mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)大腸桿菌重組蛋白表達(dá)的影響機(jī)制與應(yīng)用研究一、引言1.1研究背景在現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域，重組蛋白表達(dá)是一項(xiàng)至關(guān)重要的技術(shù)，其在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。例如在醫(yī)藥領(lǐng)域，重組蛋白藥物如胰島素、干擾素等，為眾多疾病的治療提供了有效的手段；在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，重組蛋白可用于開(kāi)發(fā)新型的生物農(nóng)藥和生物肥料，以提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量；在工業(yè)領(lǐng)域，重組蛋白可作為生物催化劑，用于生物轉(zhuǎn)化和生物合成過(guò)程。大腸桿菌（Escherichiacoli）作為重組蛋白表達(dá)的常用宿主，具有諸多顯著優(yōu)勢(shì)。它遺傳背景清晰，人們對(duì)其基因組成、代謝途徑等方面有著深入的了解，這使得在進(jìn)行基因操作和表達(dá)調(diào)控時(shí)更加準(zhǔn)確和方便。同時(shí)，大腸桿菌生長(zhǎng)迅速，在適宜的條件下，其倍增時(shí)間短，能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的菌體，為重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。而且，大腸桿菌培養(yǎng)成本低廉，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求相對(duì)簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的培養(yǎng)基成分，這大大降低了生產(chǎn)成本，使其在工業(yè)生產(chǎn)中具有很大的優(yōu)勢(shì)。此外，大腸桿菌的操作簡(jiǎn)便，易于進(jìn)行基因工程改造，如質(zhì)粒的導(dǎo)入、基因的敲除和敲入等操作都相對(duì)容易實(shí)現(xiàn)。因此，大腸桿菌在重組蛋白表達(dá)中占據(jù)著重要地位，是目前應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)系統(tǒng)之一。在基因表達(dá)過(guò)程中，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。mRNA是由DNA轉(zhuǎn)錄而來(lái)的單鏈核酸分子，它可以通過(guò)自身堿基之間的互補(bǔ)配對(duì)形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如莖環(huán)結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。這些二級(jí)結(jié)構(gòu)并非隨機(jī)形成，而是在基因表達(dá)的各個(gè)階段發(fā)揮著重要的調(diào)控功能。在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)可以影響轉(zhuǎn)錄的起始、延伸和終止。例如，某些mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)可以與轉(zhuǎn)錄因子或RNA聚合酶相互作用，從而促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄的起始；在轉(zhuǎn)錄延伸過(guò)程中，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性會(huì)影響RNA聚合酶的移動(dòng)速度，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄的效率。在翻譯過(guò)程中，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯起始和延伸的影響更為顯著。翻譯起始是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵步驟，mRNA的5'端非翻譯區(qū)（UTR）的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響核糖體與mRNA的結(jié)合效率。如果5'UTR存在穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可能會(huì)阻礙核糖體的結(jié)合，從而降低翻譯起始的效率；相反，適當(dāng)?shù)亩?jí)結(jié)構(gòu)可能有助于核糖體的正確定位和結(jié)合，促進(jìn)翻譯起始。在翻譯延伸過(guò)程中，mRNA上的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響核糖體的移動(dòng)速度，當(dāng)核糖體遇到穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，可能會(huì)暫停移動(dòng)，等待二級(jí)結(jié)構(gòu)被解開(kāi)，這可能會(huì)導(dǎo)致翻譯的延遲甚至終止。此外，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)還與mRNA的穩(wěn)定性密切相關(guān)。一些研究表明，特定的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)可以保護(hù)mRNA免受核酸酶的降解，從而延長(zhǎng)mRNA的半衰期，增加蛋白質(zhì)的合成量；而另一些二級(jí)結(jié)構(gòu)則可能會(huì)使mRNA更容易被核酸酶識(shí)別和降解，降低蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。綜上所述，大腸桿菌在重組蛋白表達(dá)中具有不可替代的重要地位，而mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)基因表達(dá)調(diào)控起著關(guān)鍵作用。深入研究mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)大腸桿菌重組蛋白表達(dá)的影響，不僅有助于揭示基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，還能為優(yōu)化大腸桿菌重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)提供理論依據(jù)，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探討mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)大腸桿菌重組蛋白表達(dá)的影響，具體目的包括：揭示mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在大腸桿菌重組蛋白表達(dá)過(guò)程中，對(duì)轉(zhuǎn)錄起始、延伸、終止以及翻譯起始、延伸和終止等各個(gè)環(huán)節(jié)的具體作用機(jī)制；明確不同類(lèi)型和穩(wěn)定性的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與重組蛋白表達(dá)量、表達(dá)效率以及蛋白質(zhì)量之間的定量關(guān)系；探索通過(guò)人為調(diào)控mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)優(yōu)化大腸桿菌重組蛋白表達(dá)的有效策略和方法。深入研究mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)大腸桿菌重組蛋白表達(dá)的影響具有重要的理論意義。這有助于完善基因表達(dá)調(diào)控的理論體系，進(jìn)一步揭示mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在基因表達(dá)調(diào)控中的分子機(jī)制，為理解生命過(guò)程中的遺傳信息傳遞和表達(dá)調(diào)控提供新的視角和理論依據(jù)。同時(shí)，也能夠拓展對(duì)大腸桿菌重組蛋白表達(dá)機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為后續(xù)的相關(guān)研究奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。本研究成果對(duì)優(yōu)化大腸桿菌重組蛋白表達(dá)具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。在醫(yī)藥領(lǐng)域，重組蛋白藥物的研發(fā)和生產(chǎn)至關(guān)重要，通過(guò)優(yōu)化mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)提高重組蛋白表達(dá)水平和質(zhì)量，能夠降低生產(chǎn)成本，提高藥物產(chǎn)量和質(zhì)量，為患者提供更有效、更經(jīng)濟(jì)的治療藥物。在工業(yè)酶生產(chǎn)中，許多工業(yè)酶是通過(guò)大腸桿菌重組表達(dá)生產(chǎn)的，優(yōu)化mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)可以提高工業(yè)酶的表達(dá)量和活性，從而提高工業(yè)生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。在基礎(chǔ)科學(xué)研究中，大腸桿菌是常用的模式生物，研究mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響，有助于更準(zhǔn)確地進(jìn)行蛋白質(zhì)功能研究和基因操作，推動(dòng)生命科學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展。二、大腸桿菌重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)概述2.1大腸桿菌作為重組蛋白表達(dá)宿主的優(yōu)勢(shì)大腸桿菌在重組蛋白表達(dá)領(lǐng)域展現(xiàn)出眾多卓越優(yōu)勢(shì)，使其成為首選的表達(dá)宿主之一。生長(zhǎng)迅速是大腸桿菌的顯著特性。在適宜的條件下，如以葡萄糖-鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)，且環(huán)境條件達(dá)到最優(yōu)時(shí)，大腸桿菌的倍增時(shí)間僅約20分鐘。這意味著從低濃度接種開(kāi)始，短時(shí)間內(nèi)就能使菌液生長(zhǎng)至飽和狀態(tài)，如以1/100的接種比例，只需幾個(gè)小時(shí)就能實(shí)現(xiàn)?？焖俚纳L(zhǎng)速度極大地縮短了重組蛋白生產(chǎn)的周期，能夠在短時(shí)間內(nèi)積累大量的菌體，為后續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白提供了充足的細(xì)胞數(shù)量基礎(chǔ)，從而顯著提高生產(chǎn)效率，降低時(shí)間成本。大腸桿菌的培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求相對(duì)不苛刻。它能夠在多種常見(jiàn)的培養(yǎng)基中良好生長(zhǎng)，如LB培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基成分主要包括酵母粉、胰蛋白胨和氯化鈉等，來(lái)源廣泛且價(jià)格低廉。并且，大腸桿菌對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的要求也不復(fù)雜，在較為寬泛的溫度、pH值等條件范圍內(nèi)都能生長(zhǎng)。一般情況下，其適宜的培養(yǎng)溫度在37℃左右，接近人體體溫，便于實(shí)驗(yàn)操作和控制；pH值通常在7.0-7.5之間，常見(jiàn)的中性環(huán)境即可滿(mǎn)足其生長(zhǎng)需求。簡(jiǎn)單的培養(yǎng)條件使得在實(shí)驗(yàn)室研究和工業(yè)生產(chǎn)中，都能夠輕松地對(duì)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)和擴(kuò)繁，無(wú)需復(fù)雜的設(shè)備和高昂的成本投入。大腸桿菌具有清晰的遺傳背景。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究，科研人員對(duì)大腸桿菌的基因組成、遺傳調(diào)控機(jī)制、代謝途徑等方面都有了深入透徹的了解。其全基因組測(cè)序早已完成，這使得科學(xué)家能夠精確地定位和分析基因的功能、結(jié)構(gòu)以及它們之間的相互作用關(guān)系。在進(jìn)行重組蛋白表達(dá)時(shí)，可以依據(jù)對(duì)大腸桿菌遺傳背景的認(rèn)識(shí)，有針對(duì)性地對(duì)基因進(jìn)行操作和調(diào)控。例如，能夠精準(zhǔn)地選擇合適的啟動(dòng)子、終止子以及其他調(diào)控元件，確保外源基因在大腸桿菌中高效、穩(wěn)定地表達(dá)；還可以通過(guò)基因工程技術(shù)對(duì)大腸桿菌自身的基因進(jìn)行修飾，使其更有利于重組蛋白的表達(dá)和生產(chǎn)，如敲除某些可能影響重組蛋白表達(dá)的基因，或者導(dǎo)入一些有助于蛋白折疊、分泌的基因等。在研究工具方面，大腸桿菌擁有豐富的資源。在基因操作過(guò)程中，有多種高效的質(zhì)粒載體可供選擇，這些質(zhì)粒載體具有不同的特性和功能，如pET系列質(zhì)粒采用T7表達(dá)系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)外源基因表達(dá)的嚴(yán)格調(diào)控，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和目的蛋白的特點(diǎn)進(jìn)行合理選擇。同時(shí)，大腸桿菌的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，能夠高效地將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)基因的重組和表達(dá)。