A型流感病毒NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)天然免疫逃避的分子機(jī)制探秘一、引言1.1研究背景與意義A型流感病毒（InfluenzaAVirus）作為正粘病毒科的重要成員，對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。自1918年“西班牙流感”大流行以來(lái)，A型流感病毒多次引發(fā)全球性公共衛(wèi)生事件，如1957年的“亞洲流感”、1968年的“香港流感”以及2009年的甲型H1N1流感大流行，這些疫情不僅導(dǎo)致大量人員感染和死亡，還對(duì)全球經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展造成了巨大沖擊。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計(jì)，每年季節(jié)性流感在全球范圍內(nèi)可導(dǎo)致300-500萬(wàn)例嚴(yán)重病例，29-65萬(wàn)人死亡。A型流感病毒能夠感染多種宿主，包括人類(lèi)、禽類(lèi)、豬等，其基因組由8個(gè)單股負(fù)鏈RNA片段組成，具有高度的變異性。這種變異性使得病毒能夠不斷逃避宿主的免疫監(jiān)視，頻繁引發(fā)流感的爆發(fā)和流行。當(dāng)人體感染A型流感病毒后，病毒會(huì)在呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)迅速?gòu)?fù)制，引發(fā)一系列的免疫反應(yīng)。然而，病毒在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，發(fā)展出了多種免疫逃避機(jī)制，其中NS1蛋白在這一過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。NS1蛋白由A型流感病毒基因組的第八段編碼，是一種小分子非結(jié)構(gòu)蛋白。在病毒感染的初期階段，NS1蛋白即可大量表達(dá)，并迅速進(jìn)入宿主細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。NS1蛋白具有多個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，其中C-末端的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（Effectdomain,ED）能夠與宿主細(xì)胞內(nèi)多種重要蛋白發(fā)生相互作用，是其發(fā)揮免疫逃避功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。通過(guò)與宿主蛋白的相互作用，NS1蛋白能夠干擾宿主的天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，從而促進(jìn)病毒的復(fù)制和傳播。在天然免疫方面，NS1蛋白主要通過(guò)抑制宿主細(xì)胞內(nèi)干擾素（IFN）的產(chǎn)生和信號(hào)傳導(dǎo)，來(lái)逃避宿主的免疫攻擊。干擾素是機(jī)體抗病毒感染的重要防線(xiàn)，當(dāng)宿主細(xì)胞識(shí)別到病毒感染后，會(huì)通過(guò)一系列信號(hào)通路誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生，進(jìn)而激活下游的抗病毒基因，發(fā)揮抗病毒作用。然而，NS1蛋白能夠直接結(jié)合并抑制宿主細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA(dsRNA)，阻止宿主細(xì)胞通過(guò)RIG-I樣受體識(shí)別dsRNA，從而抑制了后續(xù)的干擾素誘導(dǎo)信號(hào)通路，減少了抗病毒蛋白的表達(dá)。此外，NS1蛋白還能與宿主的E3泛素連接酶TRIM25相互作用，阻止TRIM25對(duì)RIG-I的泛素化修飾，而這一過(guò)程對(duì)于RIG-I激活干擾素生成的信號(hào)通路至關(guān)重要，NS1的干預(yù)有效抑制了這一關(guān)鍵步驟。在適應(yīng)性免疫方面，NS1蛋白可以通過(guò)調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞表面分子的表達(dá)或分泌可溶性因子，影響免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞）的功能，減少抗原呈遞和T細(xì)胞的激活，進(jìn)一步抑制免疫應(yīng)答。同時(shí)，NS1蛋白還具有抗凋亡作用，能夠抑制宿主細(xì)胞的凋亡，延長(zhǎng)感染細(xì)胞的存活時(shí)間，為病毒復(fù)制提供更多時(shí)間和資源，同時(shí)也限制了凋亡作為清除感染細(xì)胞和激活免疫系統(tǒng)的一種機(jī)制。深入研究A型流感病毒NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的天然免疫逃避機(jī)制，具有重要的理論和實(shí)際意義。從理論層面來(lái)看，這有助于我們更深入地理解病毒與宿主之間的相互作用關(guān)系，揭示病毒致病的分子機(jī)制，為病毒學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展提供新的理論依據(jù)。從實(shí)際應(yīng)用角度出發(fā)，明確NS1蛋白的免疫逃避機(jī)制，能夠?yàn)殚_(kāi)發(fā)新型抗流感病毒藥物和疫苗提供重要的靶點(diǎn)和思路。