人教版高中生物

選擇性必修3動物細胞工程第2節(jié)第2章細胞工程1認同動物細胞培養(yǎng)是模擬體內生理條件在體外進行的培養(yǎng)，由此分析、推出培養(yǎng)動物細胞需要滿足的基本條件。2嘗試建構動物細胞培養(yǎng)的基本流程，認同動物細胞培養(yǎng)是動物細胞工程的基礎。3簡述干細胞的應用；通過探討干細胞在臨床上的應用所產生的效益與風險，理性看待生物技術的應用，增強社會責任感。4闡明動物細胞融合技術的概念，舉例說出誘導動物細胞融合的方法。5概述單克隆抗體的制備過程，認同單克隆抗體在臨床上具有重要的應用價值。動物細胞工程的發(fā)展歷程1890年：希普首例胚胎移植成功。1958年：格登、童第周：體細胞核移植成功。2006年：山中伸彌獲得誘導多能干細胞。1959年：試管家兔誕生。2014年：單細胞基因組測序進行遺傳病篩查的試管嬰兒誕生。1996年:克隆羊多莉誕生。1978年：胚胎分割移植成功。1907年：哈里森:首創(chuàng)動物組織體外培養(yǎng)法。1951年：張明覺發(fā)現(xiàn)哺乳動物精子獲能現(xiàn)象。1975年：米爾斯坦和科勒：創(chuàng)立單克隆抗體技術。1981年：埃文斯成功分離和培養(yǎng)小鼠的胚胎干細胞。2017年:我國科學家首次培育了體細胞克隆猴。|

科技探索之路

|思考：動物細胞工程常用的技術有哪些？動物細胞工程常用的技術動物細胞培養(yǎng)、動物細胞融合、動物細胞核移植、生產單克隆抗體。是最基礎的技術1動物細胞培養(yǎng)的條件和過程2干細胞培養(yǎng)及其應用3動物細胞融合技術4單克隆抗體及其應用目錄人體再生術的秘密—人造皮膚小面積燒傷：患者通過切除+植皮(自身)后恢復1）使用他人皮膚如何？患者自身皮膚的不夠用，如何解決？大面積燒傷？2）培養(yǎng)自身細胞？

目前，科學家還在研究對皮膚干細胞進行培養(yǎng)，以獲得適合臨床上使用的人造皮膚。一、動物細胞培養(yǎng)的條件和過程動物細胞培養(yǎng)

從動物體中取出相關的組織，將它分散成單個細胞，然后在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下，讓這些細胞生長和增殖的技術?！舅伎肌浚簞游锝M織的選擇：

幼齡動物or老齡動物幼齡個體的細胞生命力旺盛，分化程度低、分裂能力強，易培養(yǎng)。動物體組織單個細胞細胞生長和增殖取出分散適宜條件原理地位對象目的細胞增殖（有絲分裂）動物細胞工程的基礎獲得細胞或細胞產物胚胎或幼齡動物的細胞Why?營養(yǎng)容易供應，代謝廢物容易排出欲使動物細胞培養(yǎng)順利進行，應營造怎樣的環(huán)境？思考討論:模擬體內的生理條件進行培養(yǎng)（一）動物細胞培養(yǎng)的條件糖類、氨基酸、無機鹽、維生素……無菌、無毒的環(huán)境適宜的溫度、pH和滲透壓適宜的氣體環(huán)境培養(yǎng)基的構成：+合成培養(yǎng)基血清等天然成分將細胞所需的營養(yǎng)物質按種類和所需量嚴格配制而成的培養(yǎng)基含有尚未全部研究清楚的細胞所需的營養(yǎng)物質。一般使用液體培養(yǎng)基，也稱為培養(yǎng)液1.營養(yǎng)：

血清中含有蛋白質、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中，蛋白質主要為白蛋白和球蛋白；氨基酸有多種，是細胞合成蛋白質的基本原料，且有些氨基酸是動物細胞本身不能合成的（稱為必需氨基酸），必須由培養(yǎng)液提供；激素有胰島素、生長激素等。血清還含有多種未知的促細胞生長因子、促貼附因子及其他活性物質，它們能促進細胞的生長、增殖和貼附。因此，在培養(yǎng)動物細胞時，為保證細胞能夠順利生長和增殖，一般需在培養(yǎng)基中添加10%~20％的血清等天然成分。動物細胞培養(yǎng)通常要添加血清的原因（一）動物細胞培養(yǎng)的條件糖類、氨基酸、無機鹽、維生素……無菌、無毒的環(huán)境適宜的溫度、pH和滲透壓適宜的氣體環(huán)境2.無菌、無毒的環(huán)境：（1）培養(yǎng)液、培養(yǎng)用具：滅菌處理；（2）在無菌環(huán)境下進行操作；（3）定期更換培養(yǎng)液

