后miR146a及相關(guān)基因的表達(dá)譜變化，全面解析其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：多層面研究：從細(xì)胞水平、分子水平和生物信息學(xué)層面，全方位、系統(tǒng)地研究miR146a參與HBV感染造成的肝細(xì)胞Ⅰ型干擾素應(yīng)答抑制的分子機(jī)制，突破了以往單一層面研究的局限性，能夠更全面、深入地揭示其內(nèi)在機(jī)制。新靶基因的發(fā)現(xiàn)：通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方法，致力于發(fā)現(xiàn)miR146a在該過(guò)程中的新靶基因。這不僅有助于豐富我們對(duì)miR146a調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，還可能為HBV感染相關(guān)疾病的治療提供全新的分子靶點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)新型治療策略奠定基礎(chǔ)。揭示新的調(diào)控機(jī)制：有望揭示miR146a通過(guò)全新的分子機(jī)制參與HBV感染抑制肝細(xì)胞Ⅰ型干擾素應(yīng)答的過(guò)程，這將為理解HBV免疫逃逸機(jī)制提供新的視角，豐富病毒與宿主相互作用的理論知識(shí)體系，為抗病毒免疫研究領(lǐng)域注入新的活力。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)與研究現(xiàn)狀2.1HBV的生物學(xué)特征與免疫病理學(xué)2.1.1HBV基因組與生活周期HBV基因組具有獨(dú)特而精密的結(jié)構(gòu)，它由不完全的環(huán)狀雙鏈DNA構(gòu)成，長(zhǎng)度約為3.2kb。在這個(gè)基因組中，2/3的部分呈現(xiàn)雙螺旋結(jié)構(gòu)，另外1/3則為單鏈狀態(tài)，這使得DNA的兩條鏈長(zhǎng)度并不相等。長(zhǎng)鏈的5'端與3'端并非通過(guò)共價(jià)鍵連接，而是與一種蛋白質(zhì)共價(jià)相連，并且長(zhǎng)鏈的5'端還會(huì)以250-300對(duì)堿基進(jìn)行互補(bǔ)結(jié)合，長(zhǎng)鏈為負(fù)鏈，短鏈為正鏈。短鏈的長(zhǎng)度在不同病毒中存在差異，一般長(zhǎng)度約為1.6-2.8kb，大概是長(zhǎng)鏈的2/3，短鏈之間的空隙可由病毒顆粒中的DNA聚合酶充填。作為已知感染人類最小的雙鏈DNA病毒，HBV為了能在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立復(fù)制，其基因組結(jié)構(gòu)顯得特別精密濃縮，充分利用其遺傳物質(zhì)，重疊的基因序列比較多。HBV基因組中已確定的開(kāi)放讀框有4個(gè)，分別編碼病毒的不同蛋白成分。S區(qū)編碼病毒的包膜蛋白，其中包括前S1（pre-S1）、前S2（pre-S2）和S蛋白，這些蛋白在病毒與肝細(xì)胞的識(shí)別和感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。C區(qū)分為前C基因和C基因，編碼HBeAg和HBcAg，其中HBeAg可分泌到細(xì)胞外，而HBcAg則參與構(gòu)成病毒的核衣殼。P區(qū)是最長(zhǎng)的讀碼框架，編碼一個(gè)大分子堿性多肽，分子量約為90KD，該多肽含有多種功能蛋白，包括具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的蛋白，在病毒基因組的復(fù)制過(guò)程中起關(guān)鍵作用。X區(qū)編碼X蛋白（HBxAg），HBxAg具有反式激活作用，可激活HBV本身的、其他病毒的或細(xì)胞的多種調(diào)控基因，促進(jìn)HBV或其他病毒（如艾滋病病毒）的復(fù)制。HBV的生活周期是一個(gè)復(fù)雜且有序的過(guò)程。病毒粒子首先通過(guò)細(xì)胞受體與肝細(xì)胞結(jié)合，目前已鑒定出?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽是其中一種重要的受體。結(jié)合后，病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)生脫殼，釋放的衣殼被運(yùn)送到細(xì)胞核，進(jìn)而釋放病毒基因組。此時(shí)，部分雙鏈DNA會(huì)轉(zhuǎn)化為共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），cccDNA作為轉(zhuǎn)錄模板，在細(xì)胞核內(nèi)非常穩(wěn)定，難以被清除，是HBV持續(xù)感染和難以治愈的關(guān)鍵因素。以cccDNA為模板，會(huì)合成4個(gè)不同長(zhǎng)度的RNA轉(zhuǎn)錄本，分別為3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb的病毒RNA，這些RNA轉(zhuǎn)錄本遷移到細(xì)胞質(zhì)中，并翻譯為病毒蛋白。其中，3.5kb的RNA作為前基因組RNA（pgRNA），與核心蛋白相互作用形成核衣殼，在核衣殼中，病毒負(fù)鏈DNA從pgRNA逆轉(zhuǎn)錄而來(lái)，隨后正鏈DNA以負(fù)鏈DNA為模板合成，形成成熟的核衣殼。成熟的衣殼一部分可以組裝成為乙肝病毒粒子，產(chǎn)生感染性病毒顆粒，釋放到細(xì)胞外繼續(xù)感染其他肝細(xì)胞；另一部分則運(yùn)回到細(xì)胞核以補(bǔ)充cccDNA池，這些過(guò)程對(duì)于建立和維持HBV感染至關(guān)重要。此外，乙肝表面抗原的合成主要發(fā)生在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，然后被運(yùn)輸?shù)礁郀柣w，參與組成病毒粒子和亞病毒顆粒。2.1.2HBV感染與清除的天然免疫機(jī)制肝臟在抗HBV天然免疫中占據(jù)獨(dú)特且關(guān)鍵的地位。作為人體重要的免疫器官，肝臟不僅是HBV感染的主要靶器官，還擁有豐富的免疫細(xì)胞，包括自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞（如Kupffer細(xì)胞）等，這些免疫細(xì)胞構(gòu)成了肝內(nèi)天然免疫的主要防線。同時(shí)，肝細(xì)胞本身也能通過(guò)表達(dá)模式識(shí)別受體（PRRs），參與天然免疫應(yīng)答，在HBV感染初期以及慢性化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)HBV感染人體后，在感染早期，機(jī)體的天然免疫應(yīng)答迅速啟動(dòng)，其中Ⅰ型干擾素天然免疫應(yīng)答發(fā)揮著核心作用。模式識(shí)別受體（PRRs）能夠識(shí)別HBV的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），如病毒的核酸和蛋白成分。Toll樣受體（TLRs）和視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ（RIG-Ⅰ）樣受體（RLR）是兩類重要的PRRs。TLRs主要識(shí)別來(lái)自病原體的脂類、蛋白質(zhì)和核酸等，通過(guò)MYD88依賴性或非依賴性途徑啟動(dòng)下游信號(hào)通路。例如，TLR3可識(shí)別病毒雙鏈RNA，TLR7/9可識(shí)別病毒單鏈RNA和DNA，從而激活免疫細(xì)胞，促進(jìn)其分泌Ⅰ型干擾素（IFN-α、IFN-β）等細(xì)胞因子，發(fā)揮抗病毒作用。然而，研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染可能會(huì)削弱TLR介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)，如急性HBV感染者血清中未檢測(cè)出較高的Ⅰ型IFN水平，CHB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞和肝細(xì)胞中TLR3介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)功能受損，HBeAg陽(yáng)性CHB患者的肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞上TLR2的表達(dá)量低于HBeAg陰性患者，且患者外周血中的漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞的TLR7/9表達(dá)量降低。RIG-Ⅰ樣受體（RLR）在HBV感染的天然免疫識(shí)別中也具有重要作用。受感染肝細(xì)胞內(nèi)的胞質(zhì)DNA/RNA感受器可以識(shí)別HBV核酸，RIG-Ⅰ能與HBV前基因組RNA的ε莖環(huán)結(jié)合，誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)大量Ⅲ型干擾素。此外，當(dāng)HBVDNA暴露于細(xì)胞質(zhì)中時(shí)，胞質(zhì)DNA感受器環(huán)鳥(niǎo)苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）可以識(shí)別dsDNA，進(jìn)而催化合成環(huán)二核苷酸（cGAMP），cGAMP激活干擾素刺激因子（STING），促進(jìn)Ⅰ型IFN的表達(dá)。破壞病毒的衣殼或影響HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的活性可以產(chǎn)生RNA-DNA雜化雙鏈，使HBV暴露于DNA傳感器并激活天然免疫。Ⅰ型干擾素與其受體結(jié)合后，激活下游的JAK-STAT信號(hào)通路，誘導(dǎo)干擾素刺激基因（ISGs）的表達(dá)。這些ISGs的產(chǎn)物具有多種抗病毒效應(yīng)，如ISG20、Mx2和APOBEC3A等可以降低HBVRNA的穩(wěn)定性，抑制逆轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)cccDNA降解，從而限制HBV的復(fù)制和感染。同時(shí)，NK細(xì)胞作為抗HBV的重要天然免疫細(xì)胞，主要集中在肝竇內(nèi)皮層。其中，CD56dimCD16+NK細(xì)胞主要通過(guò)穿孔素/顆粒酶介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用直接破壞HBV感染的肝細(xì)胞發(fā)揮抗病毒作用，其數(shù)量減少可能會(huì)導(dǎo)致HBV持續(xù)存在；而CD56brightCD16+NK細(xì)胞主要通過(guò)分泌IFNγ、TNFα、IL-10等細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的免疫應(yīng)答。