而且，針對(duì)大腸桿菌的各種研究方法和技術(shù)也十分成熟，如PCR技術(shù)用于基因擴(kuò)增、電泳技術(shù)用于核酸和蛋白的分離檢測(cè)、基因編輯技術(shù)如CRISPR-Cas9系統(tǒng)用于基因的精確修飾等，這些工具和技術(shù)為大腸桿菌在重組蛋白表達(dá)研究和應(yīng)用中的廣泛使用提供了有力的技術(shù)支持。綜上所述，大腸桿菌憑借生長(zhǎng)迅速、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、遺傳背景清晰以及研究工具豐富等諸多優(yōu)勢(shì)，在重組蛋白表達(dá)領(lǐng)域占據(jù)了舉足輕重的地位，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、醫(yī)藥研發(fā)、工業(yè)生產(chǎn)等多個(gè)領(lǐng)域，為重組蛋白的生產(chǎn)和應(yīng)用提供了高效、經(jīng)濟(jì)且可靠的技術(shù)平臺(tái)。2.2大腸桿菌重組蛋白表達(dá)的基本流程大腸桿菌重組蛋白表達(dá)是一個(gè)涉及多步驟的復(fù)雜過(guò)程，每個(gè)步驟都對(duì)最終重組蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量有著關(guān)鍵影響。宿主選擇是該過(guò)程的首要關(guān)鍵環(huán)節(jié)。不同的大腸桿菌菌株在重組蛋白表達(dá)方面各有特性，因此需依據(jù)目標(biāo)蛋白的特點(diǎn)進(jìn)行科學(xué)選擇。例如，BL21(DE3)菌株因其缺乏Lon蛋白酶和OmpT外膜蛋白酶，能有效減少重組蛋白的降解，故而在大多數(shù)常規(guī)重組蛋白表達(dá)中被廣泛選用；而Rosetta系列菌株，由于攜帶了額外的編碼稀有tRNA的基因，可解決因密碼子偏好導(dǎo)致的翻譯問(wèn)題，特別適用于含有稀有密碼子的基因表達(dá)。此外，Origami和OrigamiB等菌株，通過(guò)突變使細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵形成的環(huán)境得到優(yōu)化，增強(qiáng)了胞內(nèi)二硫鍵的形成能力，對(duì)于含有二硫鍵的蛋白表達(dá)具有明顯優(yōu)勢(shì)。在選擇宿主菌株時(shí)，還需考慮蛋白的毒性、分子大小、結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度等因素，確保宿主菌株能夠?yàn)橹亟M蛋白表達(dá)提供適宜的環(huán)境?；蚩寺∈菍⒛繕?biāo)基因從其原始來(lái)源中分離并擴(kuò)增，然后連接到合適的載體上的過(guò)程。首先，需從基因組DNA、cDNA文庫(kù)或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中獲取目標(biāo)基因。常用的PCR技術(shù)，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，能夠在體外高效擴(kuò)增目標(biāo)基因。擴(kuò)增后的基因需要進(jìn)行純化，以去除反應(yīng)體系中的雜質(zhì)，保證后續(xù)操作的準(zhǔn)確性。隨后，將純化后的目標(biāo)基因與經(jīng)過(guò)酶切處理的表達(dá)載體進(jìn)行連接。連接反應(yīng)通常利用DNA連接酶，將目標(biāo)基因與載體的粘性末端或平末端進(jìn)行共價(jià)連接，形成重組表達(dá)載體。在這個(gè)過(guò)程中，載體的選擇至關(guān)重要，不同的載體具有不同的特性，如pET系列載體采用T7強(qiáng)啟動(dòng)子，能實(shí)現(xiàn)高水平的蛋白表達(dá)；pGEX系列載體則可在目標(biāo)蛋白N端融合谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）標(biāo)簽，方便后續(xù)的蛋白純化。構(gòu)建好的重組表達(dá)載體需要導(dǎo)入大腸桿菌宿主細(xì)胞，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為轉(zhuǎn)化。常用的轉(zhuǎn)化方法有化學(xué)轉(zhuǎn)化法和電轉(zhuǎn)化法?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化法是利用化學(xué)試劑（如氯化鈣）處理大腸桿菌細(xì)胞，使其處于感受態(tài)，即細(xì)胞膜通透性增加，便于重組表達(dá)載體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；電轉(zhuǎn)化法則是通過(guò)高壓電脈沖在細(xì)胞膜上形成小孔，促使重組表達(dá)載體進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞需涂布在含有相應(yīng)抗生素的固體培養(yǎng)基平板上，以篩選出成功轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性克隆?？股氐倪x擇依據(jù)載體上攜帶的抗性基因，如pET系列載體常攜帶氨芐青霉素抗性基因，因此在平板中添加氨芐青霉素，只有成功轉(zhuǎn)化了重組表達(dá)載體的大腸桿菌才能在平板上生長(zhǎng)形成菌落。表達(dá)條件優(yōu)化是提高重組蛋白表達(dá)量和質(zhì)量的重要步驟。誘導(dǎo)劑濃度對(duì)蛋白表達(dá)影響顯著，以常用的IPTG誘導(dǎo)系統(tǒng)為例，對(duì)于某些重組蛋白，低濃度的IPTG（如0.1mM）可能就足以誘導(dǎo)高效表達(dá)，且能減少包涵體的形成；而對(duì)于另一些蛋白，可能需要較高濃度的IPTG（如1mM）才能達(dá)到最佳表達(dá)效果。溫度也是關(guān)鍵因素之一，一般大腸桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為37℃，但在表達(dá)重組蛋白時(shí)，較低的溫度（如25℃）可能更有利于蛋白的正確折疊和可溶性表達(dá)，這是因?yàn)榈蜏乜山档偷鞍缀铣伤俣?，使蛋白有更充足的時(shí)間進(jìn)行正確折疊，減少因疏水相互作用導(dǎo)致的蛋白聚集；然而，對(duì)于某些特殊蛋白，高溫誘導(dǎo)（如42℃）可能會(huì)激活熱休克蛋白等分子伴侶，促進(jìn)蛋白的正確折疊和表達(dá)。此外，誘導(dǎo)時(shí)間也需要優(yōu)化，不同的重組蛋白在誘導(dǎo)后達(dá)到最大表達(dá)量的時(shí)間不同，通常在誘導(dǎo)后3-24小時(shí)之間，需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。表達(dá)結(jié)果驗(yàn)證是確保重組蛋白表達(dá)成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。首先可采用SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）技術(shù)，該技術(shù)根據(jù)蛋白分子量大小對(duì)蛋白進(jìn)行分離，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白Marker對(duì)比，能夠直觀地檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況，判斷其分子量是否與預(yù)期一致，以及表達(dá)量的高低；進(jìn)一步可使用Westernblot技術(shù)，利用特異性抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合，通過(guò)顯色或發(fā)光反應(yīng)，不僅能確認(rèn)重組蛋白的表達(dá)，還能檢測(cè)其純度和特異性，排除雜蛋白的干擾；對(duì)于具有生物活性的重組蛋白，還需進(jìn)行活性測(cè)定，如酶活性檢測(cè)、免疫活性檢測(cè)等，以確定重組蛋白是否具有預(yù)期的生物學(xué)功能，滿(mǎn)足后續(xù)應(yīng)用的需求。綜上所述，大腸桿菌重組蛋白表達(dá)的基本流程涵蓋了從宿主選擇到表達(dá)結(jié)果驗(yàn)證的多個(gè)步驟，每個(gè)步驟都需要精心設(shè)計(jì)和嚴(yán)格操作，通過(guò)優(yōu)化各個(gè)環(huán)節(jié)，才能實(shí)現(xiàn)重組蛋白的高效、高質(zhì)量表達(dá)，滿(mǎn)足不同領(lǐng)域?qū)χ亟M蛋白的需求。2.3影響大腸桿菌重組蛋白表達(dá)的其他因素除了mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，還有諸多因素對(duì)大腸桿菌重組蛋白表達(dá)有著顯著影響，這些因素與mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)相互關(guān)聯(lián)，共同決定著重組蛋白表達(dá)的效率和質(zhì)量。蛋白毒性是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中常見(jiàn)的挑戰(zhàn)之一。某些重組蛋白對(duì)宿主細(xì)胞具有毒性，當(dāng)它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，會(huì)干擾宿主細(xì)胞的正常生理過(guò)程。例如，核糖核酸酶能夠切割mRNA翻譯起始位點(diǎn)，從而阻礙蛋白質(zhì)的正常合成；DNA結(jié)合蛋白CENP-B會(huì)與細(xì)胞內(nèi)的DNA相互作用，影響基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制等過(guò)程；一些膜蛋白在過(guò)表達(dá)時(shí)，會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受限甚至死亡。當(dāng)宿主細(xì)胞受到毒性蛋白的影響時(shí)，其生長(zhǎng)速度會(huì)明顯減慢，甚至停止生長(zhǎng)，這將直接導(dǎo)致重組蛋白的表達(dá)量降低。為解決蛋白毒性問(wèn)題，常采用工程改造菌株的方法，如BL21（DE3）pLysS和pLysE等菌株攜帶T7RNAP抑制劑溶菌酶，在誘導(dǎo)前可降低T7啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度，從而減少毒性蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)，在誘導(dǎo)后再提高表達(dá)水平，確保在宿主細(xì)胞死亡前獲得足夠的目標(biāo)蛋白；也可將信號(hào)肽融合到目標(biāo)蛋白的N端，利用大腸桿菌的Ⅱ型分泌途徑，如Sec依賴(lài)性通路、信號(hào)識(shí)別顆粒（SRP）通路和雙精氨酸易位（TAT）通路，將目標(biāo)蛋白分泌到細(xì)胞外，避免對(duì)細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)造成破壞?；蛐蛄袑?duì)重組蛋白表達(dá)的影響不容忽視，其中密碼子偏好是關(guān)鍵因素之一。不同生物對(duì)密碼子的使用存在偏好，當(dāng)外源基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，如果mRNA中的密碼子不被大腸桿菌的tRNA有效識(shí)別，就會(huì)導(dǎo)致翻譯過(guò)程出現(xiàn)障礙。例如，某些稀有密碼子對(duì)應(yīng)的帶電tRNA在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的濃度較低，在翻譯時(shí)，核糖體可能會(huì)在這些稀有密碼子處減慢或暫停，甚至出現(xiàn)翻譯中斷、提前終止、移碼或氨基酸錯(cuò)誤摻入等情況，嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)表達(dá)的數(shù)量和質(zhì)量。為克服密碼子偏好問(wèn)題，早期研究主要對(duì)密碼子頻率和適應(yīng)指數(shù)（CAI）進(jìn)行優(yōu)化，隨著研究的深入，開(kāi)始考慮優(yōu)化更全面的參數(shù)，如tRNA適應(yīng)指數(shù)（tAI）和歸一翻譯效率（nTE）等，同時(shí)還開(kāi)發(fā)出一系列實(shí)用工具用于基因序列的優(yōu)化，以提高重組蛋白的表達(dá)水平。表達(dá)載體作為實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的關(guān)鍵工具，其元件組成和特性對(duì)重組蛋白表達(dá)起著至關(guān)重要的作用。啟動(dòng)子是表達(dá)載體的核心元件之一，它控制著轉(zhuǎn)錄的起始。不同的啟動(dòng)子具有不同的轉(zhuǎn)錄活性和調(diào)控特性，如lac、tac、trc等啟動(dòng)子在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中較為常用。理想的啟動(dòng)子應(yīng)具備強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄活性，以確保目的蛋白的高效積累，同時(shí)還需具備嚴(yán)格的調(diào)控能力，防止產(chǎn)物毒性對(duì)宿主細(xì)胞造成損害。例如，在表達(dá)毒性蛋白時(shí)，可選用可嚴(yán)格調(diào)控的啟動(dòng)子，在細(xì)胞生長(zhǎng)初期抑制蛋白表達(dá)，待細(xì)胞生長(zhǎng)到一定階段再誘導(dǎo)表達(dá)，從而減少毒性蛋白對(duì)細(xì)胞的影響。此外，表達(dá)載體上的其他元件，如終止子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）等，也會(huì)影響重組蛋白的表達(dá)。終止子能夠確保轉(zhuǎn)錄過(guò)程的準(zhǔn)確終止，防止轉(zhuǎn)錄通讀；RBS的序列和結(jié)構(gòu)會(huì)影響核糖體與mRNA的結(jié)合效率，進(jìn)而影響翻譯起始的效率。培養(yǎng)條件的優(yōu)化也是提高重組蛋白表達(dá)的重要環(huán)節(jié)。培養(yǎng)基成分對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)和重組蛋白表達(dá)有著顯著影響，由于大腸桿菌的二階段生長(zhǎng)特性，葡萄糖的存在會(huì)抑制乳糖操縱子的表達(dá)，即“代謝物阻遏”現(xiàn)象。