清除代謝物，防止細胞代謝物積累對細胞自身造成危害。（可根據(jù)實際情況適量添加抗生素）無菌無毒[拓展]動物和人體的免疫系統(tǒng)可抵御各種微生物對機體的入侵，因此體內細胞生活的內環(huán)境幾乎是無菌、無毒的。而離體培養(yǎng)的細胞對微生物和有毒物質的防御能力極低，所以其培養(yǎng)環(huán)境中一旦有細菌、真菌或病毒等微生物的污染，培養(yǎng)的細胞就會死亡。（一）動物細胞培養(yǎng)的條件糖類、氨基酸、無機鹽、維生素……無菌、無毒的環(huán)境適宜的溫度、pH和滲透壓適宜的氣體環(huán)境哺乳動物細胞培養(yǎng)的溫度多以36.5±0.5℃為宜；多數(shù)動物細胞生存的適宜pH為7.2-7.4；（1）適宜的溫度：（2）適宜的pH：（3）適宜的滲透壓：維持細胞正常的形態(tài)和功能。3.適宜的溫度、pH和滲透壓：4.適宜的氣體環(huán)境（1）氣體組成及作用:O2(細胞代謝所必需)；CO2(維持培養(yǎng)液的pH)。（2）具體操作：培養(yǎng)皿或松蓋培養(yǎng)瓶含有95%空氣和5%CO2的混合氣體的CO2培養(yǎng)箱置于培養(yǎng)皿松蓋培養(yǎng)瓶CO2培養(yǎng)箱（二）動物細胞培養(yǎng)的過程懸浮培養(yǎng)的細胞:直接用離心法收集貼壁細胞:用胰蛋白酶處理分散成單個細胞，用離心法收集取動物組織用機械法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理分散成單個細胞解決懸浮生長貼壁生長(大多數(shù)）細胞密度過大、有害代謝物積累、營養(yǎng)物質缺乏等接觸抑制傳代培養(yǎng)制成細胞懸液原代培養(yǎng)分瓶培養(yǎng)加培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶內細胞分裂受阻②制成細胞懸液，分瓶培養(yǎng)①收集細胞（動物胚胎或幼齡動物）(10代以內)(10代以后)（二）動物細胞培養(yǎng)的過程取動物組織用機械法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理分散成單個細胞傳代培養(yǎng)制成細胞懸液原代培養(yǎng)分瓶培養(yǎng)加培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶內(動物胚胎或幼齡動物)(10代以內)(10代以后)(1)培養(yǎng)前為什么分散成單個細胞？①成塊組織中細胞與細胞靠在一起，彼此限制了生長與增殖；

②利于細胞與培養(yǎng)液充分接觸，保證細胞所需的O2與營養(yǎng)供應、保證細胞內代謝物及時排出。(2)進行動物細胞傳代培養(yǎng)時用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質主要是什么？用胃蛋白酶可以嗎？為什么？動物細胞間的物質主要是蛋白質。

胃蛋白酶不可以，pH不適宜;原因是多數(shù)動物細胞生存的適宜pH為7.2-7.4；當pH大于6時，胃蛋白酶（適宜pH約為1.5）就會失去活性。纖維蛋白、膠原蛋白等（二）動物細胞培養(yǎng)的過程取動物組織用機械法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理分散成單個細胞傳代培養(yǎng)制成細胞懸液原代培養(yǎng)分瓶培養(yǎng)加培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶內(動物胚胎或幼齡動物)(10代以內)(10代以后)(3)酶解法較溫和，一定不會對動物細胞造成損傷，對嗎？

不對；使用胰蛋白酶時，要控制好用量和處理時間，因為胰蛋白酶不僅能分解細胞間的蛋白質，長時間作用還會分解細胞膜蛋白等，對細胞造成損傷。(4)體外培養(yǎng)的動物細胞類型？①懸浮生長類：能夠懸浮在培養(yǎng)液中生長增殖。需要貼附于某些基質表面才能生長增殖（細胞貼壁），大多數(shù)細胞屬于此類。②貼壁生長類：什么是細胞貼壁？要求：培養(yǎng)瓶（皿）內表面光滑、無毒、易于貼附（二）動物細胞培養(yǎng)的過程取動物組織用機械法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理分散成單個細胞傳代培養(yǎng)制成細胞懸液原代培養(yǎng)分瓶培養(yǎng)加培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶內(動物胚胎或幼齡動物)(10代以內)(10代以后)(5)“細胞增殖到互相接觸的時候，糖蛋白識別了這種信息，就會使細胞停止分裂繁殖，出現(xiàn)接觸抑制的現(xiàn)象”。試結合上述解釋，舉例說明哪種細胞無接觸抑制現(xiàn)象，并闡述原因？癌細胞無接觸抑制現(xiàn)象；癌細胞的細胞膜上糖蛋白等物質減少圓球形細胞剛開始鋪展貼壁生長（100×）培養(yǎng)的動物細胞貼壁生長并進行有絲分裂（100×）細胞單層貼壁生長鋪滿瓶壁后出現(xiàn)接觸抑制（100×）單層細胞多層細胞（二）動物細胞培養(yǎng)的過程取動物組織用機械法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理分散成單個細胞傳代培養(yǎng)制成細胞懸液原代培養(yǎng)分瓶培養(yǎng)加培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶內(動物胚胎或幼齡動物)(10代以內)(10代以后)(6)什么是原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)？①原代培養(yǎng)：將動物組織處理后的初次培養(yǎng)（10代內）。分瓶后的細胞培養(yǎng)（10代后）。②傳代培養(yǎng)：判斷依據(jù)：是否分瓶！初次培養(yǎng)10代細胞50代細胞無限增殖保持細胞正常二倍體核型部分細胞核型改變遺傳物質改變突破細胞壽限獲得不死性危機1危機2原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)（遺傳物質沒改變）（遺傳物質有的改變）使用或保存的細胞通常為10代以內，為什么？這一階段的細胞稱為細胞株這一階段的細胞稱為細胞系分