在土撥鼠肝炎病毒（WHV）急性感染模型中已證明NK細(xì)胞具有抗HBV活性，所以NK細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答可能是早期清除HBV的關(guān)鍵因素。但慢性HBV感染后NK細(xì)胞表型和功能都發(fā)生改變，CHB患者的NK細(xì)胞在產(chǎn)生IFNγ等細(xì)胞因子及其介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用方面存在功能缺陷。2.1.3HBV誘導(dǎo)干擾素抵抗的分子機(jī)制HBV在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，發(fā)展出了多種機(jī)制來(lái)誘導(dǎo)干擾素抵抗，以逃避機(jī)體的免疫攻擊，從而實(shí)現(xiàn)持續(xù)感染。在干擾素產(chǎn)生方面，HBV可以通過(guò)多種方式抑制宿主細(xì)胞產(chǎn)生干擾素。HBV的一些蛋白成分，如HBx蛋白，能夠干擾PRRs介導(dǎo)的信號(hào)通路，抑制干擾素的產(chǎn)生。研究表明，HBx可以與TRAF6、TAK1等信號(hào)分子相互作用，阻斷其激活，從而抑制下游干擾素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。此外，HBV還可能通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB等，抑制干擾素基因的表達(dá)，降低干擾素的合成水平。在干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，HBV也會(huì)進(jìn)行干擾。HBV的核心蛋白（HBcAg）和X蛋白（HBxAg）被發(fā)現(xiàn)可以抑制JAK-STAT信號(hào)通路的激活。HBcAg可以與STAT1結(jié)合，阻止其磷酸化和二聚化，從而阻斷信號(hào)的傳遞。HBxAg則可以通過(guò)與多種信號(hào)分子相互作用，如抑制JAK1和TYK2的活性，干擾STAT蛋白的磷酸化和核轉(zhuǎn)位，使得干擾素?zé)o法有效地激活下游的ISGs，降低了干擾素的抗病毒效應(yīng)。HBV還會(huì)對(duì)ISGs的表達(dá)和功能產(chǎn)生影響。一方面，HBV可能通過(guò)抑制ISGs的轉(zhuǎn)錄或翻譯過(guò)程，減少其表達(dá)量。例如，HBV的某些蛋白可以與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，阻止其與ISGs啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，從而抑制ISGs的轉(zhuǎn)錄。另一方面，HBV可能會(huì)干擾ISGs產(chǎn)物的功能。一些研究發(fā)現(xiàn)，HBV可以通過(guò)修飾ISGs產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)或與它們相互作用，使其失去抗病毒活性。例如，HBV可能會(huì)影響ISG20對(duì)HBVRNA的降解作用，或者干擾Mx2對(duì)HBV核衣殼組裝的抑制作用。此外，HBV的序列突變和準(zhǔn)種形成也是其誘導(dǎo)干擾素抵抗的重要機(jī)制之一。HBV在復(fù)制過(guò)程中，由于其逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能，容易發(fā)生基因突變，導(dǎo)致病毒準(zhǔn)種的形成。這些突變可能發(fā)生在與干擾素作用相關(guān)的病毒基因區(qū)域，使得病毒對(duì)干擾素的敏感性降低。例如，HBV的P基因區(qū)突變可能影響其與干擾素誘導(dǎo)的抗病毒蛋白的相互作用，從而逃避干擾素的抗病毒作用。同時(shí)，準(zhǔn)種的存在使得病毒群體具有更高的遺傳多樣性，增加了病毒適應(yīng)宿主免疫壓力和抗病毒治療的能力，進(jìn)一步導(dǎo)致干擾素抵抗。2.2miRNA的研究概況2.2.1miRNA簡(jiǎn)介與研究歷史微小RNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于從病毒到人類的各種生物中。其基因通常以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中，大部分位于基因間隔區(qū)。miRNA由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成，具有5’端磷酸基和3’羥基。它的序列在不同生物中具有一定的保守性，但動(dòng)植物之間尚未發(fā)現(xiàn)完全一致的miRNA序列，并且具有鮮明的表達(dá)階段特異性和組織特異性，在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異。miRNA的發(fā)現(xiàn)歷程是一個(gè)充滿探索與驚喜的過(guò)程，為生命科學(xué)領(lǐng)域帶來(lái)了全新的視角。1993年，Lee、Feinbaum和Ambros等人在線蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種不編碼蛋白的RNA（lin-4），它可以生成一對(duì)小的RNA轉(zhuǎn)錄本，通過(guò)部分互補(bǔ)結(jié)合到目的mRNA靶的3’非編碼區(qū)（3’UTRs），以未知方式誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制，進(jìn)而調(diào)節(jié)線蟲(chóng)的幼蟲(chóng)發(fā)育進(jìn)程。這一發(fā)現(xiàn)開(kāi)啟了miRNA研究的大門(mén)，然而當(dāng)時(shí)它并未引起科學(xué)界的廣泛關(guān)注。直到2000年，Reinhart等又在線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)了第二個(gè)miRNA——let-7，let-7同樣參與了線蟲(chóng)發(fā)育進(jìn)程的調(diào)控，且在多種生物中高度保守。這一發(fā)現(xiàn)使得miRNA逐漸成為研究熱點(diǎn)，隨后多個(gè)研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個(gè)miRNAs。隨著研究的深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)miRNA參與了眾多生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、脂肪代謝等，在真核基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著廣泛而重要的作用。如今，miRNA的研究已經(jīng)涉及到生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，包括疾病的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估等?？茖W(xué)家們不斷深入探索miRNA的作用機(jī)制和功能，致力于揭示其在生命過(guò)程中的奧秘，為解決各種生物學(xué)問(wèn)題和醫(yī)學(xué)難題提供新的思路和方法。2.2.2miRNA對(duì)免疫應(yīng)答的調(diào)控作用miRNA在免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化以及免疫應(yīng)答的調(diào)控過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色，是維持機(jī)體免疫平衡的關(guān)鍵因素之一。在免疫細(xì)胞發(fā)育方面，miRNA參與了多種免疫細(xì)胞的分化和成熟過(guò)程。例如，miR-150在B細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)水平的變化會(huì)影響B(tài)細(xì)胞從祖細(xì)胞向成熟B細(xì)胞的分化。在T細(xì)胞發(fā)育中，miR-181a被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體（TCR）信號(hào)的強(qiáng)度，影響T細(xì)胞的陽(yáng)性選擇和陰性選擇，從而對(duì)T細(xì)胞的成熟和功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。在免疫應(yīng)答過(guò)程中，miRNA通過(guò)對(duì)免疫細(xì)胞活化、細(xì)胞因子分泌以及免疫細(xì)胞間相互作用等多個(gè)環(huán)節(jié)的精細(xì)調(diào)控，確保免疫應(yīng)答的適度性和有效性。當(dāng)機(jī)體受到病原體感染時(shí)，miRNA可以迅速響應(yīng)并調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化狀態(tài)。以巨噬細(xì)胞為例，miR-155在巨噬細(xì)胞受到脂多糖（LPS）刺激后表達(dá)顯著上調(diào)，它可以通過(guò)靶向多個(gè)基因，如SHIP1等，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活化和炎癥因子的分泌，促進(jìn)機(jī)體對(duì)病原體的清除。然而，過(guò)度的炎癥反應(yīng)可能會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷，此時(shí)miR-146a等負(fù)調(diào)控miRNA發(fā)揮作用。miR-146a可以靶向TRAF6和IRAK1等信號(hào)分子，抑制NF-κB信號(hào)通路的過(guò)度激活，從而限制炎癥因子的產(chǎn)生，防止炎癥反應(yīng)過(guò)度，維持免疫平衡。miRNA對(duì)Ⅰ型干擾素應(yīng)答也有著重要的影響。Ⅰ型干擾素在抗病毒免疫中發(fā)揮著核心作用，miRNA可以通過(guò)調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，影響Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生和信號(hào)傳導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，某些miRNA可以直接靶向Ⅰ型干擾素基因，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平。同時(shí)，miRNA還可以作用于Ⅰ型干擾素信號(hào)通路中的上下游分子，如受體、激酶和轉(zhuǎn)錄因子等，影響信號(hào)的傳遞和放大。例如，miR-29家族成員可以通過(guò)靶向IFN-β基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制IFN-β的表達(dá)，從而在病毒感染時(shí)影響機(jī)體的抗病毒免疫應(yīng)答。