在誘導(dǎo)前添加適量葡萄糖可有效抑制基礎(chǔ)表達(dá)，減少毒性蛋白對(duì)細(xì)胞的損害；而在誘導(dǎo)時(shí)，合理調(diào)整碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等成分的比例，能夠?yàn)榇竽c桿菌的生長(zhǎng)和重組蛋白表達(dá)提供適宜的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。溫度對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)、質(zhì)粒穩(wěn)定性、重組蛋白表達(dá)速度及蛋白質(zhì)折疊效率等都有顯著影響。大腸桿菌的最佳培養(yǎng)溫度一般為37℃，但在表達(dá)重組蛋白時(shí)，較低溫度（如25℃）通常有助于減少蛋白聚集，提高可溶性蛋白的比例，因?yàn)榈蜏乜山档褪杷嗷プ饔?，抑制蛋白聚集反?yīng)；然而，對(duì)于某些蛋白，高溫或熱休克處理在誘導(dǎo)前進(jìn)行，可通過(guò)激活熱休克蛋白等機(jī)制，提高蛋白的溶解度，避免其進(jìn)入包涵體。此外，誘導(dǎo)時(shí)的細(xì)菌生長(zhǎng)階段也會(huì)影響蛋白表達(dá)，在早對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期誘導(dǎo)，通?？色@得較高的蛋白產(chǎn)量和活性，同時(shí)降低內(nèi)源性蛋白的干擾，有利于蛋白純化；但在某些情況下，晚對(duì)數(shù)期或穩(wěn)定期誘導(dǎo)可能對(duì)特定蛋白的表達(dá)更為有利，如對(duì)于對(duì)宿主細(xì)胞有毒性的蛋白。綜上所述，蛋白毒性、基因序列、表達(dá)載體和培養(yǎng)條件等因素與mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)相互作用，共同影響著大腸桿菌重組蛋白的表達(dá)。在實(shí)際研究和生產(chǎn)中，需要綜合考慮這些因素，通過(guò)優(yōu)化各個(gè)環(huán)節(jié)，實(shí)現(xiàn)重組蛋白的高效、高質(zhì)量表達(dá)。三、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)理論與研究方法3.1mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成原理與特點(diǎn)mRNA作為一種單鏈核酸分子，其二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成主要依賴(lài)于堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。在mRNA鏈中，存在著四種堿基，分別是腺嘌呤（A）、尿嘧啶（U）、鳥(niǎo)嘌呤（G）和胞嘧啶（C）。其中，A與U之間可以形成兩個(gè)氫鍵，G與C之間能夠形成三個(gè)氫鍵。這些堿基之間的互補(bǔ)配對(duì)作用促使mRNA鏈發(fā)生折疊，進(jìn)而形成各種穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。莖環(huán)結(jié)構(gòu)是mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中較為常見(jiàn)的一種形式。當(dāng)mRNA鏈中的一段序列與相鄰的互補(bǔ)序列發(fā)生堿基配對(duì)時(shí)，就會(huì)形成一個(gè)雙鏈區(qū)域，即莖部；而在莖部的兩端，未配對(duì)的堿基則會(huì)形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這便是環(huán)部。例如，若mRNA鏈上存在一段序列5'-ACGUUCGA-3'，其中的A與U、C與G可以互補(bǔ)配對(duì)，從而使該序列形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，位置2-8的核苷酸（CGUUCGA）之間的堿基配對(duì)形成莖區(qū)域，位置1和位置9的未配對(duì)核苷酸（分別為A和A）則形成環(huán)狀區(qū)域。這種莖環(huán)結(jié)構(gòu)在mRNA中具有多種生物學(xué)功能，如在基因表達(dá)調(diào)控方面，它可以充當(dāng)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，當(dāng)RNA聚合酶遇到莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，可能會(huì)停止轉(zhuǎn)錄，從而阻止全長(zhǎng)RNA分子的合成；在翻譯過(guò)程中，mRNA5'非翻譯區(qū)（UTR）中的莖環(huán)結(jié)構(gòu)可以通過(guò)隔離核糖體結(jié)合位點(diǎn)，阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，進(jìn)而影響翻譯起始的效率。發(fā)夾結(jié)構(gòu)與莖環(huán)結(jié)構(gòu)類(lèi)似，也是由mRNA鏈自身折疊形成。當(dāng)mRNA鏈上一段較短的反向互補(bǔ)序列進(jìn)行堿基配對(duì)時(shí)，就會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)同樣在mRNA的功能中發(fā)揮著重要作用，比如某些mRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以與特定的蛋白質(zhì)相互作用，通過(guò)這種相互作用來(lái)調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性、翻譯效率等。mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)并非固定不變，而是具有動(dòng)態(tài)變化的特性。mRNA分子在細(xì)胞內(nèi)處于復(fù)雜的環(huán)境中，受到多種因素的影響，其二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)不斷發(fā)生改變。從時(shí)間維度來(lái)看，在mRNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，隨著RNA聚合酶沿著DNA模板移動(dòng)，新合成的mRNA鏈會(huì)逐漸折疊形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，這個(gè)過(guò)程是動(dòng)態(tài)進(jìn)行的，不同轉(zhuǎn)錄階段的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)可能存在差異。從空間角度分析，mRNA在細(xì)胞內(nèi)的不同區(qū)域，由于離子濃度、蛋白質(zhì)結(jié)合等環(huán)境因素的不同，其二級(jí)結(jié)構(gòu)也會(huì)有所變化。例如，在核糖體附近，mRNA與核糖體結(jié)合進(jìn)行翻譯時(shí)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)調(diào)整，以適應(yīng)翻譯過(guò)程的需要。此外，溫度、pH值等環(huán)境因素的變化也會(huì)對(duì)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。當(dāng)溫度升高時(shí)，分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，可能會(huì)破壞mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中的氫鍵，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的解折疊；而pH值的改變則可能影響堿基的質(zhì)子化狀態(tài)，進(jìn)而改變堿基之間的相互作用，使mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)還具有多樣性的特點(diǎn)。不同基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA，由于其堿基序列的差異，會(huì)形成各不相同的二級(jí)結(jié)構(gòu)。即使是同一mRNA分子，在不同的條件下，也可能形成多種不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象，這些構(gòu)象之間處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。這種多樣性為mRNA行使各種復(fù)雜的生物學(xué)功能提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)可以與不同的蛋白質(zhì)、小分子等相互作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控。3.2mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)與測(cè)定方法在mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究中，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)和測(cè)定其結(jié)構(gòu)是深入探究其對(duì)大腸桿菌重組蛋白表達(dá)影響的關(guān)鍵前提。目前，已發(fā)展出多種預(yù)測(cè)與測(cè)定方法，這些方法各有特點(diǎn)，從不同角度為mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究提供了有力支持。自由能最小化方法是一種經(jīng)典的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法，其核心原理基于熱力學(xué)理論。該方法認(rèn)為，mRNA分子在自然狀態(tài)下會(huì)傾向于形成自由能最低的結(jié)構(gòu)，因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定。在實(shí)際計(jì)算過(guò)程中，會(huì)根據(jù)堿基配對(duì)規(guī)則以及各種堿基對(duì)之間的相互作用能量參數(shù)，通過(guò)動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法等計(jì)算手段，搜索出自由能最小的二級(jí)結(jié)構(gòu)。例如，ViennaRNAfold軟件就是基于自由能最小化原理開(kāi)發(fā)的，它在預(yù)測(cè)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)方面得到了廣泛應(yīng)用。這種方法的優(yōu)勢(shì)在于理論基礎(chǔ)堅(jiān)實(shí)，計(jì)算過(guò)程相對(duì)較為成熟，能夠快速給出一個(gè)較為穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果；然而，其局限性也較為明顯，它僅考慮了熱力學(xué)因素，而忽略了生物學(xué)環(huán)境中其他因素對(duì)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，如與蛋白質(zhì)的相互作用等，這可能導(dǎo)致預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際結(jié)構(gòu)存在一定偏差。次優(yōu)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法則是對(duì)自由能最小化方法的補(bǔ)充。由于mRNA分子可能存在多種亞穩(wěn)定狀態(tài)，僅僅預(yù)測(cè)自由能最小的結(jié)構(gòu)并不能全面反映其真實(shí)的結(jié)構(gòu)情況。次優(yōu)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法通過(guò)搜索自由能接近最小值的一系列結(jié)構(gòu)，來(lái)更全面地展示mRNA可能形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)。例如，CentroidFold算法在預(yù)測(cè)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，不僅考慮了自由能最小的結(jié)構(gòu)，還通過(guò)計(jì)算結(jié)構(gòu)的質(zhì)心等參數(shù)，搜索出一系列次優(yōu)結(jié)構(gòu)。這種方法能夠提供更多關(guān)于mRNA結(jié)構(gòu)多樣性的信息，有助于更深入地理解mRNA的功能；但它也存在計(jì)算復(fù)雜度較高的問(wèn)題，隨著mRNA序列長(zhǎng)度的增加，搜索次優(yōu)結(jié)構(gòu)的計(jì)算量會(huì)迅速增大。堿基配對(duì)概率預(yù)測(cè)方法從概率的角度來(lái)描述mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。該方法通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析或基于熱力學(xué)模型的計(jì)算，預(yù)測(cè)mRNA序列中每個(gè)堿基與其他堿基配對(duì)的概率。例如，RNAstructure軟件可以輸出每個(gè)堿基的配對(duì)概率，通過(guò)這些概率信息，可以構(gòu)建出堿基配對(duì)概率矩陣，進(jìn)而直觀地展示mRNA序列中潛在的堿基配對(duì)情況。這種方法能夠提供關(guān)于mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的概率性描述，更符合mRNA在實(shí)際生物環(huán)境中結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化的特點(diǎn)；但它對(duì)于具體結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)相對(duì)較為模糊，不能像自由能最小化方法那樣直接給出明確的二級(jí)結(jié)構(gòu)模型。