瓶（二）動物細胞培養(yǎng)的過程取動物組織用機械法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理分散成單個細胞傳代培養(yǎng)制成細胞懸液原代培養(yǎng)分瓶培養(yǎng)加培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶內(動物胚胎或幼齡動物)(10代以內)(10代以后)(7)原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)都用到胰蛋白酶處理，對象相同嗎？原代培養(yǎng)：用胰蛋白酶對剪碎的動物組織進行處理，使其分散成單個細胞后進行培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：細胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)接觸抑制，用胰蛋白酶使其從瓶壁上脫離下來，然后，將其分散到多個培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。區(qū)分兩種“培養(yǎng)”的關鍵是看用胰蛋白酶處理的對象歸納:請列表比較動物細胞培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng)比較項目植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)基性質培養(yǎng)基特有成分取材培養(yǎng)過程培養(yǎng)結果培養(yǎng)目的相同點獲得細胞或細胞產物固體培養(yǎng)基完整植株葡萄糖、動物血清液體培養(yǎng)基細胞增殖植物細胞的全能性許多細胞快速繁殖等蔗糖、植物激素1.培養(yǎng)過程中細胞都進行有絲分裂，不涉及減數(shù)分裂；原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)脫分化、再分化2.均需無菌操作、無菌培養(yǎng)，需要適宜的溫度、pH等條件。植物幼嫩的部位或花藥等動物胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織(1)動物細胞培養(yǎng)體現(xiàn)了動物細胞的全能性(

)動物細胞培養(yǎng)未體現(xiàn)動物細胞的全能性，其原理是細胞增殖?！?2)培養(yǎng)保留接觸抑制的細胞可在培養(yǎng)瓶的瓶壁上形成多層細胞(

)×培養(yǎng)保留接觸抑制的細胞可在培養(yǎng)瓶的瓶壁上形成單層細胞。(3)懸浮培養(yǎng)的細胞直接用離心法收集，貼壁細胞需要用胰蛋白酶等處理后再用離心法收集(