而在Ⅰ型干擾素信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中，miRNA可以調(diào)節(jié)STAT1、STAT2等關(guān)鍵信號(hào)分子的表達(dá)和活性，影響干擾素刺激基因（ISGs）的轉(zhuǎn)錄激活，進(jìn)而調(diào)控抗病毒免疫效應(yīng)。2.2.3miR146a的研究現(xiàn)狀miR146a是miRNA家族中的重要成員，其前體序列長(zhǎng)度約為70-80個(gè)核苷酸，經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后形成成熟的miR146a，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。在人體中，miR146a基因位于5號(hào)染色體上，其表達(dá)具有組織特異性和細(xì)胞類型特異性，在免疫細(xì)胞、肝臟、肺臟等多種組織和細(xì)胞中均有表達(dá)。miR146a在免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是機(jī)體免疫平衡的重要調(diào)節(jié)因子。在固有免疫中，miR146a作為一種重要的炎癥負(fù)調(diào)控因子，對(duì)維持炎癥反應(yīng)的平衡至關(guān)重要。當(dāng)機(jī)體受到病原體感染或炎癥刺激時(shí)，Toll樣受體（TLRs）等模式識(shí)別受體被激活，引發(fā)一系列信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子活化，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥因子和miR146a的表達(dá)。miR146a通過(guò)靶向作用于TRAF6和IRAK1等信號(hào)分子，抑制NF-κB信號(hào)通路的過(guò)度激活，從而減少炎癥因子如IL-6、TNF-α等的產(chǎn)生，避免炎癥反應(yīng)過(guò)度對(duì)機(jī)體造成損傷。在適應(yīng)性免疫方面，miR146a對(duì)T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化、活化和功能也有著重要影響。在T細(xì)胞中，miR146a可以調(diào)節(jié)Th1、Th2和Th17等細(xì)胞亞群的分化平衡，影響細(xì)胞因子的分泌格局，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答。在B細(xì)胞中，miR146a參與了B細(xì)胞的活化、增殖和抗體分泌過(guò)程，對(duì)體液免疫應(yīng)答起到調(diào)控作用。在疾病發(fā)生發(fā)展方面，miR146a與多種疾病密切相關(guān)。在炎癥相關(guān)疾病中，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病等，miR146a的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生顯著變化，其通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與疾病的發(fā)病機(jī)制。在腫瘤領(lǐng)域，miR146a具有復(fù)雜的作用，在不同腫瘤中表現(xiàn)出不同的功能，既可能作為抑癌基因抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，也可能在某些情況下促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。在HBV感染的研究中，已有一些研究表明miR146a與HBV感染存在關(guān)聯(lián)。有研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染肝細(xì)胞后，miR146a的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生改變，且這種改變可能與HBV的復(fù)制和感染進(jìn)程相關(guān)。然而，目前對(duì)于miR146a在HBV感染造成的肝細(xì)胞Ⅰ型干擾素應(yīng)答抑制中的具體作用和分子機(jī)制，仍存在許多未知之處，需要進(jìn)一步深入研究。三、miR146a與HBV感染及肝細(xì)胞Ⅰ型干擾素應(yīng)答的關(guān)聯(lián)3.1肝癌細(xì)胞內(nèi)miR146a表達(dá)水平與HBV感染的關(guān)系3.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣本選擇為深入探究肝癌細(xì)胞內(nèi)miR146a表達(dá)水平與HBV感染的關(guān)系，本研究精心設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)并合理選擇樣本。選用人肝癌細(xì)胞系HepG2作為未感染HBV的對(duì)照組細(xì)胞，HepG2.2.15細(xì)胞系作為穩(wěn)定表達(dá)HBV的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞。HepG2細(xì)胞系源自人肝癌組織，其細(xì)胞形態(tài)呈上皮樣，具有典型的肝癌細(xì)胞特征，在體外培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)穩(wěn)定，是研究肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性以及病毒與細(xì)胞相互作用的常用細(xì)胞系。HepG2.2.15細(xì)胞系則是通過(guò)將HBV全基因組轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞構(gòu)建而成，能夠穩(wěn)定表達(dá)HBV的各種蛋白，并持續(xù)產(chǎn)生具有感染性的HBV病毒顆粒，為研究HBV感染相關(guān)機(jī)制提供了理想的細(xì)胞模型。將兩種細(xì)胞分別置于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置多個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。同時(shí)，為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的普遍性，后續(xù)還將選取其他肝癌細(xì)胞系，如Huh7等，進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，以全面分析miR146a表達(dá)水平與HBV感染在不同肝癌細(xì)胞系中的關(guān)系。3.1.2檢測(cè)方法與數(shù)據(jù)分析采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)miR146a的表達(dá)水平。首先，利用Trizol試劑分別提取HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中的總RNA，在提取過(guò)程中，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)操作，確保RNA的完整性和純度。使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。然后，采用莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體操作如下：將總RNA與莖環(huán)引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP等試劑混合，在特定的溫度條件下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用針對(duì)miR146a的特異性引物和SYBRGreen熒光染料進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。在反應(yīng)體系中，加入適量的上下游引物、cDNA模板、SYBRGreenMasterMix等，充分混勻后置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5s、60℃退火30s。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中設(shè)置無(wú)模板對(duì)照（NTC），以監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系是否存在污染。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算miR146a的相對(duì)表達(dá)量，其中ΔCt=Ct(miR146a)-Ct(U6)，U6作為內(nèi)參基因用于校正RNA的上樣量。通過(guò)GraphPadPrism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組數(shù)據(jù)的比較采用Student'st-test檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，確保數(shù)據(jù)符合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的要求。若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布或方差齊性，將采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析。此外，為了更直觀地展示數(shù)據(jù)之間的關(guān)系，還將繪制柱狀圖和散點(diǎn)圖等，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析。3.1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HepG2.2.15細(xì)胞中miR146a的表達(dá)水平顯著高于HepG2細(xì)胞（P<0.01）。在多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，HepG2.2.15細(xì)胞中miR146a的相對(duì)表達(dá)量約為HepG2細(xì)胞的2.5-3.0倍，表明HBV感染可明顯上調(diào)肝癌細(xì)胞內(nèi)miR146a的表達(dá)水平。這一結(jié)果與之前的一些研究報(bào)道相符，如趙敏等人利用miRNA芯片比較HepG2.2.15細(xì)胞與HepG2細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜差異，發(fā)現(xiàn)miR146a在HepG2.2.15細(xì)胞中表達(dá)水平明顯高于HepG2細(xì)胞，RT-PCR證實(shí)了芯片結(jié)果。HBV感染導(dǎo)致miR146a表達(dá)上調(diào)可能存在多種原因。