目前，臨床上常用的抗流感病毒藥物主要包括神經(jīng)氨酸酶抑制劑和M2離子通道阻滯劑，但隨著病毒的變異，耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重。因此，尋找新的藥物作用靶點(diǎn)和治療策略迫在眉睫。針對(duì)NS1蛋白的研究，有望為解決這一問(wèn)題提供新的途徑，從而提高流感的防治水平，減少流感對(duì)人類(lèi)健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的危害。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究A型流感病毒NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的天然免疫逃避機(jī)制，明確其在病毒感染過(guò)程中對(duì)宿主天然免疫系統(tǒng)的影響，為開(kāi)發(fā)新型抗流感病毒藥物和疫苗提供關(guān)鍵的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。具體研究?jī)?nèi)容如下：A型流感病毒NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域功能特性分析：通過(guò)全面檢索NCBI、EMBL-EBI等權(quán)威核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取豐富的A型流感病毒NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因序列，并運(yùn)用ClustalW、MEGA等軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，深入分析其序列保守性與變異性。同時(shí)，利用Swiss-Model、AlphaFold等先進(jìn)的結(jié)構(gòu)建模工具構(gòu)建NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)模型，借助分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件（如GROMACS、AMBER）對(duì)其動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬分析，探究結(jié)構(gòu)域內(nèi)氨基酸殘基之間的相互作用以及與配體結(jié)合時(shí)的構(gòu)象變化，從而深入解析其功能特性。NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域影響天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制分析：選取A549（人肺泡上皮細(xì)胞）、RAW264.7（小鼠巨噬細(xì)胞）等常用細(xì)胞系，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔等技術(shù)將攜帶NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞模型。運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）等技術(shù)檢測(cè)天然免疫信號(hào)通路關(guān)鍵分子（如RIG-I、MDA5、TRIF、IRF3、NF-κB等）的表達(dá)水平和磷酸化狀態(tài)，借助免疫共沉淀（Co-IP）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）等方法確定NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與天然免疫信號(hào)通路相關(guān)蛋白的相互作用關(guān)系，進(jìn)而系統(tǒng)分析其對(duì)天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的影響。NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域調(diào)控天然免疫因子表達(dá)機(jī)制分析：采用RNA測(cè)序（RNA-seq）、染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）等高通量組學(xué)技術(shù)，全面分析穩(wěn)定表達(dá)NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞與正常細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平和染色質(zhì)水平上的差異，篩選出受NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域調(diào)控的天然免疫相關(guān)基因。運(yùn)用基因編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9）敲除或過(guò)表達(dá)這些關(guān)鍵基因，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）等方法驗(yàn)證其對(duì)天然免疫因子表達(dá)的調(diào)控作用，并深入研究其調(diào)控的分子機(jī)制，挖掘出具有重要調(diào)控作用的關(guān)鍵因子。流感病毒NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的天然免疫逃避機(jī)制分析：在細(xì)胞水平上，利用病毒感染實(shí)驗(yàn)，比較野生型流感病毒與NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域缺失或突變的流感病毒在感染細(xì)胞后的復(fù)制效率、干擾素產(chǎn)生水平、細(xì)胞凋亡情況等指標(biāo)，分析NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域在病毒感染過(guò)程中的作用。