)√(4)培養(yǎng)動物細胞的第一代(即第一次細胞增殖)被稱為原代培養(yǎng)(

)原代培養(yǎng)指動物組織經處理后的初次培養(yǎng)，不一定是第一次細胞增殖?！谅鋵嵥季S方法1.(2022·湖北)某興趣小組開展小鼠原代神經元培養(yǎng)的研究，結果發(fā)現(xiàn)其培養(yǎng)的原代神經元生長緩慢，其原因不可能是A.實驗材料取自小鼠胚胎的腦組織B.為了防止污染將培養(yǎng)瓶瓶口密封C.血清經過高溫處理后加入培養(yǎng)基D.所使用的培養(yǎng)基呈弱酸性√落實思維方法2.如圖是動物細胞培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)的接觸抑制現(xiàn)象，下列有關敘述錯誤的是A.正常動物細胞培養(yǎng)過程中均會出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象B.癌細胞無接觸抑制因而培養(yǎng)時可形成多層細胞C.出現(xiàn)接觸抑制時細胞將停止分裂活動D.出現(xiàn)接觸抑制后需要用胰蛋白酶等處理后才可進行傳代培養(yǎng)√接觸抑制是體外細胞培養(yǎng)時貼附型細胞生長的特性，懸浮型細胞不會出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象，A錯誤。1動物細胞培養(yǎng)的條件和過程2干細胞培養(yǎng)及其應用3動物細胞融合技術4單克隆抗體及其應用目錄干細胞技術帶來延長生命的可能二、干細胞培養(yǎng)及其應用定義：分布、種類：功能：動物和人體內保留的具有分裂和分化能力的細胞。干細胞存在于早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中，包括胚胎干細胞和成體干細胞等。存在于早期胚胎中具有分化為成年動物體內的任何一種類型的細胞，并進一步形成機體的所有組織和器官甚至個體的潛能。ES細胞在體外分化成心肌細胞、神經元細胞和造血干細胞等必須從胚胎中獲取，涉及倫理問題；因而限制了在醫(yī)學上的應用。應用:特點:局限性:分布:胚胎干細胞（簡稱ES細胞）在一定條件下，可以分化成其他類型的細胞。也叫全能干細胞形態(tài)特點：通常呈圓球形或橢球形，細胞體積小，細胞核大，核仁明顯。二、干細胞培養(yǎng)及其應用成體干細胞存在于成體組織或器官內。具有組織特異性，只能分化成特定的細胞或組織，不具有發(fā)育成完整個體的能力。舉例:特點:應用實例:分布:治療神經組織損傷和神經系統(tǒng)退行性疾?。ㄈ缗两鹕?、阿爾茨海默病等）。治療白血病及一些惡性腫瘤放療或化療后引起的造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)功能障礙等疾病。造血干細胞：神經干細胞：有著自我更新能力及分化潛能的干細胞，與組織、器官的發(fā)育、再生和修復等密切相關。發(fā)現(xiàn)最早、研究最多、應用最成熟造血干細胞（骨髓、外周血和臍帶血中）精原干細胞（睪丸中）神經干細胞（神經系統(tǒng)中）血細胞和免疫細胞神經細胞精原細胞治療細胞損傷造成的疾病二、干細胞培養(yǎng)及其應用誘導多能干細胞(iPS細胞)制備:優(yōu)點:應用:概念:通過體外誘導小鼠成纖維細胞得到的類似胚胎干細胞的一種細胞。①將特定基因或特定蛋白導入細胞(成纖維細胞、已分化的T細胞、B細胞)；②用小分子化合物誘導形成。①誘導過程無須破壞胚胎；②iPS細胞可以來源于病人自身的體細胞，將它移植回病人體內后，理論上可以避免免疫排斥反應?？芍委熺牋罴毎氀Y；在治療阿爾茨海默病、心血管疾病等領域的研究也取得了新進展。二、干細胞培養(yǎng)及其應用iPS細胞的應用前景：iPS細胞用于治療人類疾病示意圖移植取成纖維細胞等iPS細胞轉入相關因子細胞發(fā)生轉化分化胰島細胞神經元血細胞腸上皮細胞心肌細胞肝細胞病人①取成纖維細胞②轉入相關因子③細胞轉化為iPS細胞④誘導iPS細胞定向分化為多種組織細胞⑤移植回病人體內治療糖尿病疾病治療神經疾病治療心血管疾病治療消化道疾病(1)過程④的實質是什么？基因的選擇性表達。(2)誘導多能干細胞用于治療人類的某些頑癥的原理是什么？誘導多能干細胞可以被誘導分化形成新的組織細胞，經移植可使壞死或退化部位得以修復并恢復正常功能。二、干細胞培養(yǎng)及其應用①取成纖維細胞②轉入相關因子③細胞轉化為iPS細胞④誘導iPS細胞定向分化為多種組織細胞⑤移植回病人體內(3)誘導多能干細胞為什么可以解決供體器官不足和器官移植后免疫排斥的問題？通過干細胞體外誘導分化，可以培育出人造器官，從而解決供體器官不足的問題；又因人造器官是由病人自身細胞經誘導分化形成的，所以可以避免免疫排斥反應。(4)科學家已嘗試采用多種方法來制備iPS細胞，請說出幾種獲取iPS細胞的方法。借助載體將特定基因導入細胞中，直接將特定蛋白導入細胞中或者用小分子化合物等來誘導形成iPS細胞。iPS細胞最初是由成纖維細胞轉化而來的，后來發(fā)現(xiàn)已分化的T細胞、B細胞等也能被誘導為iPS細胞。

現(xiàn)在關于iPS細胞的研究正在不斷深入。請你從以下兩個方面來查閱資料進行思考。（1）由于誘導iPS細胞、促使其分化都需要時間，因此用某人特異的iPS細胞進行醫(yī)療只限于時間比較充裕的情形。從實際事故、疾病發(fā)生的不可預測性方面考慮，如果要將這些細胞用于緊急情況，應該提前采取什么措施?

像建立骨髓庫一樣，有研究團隊正在嘗試建立HLA(HumanLeukocyteAntigen,人類白細胞抗原)多態(tài)性豐富的iPS細胞庫，可以為需要的人找到HIA匹配度較高的iPS細胞，這樣不僅可以節(jié)省時間、成本，還能減輕異體干細胞移植后發(fā)生的免疫排斥反應。（2）如果誘導iPS細胞定向分化為生殖細胞的技術發(fā)展成熟，該技術可能會有哪些應用？又可能帶來哪些問題？該技術可能被用于治療不孕癥；獲得足夠量的生殖細胞來進行瀕危物種的克隆研究；獲得生殖細胞進行轉基因操作，再經過受精、胚胎發(fā)育等過程來獲得轉基因動物。該技術可能帶來一系列的倫理問題。例如，如果用同一個人的iPS細胞分別誘導形成精子和卵子，兩者受精可能培育出“單親”嬰兒；有的人還可能有目的地選擇iPS細胞，從而“設計”嬰兒。(1)干細胞都來源于早期胚胎(