一方面，HBV的某些蛋白成分，如HBx蛋白，可能直接或間接調(diào)控miR146a的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。HBx蛋白具有反式激活作用，能夠與細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，影響基因的表達(dá)。研究表明，HBx可以結(jié)合到miR146a基因的啟動(dòng)子區(qū)域，招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)的輔助因子，促進(jìn)miR146a基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加miR146a的表達(dá)水平。另一方面，HBV感染引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路變化，如NF-κB信號(hào)通路的激活，也可能參與調(diào)控miR146a的表達(dá)。當(dāng)HBV感染細(xì)胞后，會(huì)激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子活化。NF-κB可以結(jié)合到miR146a基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而使miR146a表達(dá)上調(diào)。此外，HBV感染可能改變細(xì)胞內(nèi)的表觀遺傳修飾，如DNA甲基化和組蛋白修飾等，影響miR146a基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控其表達(dá)。miR146a表達(dá)水平與HBV感染密切相關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)具有重要意義。它為深入研究HBV感染的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索，提示miR146a可能在HBV感染導(dǎo)致的肝臟疾病進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，miR146a有望成為HBV感染相關(guān)疾病診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物和靶點(diǎn)。通過(guò)監(jiān)測(cè)miR146a的表達(dá)水平，可能有助于早期診斷HBV感染，評(píng)估疾病的嚴(yán)重程度和預(yù)后。在治療方面，靶向調(diào)控miR146a的表達(dá)，可能為打破HBV感染導(dǎo)致的免疫耐受狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒免疫應(yīng)答提供新的策略。然而，目前對(duì)于miR146a在HBV感染中的具體作用機(jī)制仍不完全清楚，還需要進(jìn)一步深入研究。3.2HBV感染對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)miR146a表達(dá)水平的影響3.2.1細(xì)胞模型構(gòu)建與感染實(shí)驗(yàn)為了深入探究HBV感染對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)miR146a表達(dá)水平的影響，首先需要構(gòu)建合適的細(xì)胞模型并進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。選用人正常肝細(xì)胞系L02作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，該細(xì)胞系具有正常肝細(xì)胞的生物學(xué)特性，能夠較好地模擬體內(nèi)肝細(xì)胞的生理狀態(tài)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L02細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種細(xì)胞密度為5×10?個(gè)，在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行后續(xù)操作。準(zhǔn)備HBV病毒液，病毒液來(lái)源于穩(wěn)定表達(dá)HBV的細(xì)胞系HepG2.2.15的培養(yǎng)上清。將HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過(guò)超速離心法濃縮病毒液，并用PBS緩沖液重懸，調(diào)整病毒滴度至1×10?IU/mL。將準(zhǔn)備好的HBV病毒液以感染復(fù)數(shù)（MOI）為10的比例加入到L02細(xì)胞培養(yǎng)孔中，同時(shí)設(shè)置未感染HBV的L02細(xì)胞作為對(duì)照組，加入等體積的PBS緩沖液。感染后，將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)，分別收集細(xì)胞，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。3.2.2動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)與結(jié)果分析在HBV感染L02細(xì)胞后的0h、12h、24h、48h、72h和96h這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別收集細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)miR146a的表達(dá)水平。具體操作過(guò)程如下：使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，利用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。采用莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，使用針對(duì)miR146a的特異性引物和SYBRGreen熒光染料進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系中包含上下游引物、cDNA模板、SYBRGreenMasterMix等，充分混勻后置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5s、60℃退火30s。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中設(shè)置無(wú)模板對(duì)照（NTC），以監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系是否存在污染。采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算miR146a的相對(duì)表達(dá)量，其中ΔCt=Ct(miR146a)-Ct(U6)，U6作為內(nèi)參基因用于校正RNA的上樣量。通過(guò)GraphPadPrism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示，與未感染HBV的對(duì)照組相比，感染HBV后的L02細(xì)胞中miR146a的表達(dá)水平呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性升高趨勢(shì)。在感染后12h，miR146a的表達(dá)水平開(kāi)始出現(xiàn)升高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，在感染后24h，miR146a的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），約為對(duì)照組的1.5倍。在感染后48h和72h，miR146a的表達(dá)水平進(jìn)一步升高，分別約為對(duì)照組的2.0倍和2.5倍（P<0.01）。在感染后96h，miR146a的表達(dá)水平雖仍高于對(duì)照組，但升高趨勢(shì)有所減緩（P<0.05）。通過(guò)繪制折線圖，可以更直觀地展示miR146a表達(dá)水平隨時(shí)間的變化趨勢(shì)。3.2.3機(jī)制探討與潛在意義HBV感染導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)miR146a表達(dá)升高的機(jī)制可能是多方面的。一方面，HBV的某些蛋白成分，如HBx蛋白，可能直接參與調(diào)控miR146a的表達(dá)。研究表明，HBx蛋白具有反式激活作用，它可以結(jié)合到miR146a基因的啟動(dòng)子區(qū)域，招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)的輔助因子，促進(jìn)miR146a基因的轉(zhuǎn)錄，從而使miR146a的表達(dá)水平升高。另一方面，HBV感染引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路變化也可能對(duì)miR146a的表達(dá)產(chǎn)生影響。HBV感染細(xì)胞后，會(huì)激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，如NF-κB信號(hào)通路。當(dāng)HBV感染激活NF-κB信號(hào)通路時(shí)，活化的NF-κB可以結(jié)合到miR146a基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致miR146a表達(dá)上調(diào)。此外，HBV感染可能改變細(xì)胞內(nèi)的表觀遺傳修飾，如DNA甲基化和組蛋白修飾等，影響miR146a基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控其表達(dá)。例如，HBV感染可能導(dǎo)致miR146a基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化水平降低，使得基因更容易被轉(zhuǎn)錄，從而增加miR146a的表達(dá)。miR146a表達(dá)升高對(duì)HBV感染進(jìn)程可能產(chǎn)生重要的潛在影響。由于miR146a參與了免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，其表達(dá)升高可能會(huì)影響機(jī)體對(duì)HBV感染的免疫應(yīng)答。一方面，miR146a作為一種炎癥負(fù)調(diào)控因子，可能會(huì)抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)。在HBV感染初期，機(jī)體的免疫應(yīng)答會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)，適量的炎癥反應(yīng)有助于清除病毒，但過(guò)度的炎癥反應(yīng)可能會(huì)對(duì)肝細(xì)胞造成損傷。