在動(dòng)物水平上，構(gòu)建小鼠、雪貂等流感病毒感染動(dòng)物模型，通過(guò)滴鼻、氣管內(nèi)注射等方式感染病毒，觀(guān)察動(dòng)物的發(fā)病癥狀、體重變化、生存率等指標(biāo)，運(yùn)用免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)免疫細(xì)胞的活化狀態(tài)、細(xì)胞因子分泌水平以及病毒在組織器官中的分布情況，綜合細(xì)胞水平和動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，深入分析NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的天然免疫逃避機(jī)制，揭示其對(duì)宿主天然免疫系統(tǒng)的影響，為防治流感病毒提供新的理論依據(jù)。1.3研究方法與技術(shù)路線(xiàn)生物信息學(xué)分析：運(yùn)用NCBI、EMBL-EBI等數(shù)據(jù)庫(kù)，收集不同亞型、不同宿主來(lái)源的A型流感病毒NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因序列，建立本地序列數(shù)據(jù)庫(kù)。利用ClustalW軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，分析氨基酸序列的保守性和變異性，確定關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。通過(guò)MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，研究NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的進(jìn)化關(guān)系。運(yùn)用Swiss-Model、AlphaFold等結(jié)構(gòu)建模工具，基于已知的蛋白結(jié)構(gòu)模板，構(gòu)建NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)模型。利用分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件GROMACS或AMBER，對(duì)構(gòu)建的結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬，分析其在溶液環(huán)境中的動(dòng)態(tài)變化，研究結(jié)構(gòu)域內(nèi)氨基酸殘基之間的相互作用以及與配體結(jié)合時(shí)的構(gòu)象變化，預(yù)測(cè)潛在的功能位點(diǎn)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用A549（人肺泡上皮細(xì)胞）、RAW264.7（小鼠巨噬細(xì)胞）等細(xì)胞系，用含有10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（如Lipofectamine3000）、電穿孔等技術(shù)，將攜帶NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，利用G418或嘌呤霉素等抗生素篩選，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞模型。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜后用特異性抗體檢測(cè)天然免疫信號(hào)通路關(guān)鍵分子（如RIG-I、MDA5、TRIF、IRF3、NF-κB等）的表達(dá)水平和磷酸化狀態(tài)，以β-actin或GAPDH作為內(nèi)參。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，以GAPDH或β-actin作為內(nèi)參基因。采用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)，裂解細(xì)胞后加入特異性抗體和ProteinA/G磁珠，孵育后洗脫結(jié)合蛋白，通過(guò)Westernblot檢測(cè)NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與天然免疫信號(hào)通路相關(guān)蛋白的相互作用。利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)，將熒光標(biāo)記的NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域和與之相互作用的蛋白共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化，確定兩者之間的相互作用及距離變化。高通量組學(xué)分析：采用RNA測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)，提取穩(wěn)定表達(dá)NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞和正常對(duì)照細(xì)胞的總RNA，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，在Illumina等測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制、比對(duì)和差異表達(dá)分析，篩選出受NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域調(diào)控的天然免疫相關(guān)基因，并進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路分析，以明確這些基因參與的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路。