從基因密碼到免疫防線：新冠mRNA疫苗與非洲豬瘟蛋白結構的前沿探索一、引言1.1研究背景與意義1.1.1新型冠狀病毒mRNA疫苗開發(fā)的緊迫性自2019年底新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引發(fā)的新冠肺炎疫情（COVID-19）爆發(fā)以來，迅速在全球范圍內大流行，給人類健康、經(jīng)濟和社會發(fā)展帶來了前所未有的沖擊。世界衛(wèi)生組織（WHO）數(shù)據(jù)顯示，截至[具體日期]，全球累計確診病例數(shù)已超過[X]億，死亡病例數(shù)超過[X]萬，疫情波及全球200多個國家和地區(qū)。這場疫情嚴重威脅到人類的生命安全，使醫(yī)療系統(tǒng)面臨巨大壓力，醫(yī)院人滿為患，醫(yī)療資源如口罩、防護服、呼吸機等一度極度短缺，許多患者無法得到及時有效的救治。在經(jīng)濟方面，為了控制疫情傳播，各國紛紛采取封鎖措施，包括限制人員流動、關閉商業(yè)場所、暫停交通運輸?shù)?。這些措施導致全球經(jīng)濟陷入嚴重衰退，國際貨幣基金組織（IMF）報告指出，2020年全球經(jīng)濟增長率降至-3.1%，許多行業(yè)如航空、旅游、酒店、餐飲等遭受重創(chuàng)，大量企業(yè)倒閉，失業(yè)率急劇上升。國際貿(mào)易也受到極大阻礙，全球供應鏈斷裂，貨物運輸受阻，企業(yè)生產(chǎn)經(jīng)營面臨諸多困難。疫情還對社會的各個層面產(chǎn)生了深遠影響，教育行業(yè)從線下教學被迫轉為線上，給學生的學習和成長帶來了挑戰(zhàn)；人們的日常生活方式發(fā)生了巨大改變，社交活動受限，心理健康問題日益凸顯，焦慮、抑郁等情緒困擾著許多人。疫苗接種被公認為是控制傳染病最有效、最經(jīng)濟的手段。在新冠疫情防控中，開發(fā)安全有效的疫苗成為全球科學界和醫(yī)學界的首要任務。傳統(tǒng)疫苗研發(fā)技術，如滅活疫苗、減毒活疫苗和重組蛋白疫苗等，雖然在傳染病防控歷史上發(fā)揮了重要作用，但在應對新冠疫情時，存在研發(fā)周期長、生產(chǎn)工藝復雜等局限性。例如，滅活疫苗需要培養(yǎng)大量的病毒，然后進行滅活處理，這個過程不僅耗時，而且存在一定的生物安全風險；重組蛋白疫苗則需要對病毒蛋白進行表達和純化，生產(chǎn)工藝較為繁瑣。相比之下，mRNA疫苗技術展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，成為新冠疫苗研發(fā)的重要方向。mRNA疫苗通過將編碼病毒抗原的mRNA導入人體細胞，利用人體自身的細胞機制合成抗原，從而激發(fā)免疫反應。它具有開發(fā)周期短的特點，從病毒基因序列確定到疫苗進入臨床試驗，理論上可以在數(shù)周內完成，這使得其能夠快速響應突發(fā)公共衛(wèi)生事件。mRNA疫苗易于工業(yè)化生產(chǎn)，可通過標準化的體外轉錄技術大量合成mRNA，并且生產(chǎn)過程相對簡單，能夠快速擴大產(chǎn)能，滿足全球大規(guī)模接種的需求。mRNA疫苗還具有良好的免疫原性，能夠同時激活體液免疫和細胞免疫，提供更全面的免疫保護。在新冠疫情持續(xù)肆虐，給人類帶來巨大災難的背景下，加快新型冠狀病毒mRNA疫苗的開發(fā)，對于有效控制疫情傳播、保護人類生命健康、恢復經(jīng)濟社會正常秩序具有至關重要的緊迫性和現(xiàn)實意義。只有盡快研發(fā)出安全有效的mRNA疫苗并實現(xiàn)廣泛接種，才能在全球范圍內建立起免疫屏障，阻斷病毒傳播，最終戰(zhàn)勝這場疫情。1.1.2非洲豬瘟關鍵蛋白結構解析的必要性非洲豬瘟（AfricanSwineFever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus，ASFV）引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，嚴重危害著全球養(yǎng)豬業(yè)。1921年，ASFV在肯尼亞首次被報道，隨后逐漸傳播至西歐、拉丁美洲和東歐國家。2018年，非洲豬瘟傳入我國，給我國乃至全球的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）統(tǒng)計，全球養(yǎng)豬業(yè)因非洲豬瘟疫情遭受的經(jīng)濟損失已超過數(shù)百億美元。在疫情嚴重的地區(qū)，大量生豬被撲殺，豬場倒閉，養(yǎng)豬戶面臨巨大的經(jīng)濟困境。例如，在2018-2019年非洲豬瘟疫情高峰期，我國生豬存欄量大幅下降，豬肉價格飆升，不僅影響了養(yǎng)豬戶的收入，也給消費者的生活帶來了較大影響。非洲豬瘟疫情還對相關產(chǎn)業(yè)鏈，如飼料生產(chǎn)、肉類加工、運輸?shù)刃袠I(yè)造成了連鎖反應，導致產(chǎn)業(yè)上下游企業(yè)的經(jīng)營受到?jīng)_擊，就業(yè)崗位減少。目前，全球范圍內尚無有效的非洲豬瘟疫苗和治療藥物，防控主要依賴于嚴格的生物安全措施，如封鎖疫區(qū)、撲殺病豬、消毒等。然而，這些措施難以完全阻止病毒的傳播，因為ASFV具有很強的環(huán)境抵抗力，能夠在豬肉制品、飼料、土壤等環(huán)境中存活較長時間，且傳播途徑多樣，包括直接接觸感染豬、間接接觸被污染的物品、蜱蟲等媒介傳播等。解析ASFV關鍵蛋白的結構對于防控非洲豬瘟疫病、研發(fā)疫苗和治療藥物具有重要意義。從疫苗研發(fā)角度來看，了解關鍵蛋白的結構可以為疫苗設計提供精準的靶點。例如，ASFV的表面蛋白在病毒感染宿主細胞的過程中起著關鍵作用，解析這些蛋白的結構可以幫助科研人員設計出更有效的抗原，提高疫苗的免疫原性和特異性。通過對關鍵蛋白結構的分析，還可以深入研究病毒與宿主細胞之間的相互作用機制，為開發(fā)新型疫苗佐劑提供理論依據(jù)，增強疫苗的免疫效果。在治療藥物研發(fā)方面，明確關鍵蛋白的結構有助于發(fā)現(xiàn)潛在的藥物作用靶點。基于結構的藥物設計方法可以根據(jù)蛋白的三維結構，設計出能夠特異性結合關鍵蛋白、阻斷其功能的小分子化合物或生物制劑。例如，如果能夠找到與ASFV復制相關關鍵蛋白結合的小分子，就有可能開發(fā)出抑制病毒復制的藥物，從而為非洲豬瘟的治療提供新的手段。對ASFV關鍵蛋白結構的解析還能加深我們對病毒生物學特性和致病機制的理解。通過研究關鍵蛋白在病毒生命周期中的功能，如病毒的吸附、侵入、復制、裝配和釋放等過程，可以揭示非洲豬瘟的發(fā)病機制，為制定更科學、有效的防控策略提供理論基礎。在非洲豬瘟對全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大破壞，且缺乏有效防控手段的現(xiàn)狀下，解析非洲豬瘟關鍵蛋白結構迫在眉睫，這對于保障全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展、維護食品安全和社會穩(wěn)定具有不可替代的重要作用。1.2研究目的與創(chuàng)新點1.2.1研究目的本研究旨在攻克新型冠狀病毒mRNA疫苗開發(fā)中的關鍵技術難題，同時深入解析非洲豬瘟關鍵蛋白結構，為相關疫病的防控提供堅實的理論基礎與技術支撐。在新型冠狀病毒mRNA疫苗開發(fā)方面，研究期望通過優(yōu)化mRNA序列設計，顯著提升疫苗的免疫原性與穩(wěn)定性。傳統(tǒng)的mRNA序列在體內易被降解，免疫原性也有待提高，本研究將運用先進的生物信息學工具和分子生物學技術，對編碼新冠病毒關鍵抗原的mRNA序列進行優(yōu)化，如優(yōu)化密碼子使用頻率、添加特定的非翻譯區(qū)序列等，以增強mRNA在體內的穩(wěn)定性，使其能夠更有效地被細胞攝取和翻譯，從而產(chǎn)生更強的免疫反應。研究還將致力于開發(fā)高效、安全的mRNA遞送系統(tǒng)。目前，脂質納米顆粒（LNP）是應用最廣泛的mRNA遞送載體，但仍存在一些局限性，如潛在的毒性和免疫原性等問題。本研究計劃探索新型的納米材料和遞送技術，設計出具有更高包封效率、更低毒性和更好靶向性的mRNA遞送系統(tǒng)，確保mRNA能夠精準地遞送至靶細胞，提高疫苗的有效性和安全性。研究還將對mRNA疫苗的生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，為mRNA疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)和廣泛應用奠定基礎。