RNA結(jié)構(gòu)平行分析（PARS）圖譜是一種實(shí)驗(yàn)測(cè)定mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法。其原理是利用核酸酶對(duì)單鏈和雙鏈RNA的不同切割特性，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，分析mRNA分子在核酸酶作用下的切割位點(diǎn)，從而推斷出mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將mRNA分子與核酸酶孵育，核酸酶會(huì)優(yōu)先切割單鏈區(qū)域，然后對(duì)切割后的片段進(jìn)行高通量測(cè)序，通過(guò)分析測(cè)序數(shù)據(jù)中切割位點(diǎn)的分布情況，就可以繪制出PARS圖譜，直觀地展示mRNA的單鏈和雙鏈區(qū)域。PARS圖譜能夠在接近生理?xiàng)l件下測(cè)定mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果更接近mRNA在細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)結(jié)構(gòu)狀態(tài)；但該方法實(shí)驗(yàn)操作較為復(fù)雜，需要一定的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和設(shè)備支持，且數(shù)據(jù)分析也相對(duì)繁瑣?；瘜W(xué)修飾探測(cè)方法是利用化學(xué)試劑與mRNA分子中不同結(jié)構(gòu)區(qū)域的特異性反應(yīng)來(lái)探測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)。例如，DMS（二***亞砜）等化學(xué)試劑能夠特異性地修飾單鏈區(qū)域的腺嘌呤和胞嘧啶，而不修飾雙鏈區(qū)域。在實(shí)驗(yàn)中，將mRNA分子與化學(xué)試劑反應(yīng)后，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄和測(cè)序技術(shù)，分析修飾位點(diǎn)在mRNA序列中的分布情況，從而推斷出mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。這種方法能夠提供高分辨率的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，對(duì)于研究mRNA結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)具有重要意義；但它也存在一定的局限性，某些化學(xué)修飾反應(yīng)可能會(huì)受到mRNA序列背景等因素的影響，導(dǎo)致結(jié)果的準(zhǔn)確性受到一定挑戰(zhàn)。冷凍電子顯微鏡（Cryo-EM）技術(shù)近年來(lái)在RNA結(jié)構(gòu)研究中取得了顯著進(jìn)展，為mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定提供了新的手段。該技術(shù)通過(guò)將樣品快速冷凍在液氮溫度下，使mRNA分子保持其天然的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，然后利用電子顯微鏡對(duì)冷凍樣品進(jìn)行成像，再通過(guò)圖像處理和三維重構(gòu)算法，解析出mRNA的三維結(jié)構(gòu)，其中包含了二級(jí)結(jié)構(gòu)信息。Cryo-EM技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于能夠直接觀察到mRNA分子的真實(shí)結(jié)構(gòu)，無(wú)需依賴(lài)于預(yù)測(cè)模型，且可以在接近生理?xiàng)l件下進(jìn)行測(cè)定；然而，該技術(shù)設(shè)備昂貴，樣品制備和數(shù)據(jù)處理過(guò)程復(fù)雜，對(duì)操作人員的技術(shù)要求也很高，目前在mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用還受到一定限制。隨著人工智能技術(shù)的快速發(fā)展，利用人工智能預(yù)測(cè)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)成為了研究的熱點(diǎn)。深度學(xué)習(xí)模型如循環(huán)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（RNN）、卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）及其變體等被廣泛應(yīng)用于mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。這些模型通過(guò)對(duì)大量已知mRNA序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的學(xué)能夠自動(dòng)提取序列中的特征信息，并建立起序列與結(jié)構(gòu)之間的映射關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。例如，UFold模型采用了類(lèi)似圖像的RNA序列表示形式，通過(guò)全卷積網(wǎng)絡(luò)（FCN）進(jìn)行處理，在RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中表現(xiàn)出了良好的性能，能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)假結(jié)等復(fù)雜結(jié)構(gòu)。人工智能預(yù)測(cè)方法具有強(qiáng)大的學(xué)和泛化能力，能夠處理復(fù)雜的非線性關(guān)系，在預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性和速度方面都有很大的潛力；但它也面臨著訓(xùn)練數(shù)據(jù)質(zhì)量和數(shù)量的限制，以及模型可解釋性較差等問(wèn)題。綜上所述，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)與測(cè)定方法各有優(yōu)劣，在實(shí)際研究中，通常需要結(jié)合多種方法，相互驗(yàn)證和補(bǔ)充，以更準(zhǔn)確地揭示mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的奧秘，為深入研究其對(duì)大腸桿菌重組蛋白表達(dá)的影響提供堅(jiān)實(shí)的技術(shù)支撐。四、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)大腸桿菌重組蛋白表達(dá)的影響機(jī)制4.1對(duì)翻譯起始的影響4.1.1起始密碼子附近二級(jí)結(jié)構(gòu)的阻礙作用翻譯起始是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵起始步驟，而mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在這一過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色，尤其是起始密碼子附近的二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)翻譯起始有著顯著的影響。在大腸桿菌中，翻譯起始需要核糖體小亞基、mRNA、起始tRNA以及多種翻譯起始因子的協(xié)同作用。當(dāng)起始密碼子附近存在穩(wěn)定的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，會(huì)對(duì)核糖體與mRNA的結(jié)合產(chǎn)生阻礙，進(jìn)而抑制翻譯起始。核糖體小亞基需要準(zhǔn)確識(shí)別并結(jié)合到mRNA的起始密碼子上，才能啟動(dòng)翻譯過(guò)程。然而，起始密碼子附近的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，如莖環(huán)結(jié)構(gòu)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，會(huì)在空間上形成物理障礙，阻止核糖體小亞基的順利結(jié)合。這種阻礙作用的強(qiáng)弱與二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性密切相關(guān)。一般來(lái)說(shuō)，二級(jí)結(jié)構(gòu)中堿基配對(duì)的數(shù)量越多、GC含量越高，其穩(wěn)定性就越強(qiáng)，對(duì)核糖體結(jié)合的阻礙作用也就越大。研究表明，當(dāng)mRNA的5'端非翻譯區(qū)（UTR）形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且該結(jié)構(gòu)靠近起始密碼子時(shí)，核糖體小亞基結(jié)合到mRNA上的效率會(huì)顯著降低，導(dǎo)致翻譯起始受到抑制，最終影響重組蛋白的表達(dá)水平。在綠色熒光蛋白（GFP）基因在大腸桿菌中的表達(dá)研究中，通過(guò)對(duì)其mRNA序列進(jìn)行改造，在起始密碼子附近引入了穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，與未改造的對(duì)照組相比，含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)組中，核糖體與mRNA的結(jié)合效率明顯下降，GFP的表達(dá)量大幅降低，熒光強(qiáng)度顯著減弱。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀地證明了起始密碼子附近穩(wěn)定的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，從而抑制翻譯起始，進(jìn)而影響重組蛋白的表達(dá)。4.1.25'UTR區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯起始的調(diào)控5'非翻譯區(qū)（UTR）是mRNA分子中位于起始密碼子之前的一段序列，其二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯起始有著復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控作用。5'UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要通過(guò)影響核糖體掃描、招募翻譯起始因子等方式，來(lái)調(diào)控翻譯起始過(guò)程。核糖體在翻譯起始時(shí)，需要從mRNA的5'端開(kāi)始，沿著mRNA進(jìn)行掃描，尋找起始密碼子AUG。5'UTR中的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響核糖體的掃描進(jìn)程。當(dāng)5'UTR存在穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，核糖體在掃描過(guò)程中遇到這些結(jié)構(gòu)時(shí)，可能會(huì)暫?；蛲瑢?dǎo)致掃描速度減慢，甚至無(wú)法順利找到起始密碼子，從而降低翻譯起始的效率。研究發(fā)現(xiàn)，在某些基因的5'UTR中，若存在富含GC堿基對(duì)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，核糖體在掃描經(jīng)過(guò)該區(qū)域時(shí)，會(huì)花費(fèi)更多的時(shí)間來(lái)解開(kāi)二級(jí)結(jié)構(gòu)，這使得核糖體到達(dá)起始密碼子的時(shí)間延遲，進(jìn)而影響翻譯起始的速率。5'UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)還可以通過(guò)與翻譯起始因子的相互作用，來(lái)調(diào)控翻譯起始。翻譯起始因子在翻譯起始過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，它們參與核糖體的組裝、mRNA的識(shí)別以及起始密碼子的定位等步驟。5'UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)可以與某些翻譯起始因子結(jié)合，改變其構(gòu)象或活性，從而影響翻譯起始因子與核糖體、mRNA之間的相互作用。例如，一些翻譯起始因子能夠識(shí)別并結(jié)合到5'UTR的特定二級(jí)結(jié)構(gòu)上，當(dāng)它們結(jié)合后，可能會(huì)促進(jìn)核糖體與mRNA的結(jié)合，增強(qiáng)翻譯起始的效率；相反，某些情況下，5'UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)與翻譯起始因子的結(jié)合可能會(huì)阻礙核糖體的結(jié)合，抑制翻譯起始。在大腸桿菌中，起始因子IF3與5'UTR的相互作用就受到二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。當(dāng)5'UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)不利于IF3的結(jié)合時(shí)，IF3與核糖體小亞基的結(jié)合能力會(huì)下降，從而影響核糖體小亞基與mRNA的正確組裝，進(jìn)而抑制翻譯起始。5'UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)還可以通過(guò)與其他RNA結(jié)合蛋白的相互作用，間接調(diào)控翻譯起始。這些RNA結(jié)合蛋白可以與5'UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，該復(fù)合物可以進(jìn)一步影響核糖體的掃描、翻譯起始因子的招募等過(guò)程。例如，在某些細(xì)菌中，5'UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)可以與CsrA蛋白結(jié)合，形成的復(fù)合物會(huì)改變mRNA的構(gòu)象，使核糖體結(jié)合位點(diǎn)被遮蔽，從而抑制翻譯起始；而在另一些情況下，RNA結(jié)合蛋白與5'UTR二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)合可能會(huì)促進(jìn)mRNA的環(huán)化，有利于核糖體與起始密碼子的結(jié)合，促進(jìn)翻譯起始。