)干細胞存在于早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中，包括胚胎干細胞和成體干細胞等?！?2)iPS細胞可以來源于病人自身的體細胞，將它移植回病人體內后，可以避免免疫排斥反應(

)(3)不同類型的干細胞，它們的分化潛能完全相同(

)√×不同類型的干細胞，它們的分化潛能是有差別的，如胚胎干細胞的分化潛能大于成體干細胞。落實思維方法3.研究人員研究肥胖機理時發(fā)現(xiàn)了一種與脂肪細胞的分化形成有關的蛋白質M，其細胞分化過程如圖所示。下列有關敘述錯誤的是A.已分化的細胞不可能繼續(xù)

分化為其他類型的細胞B.肌肉細胞與脂肪細胞中均含控制蛋白質M合成的基因C.促進蛋白質M的合成是解決肥胖問題的一條途徑D.間充質細胞是一種成體干細胞，其分化過程具有組織特異性√已分化的細胞也可能繼續(xù)分化為其他類型的細胞，如人體的干細胞可分化為間充質細胞，間充質細胞又分化為肌肉細胞或脂肪細胞，A錯誤。落實思維方法4.將Oct3/4、Sox2、c－Myc和Klf4基因通過逆轉錄病毒轉入小鼠成纖維細胞后得到類似于小鼠胚胎干細胞的一種細胞，命名為誘導多能干細胞(iPS細胞)。與ES細胞相比，iPS細胞更容易獲得，廣泛應用于藥物篩選或基因治療。下列說法錯誤的是A.逆轉錄病毒充當了將目的基因導入成纖維細胞的載體B.iPS細胞的應用中存在分化成腫瘤細胞的風險C.體細胞經誘導產生iPS細胞后再轉化為需要的細胞給病人治病，會引起

免疫排斥反應D.欲驗證iPS細胞的產生是由于外源基因的作用，應設置不轉入外源基因

的對照組√無菌、無毒營養(yǎng)溫度、pH和滲透壓氣體環(huán)境制備細胞懸液原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)的條件動物細胞培養(yǎng)的過程干細胞的培養(yǎng)和應用干細胞的種類、特點及應用iPS細胞的培養(yǎng)和應用五分鐘查落實【要語必背】1.動物細胞工程常用的技術包括動物細胞培養(yǎng)、動物細胞融合和動物細胞核移植等，其中動物細胞培養(yǎng)是動物細胞工程的基礎。2.動物細胞培養(yǎng)的條件：營養(yǎng)；無菌、無毒的環(huán)境；溫度、pH和滲透壓；氣體環(huán)境。3.人們通常將分瓶之前的細胞培養(yǎng)，即動物組織經處理后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)，將分瓶后的細胞培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。4.在進行傳代培養(yǎng)時，懸浮培養(yǎng)的細胞直接用離心法收集；貼壁細胞需要重新用胰蛋白酶等處理，使之分散成單個細胞，然后再用離心法收集。之后，將收集的細胞制成細胞懸液，分瓶培養(yǎng)。5.干細胞存在于早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中，包括胚胎干細胞和成體干細胞等?！鹃L句表達】1.動物細胞培養(yǎng)需要添加血清的原因：_____________________________

。2.動物細胞培養(yǎng)時所需的氣體環(huán)境是

，O2是________

，CO2的主要作用是

。3.

稱為細胞貼壁。貼壁細胞在生長增殖時，會發(fā)生接觸抑制現(xiàn)象，即___________________________________

的現(xiàn)象。血清中含有尚未全部研究清楚的細胞所需的營養(yǎng)物質95%空氣和5%CO2細胞代謝所必需的維持培養(yǎng)液的pH細胞貼附在培養(yǎng)瓶的瓶壁上的現(xiàn)象當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞通常會停止分裂增殖4.動物細胞的整個培養(yǎng)過程中可能多次用到胰蛋白酶或膠原蛋白酶，第一次使用的目的是

；貼壁細胞傳代培養(yǎng)時使用的目的是

。5.成體干細胞的特點：具有

，只能分化成

，不具有

的能力。6.誘導多能干細胞是通過體外誘導成纖維細胞，所獲得的類似___________的一種細胞，簡稱iPS細胞。優(yōu)點是________________________________