通過優(yōu)化轉錄條件、純化工藝等，實現(xiàn)mRNA疫苗的高質量、大規(guī)模生產(chǎn)，滿足全球對新冠疫苗的需求。針對非洲豬瘟關鍵蛋白結構解析，本研究的目標是利用先進的結構生物學技術，如冷凍電鏡（Cryo-EM）、X射線晶體學等，解析非洲豬瘟病毒關鍵蛋白的高分辨率三維結構。非洲豬瘟病毒的結構復雜，其關鍵蛋白在病毒的感染、復制和致病過程中發(fā)揮著重要作用，但目前對這些蛋白的結構和功能了解還十分有限。通過解析關鍵蛋白的結構，能夠深入揭示其在病毒生命周期中的作用機制。例如，對于病毒吸附和侵入宿主細胞過程中起關鍵作用的表面蛋白，了解其結構可以幫助我們明確病毒與宿主細胞受體的相互作用方式，從而為開發(fā)阻斷病毒感染的藥物或疫苗提供精準的靶點；對于病毒復制相關的關鍵蛋白，解析其結構可以深入研究病毒的復制機制，為開發(fā)抑制病毒復制的藥物提供理論依據(jù)。研究還將通過定點突變、蛋白質相互作用分析等實驗手段，進一步驗證和深入研究關鍵蛋白的功能，為非洲豬瘟的防控提供更深入的理論基礎。1.2.2創(chuàng)新點本研究在技術方法、研究視角和成果應用等方面具有顯著的創(chuàng)新之處。在技術方法上，本研究創(chuàng)新性地結合了多種前沿技術。在新型冠狀病毒mRNA疫苗開發(fā)中，將機器學習算法引入mRNA序列設計環(huán)節(jié)。機器學習算法能夠對大量的mRNA序列數(shù)據(jù)和免疫反應數(shù)據(jù)進行分析和建模，預測不同mRNA序列的免疫原性和穩(wěn)定性，從而為mRNA序列的優(yōu)化提供更精準的指導。傳統(tǒng)的mRNA序列設計主要依賴于經(jīng)驗和試錯，效率較低，而機器學習算法的應用可以大大提高設計的準確性和效率。在非洲豬瘟關鍵蛋白結構解析中，將冷凍電鏡單顆粒分析技術與氫氘交換質譜技術（HDX-MS）相結合。冷凍電鏡單顆粒分析技術可以獲得蛋白的高分辨率三維結構，但對于蛋白的動態(tài)變化和與其他分子的相互作用信息獲取有限；而氫氘交換質譜技術能夠檢測蛋白質在不同狀態(tài)下的氫氘交換速率，從而反映蛋白質的動態(tài)結構和相互作用信息。兩者結合可以更全面地了解非洲豬瘟關鍵蛋白的結構和功能，為深入研究病毒的致病機制提供更豐富的信息。從研究視角來看，本研究打破了傳統(tǒng)的單一學科研究模式，采用多學科交叉的研究視角。在新冠mRNA疫苗開發(fā)中，不僅涉及生物學領域的知識和技術，還融合了化學、材料科學、生物信息學等多個學科的方法和理論。例如，在mRNA遞送系統(tǒng)的開發(fā)中，需要運用化學合成技術制備新型的納米材料，利用材料科學的原理優(yōu)化材料的性能，通過生物信息學分析納米材料與mRNA的相互作用以及在體內的分布和代謝情況。這種多學科交叉的研究視角能夠為mRNA疫苗的開發(fā)提供更全面、創(chuàng)新的思路和方法。在非洲豬瘟關鍵蛋白結構解析中，同樣結合了病毒學、結構生物學、生物化學、細胞生物學等多個學科的知識和技術。從病毒學角度了解病毒的生物學特性和致病過程，從結構生物學角度解析關鍵蛋白的三維結構，通過生物化學和細胞生物學實驗研究蛋白的功能和相互作用，從而更深入、全面地理解非洲豬瘟病毒的致病機制。在成果應用方面，本研究的創(chuàng)新點在于注重研究成果的轉化和實際應用。對于新型冠狀病毒mRNA疫苗，在研發(fā)過程中充分考慮其大規(guī)模生產(chǎn)和實際應用的可行性，與相關企業(yè)合作，共同優(yōu)化生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本，確保疫苗能夠快速、高效地投入市場，為全球新冠疫情防控提供有力的支持。對于非洲豬瘟關鍵蛋白結構解析的成果，將積極與疫苗和藥物研發(fā)企業(yè)合作，基于解析的蛋白結構，開展疫苗和藥物的設計與開發(fā)工作，加速研究成果從實驗室到臨床應用的轉化，為非洲豬瘟的防控提供切實可行的解決方案。1.3國內外研究現(xiàn)狀1.3.1新型冠狀病毒mRNA疫苗開發(fā)進展在新冠疫情爆發(fā)后，全球各國迅速開展了新型冠狀病毒mRNA疫苗的研發(fā)工作，在短時間內取得了一系列令人矚目的進展。國外方面，美國的輝瑞（Pfizer）公司與德國的BioNTech公司合作開發(fā)的mRNA新冠疫苗Comirnaty（BNT162b2）在2020年12月獲得了美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的緊急使用授權（EUA），成為全球首個獲批使用的mRNA新冠疫苗。該疫苗采用脂質納米顆粒（LNP）作為遞送系統(tǒng)，將編碼新冠病毒刺突蛋白（S蛋白）的mRNA遞送至人體細胞內，激發(fā)免疫反應。臨床試驗數(shù)據(jù)顯示，在大規(guī)模Ⅲ期臨床試驗中，Comirnaty對預防新冠感染的有效率高達95%，能夠顯著降低感染風險，特別是對預防重癥和死亡效果顯著。其免疫原性良好，接種后能夠誘導機體產(chǎn)生高水平的中和抗體，同時激活細胞免疫反應。Moderna公司研發(fā)的Spikevax（mRNA-1273）也在2020年12月獲得FDA的EUA。該疫苗同樣基于mRNA技術，以LNP為遞送載體。在Ⅲ期臨床試驗中，Spikevax對預防新冠感染的有效率為94.1%，展現(xiàn)出了優(yōu)秀的保護效力。它在誘導免疫反應方面也表現(xiàn)出色，可誘導機體產(chǎn)生持久的免疫記憶，接種后數(shù)月仍能維持較高水平的中和抗體。這兩款疫苗在全球范圍內廣泛接種，對控制疫情傳播發(fā)揮了重要作用，為mRNA疫苗的研發(fā)和應用奠定了堅實基礎，也為其他疫苗的開發(fā)提供了寶貴的經(jīng)驗。國內在新型冠狀病毒mRNA疫苗開發(fā)領域也取得了積極進展。艾博生物、軍事科學院軍事醫(yī)學研究院和沃森生物共同開發(fā)的ARCoVax是國內進展較快的mRNA新冠疫苗之一。2020年6月，ARCoVax獲批臨床，成為國內首個進入臨床的mRNA疫苗，目前處于III期臨床階段。其I期臨床數(shù)據(jù)顯示，在5種不同劑量（5μg、10μg、15μg、20μg和25μg）下，ARCoVax安全性和耐受性均良好，能夠誘導強烈的體液和細胞免疫反應。石藥集團的mRNA新冠疫苗SYS6006于2023年4月3日獲批臨床。臨床前研究表明，SYS6006對包含Omicron和Delta在內的當前主流突變毒株具有良好的免疫保護效力，可通過體液免疫和細胞免疫對機體提供免疫保護，并可產(chǎn)生記憶性B細胞，提供長效保護效力?？迪ＶZ生物的mRNA新冠疫苗也已進入臨床Ⅱ期試驗階段，預計在2023年底前能夠完成大部分的現(xiàn)場工作并收集到初步數(shù)據(jù)。臨床前研究結果顯示，該疫苗可以誘導出針對多種世界衛(wèi)生組織認定的重要變異株（包括當前流行株）的高滴度的中和抗體，與以原型株為基礎開發(fā)的現(xiàn)有新冠疫苗相比廣譜性更強，可以更有效地保護機體免受現(xiàn)有變異株的感染。此外，復星醫(yī)藥從BioNTech引進的mRNA新冠疫苗復必泰（BNT162b2）已在港澳臺地區(qū)上市，并且復星醫(yī)藥還從BioNTech引進了另外2款針對新冠病毒感染的mRNA疫苗，分別處于II/III期臨床和I/II期臨床階段。云頂新耀從Providence引進的PTX-COVID19-B目前處于II期臨床階段，其I期臨床研究的中期數(shù)據(jù)表明，它具有強大的病毒中和能力，并在治療組的參與者中產(chǎn)生了一定水平的抗體。國內眾多科研機構和企業(yè)積極投入mRNA新冠疫苗的研發(fā)，不斷探索創(chuàng)新，在技術和工藝上取得了多項突破，為我國乃至全球的新冠疫情防控提供了更多的選擇和保障。1.3.2非洲豬瘟關鍵蛋白結構解析成果非洲豬瘟病毒（ASFV）結構復雜，含有多種結構蛋白和非結構蛋白，對這些關鍵蛋白結構的解析是深入了解病毒致病機制和研發(fā)有效防控手段的關鍵。近年來，國內外科研人員在非洲豬瘟關鍵蛋白結構解析方面取得了一系列重要成果。復旦大學甘建華課題組在非洲豬瘟病毒復制通路蛋白結構解析方面做出了重要貢獻。2023年8月17日，該課題組在《NucleicAcidsResearch》上發(fā)表文章，報道了非洲豬瘟病毒來源的C962R蛋白與DNA復合物的結構，闡明了C962R催化DNA解旋以及DNA引物合成的分子機制。C962R是ASFVDNA復制通路中的關鍵蛋白之一，在ASFV病毒株中高度保守。研究顯示C962R為多結構域蛋白，其N端的AEP結構域負責新生DNA的從頭合成及延伸，而其SF3Helicase結構域則負責ATP分子的水解以及雙鏈DNA的解旋。