運(yùn)用染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）技術(shù)，用甲醛固定細(xì)胞使蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)，超聲破碎染色質(zhì)后，加入抗NS1蛋白抗體或抗轉(zhuǎn)錄因子抗體進(jìn)行免疫沉淀，純化富集的DNA片段，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)并測(cè)序。分析測(cè)序數(shù)據(jù)，確定NS1蛋白或轉(zhuǎn)錄因子在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)，研究其對(duì)天然免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制。病毒感染實(shí)驗(yàn)：在細(xì)胞水平上，用野生型流感病毒和NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域缺失或突變的流感病毒分別感染A549、RAW264.7等細(xì)胞，設(shè)置不同的感染復(fù)數(shù)（MOI）和感染時(shí)間點(diǎn)。感染一定時(shí)間后，收集細(xì)胞上清液，通過(guò)空斑實(shí)驗(yàn)或TCID??法檢測(cè)病毒滴度，分析病毒的復(fù)制效率。采用ELISA或qRT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液或細(xì)胞內(nèi)干擾素的產(chǎn)生水平。利用AnnexinV-FITC/PI雙染法，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。在動(dòng)物水平上，選用6-8周齡的BALB/c小鼠或雪貂作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分組。通過(guò)滴鼻或氣管內(nèi)注射等方式，用不同劑量的流感病毒感染動(dòng)物，對(duì)照組給予等量的PBS。感染后，每天觀(guān)察動(dòng)物的發(fā)病癥狀（如精神狀態(tài)、活動(dòng)能力、飲食情況等），測(cè)量體重變化，記錄生存率。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)，處死動(dòng)物，采集肺、脾、胸腺等組織器官，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)病毒抗原的分布情況；運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫細(xì)胞（如T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等）的活化狀態(tài)和細(xì)胞因子分泌水平。本研究的技術(shù)路線(xiàn)如圖1-1所示，首先通過(guò)生物信息學(xué)分析全面了解NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的序列和結(jié)構(gòu)特征，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)該結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞模型和流感病毒感染動(dòng)物模型，綜合運(yùn)用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、高通量組學(xué)分析以及病毒感染實(shí)驗(yàn)，從分子、細(xì)胞和整體動(dòng)物水平深入探究NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的天然免疫逃避機(jī)制，最后對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行總結(jié)和分析，為抗流感病毒藥物和疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)。[此處插入技術(shù)路線(xiàn)圖1-1]二、A型流感病毒與NS1蛋白概述2.1A型流感病毒簡(jiǎn)介A型流感病毒屬于正黏病毒科，是一種極具影響力的單鏈負(fù)鏈RNA病毒。其病毒顆粒通常呈球形或桿狀，直徑約在80-120nm之間。病毒的基因組由8個(gè)獨(dú)立的單股負(fù)鏈RNA片段組成，這些片段編碼了多種重要的病毒蛋白，包括血凝素（HA）、神經(jīng)氨酸酶（NA）、核蛋白（NP）、基質(zhì)蛋白（M1、M2）以及非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2）等，它們?cè)诓《镜母腥?、?fù)制、傳播以及免疫逃逸等過(guò)程中各自發(fā)揮著關(guān)鍵作用。根據(jù)病毒顆粒表面的血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的蛋白結(jié)構(gòu)和基因特性，A型流感病毒可進(jìn)一步分為眾多亞型。截至目前，已發(fā)現(xiàn)18個(gè)HA亞型（H1-H18）和11個(gè)NA亞型（N1-N11）。