5'UTR區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)多種方式對(duì)翻譯起始進(jìn)行調(diào)控，這些調(diào)控機(jī)制相互作用，共同影響著大腸桿菌重組蛋白表達(dá)的起始效率，對(duì)最終的重組蛋白表達(dá)水平有著重要影響。4.2對(duì)翻譯延伸的影響4.2.1密碼子與mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用在大腸桿菌重組蛋白表達(dá)過(guò)程中，密碼子使用頻率與mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)并非獨(dú)立發(fā)揮作用，而是存在著緊密的協(xié)同關(guān)系，共同對(duì)翻譯延伸速率產(chǎn)生影響。密碼子使用頻率是指不同密碼子在基因編碼序列中出現(xiàn)的相對(duì)頻率，由于不同生物體內(nèi)tRNA的豐度存在差異，導(dǎo)致它們對(duì)密碼子的偏好性不同。在大腸桿菌中，當(dāng)mRNA上的密碼子與細(xì)胞內(nèi)高豐度的tRNA匹配良好時(shí)，翻譯過(guò)程能夠順利進(jìn)行，核糖體可以快速地將氨基酸添加到新生肽鏈上，翻譯延伸速率較高；然而，當(dāng)mRNA中出現(xiàn)稀有密碼子時(shí)，由于對(duì)應(yīng)的tRNA在細(xì)胞內(nèi)的含量較低，核糖體在翻譯到這些稀有密碼子時(shí)，需要花費(fèi)更多的時(shí)間來(lái)等待與之匹配的tRNA，這就會(huì)導(dǎo)致核糖體暫停，翻譯延伸速率減慢。mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯延伸也有著重要影響。當(dāng)核糖體在mRNA上移動(dòng)進(jìn)行翻譯延伸時(shí)，遇到穩(wěn)定的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，如莖環(huán)結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等，會(huì)面臨物理阻礙。這些二級(jí)結(jié)構(gòu)需要核糖體消耗額外的能量來(lái)解開(kāi)，才能繼續(xù)沿著mRNA移動(dòng)，從而導(dǎo)致核糖體暫停，翻譯延伸過(guò)程受阻。研究表明，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與堿基配對(duì)的數(shù)量、GC含量等因素密切相關(guān)，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，對(duì)核糖體移動(dòng)的阻礙作用就越強(qiáng)，翻譯延伸的暫停時(shí)間也就越長(zhǎng)。密碼子使用頻率與mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的協(xié)同作用進(jìn)一步影響著翻譯延伸。當(dāng)稀有密碼子與特定的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)合時(shí)，會(huì)加劇核糖體的暫停現(xiàn)象。例如，在某些mRNA序列中，稀有密碼子恰好位于穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)附近，核糖體在遇到稀有密碼子暫停的同時(shí)，還需要克服莖環(huán)結(jié)構(gòu)的阻礙，這使得核糖體暫停的時(shí)間顯著延長(zhǎng)，嚴(yán)重影響翻譯延伸的效率。在一項(xiàng)關(guān)于綠色熒光蛋白（GFP）在大腸桿菌中表達(dá)的研究中，通過(guò)對(duì)GFP基因的mRNA序列進(jìn)行改造，在含有稀有密碼子的區(qū)域引入穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未改造的對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中核糖體在該區(qū)域的暫停頻率明顯增加，GFP的表達(dá)量顯著降低，熒光強(qiáng)度也明顯減弱。這充分說(shuō)明了密碼子與mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用對(duì)翻譯延伸的重要影響，當(dāng)兩者共同作用阻礙翻譯延伸時(shí)，會(huì)導(dǎo)致重組蛋白表達(dá)水平下降。4.2.2二級(jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的核糖體暫停與蛋白錯(cuò)誤折疊mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)引起的核糖體暫停，是導(dǎo)致新生肽鏈錯(cuò)誤折疊的重要因素之一，進(jìn)而對(duì)重組蛋白的表達(dá)和活性產(chǎn)生負(fù)面影響。在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中，核糖體沿著mRNA移動(dòng)，將氨基酸依次連接形成新生肽鏈。當(dāng)核糖體遇到mRNA上穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，會(huì)發(fā)生暫停，這使得新生肽鏈的延伸暫時(shí)中斷。在暫停期間，已經(jīng)合成的部分新生肽鏈會(huì)暴露在細(xì)胞環(huán)境中，由于缺乏核糖體的保護(hù)和正確的折疊引導(dǎo)，這些暴露的肽鏈容易發(fā)生錯(cuò)誤折疊。新生肽鏈的錯(cuò)誤折疊可能會(huì)導(dǎo)致多種不良后果。錯(cuò)誤折疊的肽鏈可能會(huì)形成異常的構(gòu)象，無(wú)法正確行使其生物學(xué)功能，從而降低重組蛋白的活性。錯(cuò)誤折疊的肽鏈之間還可能發(fā)生相互作用，形成聚集物，如包涵體。包涵體的形成不僅會(huì)降低重組蛋白的可溶性表達(dá)量，還會(huì)增加后續(xù)蛋白純化的難度，因?yàn)榘w中的蛋白需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的變性和復(fù)性過(guò)程才能恢復(fù)活性，而這個(gè)過(guò)程往往會(huì)導(dǎo)致蛋白的損失和活性降低。mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的核糖體暫停還可能影響蛋白質(zhì)合成的準(zhǔn)確性。長(zhǎng)時(shí)間的核糖體暫停可能會(huì)導(dǎo)致核糖體與mRNA之間的相互作用發(fā)生改變，增加翻譯錯(cuò)誤的概率，如氨基酸錯(cuò)配、移碼突變等。這些翻譯錯(cuò)誤會(huì)進(jìn)一步影響重組蛋白的質(zhì)量和功能，使其無(wú)法滿(mǎn)足實(shí)際應(yīng)用的需求。在大腸桿菌表達(dá)重組人胰島素的研究中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)mRNA的5'端非翻譯區(qū)（UTR）存在穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，核糖體在翻譯起始和延伸過(guò)程中頻繁暫停，導(dǎo)致新生的胰島素肽鏈錯(cuò)誤折疊，形成大量的包涵體，胰島素的活性也顯著降低。通過(guò)對(duì)mRNA序列進(jìn)行優(yōu)化，減少二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，核糖體暫?，F(xiàn)象明顯減少，胰島素的可溶性表達(dá)量提高，活性也得到了顯著改善。這一研究實(shí)例充分表明，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)引起的核糖體暫停會(huì)導(dǎo)致新生肽鏈錯(cuò)誤折疊，進(jìn)而影響重組蛋白的表達(dá)和活性，在大腸桿菌重組蛋白表達(dá)過(guò)程中，需要關(guān)注mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)核糖體的影響，采取有效措施減少核糖體暫停，以提高重組蛋白的表達(dá)質(zhì)量。4.3對(duì)mRNA穩(wěn)定性的影響4.3.1二級(jí)結(jié)構(gòu)與mRNA半衰期的關(guān)系mRNA的穩(wěn)定性是影響大腸桿菌重組蛋白表達(dá)的重要因素之一，而mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在其中起著關(guān)鍵作用，它主要通過(guò)影響mRNA被核酸酶降解的敏感性，進(jìn)而對(duì)mRNA半衰期產(chǎn)生影響。核酸酶是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一類(lèi)酶，它們能夠識(shí)別并切割RNA分子中的磷酸二酯鍵，導(dǎo)致mRNA的降解。mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的存在改變了mRNA分子的空間構(gòu)象，這種構(gòu)象變化影響了核酸酶與mRNA的相互作用，從而改變了mRNA對(duì)核酸酶降解的敏感性。當(dāng)mRNA形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，如莖環(huán)結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等，這些結(jié)構(gòu)會(huì)在空間上形成一種保護(hù)屏障，阻礙核酸酶與mRNA的結(jié)合。由于核酸酶無(wú)法有效接觸到mRNA分子，從而降低了mRNA被降解的速率，使得mRNA的半衰期延長(zhǎng)。例如，在大腸桿菌中，某些mRNA的5'端非翻譯區(qū)（UTR）形成的穩(wěn)定莖環(huán)結(jié)構(gòu)，能夠保護(hù)mRNA免受核酸酶的攻擊，使得mRNA在細(xì)胞內(nèi)的存在時(shí)間延長(zhǎng)，從而為重組蛋白的表達(dá)提供了更持久的模板。研究表明，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與堿基配對(duì)的強(qiáng)度和數(shù)量密切相關(guān)。在二級(jí)結(jié)構(gòu)中，GC堿基對(duì)之間形成三個(gè)氫鍵，相比AT堿基對(duì)（在RNA中為AU堿基對(duì)，形成兩個(gè)氫鍵）具有更強(qiáng)的相互作用，因此含有較高GC含量的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)通常更為穩(wěn)定。當(dāng)mRNA的某個(gè)區(qū)域形成富含GC堿基對(duì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，該結(jié)構(gòu)能夠抵抗核酸酶的作用，使得mRNA在細(xì)胞內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，進(jìn)而延長(zhǎng)mRNA的半衰期。相反，當(dāng)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定或缺乏二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，mRNA更容易被核酸酶識(shí)別和降解。沒(méi)有穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的保護(hù)，mRNA分子的磷酸二酯鍵更容易暴露在核酸酶的作用范圍內(nèi)，核酸酶能夠迅速結(jié)合并切割mRNA，導(dǎo)致其半衰期縮短。在某些情況下，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞可能是由于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化，如溫度、離子濃度等因素的改變，這些變化會(huì)影響堿基之間的氫鍵作用，使二級(jí)結(jié)構(gòu)解折疊，從而增加了mRNA被核酸酶降解的風(fēng)險(xiǎn)。在一項(xiàng)關(guān)于大腸桿菌表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）的研究中，通過(guò)對(duì)GFP基因的mRNA序列進(jìn)行改造，改變其二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)mRNA的5'UTR區(qū)域形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，mRNA的半衰期明顯延長(zhǎng)，GFP的表達(dá)量也相應(yīng)增加；而當(dāng)通過(guò)突變等方式破壞該區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)后，mRNA更容易被核酸酶降解，半衰期縮短，GFP的表達(dá)量顯著降低。這一研究實(shí)例充分說(shuō)明了mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與mRNA半衰期之間的密切關(guān)系，穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)能夠保護(hù)mRNA，延長(zhǎng)其半衰期，從而有利于重組蛋白的表達(dá)；而不穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)則會(huì)使mRNA更容易被降解，縮短半衰期，降低重組蛋白的表達(dá)水平。4.3.2穩(wěn)定性對(duì)蛋白表達(dá)量的間接作用穩(wěn)定的mRNA在大腸桿菌重組蛋白表達(dá)過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色，它為重組蛋白表達(dá)提供了持續(xù)的模板，通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，間接但顯著地增加了蛋白表達(dá)量。在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，穩(wěn)定的mRNA能夠保證轉(zhuǎn)錄的連續(xù)性和完整性。