不同于常規(guī)的SF3Helicase家族蛋白，C962R蛋白為環(huán)狀的12聚體，由兩個6聚體head-to-head互作形成。DNA底物的入口處于6聚體的結合界面處，DNA非模版鏈的3’端可通過此入口進入C962R結構中心的孔道，利用SF3Helicase結構域水解ATP、驅動蛋白質構象的變化以及DNA的解旋。盡管不參與直接的催化和解旋，C962R的PriCT2、D5_N以及Tail結構域參與DNA的結合，其構象變化對DNA解旋以及新生DNA的從頭合成發(fā)揮了調控作用。8月3日，該課題組在《JournalofViology》雜志上發(fā)表關于AsfvPCNA的研究成果。AsfvPCNA是ASFVDNA復制通路中的重要蛋白，雖然不具有催化功能，但可以通過與其他蛋白互作，提高互作蛋白的催化效率，在DNA復制、修復以及其他DNA相關的通路中發(fā)揮重要的調控作用。研究結果顯示AsfvPCNA蛋白由兩個相似的結構域（DomainI和II）組成，其連接區(qū)域（IDCL）含有兩個短的螺旋。與同源蛋白類似，AsfvPCNA主要以三聚體形式存在，其中心的孔道富含堿性氨基酸，可以像夾子一樣卡在雙鏈DNA上，并沿著DNA滑動。體外生化實驗顯示，AsfvPCNA具有很強的雙鏈DNA結合能力，其獨特的IDCL在AsfvLIG等互作蛋白的識別過程中發(fā)揮了作用，可以阻止互作蛋白從DNA上脫落，進而顯著地提高其催化效率。這些研究成果為深入理解ASFV的DNA復制機制提供了重要的結構基礎，也為開發(fā)ASFV特異性的小分子抑制劑提供了潛在的靶點。除了上述關于復制通路蛋白的研究，科研人員還對ASFV的其他關鍵蛋白結構進行了解析。例如，對ASFV表面蛋白的結構研究有助于揭示病毒與宿主細胞的相互作用機制。ASFV的表面蛋白在病毒吸附和侵入宿主細胞過程中起著關鍵作用，解析這些蛋白的結構可以明確病毒與宿主細胞受體的結合方式，為開發(fā)阻斷病毒感染的藥物或疫苗提供精準的靶點。通過X射線晶體學、冷凍電鏡等技術，科研人員已經(jīng)獲得了部分ASFV表面蛋白的高分辨率結構，發(fā)現(xiàn)這些蛋白具有獨特的結構特征，與其他病毒的表面蛋白存在明顯差異。對這些結構的深入分析，為進一步研究病毒的感染機制和開發(fā)新型防控策略提供了重要線索。二、新型冠狀病毒mRNA疫苗開發(fā)2.1mRNA疫苗的作用機制2.1.1mRNA的基本概念與特性mRNA，即信使核糖核酸（messengerRNA），作為遺傳信息從DNA傳遞到蛋白質的關鍵信使，在蛋白質合成過程中發(fā)揮著核心作用。其結構包括5’端帽子結構、5’非翻譯區(qū)（5’UTR）、編碼區(qū)、3’非翻譯區(qū)（3’UTR）和3’端多聚A尾。5’端帽子結構通常為調轉方向的7-甲基鳥苷三磷酸，通過5’ppp5’連接與mRNA原來的5’端核苷酸相連，形成m7GpppN。較復雜的帽子結構在后續(xù)一個或兩個核苷酸上還有2’-O-甲基修飾，其通式可寫為m7GpppN(m)pN(m)……。這一結構對mRNA的穩(wěn)定及其翻譯至關重要，不僅能將5’端封閉，使其免遭核酸外切酶水解，還可作為蛋白合成系統(tǒng)的辨認信號，被帽子結合蛋白（capbindingprotein，eIF-4E）識別并結合，進而促使mRNA與核糖體小亞基結合，啟動翻譯過程。5’非翻譯區(qū)是帽子與編碼區(qū)起始密碼子之間的一段較短序列，其中包含如原核生物SD序列等標志翻譯起始的序列，是翻譯起始的高度敏感區(qū)。其長度一般在100-200個核苷酸，若少于20個堿基，可能會錯過翻譯起始密碼AUG，即發(fā)生遺漏掃描（Leakyscanning）；而過長的5’UTR則容易形成過多二級結構，不利于翻譯起始。此外，5’UTR的長度還與基因類型有關，例如與信號轉導相關的基因往往具有較長的5’UTR。編碼區(qū)從起始密碼子AUG開始，到終止密碼子（UAG、UGA、UAA）截止，負責編碼一種蛋白質的一級結構。其中每三個堿基構成一個密碼子，對應編碼一個氨基酸。編碼區(qū)的二級結構和密碼子選擇都會對翻譯效率產(chǎn)生影響，過多的二級結構和稀有密碼子會降低翻譯速度，因此在基因工程表達蛋白時，通常會根據(jù)宿主的密碼子偏好性對編碼區(qū)序列進行優(yōu)化。3’非翻譯區(qū)位于終止密碼子之后，其中含有加尾信號，包括核心序列AAUAAA，以及下游10-30堿基處一段富含GU的輔助序列。該區(qū)域也參與翻譯調控，許多microRNA可與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)結合，通過降解或抑制翻譯過程來下調靶基因的表達。在動物胚胎發(fā)育過程中，眾多基因通過3’UTR中多種調控元件與相應蛋白因子的相互作用，構成復雜的調控網(wǎng)絡，對胚胎發(fā)育過程中基因表達的協(xié)調控制起著關鍵作用，例如果蠅的hunchback、nanos基因，線蟲的pal-1基因等。3’端尾部是一段多聚A序列，成熟的mRNA一般在3’端加上長度為20-200堿基的多聚A尾。這一結構可以防止外切酶降解，作為核孔轉運系統(tǒng)的標志，與成熟mRNA通過核孔轉運到胞漿密切相關。多聚腺苷酸結合蛋白（PABP）可與尾部結合，并進一步與eIF4G、eIF4B、Paip-1等多種蛋白相互作用，形成環(huán)狀復合物，參與翻譯起始過程和mRNA穩(wěn)定性調控過程。mRNA具有拷貝少、壽命短、修飾成分少的特點。由于生命過程需要多種蛋白協(xié)調作用，所以mRNA的種類繁多，且會隨細胞狀態(tài)和外界環(huán)境不斷變化。狹義的轉錄組就是指某種細胞在某種條件下所有mRNA的集合。在細胞內，mRNA的代謝過程包括轉錄、加工、轉運、翻譯和降解。mRNA首先在細胞核內以DNA為模板轉錄生成前體mRNA（pre-mRNA），pre-mRNA經(jīng)過5’端加帽、3’端加尾、剪接等加工過程，去除內含子，連接外顯子，形成成熟的mRNA。成熟mRNA通過核孔轉運到細胞質中，與核糖體結合進行翻譯，合成蛋白質。完成翻譯任務后，mRNA會被細胞內的核酸酶降解，其降解過程受到多種因素的調控，如mRNA的序列特征、結構、結合蛋白以及細胞的生理狀態(tài)等。作為疫苗載體，mRNA具有獨特的優(yōu)勢。其制備相對便捷，活性成分RNA可基于線性DNA模板，通過體外轉錄技術高效產(chǎn)出。在生產(chǎn)過程中，還可通過密碼子優(yōu)化、核苷修飾以及創(chuàng)新的輔助遞送系統(tǒng)等技術手段，顯著提升mRNA的穩(wěn)定性及翻譯效率，從而鑄就特異性卓越、穩(wěn)定性出色的核酸疫苗。mRNA疫苗整體工藝簡單，研發(fā)速度快，這使其能夠在面對突發(fā)傳染病時迅速響應，如在新冠疫情中，mRNA疫苗從病毒基因序列確定到進入臨床試驗，在短時間內就得以實現(xiàn)，展現(xiàn)出了傳統(tǒng)疫苗技術難以比擬的優(yōu)勢。mRNA疫苗在體內不會整合到宿主基因組中，降低了潛在的基因風險，安全性較高。而且，mRNA可以編碼全長蛋白質，能夠遞呈更豐富的抗原種類，避免患者MHC半抗原限制，通過串聯(lián)結構設計，多種抗原表型還可以組裝在一條mRNA鏈中，激發(fā)更全面的免疫反應。2.1.2mRNA疫苗激發(fā)免疫反應的原理mRNA疫苗進入人體后，首先需要通過特定的遞送系統(tǒng)進入細胞。目前應用最廣泛的遞送系統(tǒng)是脂質納米顆粒（LNP），LNP由可電離脂質、磷脂、膽固醇和聚乙二醇脂質等組成，能夠有效地包裹mRNA，保護其不被核酸酶降解，并促進其進入細胞。當LNP-mRNA復合物到達細胞表面時，通過內吞作用被細胞攝取，形成內體。在內體酸性環(huán)境下，LNP中的可電離脂質發(fā)生質子化，與內體膜相互作用，促使內體膜破裂，將mRNA釋放到細胞質中。進入細胞質的mRNA利用人體細胞自身的翻譯機制，以mRNA為模板，在核糖體、tRNA、各種翻譯起始因子和酶的參與下，合成病毒抗原蛋白。例如，對于新型冠狀病毒mRNA疫苗，其編碼的新冠病毒刺突蛋白（S蛋白）在細胞內被合成。合成的抗原蛋白一部分被蛋白酶體降解成短肽，這些短肽與細胞內的主要組織相容性復合體I類分子（MHC-I）結合，形成抗原肽-MHC-I復合物，轉運到細胞表面，被細胞毒性T淋巴細胞（CTL）表面的T細胞受體（TCR）識別，激活CTL，使其增殖并分化為效應CTL。效應CTL能夠特異性地識別并殺傷被病毒感染的細胞，通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質，誘導靶細胞凋亡，從而清除病毒感染。