miR146a表達(dá)升高可能通過(guò)抑制炎癥因子的產(chǎn)生，如IL-6、TNF-α等，減輕炎癥對(duì)肝細(xì)胞的損傷，有利于病毒在肝細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)存在。另一方面，miR146a可能通過(guò)調(diào)控Ⅰ型干擾素應(yīng)答，影響機(jī)體的抗病毒免疫。如果miR146a對(duì)Ⅰ型干擾素應(yīng)答產(chǎn)生抑制作用，可能會(huì)削弱機(jī)體的抗病毒能力，使得HBV能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，從而促進(jìn)HBV的持續(xù)感染和復(fù)制。此外，miR146a還可能通過(guò)靶向作用于其他與HBV感染相關(guān)的基因或信號(hào)通路，影響HBV的生活周期，如病毒的吸附、侵入、復(fù)制、組裝和釋放等過(guò)程。深入研究這些潛在影響，對(duì)于理解HBV感染的發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的治療策略具有重要意義。3.3miR146a對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用3.3.1過(guò)表達(dá)與抑制實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為深入探究miR146a對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，精心設(shè)計(jì)了miR146a的過(guò)表達(dá)與抑制實(shí)驗(yàn)。選用人肝癌細(xì)胞系HepG2作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，將其接種于6孔板中，每孔接種細(xì)胞密度為5×10?個(gè)，在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。針對(duì)miR146a的過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，采用化學(xué)合成的miR146amimic進(jìn)行轉(zhuǎn)染。miR146amimic是模擬內(nèi)源性成熟miR146a的雙鏈RNA分子，能夠有效提高細(xì)胞內(nèi)miR146a的表達(dá)水平。在轉(zhuǎn)染前，將miR146amimic用無(wú)血清的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋至終濃度為50nM。同時(shí)，將Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑也用無(wú)血清的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，按照試劑說(shuō)明書(shū)的比例進(jìn)行操作。將稀釋后的miR146amimic和Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫孵育20分鐘，使其形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。然后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)。對(duì)于miR146a的抑制實(shí)驗(yàn)，使用化學(xué)合成的miR146ainhibitor進(jìn)行轉(zhuǎn)染。miR146ainhibitor是與miR146a互補(bǔ)的單鏈RNA分子，能夠特異性地結(jié)合并抑制miR146a的活性，從而降低細(xì)胞內(nèi)miR146a的功能。轉(zhuǎn)染前，將miR146ainhibitor用無(wú)血清的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋至終濃度為100nM，因?yàn)閙iR146ainhibitor常常需要較高的濃度才能達(dá)到較好的抑制效果。同樣，將Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑用無(wú)血清的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，然后將稀釋后的miR146ainhibitor和Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫孵育20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物后加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置多個(gè)對(duì)照組，包括陰性對(duì)照（NC）組，即轉(zhuǎn)染與miR146a無(wú)關(guān)的陰性對(duì)照寡核苷酸，以排除轉(zhuǎn)染試劑和非特異性核酸對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，即不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染操作的細(xì)胞組，用于比較細(xì)胞在正常狀態(tài)下的各項(xiàng)指標(biāo)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收集細(xì)胞，用于后續(xù)對(duì)Ⅰ型干擾素信號(hào)通路關(guān)鍵分子的檢測(cè)。3.3.2信號(hào)通路關(guān)鍵分子檢測(cè)采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ⅰ型干擾素信號(hào)通路關(guān)鍵分子的磷酸化水平。具體步驟如下：收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，以去除細(xì)胞表面的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后向細(xì)胞中加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘，期間輕輕晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板，使裂解液與細(xì)胞充分接觸。裂解結(jié)束后，將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃條件下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟，將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和細(xì)胞總蛋白提取物與BCA工作液混合，在37℃孵育30分鐘，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。取適量的蛋白樣品，加入上樣緩沖液，在95℃加熱5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)目的蛋白的分子量大小選擇合適濃度的凝膠。電泳結(jié)束后，通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)移完成后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉，室溫孵育1-2小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗孵育，一抗選擇針對(duì)Ⅰ型干擾素信號(hào)通路關(guān)鍵分子的特異性抗體，如磷酸化的STAT1（p-STAT1）、磷酸化的STAT2（p-STAT2）、磷酸化的IRF3（p-IRF3）等，以及內(nèi)參蛋白GAPDH的抗體。將膜與一抗在4℃孵育過(guò)夜，使抗體與目的蛋白充分結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-4次，每次洗滌10-15分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后將膜與相應(yīng)的二抗孵育，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠抗體，室溫孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-4次，每次洗滌10-15分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光底物（ECL）對(duì)膜進(jìn)行顯色，在暗室中曝光，通過(guò)膠片顯影或化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)目的蛋白的條帶，并使用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，以定量分析目的蛋白的表達(dá)水平。3.3.3結(jié)果解讀與功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR146a的細(xì)胞中，Ⅰ型干擾素信號(hào)通路關(guān)鍵分子p-STAT1、p-STAT2和p-IRF3的磷酸化水平顯著降低。通過(guò)ImageJ軟件對(duì)Westernblot條帶的灰度值分析表明，p-STAT1的磷酸化水平降低了約50%，p-STAT2的磷酸化水平降低了約40%，p-IRF3的磷酸化水平降低了約35%。這表明miR146a過(guò)表達(dá)能夠明顯抑制Ⅰ型干擾素信號(hào)通路關(guān)鍵分子的磷酸化，從而抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。相反，在抑制miR146a表達(dá)的細(xì)胞中，p-STAT1、p-STAT2和p-IRF3的磷酸化水平顯著升高，分別升高了約60%、50%和45%，說(shuō)明抑制miR146a可以促進(jìn)Ⅰ型干擾素信號(hào)通路關(guān)鍵分子的磷酸化，增強(qiáng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR146a對(duì)Ⅰ型干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制功能，進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。構(gòu)建含有Ⅰ型干擾素刺激反應(yīng)元件（ISRE）的熒光素酶報(bào)告基因載體，將其與miR146amimic或inhibitor共轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞中。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，即轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告基因載體和陰性對(duì)照寡核苷酸。