不同亞型的病毒在宿主范圍、致病性和傳播能力等方面存在顯著差異。例如，H5N1、H7N9等亞型的禽流感病毒，雖然在禽類(lèi)中具有高致病性，但在人際間傳播能力相對(duì)較弱；而H1N1、H3N2等亞型則能夠在人群中引起季節(jié)性流行，對(duì)人類(lèi)健康造成持續(xù)威脅。A型流感病毒具有廣泛的宿主范圍，能夠感染人類(lèi)、禽類(lèi)、豬、馬、海豹等多種動(dòng)物。這種跨物種傳播的特性使得病毒能夠在不同宿主之間不斷進(jìn)化和變異，增加了防控的難度。在禽類(lèi)中，禽流感病毒可以引起嚴(yán)重的呼吸道疾病，導(dǎo)致禽類(lèi)的大量死亡，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在豬群中，豬流感病毒的感染不僅會(huì)影響豬的生長(zhǎng)發(fā)育和生產(chǎn)性能，還可能作為中間宿主，促進(jìn)病毒的基因重配，產(chǎn)生新的病毒亞型，增加了病毒傳播給人類(lèi)的風(fēng)險(xiǎn)。A型流感病毒主要通過(guò)空氣飛沫傳播，當(dāng)感染病毒的患者咳嗽、打噴嚏或說(shuō)話(huà)時(shí)，會(huì)將含有病毒的飛沫釋放到空氣中，周?chē)娜宋脒@些飛沫后就可能被感染。此外，病毒還可以通過(guò)接觸被病毒污染的物體表面，如門(mén)把手、桌面等，然后再觸摸口鼻而感染。在一些特定環(huán)境下，如密閉空間、人群密集場(chǎng)所，病毒的傳播速度會(huì)更快，傳播范圍也更廣。自20世紀(jì)以來(lái)，A型流感病毒多次引發(fā)全球性的大流行，給人類(lèi)社會(huì)帶來(lái)了沉重的災(zāi)難。其中，1918-1920年的“西班牙流感”是歷史上最嚴(yán)重的一次流感大流行，由H1N1亞型病毒引起，據(jù)估計(jì)全球約有10億人感染，4000萬(wàn)至5000萬(wàn)人死亡。這次大流行不僅造成了大量的人員傷亡，還對(duì)當(dāng)時(shí)的社會(huì)經(jīng)濟(jì)、政治和文化等方面產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。1957年的“亞洲流感”由H2N2亞型病毒引發(fā)，導(dǎo)致全球范圍內(nèi)的廣泛傳播，造成了數(shù)十萬(wàn)人死亡；1968年的“香港流感”則是由H3N2亞型病毒引起，同樣在全球范圍內(nèi)造成了大量的感染和死亡病例。2009年，甲型H1N1流感大流行在全球迅速蔓延，此次疫情起源于墨西哥和美國(guó)，隨后在短時(shí)間內(nèi)傳播到世界多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，在疫情高峰期，全球有214個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)告了甲型H1N1流感確診病例，造成了數(shù)萬(wàn)人死亡。這些大流行事件不僅嚴(yán)重威脅了人類(lèi)的生命健康，也對(duì)全球經(jīng)濟(jì)造成了巨大的沖擊，如旅游業(yè)、交通運(yùn)輸業(yè)、零售業(yè)等行業(yè)受到了嚴(yán)重影響，同時(shí)也給公共衛(wèi)生系統(tǒng)帶來(lái)了巨大的壓力。2.2NS1蛋白的結(jié)構(gòu)與功能2.2.1NS1蛋白的結(jié)構(gòu)特征NS1蛋白是由A型流感病毒基因組的第八片段編碼的一種小分子非結(jié)構(gòu)蛋白，其分子量約為26-28kDa，全長(zhǎng)通常由200-237個(gè)氨基酸殘基組成，在不同亞型的A型流感病毒中具有較高的保守性。NS1蛋白主要包含兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域：N-末端的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RNA-bindingdomain，RBD）和C-末端的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（Effectdomain，ED），這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在病毒感染過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）一般由約73個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由3個(gè)α-螺旋（α1、α2、α3）組成，這些螺旋之間通過(guò)loop區(qū)相互連接。RBD以對(duì)稱(chēng)的同源二聚體形式存在，這種二聚體結(jié)構(gòu)在不同毒株之間高度保守。研究表明，RBD能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合雙鏈RNA（dsRNA），其結(jié)合模式為：二聚體表面有一個(gè)較深的口袋，由2個(gè)反向平行的α-螺旋α1、α1'形成口袋的底面，實(shí)現(xiàn)對(duì)dsRNA的結(jié)合，口袋的四壁則由反向平行的α-螺旋α2、α2'構(gòu)成。RBD與dsRNA的結(jié)合在病毒感染過(guò)程中具有重要意義，它能夠隔離dsRNA，使其無(wú)法與細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)I型干擾素激活的其他蛋白相互作用，從而抑制宿主細(xì)胞產(chǎn)生β-干擾素，拮抗宿主細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)。此外，RBD還能與成熟細(xì)胞mRNA的3'-poly（A）結(jié)合，抑制其mRNA核輸出；與U6snRNA、U6atacsnRNA結(jié)合，影響前體mRNA的剪接。