另一部分抗原蛋白則通過細胞的分泌途徑被分泌到細胞外，被抗原呈遞細胞（APC），如樹突狀細胞（DC）、巨噬細胞等攝取。APC將抗原蛋白攝取后，在細胞內進行加工處理，同樣將抗原肽與MHC-II類分子結合，形成抗原肽-MHC-II復合物，轉運到細胞表面。輔助性T淋巴細胞（Th）表面的TCR識別抗原肽-MHC-II復合物，同時Th細胞表面的共刺激分子與APC表面的相應配體結合，提供共刺激信號，激活Th細胞。激活的Th細胞分泌細胞因子，如白細胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等，這些細胞因子不僅可以促進Th細胞自身的增殖和分化，還能輔助B淋巴細胞活化、增殖和分化為漿細胞。漿細胞產(chǎn)生特異性抗體，抗體與病毒結合，通過中和病毒、凝集病毒、調理吞噬等作用，阻止病毒感染細胞，清除病毒。在這個過程中，mRNA疫苗還具有自佐劑作用。內體中的mRNA會被多種模式識別受體（PRR），如Toll樣受體3（TLR3）、TLR7和TLR8等識別。這些受體識別mRNA后，激活細胞內的信號通路，促進I型干擾素（IFN-I）和其他促炎細胞因子（如IL-6和TNF-α）的產(chǎn)生。IFN-I對mRNA的影響具有雙重性，一方面可以增強免疫細胞的活性，促進免疫反應的發(fā)生；另一方面，在一定程度上也可能影響mRNA的翻譯和穩(wěn)定性，但總體上有助于激活機體的先天性免疫和適應性免疫反應。mRNA疫苗通過在細胞內表達抗原蛋白，激活機體的細胞免疫和體液免疫反應，產(chǎn)生特異性的免疫記憶細胞，當機體再次接觸到相同的病毒時，能夠迅速啟動免疫應答，有效地預防和控制病毒感染。2.2新冠mRNA疫苗的開發(fā)過程2.2.1靶點選擇與序列設計新冠mRNA疫苗的開發(fā)，首要任務是基于新冠病毒的結構和致病機制，精準選擇合適的抗原靶點。新冠病毒（SARS-CoV-2）屬于β屬冠狀病毒，其結構包括包膜、刺突蛋白（S蛋白）、包膜蛋白（E蛋白）、膜蛋白（M蛋白）和核衣殼蛋白（N蛋白）。在這些蛋白中，S蛋白是病毒感染宿主細胞的關鍵蛋白，其受體結合域（RBD）能夠與人體細胞表面的血管緊張素轉化酶2（ACE2）受體特異性結合，介導病毒侵入細胞。大量研究表明，S蛋白是誘導機體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原，也是新冠mRNA疫苗設計的關鍵靶點。在確定以S蛋白為靶點后，需要對編碼S蛋白的mRNA序列進行優(yōu)化設計，以提高mRNA的穩(wěn)定性、翻譯效率和免疫原性。密碼子優(yōu)化是序列設計中的重要環(huán)節(jié)。由于不同物種對密碼子的使用偏好存在差異，若mRNA序列中存在大量宿主細胞不常用的稀有密碼子，會導致翻譯過程中轉運RNA（tRNA）供應不足，從而降低翻譯效率。通過生物信息學分析，根據(jù)人體細胞的密碼子使用頻率，對編碼S蛋白的mRNA序列進行密碼子優(yōu)化，用高頻密碼子替換稀有密碼子，可顯著提高mRNA的翻譯效率。例如，在對新冠mRNA疫苗的研究中，將mRNA序列中的部分稀有密碼子替換為常用密碼子后，在體外細胞實驗和動物實驗中，蛋白表達水平明顯提高，免疫原性也得到增強。添加特定的非翻譯區(qū)（UTR）序列也對mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率有著重要影響。5’UTR和3’UTR雖然不編碼蛋白質，但它們包含許多順式作用元件，能夠與各種反式作用因子相互作用，調控mRNA的轉錄、加工、轉運、翻譯和降解。在5’UTR中添加合適的元件，如帽子結構類似物、內部核糖體進入位點（IRES）等，可以增強mRNA與核糖體的結合能力，促進翻譯起始。在3’UTR中添加富含AU的元件或與特定蛋白結合的序列，可以增加mRNA的穩(wěn)定性，延長其半衰期。研究發(fā)現(xiàn)，在新冠mRNA疫苗的mRNA序列中，優(yōu)化5’UTR和3’UTR的長度和序列組成，能夠提高mRNA在體內的穩(wěn)定性和翻譯效率，增強疫苗的免疫效果。修飾核苷堿基也是優(yōu)化mRNA序列的重要手段。天然的mRNA容易被核酸酶降解，且在體內可能引發(fā)免疫反應。通過對mRNA中的核苷堿基進行修飾，如將尿苷修飾為假尿苷、N1-甲基-假尿苷等，可以降低mRNA的免疫原性，提高其穩(wěn)定性。這些修飾后的核苷堿基能夠改變mRNA的二級結構，使其更難被核酸酶識別和降解。修飾后的mRNA在體內的翻譯效率也有所提高，因為它們能夠更好地與翻譯相關的蛋白和因子相互作用。在臨床研究中，使用修飾核苷堿基的新冠mRNA疫苗，不僅安全性得到了保障，免疫原性也得到了顯著提升。2.2.2生產(chǎn)工藝與質量控制新冠mRNA疫苗的生產(chǎn)是一個復雜且精細的過程，主要包括mRNA的合成、純化，以及疫苗制劑的制備等關鍵步驟。mRNA的合成通常采用體外轉錄（IVT）技術，以線性化的DNA為模板，在RNA聚合酶（如T7RNA聚合酶）、核苷三磷酸（NTPs）、核糖核酸酶抑制劑等物質的參與下，在體外合成mRNA。在這一過程中，DNA模板的質量至關重要，其純度、完整性和序列準確性直接影響mRNA的合成效率和質量。為了獲得高質量的DNA模板，需要通過基因克隆技術將編碼抗原的基因插入到合適的質粒載體中，然后在大腸桿菌中進行擴增。經(jīng)過一系列的純化步驟，如堿裂解法、柱層析法等，去除雜質和內毒素，得到高純度的質粒DNA。再使用限制性內切酶將質粒線性化，使其能夠作為IVT反應的模板。IVT反應體系的優(yōu)化也對mRNA的合成產(chǎn)量和質量有著重要影響。反應體系中的NTPs濃度、RNA聚合酶的活性和用量、反應溫度和時間等因素都需要進行精確控制。適當提高NTPs的濃度可以增加mRNA的合成量，但過高的濃度可能導致反應副產(chǎn)物的增加，影響mRNA的純度。RNA聚合酶的活性和用量直接決定了轉錄效率，需要根據(jù)實際情況進行優(yōu)化選擇。反應溫度和時間也需要根據(jù)酶的特性和mRNA的序列特點進行調整，以確保mRNA的合成效率和完整性。合成后的mRNA需要進行純化，以去除反應體系中的雜質，如未反應的NTPs、DNA模板、RNA聚合酶、雙鏈RNA（dsRNA）等。常用的純化方法包括氯化鋰沉淀法、高效液相色譜法（HPLC）、磁珠法和陰離子交換法等。氯化鋰沉淀法利用mRNA在高濃度氯化鋰溶液中的溶解度較低的特性，將mRNA沉淀下來，從而與雜質分離。這種方法操作簡單，但純化效果相對較差，可能會殘留一些雜質。HPLC法通過利用不同物質在固定相和流動相之間的分配系數(shù)差異，對mRNA進行分離純化，能夠獲得高純度的mRNA，但設備昂貴，成本較高。磁珠法利用磁珠表面的特異性基團與mRNA結合，通過磁場分離磁珠，實現(xiàn)mRNA的純化，具有操作簡便、快速的優(yōu)點。陰離子交換法利用mRNA帶負電荷的特性，在特定的緩沖液條件下，與陰離子交換樹脂結合，然后通過洗脫將mRNA分離出來，純化效果較好。在實際生產(chǎn)中，通常會采用多種純化方法相結合的方式，以獲得高純度、高質量的mRNA。疫苗制劑的制備是將純化后的mRNA與脂質納米顆粒（LNP）等遞送載體結合，形成穩(wěn)定的疫苗制劑。LNP由可電離脂質、磷脂、膽固醇和聚乙二醇脂質等組成，能夠有效地包裹mRNA，保護其不被核酸酶降解，并促進其進入細胞。在制備LNP-mRNA復合物時，需要精確控制脂質與mRNA的比例、制備工藝和條件等因素。不同的脂質組成和比例會影響LNP的粒徑、電荷、穩(wěn)定性和轉染效率。通過微流控技術等方法，將脂質和mRNA在特定的條件下混合，形成均勻的LNP-mRNA復合物。在制備過程中，還需要對復合物的粒徑、電位、包封率等參數(shù)進行監(jiān)測和控制，以確保疫苗制劑的質量和穩(wěn)定性。質量控制貫穿于新冠mRNA疫苗生產(chǎn)的全過程，是確保疫苗安全性和有效性的關鍵環(huán)節(jié)。在原材料方面，對DNA模板、NTPs、脂質等原材料的質量進行嚴格把控，檢測其純度、含量、雜質等指標，確保符合生產(chǎn)要求。對于DNA模板，需要進行測序驗證，確保其序列準確無誤；對NTPs的純度和含量進行檢測，避免因雜質影響mRNA的合成。在mRNA原液階段，需要對mRNA的含量、純度、完整性、加帽率、poly(A)長度及分布等進行檢測。mRNA的含量可以通過紫外分光光度法或熒光定量PCR法進行測定；純度檢測可以采用瓊脂糖凝膠電泳、毛細管電泳等方法，檢測是否存在雜質RNA和dsRNA；加帽率的測定通常采用液相色譜-質譜聯(lián)用技術（LC-MS），加帽率直接影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。