。使組織細胞分散開使細胞從瓶壁上脫離下來，分散成單個細胞，便于分瓶培養(yǎng)組織特異性特定的細胞或組織發(fā)育成完整個體胚胎干細胞不涉及倫理問題，理論上可以避免免疫排斥反應問題探究：1.視頻中了解到針對新冠肺炎真正的特效藥是什么？2.這種特效藥有著怎樣的特點呢？針對新冠病毒的單克隆抗體。這種單克隆抗體可以和新冠病毒特異性結合，準確定位、藥效強、持續(xù)時間久，并且可以大量儲備生產?！净仡櫯f知】①什么細胞能產生抗體？②能產生抗體的細胞能否大量增殖？③什么細胞具有無限增殖的能力？④能否培養(yǎng)出一種能分泌抗體且增殖力強的細胞？漿細胞漿細胞沒有增殖能力腫瘤細胞動物細胞融合技術1動物細胞培養(yǎng)的條件和過程2干細胞培養(yǎng)及其應用3動物細胞融合技術4單克隆抗體及其應用目錄人—鼠細胞融合融合細胞細胞融合37℃40min正在融合的細胞紅色熒光染料標記膜蛋白綠色熒光染料標記膜蛋白人細胞小鼠細胞該實驗說明：細胞膜具有流動性三、動物細胞融合技術1.概念：2.原理：結果：3.融合方法：4.意義：5.應用：使兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的技術。細胞膜的流動性PEG融合法、電融合法和滅活病毒誘導法等。（化學法、

物理法、

生物法）突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交（種間、屬間、科間、動植物之間）成為可能。動物細胞融合特有具有原來兩個或多個細胞的遺傳信息①研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。②特別是雜交瘤技術，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。形成單核雜交細胞常用：仙臺病毒、皰疹病毒、腮腺炎病毒什么是滅活病毒？滅活病毒誘導細胞融合的原理是？

滅活是指用物理或化學手段使病毒或細菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結構。

原理：病毒的糖蛋白和一些酶可以與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞膜的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。過程：病毒顆粒滅活的病毒顆粒粘附于細胞表面，使細胞互相凝聚細胞膜融合細胞核融合形成雜交細胞細胞膜打開細胞質融合動物細胞融合實質及完成的標志：細胞核融合資料1

19世紀30年代，科學家曾在患肺結核、天花和麻疹等疾病的病人的病理組織中觀察到多核細胞。如何解釋這一現(xiàn)象？病人體內的病毒等誘導多個體細胞融合，形成了多核細胞。肺結核病人病理切片動物細胞融合和植物體細胞雜交的比較植物體細胞雜交動物細胞融合原理細胞融合前的處理方法誘導細胞融合的方法細胞融合成功的標志結果意義遺傳信息細胞膜具有一定的流動性、植物細胞的全能性細胞膜具有一定的流動性、細胞增殖用果膠酶和纖維素酶去除細胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細胞分散成單個細胞物理法：電融合法、離心法；化學法：聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、電融合法、▲滅活病毒誘導法再生出細胞壁細胞核的融合雜種植株雜交細胞打破生殖隔離，實現(xiàn)遠緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能具有原來兩個或多個細胞的遺傳信息(1)與植物原生質體融合相比，動物細胞融合特有的誘導因素有聚乙二醇(PEG)、滅活的病毒(

)與植物原生質體融合相比，動物細胞融合特有的誘導因素是滅活的病毒?！?2)滅活的含義是用物理或化學手段使病毒或細菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結構(

)√落實思維方法1.如圖表示仙臺病毒誘導動物細胞融合的部分過程，下列敘述正確的是A.細胞a和細胞b必須為同種細胞才能融合B.細胞c同時有細胞a和細胞b的遺傳物質C.該融合過程體現(xiàn)了細胞膜具有選擇透過性D.此過程的原理是動物細胞具有全能性√落實思維方法2.對比動物細胞融合和植物體細胞雜交技術，下列論述正確的是A.均可使用PEG、電融合或滅活病毒誘導細胞融合B.兩者都可以跨越種屬間的生殖隔離C.兩者都可以體現(xiàn)細胞的全能性D.在適宜的條件下，均可產生完整個體√1動物細胞培養(yǎng)的條件和過程2干細胞培養(yǎng)及其應用3動物細胞融合技術4單克隆抗體及其應用目錄產量低，純度低，特異性差反復注射動物體內抗原多種漿細胞多種抗體（血清）缺點（2）什么細胞分泌抗體？漿細胞（B淋巴細胞分化）（3）抗體主要分布在哪里？血清（4）早期獲得抗體的方法有哪些？1.傳統(tǒng)抗體的制備2.大量制備單一抗體的思路和需解決的問題單克隆抗體一個B淋巴細胞細胞群抗體克隆（1）什么是抗體？機體受抗原刺激后產生的，能與該抗原發(fā)生特異性結合的具有免疫功能的球蛋白。B淋巴細胞不可能無限增殖四、單克隆抗體及其應用１：什么細胞具有無限增殖的能力？２：有什么方法能培養(yǎng)出既能分泌抗體且無限增殖的細胞？骨髓瘤細胞（癌細胞）動物細胞融合一個極富創(chuàng)造力的方案：1975年，發(fā)明了單克隆抗體的制備技術；1984年，諾貝爾生理學或醫(yī)學獎米爾斯坦【英國】柯勒【德國】動物細胞融合雜交細胞動物細胞培養(yǎng)單克隆抗體骨髓瘤細胞（癌細胞）能無限增殖一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體雜交瘤細胞既能迅速大量增殖，又能產生特定抗體四、單克隆抗體及其應用注射到腹腔注射抗原培養(yǎng)骨髓瘤細胞多種B淋巴細胞骨髓瘤細胞細胞融合多種雜交細胞誘導融合抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞體外培養(yǎng)用特定抗原對小鼠進行免疫，并從其脾中獲取能產生特定抗體的B淋巴細胞用特定的選擇培養(yǎng)基進行篩選：只有融合的雜交瘤細胞才能生長多次克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，再篩選體外大規(guī)模培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔內增殖從培養(yǎng)液或小鼠腹水中獲得大量的單克隆抗體雜交瘤細胞單克隆抗體第一次篩選：獲得雜交瘤細胞第二次篩選：獲得能產生特定抗體的雜交瘤細胞能產生抗體，但不能大量繁殖能大量繁殖，但不能產生抗體既能大量繁殖又能產生抗體既能大量繁殖又能產生特定抗體