由于mRNA的穩(wěn)定性較高，在轉(zhuǎn)錄尚未完成時(shí)，已經(jīng)合成的mRNA部分不易被降解，使得RNA聚合酶能夠順利地沿著DNA模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，完成全長(zhǎng)mRNA的合成。這確保了細(xì)胞內(nèi)有足夠數(shù)量的完整mRNA分子，為后續(xù)的翻譯過(guò)程提供充足的模板。如果mRNA穩(wěn)定性差，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中就可能被核酸酶降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止，無(wú)法形成完整的mRNA分子，從而減少了可用于翻譯的模板數(shù)量，最終影響重組蛋白的表達(dá)量。在翻譯過(guò)程中，穩(wěn)定的mRNA能夠持續(xù)地為核糖體提供模板，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。核糖體在翻譯mRNA時(shí)，需要不斷地與mRNA結(jié)合并沿著其移動(dòng)，將氨基酸連接成多肽鏈。穩(wěn)定的mRNA能夠在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存在，使得核糖體有更多的機(jī)會(huì)與之結(jié)合，進(jìn)行多次翻譯循環(huán)，從而增加了蛋白質(zhì)的合成量。而且，穩(wěn)定的mRNA能夠保證翻譯過(guò)程的順利進(jìn)行，減少因mRNA降解而導(dǎo)致的翻譯中斷現(xiàn)象。當(dāng)mRNA在翻譯過(guò)程中突然被降解時(shí)，核糖體可能會(huì)從mRNA上脫落，導(dǎo)致正在合成的多肽鏈中斷，無(wú)法形成完整的蛋白質(zhì)。而穩(wěn)定的mRNA能夠維持翻譯的連續(xù)性，保證核糖體能夠順利地完成多肽鏈的合成，提高蛋白質(zhì)的合成效率。穩(wěn)定的mRNA還可以影響細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成相關(guān)因子的分配。由于穩(wěn)定的mRNA能夠長(zhǎng)時(shí)間存在并持續(xù)參與翻譯過(guò)程，細(xì)胞內(nèi)的翻譯起始因子、延伸因子等蛋白質(zhì)合成相關(guān)因子會(huì)更多地分配到這些穩(wěn)定的mRNA上，促進(jìn)其翻譯過(guò)程，從而進(jìn)一步增加重組蛋白的表達(dá)量。如果mRNA穩(wěn)定性差，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成相關(guān)因子可能會(huì)因?yàn)轭l繁地需要尋找新的mRNA模板而被分散，降低了它們?cè)谟行Хg過(guò)程中的作用效率，進(jìn)而影響重組蛋白的表達(dá)。在大腸桿菌表達(dá)重組人胰島素的研究中，通過(guò)優(yōu)化mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高了mRNA的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，穩(wěn)定的mRNA在細(xì)胞內(nèi)的半衰期顯著延長(zhǎng)，能夠持續(xù)為翻譯提供模板，使得重組人胰島素的表達(dá)量明顯增加。這一研究結(jié)果直觀地表明了穩(wěn)定的mRNA對(duì)重組蛋白表達(dá)量的間接促進(jìn)作用，穩(wěn)定的mRNA通過(guò)為轉(zhuǎn)錄和翻譯提供持續(xù)、有效的模板，以及優(yōu)化蛋白質(zhì)合成相關(guān)因子的分配，顯著增加了重組蛋白的表達(dá)量，在大腸桿菌重組蛋白表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。五、基于mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化大腸桿菌重組蛋白表達(dá)的策略5.1基因序列優(yōu)化5.1.1密碼子優(yōu)化與mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)調(diào)整密碼子優(yōu)化是基因序列優(yōu)化的重要策略之一，它不僅能夠提高翻譯效率，還能對(duì)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響，從而優(yōu)化大腸桿菌重組蛋白表達(dá)。在自然界中，不同生物對(duì)密碼子的使用存在偏好性，這是由于不同生物體內(nèi)tRNA的種類(lèi)和豐度不同所導(dǎo)致的。當(dāng)外源基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，如果其mRNA序列中存在大量大腸桿菌稀有密碼子，這些稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的含量較低，核糖體在翻譯過(guò)程中需要花費(fèi)更多的時(shí)間等待與之匹配的tRNA，這會(huì)導(dǎo)致翻譯速度減慢，甚至出現(xiàn)翻譯中斷、提前終止、移碼或氨基酸錯(cuò)誤摻入等情況，嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)表達(dá)的數(shù)量和質(zhì)量。為了解決密碼子偏好問(wèn)題，通常會(huì)對(duì)基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，即將基因中的稀有密碼子替換為大腸桿菌偏好的密碼子。在優(yōu)化過(guò)程中，需要綜合考慮多個(gè)因素，以確保優(yōu)化后的基因能夠高效表達(dá)重組蛋白。除了考慮密碼子的使用頻率，還需要關(guān)注優(yōu)化后的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。因?yàn)槊艽a子的改變會(huì)直接影響mRNA的堿基序列，進(jìn)而改變mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在某些情況下，簡(jiǎn)單地將稀有密碼子替換為常用密碼子可能會(huì)導(dǎo)致mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)變得更加穩(wěn)定，反而不利于翻譯過(guò)程。例如，在對(duì)某一外源基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化時(shí)，將其中的稀有密碼子AGG替換為常用密碼子AGA，雖然解決了密碼子偏好問(wèn)題，但卻使得mRNA在起始密碼子附近形成了更穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致核糖體與mRNA的結(jié)合受阻，翻譯起始效率降低，最終重組蛋白的表達(dá)量并未得到提高。為了避免這種情況，在密碼子優(yōu)化過(guò)程中，需要同時(shí)考慮mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性?？梢岳蒙镄畔W(xué)工具，如RNAfold、Mfold等，對(duì)優(yōu)化前后的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。通過(guò)這些工具，可以計(jì)算出mRNA的自由能，自由能越低，表明mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。在進(jìn)行密碼子優(yōu)化時(shí)，選擇那些既能提高密碼子適應(yīng)性，又能保持mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)不穩(wěn)定的密碼子組合，以促進(jìn)核糖體與mRNA的結(jié)合和翻譯的順利進(jìn)行。在優(yōu)化綠色熒光蛋白（GFP）基因時(shí)，通過(guò)對(duì)多種密碼子優(yōu)化方案的模擬分析，選擇了一種既能提高密碼子使用頻率，又能使mRNA5'端非翻譯區(qū)（UTR）的二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能升高（即結(jié)構(gòu)變得相對(duì)不穩(wěn)定）的優(yōu)化方案。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化后的GFP基因在大腸桿菌中的表達(dá)量顯著提高，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。這充分說(shuō)明在密碼子優(yōu)化過(guò)程中，綜合考慮mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)調(diào)整的重要性，通過(guò)合理的密碼子優(yōu)化和mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)調(diào)整，可以有效提高大腸桿菌重組蛋白的表達(dá)水平。5.1.2設(shè)計(jì)合成低復(fù)雜度二級(jí)結(jié)構(gòu)的mRNA利用生物信息學(xué)工具設(shè)計(jì)合成具有低復(fù)雜度二級(jí)結(jié)構(gòu)的mRNA，是優(yōu)化大腸桿菌重組蛋白表達(dá)的另一種有效策略。mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜度對(duì)其在大腸桿菌中的表達(dá)效率有著重要影響，復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能會(huì)阻礙核糖體的移動(dòng)，導(dǎo)致翻譯過(guò)程受阻，從而降低重組蛋白的表達(dá)量。生物信息學(xué)工具在設(shè)計(jì)合成低復(fù)雜度二級(jí)結(jié)構(gòu)的mRNA中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。目前，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種生物信息學(xué)算法和軟件用于預(yù)測(cè)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，如ViennaRNAPackage、RNAstructure等。這些工具基于熱力學(xué)原理，通過(guò)計(jì)算mRNA序列中堿基對(duì)之間的相互作用能量，預(yù)測(cè)出mRNA可能形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并給出相應(yīng)的自由能值，自由能越低，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。在設(shè)計(jì)mRNA序列時(shí)，可以利用這些工具對(duì)不同的序列進(jìn)行模擬和分析，預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜度，從而篩選出具有低復(fù)雜度二級(jí)結(jié)構(gòu)的mRNA序列。在設(shè)計(jì)過(guò)程中，需要遵循一定的原則來(lái)降低mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜度。要避免在mRNA的關(guān)鍵區(qū)域，如5'UTR、起始密碼子附近、編碼區(qū)等，形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)可能會(huì)阻礙核糖體的結(jié)合和移動(dòng)，影響翻譯起始和延伸。可以通過(guò)調(diào)整堿基序列，改變堿基配對(duì)的可能性，來(lái)破壞潛在的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。要盡量減少mRNA序列中連續(xù)的互補(bǔ)堿基區(qū)域，因?yàn)檫@些區(qū)域容易形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，增加二級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜度。在設(shè)計(jì)mRNA序列時(shí)，可以適當(dāng)引入一些不互補(bǔ)的堿基，打亂連續(xù)互補(bǔ)堿基的排列，降低二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。在一項(xiàng)關(guān)于人胰島素在大腸桿菌中表達(dá)的研究中，研究人員利用生物信息學(xué)工具對(duì)人胰島素基因的mRNA序列進(jìn)行了重新設(shè)計(jì)。通過(guò)分析預(yù)測(cè)，對(duì)mRNA的5'UTR和編碼區(qū)進(jìn)行了優(yōu)化，減少了可能形成穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域，降低了二級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜度。將優(yōu)化后的mRNA序列導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果顯示，重組人胰島素的表達(dá)量相比未優(yōu)化前提高了數(shù)倍，且蛋白的可溶性和活性也得到了顯著改善。這一研究實(shí)例充分證明了設(shè)計(jì)合成低復(fù)雜度二級(jí)結(jié)構(gòu)的mRNA能夠有效促進(jìn)大腸桿菌重組蛋白的表達(dá)，為重組蛋白的高效表達(dá)提供了一種可行的策略。5.2表達(dá)載體改造5.2.1調(diào)控翻譯起始區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)翻譯起始區(qū)在大腸桿菌重組蛋白表達(dá)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，其mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯起始效率有著重要影響。通過(guò)改造表達(dá)載體的翻譯起始區(qū)序列，可以有效地優(yōu)化mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)翻譯起始效率。在大腸桿菌中，翻譯起始需要核糖體小亞基、mRNA、起始tRNA以及多種翻譯起始因子的協(xié)同作用。翻譯起始區(qū)的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，尤其是核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）和起始密碼子附近的結(jié)構(gòu)，會(huì)影響核糖體與mRNA的結(jié)合以及翻譯起始因子的招募，進(jìn)而影響翻譯起始的效率。