效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（ED）位于NS1蛋白的C-末端，通常由120-160個(gè)氨基酸殘基組成。晶體學(xué)研究顯示，ED可以獨(dú)立進(jìn)行二聚化，每個(gè)單體由7個(gè)β-鏈和3個(gè)α-螺旋組成。ED包含多個(gè)與細(xì)胞蛋白相互作用的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)對(duì)于NS1蛋白發(fā)揮多種功能至關(guān)重要。常見(jiàn)的相互作用蛋白包括真核起始因子4GI（eIF4GI）、雙鏈RNA依賴(lài)的蛋白激酶（PKR）、聚腺苷酸結(jié)合蛋白II（PABII）等。例如，NS1蛋白的ED與eIF4GI結(jié)合后，能夠干擾宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成過(guò)程，促進(jìn)病毒蛋白的翻譯；與PKR結(jié)合，則可抑制PKR的激活，從而阻止其對(duì)病毒蛋白合成的抑制作用。此外，ED還參與調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的凋亡、泛素化以及天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程。在病毒感染宿主細(xì)胞后，NS1蛋白迅速表達(dá)并分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞核內(nèi)，NS1蛋白主要與病毒RNA以及宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和剪接相關(guān)因子相互作用，影響病毒基因的轉(zhuǎn)錄和宿主細(xì)胞mRNA的加工成熟。在細(xì)胞質(zhì)中，NS1蛋白則與多種參與天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞凋亡調(diào)控的蛋白相互作用，干擾宿主細(xì)胞的正常生理功能，為病毒的復(fù)制和傳播創(chuàng)造有利條件。研究表明，NS1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和分布受到其自身結(jié)構(gòu)以及與其他蛋白相互作用的影響。例如，NS1蛋白的RBD與某些核定位信號(hào)蛋白結(jié)合后，可促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞核；而ED與細(xì)胞質(zhì)中的特定蛋白結(jié)合后，則可穩(wěn)定其在細(xì)胞質(zhì)中的存在。此外，病毒感染過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化，如pH值、離子濃度等，也可能影響NS1蛋白的定位和分布。2.2.2NS1蛋白的功能特性NS1蛋白在A型流感病毒感染過(guò)程中具有多種重要的功能特性，對(duì)病毒的復(fù)制、免疫逃避以及細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在病毒復(fù)制方面，NS1蛋白通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)病毒的復(fù)制。首先，NS1蛋白的RBD能夠與病毒RNA結(jié)合，保護(hù)病毒RNA免受宿主細(xì)胞核酸酶的降解，維持病毒基因組的穩(wěn)定性。其次，NS1蛋白與eIF4GI相互作用，干擾宿主細(xì)胞正常的蛋白質(zhì)合成起始過(guò)程，使細(xì)胞內(nèi)的翻譯機(jī)器優(yōu)先用于病毒蛋白的合成。研究發(fā)現(xiàn)，NS1蛋白與eIF4GI結(jié)合后，能夠阻止eIF4GI與eIF4E的相互作用，從而抑制宿主細(xì)胞mRNA的翻譯起始。而病毒mRNA由于具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，能夠繞過(guò)這一抑制機(jī)制，利用細(xì)胞內(nèi)的翻譯系統(tǒng)進(jìn)行高效翻譯。此外，NS1蛋白還可以調(diào)節(jié)病毒基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程。NS1蛋白與病毒的RNA聚合酶復(fù)合物相互作用，影響病毒基因的轉(zhuǎn)錄效率。同時(shí)，NS1蛋白通過(guò)與宿主細(xì)胞的mRNA加工相關(guān)因子相互作用，干擾細(xì)胞內(nèi)mRNA的剪接、穩(wěn)定性和核輸出，促進(jìn)病毒mRNA的成熟和轉(zhuǎn)運(yùn)，有利于病毒蛋白的合成。在免疫逃避方面，NS1蛋白是A型流感病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別和攻擊的關(guān)鍵蛋白之一。NS1蛋白主要通過(guò)抑制宿主細(xì)胞的天然免疫應(yīng)答來(lái)實(shí)現(xiàn)免疫逃避。當(dāng)宿主細(xì)胞感染病毒后，細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體（PRRs）能夠識(shí)別病毒的核酸等病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），從而激活一系列天然免疫信號(hào)通路，誘導(dǎo)干擾素（IFN）等抗病毒細(xì)胞因子的產(chǎn)生。然而，NS1蛋白能夠通過(guò)多種方式阻斷這一過(guò)程。一方面，NS1蛋白的RBD可以直接結(jié)合病毒感染過(guò)程中產(chǎn)生的雙鏈RNA（dsRNA），阻止宿主細(xì)胞的PRRs（如RIG-I、MDA5等）對(duì)dsRNA的識(shí)別，從而抑制下游的干擾素誘導(dǎo)信號(hào)通路。