嘗試構建制備單克隆抗體的流程思考1:進行誘導融合后，培養(yǎng)基中共出現(xiàn)幾種細胞？其中融合的細胞有幾種？(若融合的話，只考慮兩兩融合)5種骨髓瘤+B細胞骨髓瘤+骨髓瘤B細胞+B細胞骨髓瘤(未融合)B細胞(未融合)理論上融合的細胞有3種。體系中出現(xiàn)多種類型細胞的原因?細胞融合是隨機的，且融合率達不到100%。思考2:單克隆抗體制備過程中，第一次篩選的目的是什么？方法是什么？資料：已知細胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基喋呤阻斷。①免疫的B淋巴細胞中有這兩種DNA的合成途徑，但它不能分裂增殖，其本身也不

能在體外長期存活。

②鼠骨髓瘤細胞中只有D途徑，沒有S途徑，但它能不斷分裂增殖。如果它的D途徑

被阻斷的話，它會因不能合成DNA而死亡。篩選出雜交瘤細胞特定的選擇培養(yǎng)基篩選B淋巴細胞合成DNAS途徑D途徑不能分裂增殖骨髓瘤細胞合成DNAD途徑能無限增殖雜交瘤細胞合成DNAS途徑D途徑能無限增殖培養(yǎng)基中加入氨基喋呤B淋巴細胞+B淋巴細胞能合成DNA，不能無限增殖，死亡骨髓瘤細胞+骨髓瘤細胞不能合成DNA，不能增殖，死亡雜交瘤細胞（B淋巴+骨髓瘤）能合成DNA且能無限增殖，存活資料：在單克隆抗體制備過程中，要用特定的HAT選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞，篩選的過程利用了哺乳動物DNA合成的原理。哺乳動物DNA合成有兩個途徑，物質A可以阻斷其中的全合成途徑（D途徑）(如圖)。正常細胞內含有補救合成途徑（S途徑）所必需的轉化酶和激酶，制備單克隆抗體時選用的骨髓瘤細胞中缺乏轉化酶。請據(jù)圖分析回答下列問題：在培養(yǎng)基中含有H、A、T的情況下，會導致骨髓瘤細胞和B細胞死亡的原因是什么？只有雜交瘤細胞才能存活并增殖，原因是什么?

培養(yǎng)基含有物質A且骨髓瘤細胞中缺乏轉化酶，因此，骨髓瘤細胞不能合成DNA，不能增殖而導致死亡；B細胞為成熟細胞，沒有增殖能力，也會死亡。雜交瘤細胞可以利用B細胞中的轉化酶，通過補救合成途徑合成DNA，能存活并增殖。思考3:單克隆抗體制備過程中，第二次篩選的目的、方法及其原理是什么？篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細胞方法是抗體檢測，其原理是抗原—抗體的特異性結合克隆化培養(yǎng)和抗體檢測★有限稀釋法每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞（克隆化培養(yǎng)）側面模擬圖克隆化培養(yǎng)一段時間取上清液進行抗體檢測上清液可與特定抗原結合的培養(yǎng)孔為陽性孔陽性孔中的細胞還