當(dāng)RBS和起始密碼子附近存在穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如莖環(huán)結(jié)構(gòu)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，會(huì)阻礙核糖體小亞基與mRNA的結(jié)合，導(dǎo)致翻譯起始受到抑制。為了優(yōu)化翻譯起始區(qū)的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，研究人員通常采用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)表達(dá)載體的相關(guān)序列進(jìn)行改造。通過(guò)改變堿基序列，調(diào)整mRNA的堿基配對(duì)情況，從而破壞不利于翻譯起始的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，或者構(gòu)建有利于翻譯起始的結(jié)構(gòu)。在對(duì)某一重組蛋白表達(dá)載體的研究中，發(fā)現(xiàn)其翻譯起始區(qū)的mRNA形成了穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重阻礙了核糖體的結(jié)合。通過(guò)定點(diǎn)突變，將莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的部分堿基進(jìn)行替換，破壞了莖環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使得核糖體能夠更順利地與mRNA結(jié)合，翻譯起始效率顯著提高，重組蛋白的表達(dá)量也隨之增加。在優(yōu)化過(guò)程中，需要借助生物信息學(xué)工具對(duì)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，以確保改造后的序列能夠達(dá)到預(yù)期的效果。利用RNAfold、Mfold等軟件，可以計(jì)算mRNA的自由能，預(yù)測(cè)其可能形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而指導(dǎo)定點(diǎn)突變的設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)翻譯起始區(qū)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)調(diào)控。5.2.2引入特殊元件影響mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在表達(dá)載體中引入特殊元件，如RNA適配體、核酶等，是調(diào)控mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和重組蛋白表達(dá)的一種有效方法。這些特殊元件能夠與mRNA相互作用，改變其二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響重組蛋白的表達(dá)過(guò)程。RNA適配體是一類(lèi)能夠特異性結(jié)合目標(biāo)分子的RNA分子，它可以通過(guò)與mRNA的特定區(qū)域結(jié)合，改變mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控基因表達(dá)。在表達(dá)載體中引入RNA適配體，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的精確調(diào)控。當(dāng)RNA適配體與mRNA的5'非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合時(shí)，可能會(huì)改變5'UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)，影響核糖體與mRNA的結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控翻譯起始效率。研究人員設(shè)計(jì)了一種針對(duì)特定mRNA的RNA適配體，將其引入表達(dá)載體中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該RNA適配體能夠與mRNA的5'UTR特異性結(jié)合，改變了5'UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使得核糖體更容易與mRNA結(jié)合，翻譯起始效率提高，重組蛋白的表達(dá)量顯著增加。核酶是一類(lèi)具有催化活性的RNA分子，它可以在特定條件下對(duì)mRNA進(jìn)行切割或修飾，從而影響mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。在表達(dá)載體中引入核酶，可以通過(guò)其催化作用調(diào)控mRNA的結(jié)構(gòu)和表達(dá)。錘頭狀核酶是一種常見(jiàn)的核酶，它能夠在特定的堿基序列處對(duì)mRNA進(jìn)行切割。將錘頭狀核酶的編碼序列引入表達(dá)載體中，使其與目標(biāo)mRNA共轉(zhuǎn)錄。當(dāng)核酶轉(zhuǎn)錄形成后，它會(huì)識(shí)別并切割mRNA，改變mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，影響其穩(wěn)定性和翻譯效率。在一項(xiàng)研究中，將錘頭狀核酶引入表達(dá)載體，使其作用于mRNA的3'UTR區(qū)域。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核酶切割了mRNA的3'UTR，改變了mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致mRNA的穩(wěn)定性下降，翻譯效率降低，重組蛋白的表達(dá)量也相應(yīng)減少。這表明通過(guò)合理設(shè)計(jì)核酶的作用位點(diǎn)和條件，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和重組蛋白表達(dá)的有效調(diào)控。5.3培養(yǎng)條件優(yōu)化5.3.1溫度對(duì)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白表達(dá)的影響溫度是影響大腸桿菌生長(zhǎng)和重組蛋白表達(dá)的重要培養(yǎng)條件之一，它對(duì)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及重組蛋白表達(dá)有著復(fù)雜而顯著的影響。溫度的變化會(huì)直接影響mRNA分子內(nèi)堿基之間的氫鍵相互作用，從而改變mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。在較低溫度下，分子熱運(yùn)動(dòng)減弱，mRNA分子中堿基之間的氫鍵更容易形成和維持，使得mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。例如，當(dāng)培養(yǎng)溫度從37℃降低到25℃時(shí)，某些mRNA的5'端非翻譯區(qū)（UTR）原本不穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)可能會(huì)變得更加穩(wěn)定，因?yàn)榈蜏赜兄诰S持堿基之間的氫鍵，增強(qiáng)莖環(huán)結(jié)構(gòu)中堿基對(duì)的相互作用。mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的改變又會(huì)進(jìn)一步影響重組蛋白的表達(dá)。在翻譯起始階段，穩(wěn)定的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)可能會(huì)阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，從而抑制翻譯起始。當(dāng)5'UTR的莖環(huán)結(jié)構(gòu)在低溫下變得更加穩(wěn)定時(shí)，核糖體小亞基結(jié)合到mRNA上的難度增加，導(dǎo)致翻譯起始效率降低，進(jìn)而減少重組蛋白的表達(dá)量。在翻譯延伸過(guò)程中，穩(wěn)定的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)也會(huì)阻礙核糖體的移動(dòng)，使核糖體在遇到這些結(jié)構(gòu)時(shí)暫停，增加了翻譯延伸的時(shí)間，甚至可能導(dǎo)致翻譯提前終止，影響重組蛋白的合成。在某些情況下，適當(dāng)?shù)臏囟茸兓部梢源龠M(jìn)重組蛋白的表達(dá)。在表達(dá)一些對(duì)溫度敏感的重組蛋白時(shí)，通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)溫度，可以?xún)?yōu)化mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高蛋白表達(dá)量。對(duì)于某些蛋白，在誘導(dǎo)表達(dá)前，先在較高溫度下培養(yǎng)大腸桿菌，使細(xì)胞快速生長(zhǎng)到一定密度，此時(shí)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)不穩(wěn)定，有利于轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始；然后降低溫度進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，較低的溫度可以減緩蛋白合成速度，使mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，為蛋白的正確折疊提供更充足的時(shí)間，減少包涵體的形成，從而提高重組蛋白的可溶性表達(dá)量。在大腸桿菌表達(dá)重組人胰島素的研究中，采用了兩階段溫度調(diào)控策略。在前期培養(yǎng)時(shí)，將溫度設(shè)置為37℃，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；在誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，將溫度降低到20℃。結(jié)果顯示，與一直保持37℃培養(yǎng)相比，這種溫度調(diào)控策略使得mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)更加有利于蛋白表達(dá)，重組人胰島素的可溶性表達(dá)量顯著提高，活性也得到了增強(qiáng)。5.3.2其他培養(yǎng)條件的協(xié)同作用除了溫度，培養(yǎng)基成分和誘導(dǎo)劑濃度等培養(yǎng)條件也與mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)相互作用，共同影響著大腸桿菌重組蛋白的表達(dá)。培養(yǎng)基成分對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)和mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)有著重要影響。不同的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等成分會(huì)影響大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑和生理狀態(tài)，進(jìn)而影響mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定性。以碳源為例，葡萄糖是大腸桿菌常用的碳源之一，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度較高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的代謝通量發(fā)生改變，影響相關(guān)基因的表達(dá)和mRNA的穩(wěn)定性。在某些情況下，高濃度的葡萄糖會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物積累，這些代謝產(chǎn)物可能會(huì)與mRNA相互作用，改變mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度過(guò)高時(shí)，某些mRNA的5'UTR會(huì)形成更穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，阻礙核糖體的結(jié)合，從而抑制翻譯起始，降低重組蛋白的表達(dá)量。相反，選擇合適的碳源，如乳糖等，不僅可以避免葡萄糖的代謝物阻遏效應(yīng)，還可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑，優(yōu)化mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)重組蛋白的表達(dá)。誘導(dǎo)劑濃度也是影響重組蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因素之一，它與mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)之間存在著密切的相互作用。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，常用的誘導(dǎo)劑如IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷），通過(guò)與阻遏蛋白結(jié)合，解除對(duì)啟動(dòng)子的抑制，從而啟動(dòng)重組蛋白的表達(dá)。誘導(dǎo)劑濃度的變化會(huì)影響mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，進(jìn)而影響mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和重組蛋白的表達(dá)。當(dāng)誘導(dǎo)劑濃度較低時(shí)，mRNA的轉(zhuǎn)錄水平較低，可能導(dǎo)致mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，影響翻譯起始和延伸。