在疫苗制劑階段，需要檢測疫苗的外觀、pH值、無菌性、細菌內毒素、粒徑分布、包封率、mRNA含量等指標。外觀檢查主要觀察疫苗是否有渾濁、沉淀等異?，F(xiàn)象；pH值的檢測確保疫苗處于合適的酸堿度范圍，以保證其穩(wěn)定性；無菌檢測和細菌內毒素檢測是保證疫苗安全性的重要指標；粒徑分布和包封率的檢測可以通過動態(tài)光散射技術（DLS）等方法進行，確保LNP-mRNA復合物的質量和穩(wěn)定性。通過嚴格的質量控制，確保每一批新冠mRNA疫苗都符合質量標準，為其安全有效地應用于臨床提供保障。2.2.3臨床前研究與臨床試驗臨床前研究是新冠mRNA疫苗進入臨床試驗前的重要階段，主要在動物模型上進行安全性和有效性研究，為后續(xù)的臨床試驗提供重要依據(jù)。在安全性研究方面，通常會選用多種動物模型，如小鼠、大鼠、食蟹猴等。小鼠模型具有繁殖快、成本低、遺傳背景清晰等優(yōu)點，常用于初步的安全性評估。通過肌肉注射或皮下注射等途徑給予小鼠不同劑量的mRNA疫苗，觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、活動等情況，監(jiān)測是否出現(xiàn)不良反應，如發(fā)熱、體重下降、局部紅腫等。對小鼠進行血液學、血液生化和組織病理學檢查，評估疫苗對小鼠的血液系統(tǒng)、肝腎功能以及各組織器官的影響。在血液學檢查中，檢測血常規(guī)指標，如白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血小板計數(shù)等，觀察是否存在血液學異常；血液生化檢查主要檢測肝功能指標（如谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶）、腎功能指標（如肌酐、尿素氮）等，評估疫苗對肝腎功能的影響。組織病理學檢查則通過對小鼠的心、肝、脾、肺、腎等主要組織器官進行切片、染色，觀察組織形態(tài)學變化，判斷是否存在炎癥、損傷等病理改變。大鼠模型在安全性研究中也具有重要作用，其生理和代謝特點與人類更為接近。在大鼠模型中，同樣進行上述各項安全性指標的檢測，進一步驗證疫苗在不同動物模型中的安全性。食蟹猴模型由于其與人類在進化上的親緣關系較近，生理和免疫反應更接近人類，因此在疫苗安全性評價中具有獨特的價值。在食蟹猴實驗中，除了進行常規(guī)的安全性檢測外，還會重點關注疫苗對免疫系統(tǒng)的影響，如檢測免疫細胞的數(shù)量和功能變化，觀察是否存在免疫相關的不良反應，如過敏反應、自身免疫性疾病等。有效性研究主要通過動物攻毒實驗來評估新冠mRNA疫苗的保護效果。在動物攻毒實驗中，首先對動物進行免疫接種，給予不同劑量的mRNA疫苗，按照預定的免疫程序進行多次接種。在完成免疫接種后，經(jīng)過一段時間的觀察，使動物體內產(chǎn)生免疫反應。然后，使用新冠病毒對免疫后的動物進行攻擊，觀察動物的感染情況和疾病發(fā)展進程。通過檢測動物體內的病毒載量，如采集動物的鼻咽拭子、肺組織等樣本，采用實時熒光定量PCR等技術檢測病毒核酸的含量，評估疫苗對病毒感染的抑制效果。觀察動物的發(fā)病癥狀，如體溫變化、呼吸狀況、精神狀態(tài)等，判斷疫苗是否能夠減輕動物的發(fā)病程度。在動物攻毒實驗中，還會檢測動物體內的免疫指標，如中和抗體水平、細胞免疫反應等，分析疫苗誘導的免疫反應與保護效果之間的關系。中和抗體能夠特異性地結合病毒，阻止病毒感染細胞，是評估疫苗有效性的重要指標之一。通過檢測動物血清中的中和抗體滴度，了解疫苗誘導中和抗體產(chǎn)生的能力。細胞免疫反應在抗病毒感染中也發(fā)揮著重要作用，通過檢測免疫細胞（如T淋巴細胞）的活性和數(shù)量變化，評估疫苗對細胞免疫的激活作用。臨床試驗是驗證新冠mRNA疫苗安全性和有效性的關鍵環(huán)節(jié)，通常分為I、II、III期臨床試驗，每個階段都有明確的目的、方法和主要結果。I期臨床試驗主要目的是評估疫苗的安全性和初步的免疫原性，確定疫苗的安全劑量范圍。通常會選擇少量的健康志愿者（一般為20-100人）參與試驗。試驗采用不同的劑量組，給予志愿者不同劑量的mRNA疫苗，觀察志愿者在接種后的不良反應發(fā)生情況，包括局部不良反應（如注射部位疼痛、紅腫、硬結等）和全身不良反應（如發(fā)熱、頭痛、乏力、肌肉酸痛等）。對不良反應的發(fā)生頻率、嚴重程度進行詳細記錄和分析，確定疫苗的最大耐受劑量。在免疫原性方面，檢測志愿者接種疫苗后體內的免疫反應指標，如中和抗體水平、T細胞免疫反應等。通過ELISA等方法檢測血清中的中和抗體滴度，觀察抗體產(chǎn)生的時間、水平和持續(xù)時間；采用流式細胞術等技術檢測T淋巴細胞的活性和數(shù)量變化，評估疫苗對細胞免疫的激活作用。I期臨床試驗的結果為后續(xù)II期臨床試驗的劑量選擇和免疫程序設計提供重要參考。II期臨床試驗在I期臨床試驗的基礎上，進一步擴大樣本量（一般為幾百人），主要目的是評估疫苗的免疫原性和初步的有效性，優(yōu)化疫苗的劑量和免疫程序。在II期臨床試驗中，會設置不同的劑量組和免疫程序組，如不同的接種劑量、接種次數(shù)和接種間隔時間等。通過比較不同組別的免疫反應指標和不良反應發(fā)生情況，確定最佳的疫苗劑量和免疫程序。在免疫原性評估方面，除了檢測中和抗體水平和T細胞免疫反應外，還會關注免疫記憶的產(chǎn)生情況，如檢測接種疫苗后一段時間內再次接觸抗原時的免疫反應增強情況。在有效性評估方面，通過對部分志愿者進行密切的健康監(jiān)測，觀察接種疫苗后是否能夠降低感染新冠病毒的風險，初步評估疫苗的保護效力。II期臨床試驗的結果為III期臨床試驗的設計和實施提供重要依據(jù)。III期臨床試驗是大規(guī)模的隨機對照試驗，樣本量通常達到數(shù)千人甚至數(shù)萬人，主要目的是全面評估疫苗的有效性和安全性，為疫苗的上市許可提供關鍵數(shù)據(jù)。在III期臨床試驗中，采用隨機、雙盲、安慰劑對照的設計原則，將受試者隨機分為疫苗接種組和安慰劑對照組。疫苗接種組給予預定劑量和免疫程序的mRNA疫苗，安慰劑對照組給予外觀和劑型與疫苗相同的安慰劑。在試驗期間，對所有受試者進行密切的健康監(jiān)測，記錄感染新冠病毒的情況，包括確診病例數(shù)、癥狀嚴重程度等。通過比較疫苗接種組和安慰劑對照組的感染率，計算疫苗的保護效力。在安全性方面，全面收集受試者在接種疫苗后的不良反應信息，包括罕見的不良反應和長期的不良反應，對疫苗的安全性進行更深入、全面的評估。III期臨床試驗的結果是決定疫苗是否能夠獲得上市許可的關鍵依據(jù)。例如，輝瑞和BioNTech合作開發(fā)的mRNA新冠疫苗Comirnaty（BNT162b2）在III期臨床試驗中，對43448名受試者進行了研究，結果顯示該疫苗對預防新冠感染的有效率高達95%，在安全性方面，常見的不良反應包括注射部位疼痛、疲勞、頭痛、肌肉疼痛等，大多數(shù)為輕度至中度，且持續(xù)時間較短。Moderna公司的Spikevax（mRNA-1273）在III期臨床試驗中，對30420名受試者進行了研究，疫苗的有效率為94.1%，安全性方面也表現(xiàn)良好。這些III期臨床試驗的結果為mRNA新冠疫苗的廣泛應用提供了堅實的科學依據(jù)。2.3開發(fā)過程中的挑戰(zhàn)與應對策略2.3.1技術難題，如穩(wěn)定性、遞送系統(tǒng)等mRNA疫苗開發(fā)過程中面臨著諸多技術難題，mRNA本身穩(wěn)定性差、易降解的問題尤為突出。mRNA是一種單鏈核酸分子，其化學結構使其在體內外環(huán)境中容易受到核酸酶的攻擊而降解。核酸酶廣泛存在于人體組織、細胞和體液中，它們能夠識別并切割mRNA的磷酸二酯鍵，導致mRNA的完整性遭到破壞。mRNA的不穩(wěn)定性還與其結構特點有關，其5’端帽子結構和3’端多聚A尾如果受到損傷或不完整，會顯著降低mRNA的穩(wěn)定性。例如，在體外轉錄合成mRNA的過程中，如果加帽效率不高，或者多聚A尾的長度不足，都會使mRNA更容易被核酸酶降解。mRNA在儲存和運輸過程中，也容易受到溫度、濕度、光照等環(huán)境因素的影響，進一步降低其穩(wěn)定性。在高溫環(huán)境下，mRNA的二級結構會發(fā)生改變，導致其更容易被降解；而在高濕度環(huán)境中，水分會加速核酸酶的活性，對mRNA造成損害。將mRNA高效遞送至靶細胞也是mRNA疫苗開發(fā)的關鍵技術難題之一。mRNA是一種大分子物質，難以自行穿過細胞膜進入細胞。