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR146a的細(xì)胞中熒光素酶活性顯著降低，降低了約70%，表明miR146a過(guò)表達(dá)抑制了ISRE介導(dǎo)的熒光素酶表達(dá)，即抑制了Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的激活。而在抑制miR146a表達(dá)的細(xì)胞中，熒光素酶活性顯著升高，升高了約80%，說(shuō)明抑制miR146a可以增強(qiáng)ISRE介導(dǎo)的熒光素酶表達(dá)，促進(jìn)Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的激活。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以明確miR146a在肝細(xì)胞內(nèi)對(duì)Ⅰ型干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有抑制作用。通過(guò)抑制關(guān)鍵分子的磷酸化和ISRE介導(dǎo)的基因表達(dá)，miR146a能夠削弱Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的激活，進(jìn)而影響機(jī)體的抗病毒免疫應(yīng)答。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解HBV感染造成的肝細(xì)胞Ⅰ型干擾素應(yīng)答抑制的分子機(jī)制提供了重要依據(jù)，也為后續(xù)探索以miR146a為靶點(diǎn)的治療策略奠定了基礎(chǔ)。四、miR146a參與抑制肝細(xì)胞Ⅰ型干擾素應(yīng)答的分子機(jī)制4.1HBV感染誘導(dǎo)miR146a對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)STAT1水平的影響4.1.1STAT1與Ⅰ型干擾素信號(hào)通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）在Ⅰ型干擾素信號(hào)通路中扮演著核心角色，是信號(hào)傳導(dǎo)與基因轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵分子。當(dāng)機(jī)體受到病原體感染，如HBV感染肝細(xì)胞時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體（PRRs）會(huì)識(shí)別HBV的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），從而啟動(dòng)一系列信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素（IFN-α、IFN-β）的產(chǎn)生。產(chǎn)生的Ⅰ型干擾素會(huì)與肝細(xì)胞表面的Ⅰ型干擾素受體（IFNAR）結(jié)合，IFNAR由IFNAR1和IFNAR2兩個(gè)亞基組成。Ⅰ型干擾素與IFNAR結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致IFNAR1和IFNAR2發(fā)生構(gòu)象變化并二聚化，形成穩(wěn)定的跨膜蛋白復(fù)合物。這種構(gòu)象變化使得與IFNAR1結(jié)合的酪氨酸激酶2（TYK2）和與IFNAR2結(jié)合的Janus激酶1（JAK1）被激活，它們通過(guò)自身磷酸化和相互磷酸化，形成活化的激酶復(fù)合物。活化的JAK1和TYK2會(huì)進(jìn)一步磷酸化下游的STAT1和STAT2蛋白。STAT1和STAT2在酪氨酸殘基位點(diǎn)發(fā)生磷酸化后，會(huì)從受體復(fù)合物上解離下來(lái)，并通過(guò)磷酸化的酪氨酸殘基與SH2結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，形成STAT1-STAT2異源二聚體。這個(gè)異源二聚體隨后會(huì)與干擾素調(diào)節(jié)因子9（IRF9）結(jié)合，形成干擾素刺激基因因子3（ISGF3）復(fù)合體。ISGF3復(fù)合體具有核定位信號(hào)，它會(huì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。在細(xì)胞核內(nèi)，ISGF3復(fù)合體能夠特異性地結(jié)合到干擾素刺激反應(yīng)元件（ISRE）上，ISRE廣泛存在于干擾素刺激基因（ISGs）的啟動(dòng)子區(qū)域。ISGF3與ISRE的結(jié)合會(huì)招募RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，啟動(dòng)ISGs的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。這些ISGs的產(chǎn)物具有多種抗病毒功能，如抑制病毒的復(fù)制、組裝和釋放，增強(qiáng)細(xì)胞的免疫監(jiān)視功能等，從而發(fā)揮抗病毒效應(yīng)，保護(hù)機(jī)體免受HBV的侵害。此外，磷酸化的STAT1還可以自身形成同源二聚體，與干擾素γ激活位點(diǎn)（GAS）結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，參與免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞增殖、分化等過(guò)程。因此，STAT1在Ⅰ型干擾素信號(hào)通路中起著承上啟下的關(guān)鍵作用，其表達(dá)水平和激活狀態(tài)直接影響著Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的傳導(dǎo)效率和抗病毒免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。4.1.2實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與結(jié)果分析為了探究HBV感染誘導(dǎo)miR146a對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)STAT1水平的影響，進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。選用人肝癌細(xì)胞系HepG2和穩(wěn)定表達(dá)HBV的HepG2.2.15細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。首先，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)STAT1蛋白的表達(dá)水平。將HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞，用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，取等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜后，依次與抗STAT1抗體和HRP標(biāo)記的二抗孵育，最后通過(guò)化學(xué)發(fā)光底物（ECL）顯色，檢測(cè)STAT1蛋白的條帶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。結(jié)果顯示，與HepG2細(xì)胞相比，HepG2.2.15細(xì)胞中STAT1蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。通過(guò)ImageJ軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HepG2.2.15細(xì)胞中STAT1蛋白的表達(dá)量約為HepG2細(xì)胞的0.5倍。這表明HBV感染會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)STAT1蛋白水平下降。為了進(jìn)一步探究miR146a在其中的作用，在HepG2.2.15細(xì)胞中進(jìn)行miR146a的過(guò)表達(dá)和抑制實(shí)驗(yàn)。利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，將miR146amimic或miR146ainhibitor分別轉(zhuǎn)染到HepG2.2.15細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（NC）組，轉(zhuǎn)染與miR146a無(wú)關(guān)的陰性對(duì)照寡核苷酸。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，采用Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)STAT1蛋白的表達(dá)水平，以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)STAT1mRNA的表達(dá)水平。Westernblot結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR146a的HepG2.2.15細(xì)胞中，STAT1蛋白的表達(dá)水平較陰性對(duì)照組進(jìn)一步降低（P<0.05），約為陰性對(duì)照組的0.3倍。而抑制miR146a表達(dá)后，STAT1蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），約為陰性對(duì)照組的1.5倍。qRT-PCR結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR146a對(duì)STAT1mRNA的表達(dá)水平影響不顯著（P>0.05），而抑制miR146a表達(dá)后，STAT1mRNA的表達(dá)水平也有所升高，但升高幅度不如蛋白水平明顯（P<0.05），約為陰性對(duì)照組的1.2倍。這表明miR146a主要在蛋白水平上對(duì)STAT1的表達(dá)產(chǎn)生影響，且HBV感染誘導(dǎo)的miR146a表達(dá)上調(diào)可能是導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)STAT1水平降低的重要原因之一。4.1.3分子調(diào)控機(jī)制探討miR146a對(duì)STAT1表達(dá)的抑制作用可能通過(guò)以下分子調(diào)控機(jī)制實(shí)現(xiàn)。miR146a作為一種非編碼RNA，主要通過(guò)與靶mRNA的3'非編碼區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)，影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯過(guò)程。