而當(dāng)誘導(dǎo)劑濃度過(guò)高時(shí)，雖然可以提高mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，但可能會(huì)使mRNA轉(zhuǎn)錄速度過(guò)快，導(dǎo)致mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)異常，不利于蛋白的正確折疊和表達(dá)。在研究綠色熒光蛋白（GFP）在大腸桿菌中的表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)IPTG濃度為0.1mM時(shí)，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，GFP的表達(dá)量和熒光強(qiáng)度較高；當(dāng)IPTG濃度提高到1mM時(shí)，雖然mRNA轉(zhuǎn)錄量增加，但mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定，導(dǎo)致GFP的表達(dá)量和熒光強(qiáng)度反而下降。培養(yǎng)基成分和誘導(dǎo)劑濃度等培養(yǎng)條件與mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)相互作用，共同影響著大腸桿菌重組蛋白的表達(dá)。在實(shí)際應(yīng)用中，需要綜合考慮這些因素，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件，調(diào)控mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)重組蛋白的高效、高質(zhì)量表達(dá)。六、案例分析6.1成功利用mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化重組蛋白表達(dá)的案例在重組蛋白表達(dá)研究領(lǐng)域，諸多實(shí)驗(yàn)案例充分展示了通過(guò)調(diào)整mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)可有效提高蛋白表達(dá)量和活性。以人胰島素在大腸桿菌中的表達(dá)為例，人胰島素作為一種重要的生物藥物，對(duì)于糖尿病的治療具有關(guān)鍵作用。傳統(tǒng)生產(chǎn)方法成本高昂且產(chǎn)量有限，利用大腸桿菌進(jìn)行重組表達(dá)成為研究熱點(diǎn)?？蒲腥藛T通過(guò)對(duì)人胰島素mRNA序列的深入分析，發(fā)現(xiàn)其5'端非翻譯區(qū)（UTR）存在穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)嚴(yán)重阻礙了核糖體與mRNA的結(jié)合，抑制了翻譯起始，導(dǎo)致人胰島素表達(dá)量較低。為解決這一問(wèn)題，研究人員利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)mRNA序列進(jìn)行改造，破壞了5'UTR的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使核糖體能夠順利結(jié)合到mRNA上，翻譯起始效率顯著提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，改造后的大腸桿菌中人胰島素的表達(dá)量相比未改造前提高了數(shù)倍。而且，由于mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化，翻譯過(guò)程更加順暢，減少了錯(cuò)誤折疊的發(fā)生，人胰島素的活性也得到了顯著提升，其降糖效果與天然胰島素相當(dāng)。綠色熒光蛋白（GFP）在大腸桿菌中的表達(dá)研究也為mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響提供了有力證據(jù)。GFP作為一種常用的報(bào)告蛋白，在生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)用。在最初的實(shí)驗(yàn)中，GFP在大腸桿菌中的表達(dá)量較低，熒光強(qiáng)度較弱。研究人員對(duì)其mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，GFP基因的mRNA編碼區(qū)存在一些穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)導(dǎo)致核糖體在翻譯延伸過(guò)程中頻繁暫停，影響了GFP的合成效率。為優(yōu)化表達(dá)，研究人員采用密碼子優(yōu)化策略，在提高密碼子適應(yīng)性的同時(shí)，調(diào)整mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，減少了編碼區(qū)穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，優(yōu)化后的GFP在大腸桿菌中的表達(dá)量大幅提高，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，使得GFP在生物成像等研究中的應(yīng)用更加有效。在乙肝表面抗原（HBsAg）于大腸桿菌中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，HBsAg的表達(dá)水平起初較低，難以滿(mǎn)足疫苗生產(chǎn)的需求。通過(guò)對(duì)HBsAg的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其5'UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)與翻譯起始效率密切相關(guān)。研究人員利用RNA適配體技術(shù)，在表達(dá)載體中引入與5'UTR特異性結(jié)合的RNA適配體，改變了5'UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了核糖體與mRNA的結(jié)合，增強(qiáng)了翻譯起始效率。經(jīng)過(guò)改造后，HBsAg在大腸桿菌中的表達(dá)量顯著提高，且蛋白的免疫原性也得到了保證，為乙肝疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)提供了更有效的途徑。這些成功案例表明，通過(guò)深入研究mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，采用定點(diǎn)突變、密碼子優(yōu)化、RNA適配體等技術(shù)手段調(diào)整mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，能夠有效提高大腸桿菌重組蛋白的表達(dá)量和活性，為重組蛋白在醫(yī)藥、生物研究等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了重要的技術(shù)支持和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。6.2未充分考慮mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致表達(dá)失敗的案例在重組蛋白表達(dá)研究中，因忽視mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)因素而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗的案例并不鮮見(jiàn)，這些案例為科研人員提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)。某研究團(tuán)隊(duì)旨在利用大腸桿菌表達(dá)一種具有重要藥用價(jià)值的重組蛋白，該蛋白是一種新型的細(xì)胞因子，在免疫調(diào)節(jié)方面具有潛在的應(yīng)用前景。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，研究人員按照常規(guī)方法進(jìn)行操作，選用了常用的大腸桿菌BL21(DE3)菌株作為宿主，將目標(biāo)基因克隆到pET-28a表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌后，在37℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。然而，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，均未檢測(cè)到重組蛋白的表達(dá)，即便通過(guò)提高誘導(dǎo)劑IPTG的濃度、延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間等方式進(jìn)行優(yōu)化，依然未能成功。經(jīng)過(guò)深入分析，研究人員發(fā)現(xiàn)問(wèn)題出在mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)上。對(duì)目標(biāo)基因的mRNA序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析后，發(fā)現(xiàn)其5'端非翻譯區(qū)（UTR）形成了非常穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且起始密碼子恰好位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)部。這種穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重阻礙了核糖體與mRNA的結(jié)合，使得翻譯起始無(wú)法正常進(jìn)行，從而導(dǎo)致重組蛋白無(wú)法表達(dá)。由于研究人員在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)階段未對(duì)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)給予足夠的重視，沒(méi)有對(duì)mRNA序列進(jìn)行合理的優(yōu)化，最終導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)的失敗，不僅浪費(fèi)了大量的時(shí)間和資源，還延誤了研究進(jìn)度。在另一項(xiàng)關(guān)于重組酶表達(dá)的研究中，研究人員希望在大腸桿菌中表達(dá)一種能夠高效催化特定化學(xué)反應(yīng)的重組酶，用于工業(yè)生物催化領(lǐng)域。在構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，同樣沒(méi)有考慮mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然能夠檢測(cè)到重組酶的表達(dá)，但表達(dá)量極低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)無(wú)法滿(mǎn)足工業(yè)應(yīng)用的需求。通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，mRNA編碼區(qū)存在多個(gè)穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)導(dǎo)致核糖體在翻譯延伸過(guò)程中頻繁暫停，使得翻譯效率大幅降低，進(jìn)而影響了重組酶的表達(dá)量。由于未能提前預(yù)測(cè)和解決mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)帶來(lái)的問(wèn)題，使得該研究在重組酶表達(dá)方面遇到了瓶頸，限制了其在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用推廣。這些案例深刻地表明，在大腸桿菌重組蛋白表達(dá)研究中，忽視mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)因素可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。為了避免類(lèi)似的失敗，科研人員在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)階段應(yīng)充分利用生物信息學(xué)工具，對(duì)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)和分析，提前發(fā)現(xiàn)可能存在的問(wèn)題，并采取相應(yīng)的優(yōu)化措施，如基因序列優(yōu)化、表達(dá)載體改造等，以確保mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)有利于重組蛋白的表達(dá)，提高實(shí)驗(yàn)的成功率和重組蛋白的表達(dá)水平。七、研究結(jié)論與展望7.1研究結(jié)論總結(jié)本研究深入剖析了mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)大腸桿菌重組蛋白表達(dá)的影響，全面揭示了其在翻譯起始、延伸和mRNA穩(wěn)定性等關(guān)鍵方面的作用機(jī)制，并提出了一系列基于此的優(yōu)化策略，在實(shí)際應(yīng)用中取得了顯著效果。在翻譯起始階段，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。起始密碼子附近穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如莖環(huán)結(jié)構(gòu)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，會(huì)形成物理阻礙，顯著抑制核糖體與mRNA的結(jié)合，進(jìn)而阻礙翻譯起始，導(dǎo)致重組蛋白表達(dá)量降低。5'非翻譯區(qū)（UTR）的二級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)影響核糖體掃描進(jìn)程和招募翻譯起始因子，對(duì)翻譯起始進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。當(dāng)5'UTR存在穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，核糖體在掃描過(guò)程中會(huì)遇到阻礙，掃描速度減慢，甚至無(wú)法順利找到起始密碼子，從而降低翻譯起始效率；同時(shí)，5'U