為了實現(xiàn)mRNA的有效遞送，需要借助合適的遞送系統(tǒng)。目前，脂質納米顆粒（LNP）是應用最廣泛的mRNA遞送載體，但它仍存在一些局限性。LNP的潛在毒性和免疫原性問題不容忽視，其組成成分中的可電離脂質、磷脂等在體內可能會引發(fā)免疫反應，導致不良反應的發(fā)生。研究表明，某些可電離脂質在體內會激活免疫系統(tǒng)的模式識別受體，引發(fā)炎癥反應，影響疫苗的安全性。LNP的靶向性相對較差，難以將mRNA精準地遞送至特定的靶細胞。在體內，LNP-mRNA復合物可能會被非靶細胞攝取，降低了疫苗的有效性，同時也可能增加不良反應的發(fā)生風險。此外，LNP的制備工藝較為復雜，質量控制難度較大，不同批次之間的質量差異可能會影響疫苗的穩(wěn)定性和有效性。為了解決mRNA穩(wěn)定性差的問題，科研人員采取了一系列有效的策略。對mRNA進行化學修飾是提高其穩(wěn)定性的重要手段。將尿苷修飾為假尿苷、N1-甲基-假尿苷等，能夠改變mRNA的結構，降低其被核酸酶識別和降解的可能性。修飾后的核苷堿基能夠增加mRNA的堿基堆積力，使mRNA的二級結構更加穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，使用假尿苷修飾的mRNA在體內的半衰期明顯延長，翻譯效率也有所提高。優(yōu)化mRNA的結構設計也有助于提高其穩(wěn)定性。合理調整5’UTR和3’UTR的長度和序列組成，添加特定的順式作用元件，能夠增強mRNA與細胞內保護蛋白的結合能力，減少核酸酶的攻擊。通過生物信息學分析，設計出具有穩(wěn)定二級結構的mRNA序列，也可以提高mRNA的穩(wěn)定性。在遞送系統(tǒng)方面，科研人員不斷探索創(chuàng)新，以克服現(xiàn)有技術的局限性。開發(fā)新型的納米材料作為mRNA遞送載體是研究的熱點之一。例如，聚合物納米顆粒、無機納米顆粒等具有獨特的物理化學性質，可能具有更低的毒性和更好的靶向性。聚合物納米顆?？梢酝ㄟ^調整聚合物的組成和結構，實現(xiàn)對mRNA的高效包封和穩(wěn)定遞送。一些聚合物納米顆粒還可以通過表面修飾，引入靶向配體，實現(xiàn)對特定靶細胞的靶向遞送。無機納米顆粒如金納米顆粒、二氧化硅納米顆粒等，具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性，也被用于mRNA遞送系統(tǒng)的研究。金納米顆?？梢酝ㄟ^表面修飾與mRNA結合，形成穩(wěn)定的復合物，并且其表面可以連接靶向分子，提高遞送的靶向性。對LNP進行優(yōu)化也是提高mRNA遞送效率的重要途徑。通過調整LNP的脂質組成和比例，優(yōu)化制備工藝，可以改善LNP的性能。研究發(fā)現(xiàn)，改變可電離脂質的結構和比例，能夠調節(jié)LNP的電荷和粒徑，提高其對mRNA的包封效率和穩(wěn)定性。在LNP表面修飾靶向配體，如抗體、適配體等，可以增強LNP對靶細胞的特異性識別和結合能力，實現(xiàn)靶向遞送。2.3.2臨床試驗的不確定性臨床試驗是驗證新冠mRNA疫苗安全性和有效性的關鍵環(huán)節(jié)，但在這個過程中面臨著諸多不確定性。受試者招募困難是臨床試驗中常見的問題之一。新冠mRNA疫苗的臨床試驗通常需要大量的受試者，以確保試驗結果的可靠性和統(tǒng)計學意義。在實際招募過程中，受到多種因素的影響，導致受試者招募進度緩慢。公眾對新冠mRNA疫苗的認知和接受程度較低是一個重要因素。由于mRNA疫苗是一種新型疫苗技術，許多人對其原理、安全性和有效性存在疑慮，擔心接種疫苗后會出現(xiàn)不良反應，因此對參與臨床試驗持謹慎態(tài)度。一些地區(qū)的文化和宗教信仰也可能影響公眾對疫苗臨床試驗的參與意愿。例如，某些宗教信仰認為接種疫苗違背教義，導致部分人群不愿意參與試驗。此外，臨床試驗的嚴格入選標準和排除標準也限制了受試者的招募范圍。為了確保試驗結果的準確性和可靠性，臨床試驗通常對受試者的年齡、健康狀況、病史等有嚴格的要求，這使得符合條件的受試者數(shù)量相對較少。疫苗不良反應的監(jiān)測與評估也是臨床試驗中的關鍵問題。新冠mRNA疫苗在臨床試驗中可能會出現(xiàn)各種不良反應，包括局部不良反應（如注射部位疼痛、紅腫、硬結等）和全身不良反應（如發(fā)熱、頭痛、乏力、肌肉酸痛、過敏反應等）。準確監(jiān)測和評估這些不良反應的發(fā)生頻率、嚴重程度和因果關系，對于判斷疫苗的安全性至關重要。在實際監(jiān)測過程中，存在一些困難和挑戰(zhàn)。不良反應的表現(xiàn)形式多樣，有些不良反應可能較為隱匿，難以被及時發(fā)現(xiàn)和識別。例如，一些輕微的過敏反應可能僅表現(xiàn)為皮膚瘙癢、皮疹等，容易被忽視。不良反應的發(fā)生時間也具有不確定性，有些不良反應可能在接種后立即出現(xiàn)，而有些則可能在數(shù)天甚至數(shù)周后才出現(xiàn)。這就需要對受試者進行長期、密切的隨訪觀察，增加了監(jiān)測的難度和成本。此外，確定不良反應與疫苗之間的因果關系也較為復雜。受試者在接種疫苗后，可能同時暴露于其他因素，如感染其他疾病、使用其他藥物等，這些因素都可能導致不良反應的發(fā)生，使得判斷不良反應是否由疫苗引起變得困難。不同人群的免疫反應差異也是臨床試驗中需要關注的問題。由于個體的遺傳背景、年齡、健康狀況、生活方式等因素的不同，不同人群對新冠mRNA疫苗的免疫反應存在差異。年齡是影響免疫反應的重要因素之一。老年人的免疫系統(tǒng)功能相對較弱，對疫苗的免疫應答能力可能不如年輕人。研究表明，老年人接種新冠mRNA疫苗后，產(chǎn)生的中和抗體水平相對較低，免疫保護效果可能不如年輕人?；加谢A疾病的人群，如糖尿病、高血壓、心血管疾病等，其免疫系統(tǒng)也可能受到影響，導致對疫苗的免疫反應降低。一些藥物也可能影響疫苗的免疫效果。例如，免疫抑制劑會抑制免疫系統(tǒng)的功能，降低疫苗的免疫原性。不同種族和民族之間的遺傳差異也可能導致免疫反應的不同。研究發(fā)現(xiàn)，某些種族和民族對特定疫苗的免疫反應存在差異，這可能與遺傳因素有關。這些不同人群的免疫反應差異，給臨床試驗的設計和結果分析帶來了挑戰(zhàn)，需要在試驗中充分考慮這些因素，以確保疫苗在不同人群中的安全性和有效性。2.3.3應對策略與解決方案針對新冠mRNA疫苗開發(fā)過程中面臨的諸多挑戰(zhàn)，科研人員、醫(yī)療機構和監(jiān)管部門采取了一系列應對策略與解決方案。在技術改進方面，持續(xù)優(yōu)化mRNA序列和遞送系統(tǒng)。通過深入研究mRNA的結構與功能關系，運用先進的生物信息學算法和實驗技術，進一步優(yōu)化mRNA序列。利用機器學習算法對大量的mRNA序列數(shù)據(jù)和免疫反應數(shù)據(jù)進行分析，預測不同mRNA序列的免疫原性和穩(wěn)定性，從而更精準地設計出具有高免疫原性和穩(wěn)定性的mRNA序列。在遞送系統(tǒng)方面，加大對新型納米材料和遞送技術的研發(fā)投入。探索基于生物可降解聚合物、脂質-聚合物雜化材料等新型納米材料的遞送系統(tǒng)，這些材料具有更好的生物相容性和更低的免疫原性。開發(fā)基于外泌體、病毒樣顆粒等天然載體的遞送技術，利用它們天然的靶向性和低免疫原性優(yōu)勢，提高mRNA的遞送效率。還可以結合多種遞送技術，如將LNP與靶向配體修飾、物理靶向技術（如超聲靶向、磁靶向等）相結合，實現(xiàn)mRNA的高效、精準遞送。在臨床試驗設計優(yōu)化方面，采取多種措施提高受試者招募效率和試驗結果的準確性。加強對公眾的科普宣傳，通過多種渠道，如媒體報道、社區(qū)宣傳、專家講座等，向公眾普及新冠mRNA疫苗的科學知識，包括疫苗的作用機制、安全性和有效性等方面的信息，消除公眾的疑慮，提高公眾對疫苗臨床試驗的認知和接受程度。優(yōu)化臨床試驗的入選標準和排除標準，在確保試驗科學性的前提下，適當放寬標準，擴大受試者招募范圍。采用靈活的招募策略，如與社區(qū)醫(yī)療機構、企業(yè)、學校等合作，開展多中心招募，提高招募效率。在不良反應監(jiān)測方面，建立完善的不良反應監(jiān)測體系。采用先進的監(jiān)測技術和設備，如遠程監(jiān)測系統(tǒng)、智能穿戴設備等，對受試者進行實時、動態(tài)的監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)和記錄不良反應。加強對醫(yī)護人員的培訓，提高他們對不良反應的識別和判斷能力。