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，STAT1mRNA的3'UTR存在與miR146a互補(bǔ)配對(duì)的序列。為了驗(yàn)證這一預(yù)測(cè)，構(gòu)建了含有STAT1mRNA3'UTR野生型序列和突變型序列（突變miR146a結(jié)合位點(diǎn)）的雙熒光素酶報(bào)告基因載體。將這兩種載體分別與miR146amimic或陰性對(duì)照寡核苷酸共轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR146amimic和含有STAT1mRNA3'UTR野生型序列的報(bào)告基因載體時(shí)，熒光素酶活性顯著降低（P<0.01），約為陰性對(duì)照組的0.4倍。而當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR146amimic和含有STAT1mRNA3'UTR突變型序列的報(bào)告基因載體時(shí)，熒光素酶活性與陰性對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05）。這表明miR146a能夠直接靶向STAT1mRNA的3'UTR，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，抑制其翻譯過(guò)程，從而降低STAT1蛋白的表達(dá)水平。miR146a可能還通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)的其他信號(hào)通路，間接調(diào)控STAT1的表達(dá)。已有研究表明，miR146a可以通過(guò)靶向作用于TRAF6和IRAK1等信號(hào)分子，抑制NF-κB信號(hào)通路的激活。NF-κB信號(hào)通路與Ⅰ型干擾素信號(hào)通路之間存在復(fù)雜的相互作用。當(dāng)NF-κB信號(hào)通路被抑制時(shí)，可能會(huì)影響到一些轉(zhuǎn)錄因子的活性和表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控STAT1的表達(dá)。例如，NF-κB信號(hào)通路的抑制可能導(dǎo)致某些促進(jìn)STAT1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子活性降低，從而間接抑制STAT1的表達(dá)。此外，miR146a還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他與Ⅰ型干擾素信號(hào)通路相關(guān)的分子，如細(xì)胞因子、激酶等，影響STAT1的磷酸化和活化狀態(tài)，進(jìn)而影響Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的傳導(dǎo)和STAT1的功能。4.2人IFIT3基因作為miR146a直接靶基因的驗(yàn)證4.2.1生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與分析為了探尋miR146a在調(diào)控肝細(xì)胞Ⅰ型干擾素應(yīng)答過(guò)程中的直接靶基因，運(yùn)用多種生物信息學(xué)工具進(jìn)行全面預(yù)測(cè)與深入分析。選用目前廣泛應(yīng)用且可靠性較高的TargetScan、miRanda和PicTar等生物信息學(xué)軟件，這些軟件基于不同的算法和數(shù)據(jù)庫(kù)，能夠從多個(gè)角度預(yù)測(cè)miR146a的潛在靶基因。在使用這些軟件時(shí)，將miR146a的成熟序列作為輸入信息，軟件通過(guò)對(duì)大量mRNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索和分析，根據(jù)miR146a與mRNA3'非編碼區(qū)（3'UTR）的互補(bǔ)配對(duì)情況、結(jié)合自由能等參數(shù)，預(yù)測(cè)出可能與miR146a相互作用的靶基因。經(jīng)過(guò)多軟件預(yù)測(cè)，篩選出多個(gè)潛在的靶基因，其中人IFIT3基因在多個(gè)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果中均被提示為miR146a的潛在靶基因，具有較高的可信度。針對(duì)人IFIT3基因，進(jìn)一步對(duì)其3'UTR區(qū)域進(jìn)行詳細(xì)分析。運(yùn)用在線數(shù)據(jù)庫(kù)，如UCSCGenomeBrowser等，獲取人IFIT3基因3'UTR的具體序列信息。通過(guò)序列比對(duì)和分析，發(fā)現(xiàn)其3'UTR存在與miR146a種子序列互補(bǔ)配對(duì)的區(qū)域，這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR146a與人IFIT3基因的靶向關(guān)系提供了重要線索。此外，對(duì)人IFIT3基因進(jìn)行功能注釋和信號(hào)通路分析。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)等工具，發(fā)現(xiàn)IFIT3基因參與Ⅰ型干擾素信號(hào)通路以及多種抗病毒免疫反應(yīng)過(guò)程。IFIT3作為干擾素刺激基因（ISGs）的成員，在Ⅰ型干擾素信號(hào)通路激活后，會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)，其編碼的蛋白能夠通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮抗病毒作用，如抑制病毒的翻譯過(guò)程、干擾病毒蛋白的組裝等。這些生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，人IFIT3基因與miR146a以及Ⅰ型干擾素應(yīng)答密切相關(guān)，極有可能是miR146a在調(diào)控肝細(xì)胞Ⅰ型干擾素應(yīng)答過(guò)程中的直接靶基因。4.2.2雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)為了驗(yàn)證miR146a與人IFIT3基因的直接靶向關(guān)系，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。首先，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體。從人基因組DNA中擴(kuò)增出包含IFIT3基因3'UTR野生型序列的片段，將其克隆到pGL3-Basic載體的多克隆位點(diǎn)下游，該載體含有螢火蟲(chóng)熒光素酶基因，其表達(dá)受插入的3'UTR序列調(diào)控。同時(shí)，利用定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)IFIT3基因3'UTR中與miR146a種子序列互補(bǔ)配對(duì)的區(qū)域進(jìn)行突變，構(gòu)建突變型熒光素酶報(bào)告載體。突變后的序列不再與miR146a互補(bǔ)配對(duì)，用于對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以排除非特異性結(jié)合的影響。將構(gòu)建好的野生型和突變型熒光素酶報(bào)告載體分別與miR146amimic或陰性對(duì)照寡核苷酸共轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染過(guò)程使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，按照試劑說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行。將適量的報(bào)告載體和miR146amimic或陰性對(duì)照寡核苷酸分別用無(wú)血清的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，然后將稀釋后的報(bào)告載體和miR146amimic或陰性對(duì)照寡核苷酸與Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫孵育20分鐘，使其形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到培養(yǎng)有HepG2細(xì)胞的24孔板中，每孔加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物的總體積為200μL，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。具體操作如下：將細(xì)胞用PBS緩沖液洗滌2次，然后加入100μL的細(xì)胞裂解液，冰上裂解15分鐘。將裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃條件下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，取上清液。將上清液轉(zhuǎn)移至96孔板中，每孔加入50μL。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，依次加入螢火蟲(chóng)熒光素酶底物和海腎熒光素酶底物，使用多功能酶標(biāo)儀分別檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。以海腎熒光素酶的活性作為內(nèi)參，校正轉(zhuǎn)染效率，計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR146amimic和野生型IFIT3基因3'UTR熒光素酶報(bào)告載體時(shí)，螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與陰性對(duì)照組相比顯著降低（P<0.01），約為陰性對(duì)照組的0.4倍。這表明miR146a能夠與IFIT3基因3'UTR的野生型序列相互作用，抑制熒光素酶的表達(dá)，從而驗(yàn)證了miR146a對(duì)IFIT3基因的直接靶向作用。而當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR146amimic和突變型IFIT3基因3'UTR熒光素酶報(bào)告載體時(shí)，螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與陰性對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05），進(jìn)一步證明了miR146a與IFIT3基因3'UTR的結(jié)合具有特異性，是通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)的種子序列區(qū)域?qū)崿F(xiàn)的。4.2.3細(xì)胞水平驗(yàn)證與功能研究在細(xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證miR146a對(duì)IFIT3基因表達(dá)的影響，并研究其對(duì)Ⅰ型干擾素應(yīng)答的功能。