保證是來自單個細胞，挑選

孔的細胞繼續(xù)進行有限稀釋，一般需進行3～4次，直至確信每個孔中增殖的細胞為能產生特定抗體的雜交瘤細胞。不能陽性項目腹腔培養(yǎng)體外培養(yǎng)優(yōu)點缺點易于控制培養(yǎng)條件可大規(guī)模培養(yǎng)、大量生產規(guī)模小，產量少需要人為控制培養(yǎng)基，成本相對較高【兩次篩選的比較】項目第一次篩選第二次篩選（需要多次篩選）篩選原因篩選方法篩選結果誘導融合后得到的細胞中，除雜交瘤細胞之外，還有未融合的親本細胞，也有融合的具有同種核的細胞。用特定的選擇培養(yǎng)基篩選：未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長。篩選獲得雜交瘤細胞（多種）因為小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經選擇培養(yǎng)基篩選獲得的雜交瘤細胞中有能產生其他抗體的細胞。用96孔板培養(yǎng)，在每個孔中盡量接種一個雜交瘤細胞的情況下進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經多次篩選得到足夠數(shù)量的能分泌特定抗體的細胞獲得能分泌特定抗體的雜交瘤細胞分析單克隆抗體的應用資料1：用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的"早早孕診斷試劑盒"，在妊娠第8天就可以作出診斷，這比原來的方法提前了10d左右?？梢员苊庠袐D在知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成了不利影響。該方法檢測的準確率在90%以上。分析單克隆抗體的應用資料2：使用高效的細胞毒素類藥物進行化療，可以有效殺傷腫瘤細胞。但細胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時還會對健康細胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應用。抗體—藥物偶聯(lián)物（antibody-drugconjugates，ADC）通過將細胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結合，實現(xiàn)了對腫瘤細胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物（如細胞毒素）三部分組成，它的作用機制如下圖所示?？贵w藥物接頭細胞凋亡ADC被細胞吞噬分析單克隆抗體的應用(1)ADC的抗體和藥物各具有什么作用？抗體主要發(fā)揮靶向運輸作用，即通過特異性結合靶細胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細胞；(2)除了細胞毒素，還有哪些物質理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？藥物發(fā)揮治療效應，如殺傷靶細胞。(3)單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應用上各具有什么優(yōu)勢？①可以用放射性同位素標記單克隆抗體進行靶向放療；②一些作用于細胞信號轉導通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結合進行疾病治療。①單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原發(fā)生反應，因此檢測的特異性和靈敏度大大提高；生產單克隆抗體的雜交瘤細胞可以傳代培養(yǎng)、冷凍保存和復蘇利用，有利于控制產品的質量和標準化生產診斷試劑盒。②ADC在臨床上具有靶點清楚、毒副作用小等優(yōu)點，原因是ADC中的單克隆抗體能將細胞毒素定向帶到癌細胞所在位置，在原位殺死癌細胞，不損傷正常細胞。單克隆抗體的優(yōu)點（1）能準確地識別抗原的細微差異；（2）與特定抗原發(fā)生特異性結合；（3）可以大量制備。單克隆抗體的應用（1）廣泛用作診斷試劑利用同位素或熒光標記的單克隆抗體在特定組織中成像的技術，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病。（2）用于治療疾病和運載藥物：四、單克隆抗體及其應用優(yōu)點：準確、高效、簡易、快速。a、特異性強、靈敏度高，可以大量制備。生物導彈——單克隆抗體＋抗癌藥物+放射性同位素b、位置準確、療效高、毒副作用小。結合同位素的單抗治療B細胞淋巴瘤四、單克隆抗體及其應用誘導其融合的方法有哪些？注射特定抗原的目的是什么？大量增殖雜交瘤細胞獲得單克隆抗體的方法兩次篩選的目的獲得能產生特定抗體的B淋巴細胞物理：電融合法第1次篩選：得到雜交瘤細胞（多種）。體外培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔內增殖。多種B淋巴細胞B淋巴細胞注射特定抗原骨髓瘤細胞融合B-B細胞雜交瘤細胞瘤-瘤細胞多種雜交瘤細胞符合要求的雜交瘤細胞抗原—抗體雜交法篩選2克隆化培養(yǎng)體外培養(yǎng)小鼠腹腔內增殖單克隆抗體B細胞瘤細胞選擇培養(yǎng)基篩選1化學：聚乙二醇（PEG）融合法生物：滅活病毒誘導法第2次篩選：得到能產生特定抗體的雜交瘤細胞。四、單克隆抗體及其應用單克隆抗體制備過程中應用到的細胞工程技術手段雜交瘤細胞特點單克隆抗體的優(yōu)點原理既可以產生抗體，又可以大量增殖動物細胞融合、動物細胞培養(yǎng)細胞膜具有一定的流動性、細胞增殖多種B淋巴細胞B淋巴細胞注射特定抗原骨髓瘤細胞融合B-B細胞雜交瘤細胞瘤-瘤細胞選擇性培養(yǎng)基多種雜交瘤細胞符合要求的雜交瘤細胞抗原—抗體雜交法

篩選2克隆化培養(yǎng)體外培養(yǎng)小鼠腹腔內增殖單克隆抗體B細胞瘤細胞篩選1①能準確地識別抗原的細微差異。②與特定抗原發(fā)生特異性結合。③可以大量制備。(1)B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合后，得到的都是雜交瘤細胞(

)B淋巴細胞與骨髓瘤細胞如兩兩融合，得到的融合細胞有3種，即B淋巴細胞自身融合細胞、骨髓瘤細胞自身融合細胞和雜交瘤細胞，需要篩選才能得到雜交瘤細胞?！?2)單克隆抗體制備過程中兩次篩選的目的相同(

)單克隆抗體制備過程中第一次篩選是為了篩選出雜交瘤細胞，第二次篩選是為了獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的雜交瘤細胞?！?3)ADC的抗體具有靶向運輸作用，藥物具有治療作用(

)√落實思維方法3.(2023·北京，1