建立獨立的不良反應評估委員會，由專業(yè)的醫(yī)學專家組成，對不良反應進行客觀、公正的評估，確定其與疫苗的因果關系。針對不同人群的免疫反應差異，在臨床試驗設計中充分考慮人群特征，進行分層分析。根據(jù)年齡、性別、健康狀況、種族等因素，將受試者分為不同的亞組，分別評估疫苗在各亞組中的免疫原性和安全性，為不同人群的疫苗接種提供更有針對性的依據(jù)。相關政策和法規(guī)也為新冠mRNA疫苗的研發(fā)和臨床試驗提供了重要的支持與保障。政府部門和監(jiān)管機構出臺了一系列鼓勵政策，加大對新冠mRNA疫苗研發(fā)的資金投入，設立專項科研基金，支持科研機構和企業(yè)開展相關研究。對從事新冠mRNA疫苗研發(fā)的企業(yè)給予稅收優(yōu)惠、政策扶持等，降低企業(yè)的研發(fā)成本，提高企業(yè)的研發(fā)積極性。監(jiān)管機構建立了快速審批通道，簡化審批流程，提高審批效率。在確保疫苗安全性和有效性的前提下，加快新冠mRNA疫苗的上市進程，使其能夠盡快投入使用，為疫情防控提供有力支持。監(jiān)管機構還加強了對疫苗研發(fā)和生產(chǎn)過程的質量監(jiān)管，制定嚴格的質量標準和規(guī)范，確保每一批疫苗都符合質量要求。定期對疫苗生產(chǎn)企業(yè)進行檢查和評估，對不符合要求的企業(yè)進行整改或處罰，保障疫苗的質量和安全。三、非洲豬瘟關鍵蛋白結構解析3.1非洲豬瘟病毒概述3.1.1病毒的結構與特點非洲豬瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus，ASFV）屬于非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬，是該屬的唯一成員。其病毒粒子直徑為175-215nm，呈二十面體對稱，具有獨特而復雜的五層結構，從外到內分別是外膜、衣殼、內膜、核殼以及核心。外膜由病毒穿過細胞膜出芽時形成，主要成分是脂質和蛋白質，它對病毒粒子起到保護作用，同時在病毒感染宿主細胞的過程中發(fā)揮著重要作用，參與病毒與宿主細胞的識別和融合過程。衣殼是病毒的重要結構，由多種蛋白組成，為病毒提供結構穩(wěn)定性。通過冷凍電鏡技術解析發(fā)現(xiàn)，非洲豬瘟病毒衣殼由20個三重對稱殼粒聚集體（Trisymmetron）和12個五重對稱殼粒聚集體（Pentasymmetron）組成。其中，每個Trisymmetron由135個殼粒（Capsomer）組成，而每個Pentasymmetron由30個殼粒和1個五鄰體（Penton）組成。主要衣殼蛋白p72是衣殼上含量最高的蛋白，位于衣殼的外層，是一種典型的雙“果凍卷”（Jelly-roll，JR）結構分子，以三聚體形式存在，形成了Trisymmetron、Pentasymmetron的基本單位——殼粒。五鄰體蛋白位于5次軸的頂點，推測可能對應于非洲豬瘟病毒中的H240R蛋白。此外，衣殼內部還有三個不同的次要衣殼蛋白P1、P2和P3，它們在衣殼內部形成復雜的相互作用網(wǎng)絡，像“膠水”一樣連接著相鄰的殼粒，穩(wěn)定衣殼的整體結構。P1位于Trisymmetron和Pentasymmetron區(qū)域相鄰的p72三聚體（殼粒）間隙，每一個p72蛋白結合一個P1蛋白；P2是一條長約100nm的纖維狀蛋白，沿著Trisymmetrons的邊緣延伸，相鄰的P2蛋白及其之間的區(qū)域組成了衣殼的“拉鏈”區(qū)域（Zipper）；在“拉鏈”區(qū)域連接各個殼粒的次要衣殼蛋白P3與P1結構不同。內膜處于衣殼和核殼之間，同樣對病毒起到保護作用，并且在病毒的裝配和成熟過程中發(fā)揮著關鍵作用。核殼包裹著病毒的核心，由蛋白質和核酸組成，對病毒基因組起到保護作用。核心包含病毒的雙鏈DNA基因組，長度從170kb到193kb不等，包含150-167個開放閱讀框架。基因組由一個125kb左右的保守中心區(qū)域和兩個編碼五個多基因家族（MGFs）的可變末端組成。MGFs中長達20kb的區(qū)域是基因刪除和插入的區(qū)域，這些區(qū)域可能有助于產(chǎn)生抗原變異，幫助ASFV逃避宿主免疫系統(tǒng)。ASFV在pH值4-10下，在無血清培養(yǎng)基中保持穩(wěn)定，但pH值低于4或者高于11.5，病毒幾分鐘內就會被滅活。該病毒在5°C（41°F）血清中下可保持存活6年，并能在pH值13.4條件下，25%的血清培養(yǎng)基下存活數(shù)日。ASFV通過加熱在60°C（140°F）30分鐘或56°C（133°F）70分鐘可被滅活。許多有機溶劑可以通過破壞囊膜使病毒失活，但ASFV能夠抵抗蛋白酶和核酸酶降解。ASFV田間分離毒株必須通過豬的單核細胞和巨噬細胞分離鑒定，病毒在普通細胞中不能復制。為了研究目的，多株ASFV已經(jīng)在非洲綠猴腎穩(wěn)定細胞系中適應生長，包括VERO、MS和CV-1細胞。最近，多個豬單核細胞起源的細胞系已經(jīng)開發(fā)用于研究，例如COS-1細胞系已用于田間分離株的檢測、生長和滴度測定，以及實驗室工程ASFV毒株傳代。然而，合適的細胞系尚未分離或開發(fā)出來，使得病毒或潛在的實驗疫苗可以在其中復制而無需改變其基因組的免疫原性，這仍然是ASFV研究和疫苗研發(fā)的一個重大障礙。3.1.2病毒的傳播途徑與危害非洲豬瘟病毒的傳播途徑多樣，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了極大的防控難度。發(fā)病豬和帶毒豬是主要傳染源，發(fā)病豬的組織和體液中含有高滴度的病毒，可通過唾液、淚液、鼻腔分泌物、尿液、糞便和生殖道分泌物將病毒排出體外。感染豬的豬肉產(chǎn)品，被病毒污染的飼料、飲水、泔水、欄舍、車輛、器具、衣物等也能夠攜帶病毒，間接感染健康豬。其傳播方式主要包括以下幾種：一是經(jīng)口傳播，這是最重要的傳播途徑，主要通過攝入飼料和/或接觸受病毒顆粒污染的污染物/物體。攝入被Georgia2007/1毒株污染的飼料的豬感染的最低感染劑量為104TCID50，中位數(shù)為106.8TCID50；飲用水中ASFV的最小感染劑量僅為1TCID50，中位數(shù)為10TCID50，表明通過飲用水傳播ASFV比通過飼料傳播更有效。歷史上，飼喂人類食物殘渣或泔水已被證明是ASFV傳播的重要途徑，被感染野豬污染的新鮮草和種子也是散養(yǎng)豬的潛在感染源。二是氣溶膠傳播，感染的豬通過排泄物和分泌物將病毒傳播到環(huán)境中，在急性期，口腔液、鼻液、糞便和尿液中的病毒載量特別高。當豬出現(xiàn)打噴嚏和/或咳嗽等呼吸道癥狀時，這些分泌物可能會變成攜帶病毒的氣溶膠；當被病毒污染的糞便或尿液干燥時，動物活動引起的灰塵也會產(chǎn)生攜帶病毒的氣溶膠。ASFV在空氣中的半衰期為19.2分鐘（qPCR試驗），可在感染豬和易感豬之間傳播長達2.3米的距離，說明ASFV可以在豬場內以氣溶膠的形式傳播。三是醫(yī)源性傳播，ASFV可以通過受污染的獸醫(yī)設備/材料（例如用于接種疫苗的針頭）從感染豬傳播到易感豬，但醫(yī)源性感染的有效性及其在ASFV流行病學中的重要性仍不清楚。四是通過精液傳播，雖然沒有直接證據(jù)表明ASFV是通過精液傳播的，但有研究表明，可以在感染公豬的精液中檢測到ASFV。五是通過昆蟲傳播，ASFV可以在蜱（鈍緣蜱屬）中復制，蜱是最常見的病毒載體，這些蜱生活在野豬的巢穴中，成蟲可以存活數(shù)十年，并能在不吃東西的情況下存活很長時間，使得鈍緣蜱成為病毒的理想宿主。螫蠅（廄螫蠅）可以通過機械方式將病毒傳播給易感豬，也可以通過叮咬傳播，目前蒼蠅在ASF流行病學和傳播中的作用尚不完全清楚。最近的研究表明，ASF可能在水蛭（水蛭屬）和臭蟲（科：獵蝽科，亞科：錐獵蝽亞科）中持續(xù)存在。非洲豬瘟對養(yǎng)豬業(yè)造成的危害是毀滅性的。1921年ASFV在肯尼亞首次被報道后，逐漸傳播至全球多個國家和地區(qū)。2018年傳入我國，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大沖擊。疫情導致大量生豬死亡或被撲殺，豬場存欄量急劇下降。據(jù)相關統(tǒng)計，我國在疫情高峰期生豬存欄量下降幅度超過[X]%，許多中小規(guī)模養(yǎng)豬場因疫情倒閉。非洲豬瘟還對全球養(yǎng)豬業(yè)產(chǎn)生了深遠影響，國際貿(mào)易受阻，許多國家對疫情發(fā)生國的豬肉及其制品實施進口禁令，導致全球豬肉市場供應不穩(wěn)定，價格波動劇烈。