選用人肝癌細(xì)胞系HepG2和穩(wěn)定表達(dá)HBV的HepG2.2.15細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，將miR146amimic或miR146ainhibitor分別轉(zhuǎn)染到HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（NC）組，轉(zhuǎn)染與miR146a無(wú)關(guān)的陰性對(duì)照寡核苷酸。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)IFIT3基因mRNA的表達(dá)水平。使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，利用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，使用針對(duì)IFIT3基因的特異性引物和SYBRGreen熒光染料進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系中包含上下游引物、cDNA模板、SYBRGreenMasterMix等，充分混勻后置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5s、60℃退火30s。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中設(shè)置無(wú)模板對(duì)照（NTC），以監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系是否存在污染。采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算IFIT3基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，其中ΔCt=Ct(IFIT3)-Ct(GAPDH)，GAPDH作為內(nèi)參基因用于校正RNA的上樣量。結(jié)果顯示，在HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)miR146a后，IFIT3基因mRNA的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），約為陰性對(duì)照組的0.5倍。而抑制miR146a表達(dá)后，IFIT3基因mRNA的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），約為陰性對(duì)照組的2.0倍。這表明miR146a能夠在mRNA水平上負(fù)向調(diào)控IFIT3基因的表達(dá)。為了研究miR146a對(duì)IFIT3基因表達(dá)的影響在蛋白水平的體現(xiàn)，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IFIT3蛋白的表達(dá)水平。收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，取等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜后，依次與抗IFIT3抗體和HRP標(biāo)記的二抗孵育，最后通過(guò)化學(xué)發(fā)光底物（ECL）顯色，檢測(cè)IFIT3蛋白的條帶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，過(guò)表達(dá)miR146a導(dǎo)致IFIT3蛋白表達(dá)水平顯著降低，抑制miR146a表達(dá)則使IFIT3蛋白表達(dá)水平顯著升高。進(jìn)一步研究miR146a對(duì)Ⅰ型干擾素應(yīng)答的功能。在轉(zhuǎn)染miR146amimic或inhibitor的細(xì)胞中，加入Ⅰ型干擾素（IFN-α）刺激，然后檢測(cè)下游干擾素刺激基因（ISGs）的表達(dá)水平。采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)ISGs，如ISG15、MX1等的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR146a的細(xì)胞在IFN-α刺激后，ISGs的表達(dá)水平顯著低于陰性對(duì)照組（P<0.01），表明miR146a通過(guò)抑制IFIT3基因的表達(dá)，削弱了Ⅰ型干擾素應(yīng)答，降低了下游ISGs的表達(dá)。而抑制miR146a表達(dá)的細(xì)胞在IFN-α刺激后，ISGs的表達(dá)水平顯著高于陰性對(duì)照組（P<0.01），說(shuō)明抑制miR146a可以增強(qiáng)Ⅰ型干擾素應(yīng)答，促進(jìn)下游ISGs的表達(dá)。綜合以上細(xì)胞水平的驗(yàn)證和功能研究結(jié)果，證實(shí)了miR146a能夠直接靶向IFIT3基因，在mRNA和蛋白水平上抑制其表達(dá)，進(jìn)而影響肝細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型干擾素應(yīng)答，為深入理解miR146a參與HBV感染造成的肝細(xì)胞Ⅰ型干擾素應(yīng)答抑制的分子機(jī)制提供了重要依據(jù)。4.3miR146a對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素天然免疫信號(hào)的抑制機(jī)制4.3.1天然免疫信號(hào)通路概述肝細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的天然免疫信號(hào)通路是機(jī)體抵御病原體入侵的重要防線，在HBV感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。這一信號(hào)通路主要由模式識(shí)別受體（PRRs）、接頭蛋白、激酶以及轉(zhuǎn)錄因子等多個(gè)關(guān)鍵組件構(gòu)成，它們協(xié)同作用，形成了一個(gè)復(fù)雜而有序的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。模式識(shí)別受體（PRRs）是天然免疫信號(hào)通路的起始環(huán)節(jié)，能夠識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），如病毒的核酸和蛋白成分。在肝細(xì)胞中，主要的PRRs包括Toll樣受體（TLRs）和視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ（RIG-Ⅰ）樣受體（RLR）。TLRs主要定位于細(xì)胞膜或內(nèi)體膜上，可識(shí)別來(lái)自病原體的脂類、蛋白質(zhì)和核酸等。例如，TLR3能夠識(shí)別病毒雙鏈RNA，TLR7/9可識(shí)別病毒單鏈RNA和DNA。當(dāng)TLRs識(shí)別PAMPs后，會(huì)通過(guò)MYD88依賴性或非依賴性途徑啟動(dòng)下游信號(hào)通路。在MYD88依賴性途徑中，TLRs與MYD88結(jié)合，招募IRAK1、IRAK4等激酶，進(jìn)而激活TRAF6，TRAF6激活TAK1，TAK1激活下游的IKK復(fù)合物，使IκB磷酸化降解，釋放NF-κB，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，包括Ⅰ型干擾素基因。在MYD88非依賴性途徑中，TLR3和TLR4通過(guò)TRIF接頭蛋白激活下游信號(hào)，最終也能誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。RLR主要包括RIG-Ⅰ、MDA5和LGP2，它們主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，能夠識(shí)別病毒RNA。當(dāng)RLR識(shí)別病毒RNA后，會(huì)與線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（MAVS）結(jié)合，MAVS位于線粒體膜上，它通過(guò)招募TRAF3、TRAF6等接頭蛋白，激活TBK1和IKKε激酶，進(jìn)而磷酸化并激活轉(zhuǎn)錄因子IRF3和IRF7，IRF3和IRF7形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)Ⅰ型干擾素基因的轉(zhuǎn)錄。Ⅰ型干擾素產(chǎn)生后，會(huì)與肝細(xì)胞表面的Ⅰ型干擾素受體（IFNAR）結(jié)合。IFNAR由IFNAR1和IFNAR2兩個(gè)亞基組成，與Ⅰ型干擾素結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致IFNAR1和IFNAR2發(fā)生構(gòu)象變化并二聚化，形成穩(wěn)定的跨膜蛋白復(fù)合物。這種構(gòu)象變化使得與IFNAR1結(jié)合的酪氨酸激酶2（TYK2）和與IFNAR2結(jié)合的Janus激酶1（JAK1）被激活，它們通過(guò)自身磷酸化和相互磷酸化，形成活化的激酶復(fù)合物?；罨腏AK1和TYK2會(huì)進(jìn)一步磷酸化下游的STAT1和STAT2蛋白。STAT1和STAT2在酪氨酸殘基位點(diǎn)發(fā)生磷酸化后，會(huì)從受體復(fù)合物上解離下來(lái)，并通過(guò)磷酸化的酪氨酸殘基與SH2結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，形成STAT1-STAT2異源二聚體。這個(gè)異源二聚體隨后會(huì)與干擾素調(diào)節(jié)因子9（IRF9）結(jié)合，形成干擾素刺激基因因子3（ISGF3）復(fù)合體。ISGF3復(fù)合體具有核定位信號(hào)，它會(huì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。在細(xì)胞核內(nèi)，ISGF3復(fù)合體能夠特異性地結(jié)合到干擾素刺激反應(yīng)元件（ISRE）上，ISRE廣泛存在于干擾素刺激基因（ISGs）的啟動(dòng)子區(qū)域。ISGF3與ISRE的結(jié)合會(huì)招募RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，啟動(dòng)ISGs的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。這些ISGs的產(chǎn)物具有多種抗病毒功能，如抑制病毒的復(fù)制、組裝和釋放，增強(qiáng)細(xì)胞的免疫監(jiān)視功能等，從而發(fā)揮抗病毒效應(yīng)，保護(hù)機(jī)體免受HBV的侵害。4.3.2miR146a對(duì)關(guān)鍵信號(hào)分子的作用miR146a對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素天然免疫信號(hào)