非洲豬瘟疫情還對相關產(chǎn)業(yè)鏈，如飼料生產(chǎn)、肉類加工、運輸?shù)刃袠I(yè)造成了連鎖反應，導致產(chǎn)業(yè)上下游企業(yè)的經(jīng)營受到?jīng)_擊，就業(yè)崗位減少。疫情使得飼料需求下降，飼料生產(chǎn)企業(yè)面臨產(chǎn)能過剩的問題；肉類加工企業(yè)因原料供應不足，生產(chǎn)規(guī)模受限；運輸行業(yè)因生豬和豬肉運輸量減少，業(yè)務量大幅下滑。非洲豬瘟不僅給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，也對全球糧食安全和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的穩(wěn)定發(fā)展構成了嚴重威脅。3.2關鍵蛋白的篩選與確定3.2.1與病毒復制、感染相關的蛋白在非洲豬瘟病毒的復雜生命周期中，眾多蛋白各司其職，協(xié)同作用，其中一些蛋白對病毒的復制和感染宿主細胞起著不可或缺的關鍵作用。從病毒吸附和侵入宿主細胞的初始階段來看，病毒表面的多種蛋白發(fā)揮著重要作用。例如，表面糖蛋白p12和p54在病毒與宿主細胞的識別和結合過程中扮演關鍵角色。p12是一種小分子蛋白，它能夠與宿主細胞表面的特定受體相互作用，介導病毒的吸附過程。研究表明，p12蛋白的結構具有高度特異性，其特定的氨基酸序列和空間構象使其能夠精確地識別并結合宿主細胞表面的受體分子，為病毒的侵入創(chuàng)造條件。p54蛋白同樣參與病毒的吸附過程，它與p12蛋白協(xié)同作用，增強病毒與宿主細胞的結合力。通過冷凍電鏡技術對p54蛋白的結構解析發(fā)現(xiàn)，p54蛋白具有獨特的結構域，這些結構域能夠與宿主細胞表面的受體分子形成穩(wěn)定的相互作用，促進病毒的吸附和侵入。進入宿主細胞后，病毒的脫殼過程是病毒感染的關鍵步驟之一，這一過程涉及到多種蛋白的參與。病毒的外膜和蛋白衣殼需要在特定條件下被破壞，以暴露出病毒的核心基因組，從而實現(xiàn)病毒基因組的釋放和后續(xù)的復制過程。研究發(fā)現(xiàn)，病毒編碼的一些蛋白酶可能參與了脫殼過程，它們能夠降解病毒的外膜和蛋白衣殼，為病毒基因組的釋放創(chuàng)造條件。非洲豬瘟病毒編碼的一種半胱氨酸蛋白酶可能在脫殼過程中發(fā)揮重要作用，它能夠特異性地切割病毒外膜和蛋白衣殼中的關鍵蛋白，導致病毒結構的破壞和基因組的釋放。在病毒基因組的復制過程中，多種酶類蛋白起著核心作用。DNA聚合酶是病毒基因組復制的關鍵酶之一，它負責以病毒基因組DNA為模板，合成新的DNA鏈。非洲豬瘟病毒編碼的DNA聚合酶具有獨特的結構和功能特點，與宿主細胞的DNA聚合酶存在明顯差異。通過X射線晶體學技術對非洲豬瘟病毒DNA聚合酶的結構解析發(fā)現(xiàn)，該酶具有特定的活性中心和底物結合位點，能夠高效地催化DNA的合成反應。DNA拓撲異構酶在病毒基因組復制過程中也發(fā)揮著重要作用，它能夠調節(jié)DNA的拓撲結構，解決DNA復制過程中出現(xiàn)的超螺旋問題，確保DNA復制的順利進行。非洲豬瘟病毒編碼的II型DNA拓撲異構酶pP1192R在病毒感染的中晚期階段高度活躍，是病毒復制的關鍵酶。研究表明，pP1192R通過引入單鏈或雙鏈斷裂解開DNA的超螺旋結構，促進DNA復制、轉錄、重組和修復等核心生命過程的精確進行。病毒基因的轉錄過程同樣依賴于多種蛋白的協(xié)同作用。RNA聚合酶是病毒基因轉錄的關鍵酶，它負責將病毒基因組DNA轉錄為RNA。非洲豬瘟病毒的RNA聚合酶由多個亞基組成，結構復雜。中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所的研究團隊通過同源重組技術和冷凍電鏡技術，成功解析了非洲豬瘟病毒RNA聚合酶核心復合體和延伸復合體的高分辨率結構，發(fā)現(xiàn)關鍵蛋白M1249L像“籠子”一樣包裹著RNA聚合酶的核心部分，起到了穩(wěn)定結構的作用，并且通過動態(tài)結合機制調控了RNA聚合酶的活性。轉錄因子在病毒基因轉錄過程中也發(fā)揮著重要的調控作用，它們能夠與RNA聚合酶相互作用，調節(jié)轉錄的起始、延伸和終止過程。非洲豬瘟病毒編碼的一些轉錄因子能夠特異性地結合到病毒基因組的啟動子區(qū)域，招募RNA聚合酶，啟動基因轉錄過程。在病毒的裝配和釋放階段，多種結構蛋白參與其中，形成完整的病毒粒子。主要衣殼蛋白p72是非洲豬瘟病毒衣殼上含量最高的蛋白，位于衣殼的外層，以三聚體形式存在，形成了衣殼的基本單位——殼粒。p72蛋白的結構具有高度穩(wěn)定性，其獨特的雙“果凍卷”結構使其能夠有效地保護病毒基因組。除了p72蛋白，衣殼中還包含多種次要衣殼蛋白，如P1、P2和P3等，它們在衣殼內部形成復雜的相互作用網(wǎng)絡，像“膠水”一樣連接著相鄰的殼粒，穩(wěn)定衣殼的整體結構。P1位于Trisymmetron和Pentasymmetron區(qū)域相鄰的p72三聚體間隙，每一個p72蛋白結合一個P1蛋白；P2是一條長約100nm的纖維狀蛋白，沿著Trisymmetrons的邊緣延伸，相鄰的P2蛋白及其之間的區(qū)域組成了衣殼的“拉鏈”區(qū)域；P3在“拉鏈”區(qū)域連接各個殼粒，與P1結構不同。這些結構蛋白協(xié)同作用，確保了病毒粒子的正確裝配和釋放，從而實現(xiàn)病毒的傳播和感染。3.2.2作為疫苗靶點和診斷標志物的蛋白在非洲豬瘟的防控研究中，篩選出可作為疫苗靶點和診斷標志物的關鍵蛋白至關重要，這為開發(fā)有效的疫苗和準確的診斷方法提供了重要基礎。從疫苗研發(fā)的角度來看，病毒表面的一些蛋白因其在病毒感染過程中的關鍵作用以及能夠激發(fā)機體產(chǎn)生免疫反應的特性，成為了潛在的疫苗靶點。主要衣殼蛋白p72是非洲豬瘟病毒的重要表面抗原，具有高度的免疫原性。當機體感染非洲豬瘟病毒時，p72蛋白能夠刺激機體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體。這些抗體可以與p72蛋白結合，阻止病毒與宿主細胞的吸附和侵入，從而發(fā)揮免疫保護作用。研究表明，以p72蛋白為基礎開發(fā)的亞單位疫苗在動物實驗中能夠誘導機體產(chǎn)生較高水平的中和抗體，對非洲豬瘟病毒的感染具有一定的保護作用。p72蛋白還可以作為病毒粒子的結構支撐，其結構的穩(wěn)定性對于病毒的存活和感染能力至關重要。通過對p72蛋白結構的深入研究，可以設計出能夠特異性結合p72蛋白、破壞其結構或功能的疫苗，從而阻斷病毒的感染過程。病毒的其他表面蛋白，如p54和p30等，也具有作為疫苗靶點的潛力。p54蛋白參與病毒的吸附過程，能夠與宿主細胞表面的受體相互作用。針對p54蛋白開發(fā)的疫苗可以通過阻斷p54蛋白與宿主細胞受體的結合，阻止病毒的吸附和侵入。p30蛋白在病毒感染早期能夠被機體免疫系統(tǒng)識別，誘導產(chǎn)生免疫反應。研究發(fā)現(xiàn)，p30蛋白可以刺激機體產(chǎn)生細胞免疫反應，激活T淋巴細胞，增強機體對病毒感染細胞的殺傷能力。將p30蛋白與其他抗原聯(lián)合使用，可能開發(fā)出具有更強免疫保護效果的疫苗。在疾病診斷方面，一些蛋白可作為有效的診斷標志物，用于非洲豬瘟的早期診斷和疫情監(jiān)測。核衣殼蛋白（NP）在病毒感染細胞后大量表達，且在感染早期即可檢測到。通過檢測動物血清或組織中的NP蛋白，可以快速判斷動物是否感染非洲豬瘟病毒。常用的檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫熒光試驗（IFA）等。ELISA方法利用特異性抗體與NP蛋白結合，通過酶標記的二抗檢測結合信號，具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等優(yōu)點，能夠快速、準確地檢測出樣品中的NP蛋白。免疫熒光試驗則通過熒光標記的抗體與NP蛋白結合，在熒光顯微鏡下觀察熒光信號，直觀地判斷樣品中是否存在NP蛋白。一些參與病毒復制和感染過程的酶類蛋白也可作為診斷標志物。例如，非洲豬瘟病毒編碼的DNA聚合酶在病毒復制過程中發(fā)揮關鍵作用，其活性水平與病毒的復制能力密切相關。通過檢測樣品中DNA聚合酶的活性，可以間接反映病毒的感染和復制情況。在病毒感染早期，DNA聚合酶的活性會顯著升高，因此檢測DNA聚合酶的活性可以實現(xiàn)非洲豬瘟的早期診斷。一些病毒特異性的轉錄因子也可作為診斷標志物，它們在病毒感染過程中的表達水平變化與病毒的感染進程密切相關。通過實時熒光定量PCR等技術檢測這些轉錄因子的mRNA表達水平，可以準確判斷動物的感染狀態(tài)和病毒的復制活性。3.3結構解析的方法