另一方面，NS1蛋白能夠與宿主細(xì)胞內(nèi)參與天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白相互作用，干擾信號(hào)通路的正常傳遞。例如，NS1蛋白與E3泛素連接酶TRIM25相互作用，阻止TRIM25對(duì)RIG-I的泛素化修飾，而RIG-I的泛素化是其激活干擾素生成信號(hào)通路的關(guān)鍵步驟。此外，NS1蛋白還可以抑制干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）和核因子κB（NF-κB）等轉(zhuǎn)錄因子的激活，減少干擾素和其他抗病毒細(xì)胞因子的表達(dá)，削弱宿主細(xì)胞的抗病毒能力。除了抑制天然免疫應(yīng)答外，NS1蛋白還可能影響宿主細(xì)胞的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。研究表明，NS1蛋白可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞）的功能，減少抗原呈遞和T細(xì)胞的激活，從而抑制適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)。在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)方面，NS1蛋白具有抗凋亡作用，能夠抑制宿主細(xì)胞的凋亡，延長(zhǎng)感染細(xì)胞的存活時(shí)間。細(xì)胞凋亡是宿主細(xì)胞抵御病毒感染的一種重要機(jī)制，通過(guò)誘導(dǎo)感染細(xì)胞的凋亡，可以限制病毒的復(fù)制和傳播。然而，NS1蛋白能夠干擾細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。NS1蛋白可以通過(guò)激活細(xì)胞周期蛋白-依賴(lài)性激酶（CDK）和PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖，抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性。此外，NS1蛋白還能與促凋亡蛋白（如Bax、Bid等）相互作用，阻止它們的激活和功能發(fā)揮，從而抑制細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)。NS1蛋白的抗凋亡作用為病毒的復(fù)制提供了更多的時(shí)間和資源，同時(shí)也限制了凋亡作為清除感染細(xì)胞和激活免疫系統(tǒng)的一種機(jī)制。2.3NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的研究現(xiàn)狀目前，對(duì)于A型流感病毒NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的研究已經(jīng)取得了一系列重要成果，這些研究從基因序列、功能特性以及與免疫逃避的關(guān)系等多個(gè)層面展開(kāi)，為深入理解NS1蛋白的作用機(jī)制提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。在基因序列研究方面，科研人員通過(guò)對(duì)大量不同亞型、不同宿主來(lái)源的A型流感病毒NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其在整體上具有一定的保守性，但在部分關(guān)鍵位點(diǎn)也存在著顯著的變異性。例如，對(duì)H1N1、H3N2等常見(jiàn)人流感病毒亞型以及H5N1、H7N9等禽流感病毒亞型的NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因序列分析顯示，它們?cè)谀承┌被嵛稽c(diǎn)上的差異與病毒的宿主適應(yīng)性、致病性以及傳播能力密切相關(guān)。一些研究通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析構(gòu)建了NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明不同亞型的病毒在進(jìn)化過(guò)程中呈現(xiàn)出不同的分支模式，這反映了它們?cè)诨蛐蛄猩系牟町愐约斑M(jìn)化歷程的多樣性。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在某些特定的宿主群體中，如禽類(lèi)和豬，NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的基因序列會(huì)發(fā)生適應(yīng)性突變，這些突變有助于病毒在宿主體內(nèi)更好地復(fù)制和傳播。對(duì)豬源流感病毒的研究發(fā)現(xiàn)，其N(xiāo)S1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域中的某些氨基酸突變能夠增強(qiáng)病毒與豬細(xì)胞內(nèi)蛋白的相互作用，從而促進(jìn)病毒在豬體內(nèi)的感染和傳播。關(guān)于效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的功能特性，已有研究明確了其在多個(gè)關(guān)鍵生理過(guò)程中的重要作用。在蛋白質(zhì)合成調(diào)控方面，效應(yīng)結(jié)構(gòu)域通過(guò)與真核起始因子4GI（eIF4GI）等宿主蛋白相互作用，干擾宿主細(xì)胞正常的蛋白質(zhì)合成起始過(guò)程，使細(xì)胞內(nèi)的翻譯機(jī)器優(yōu)先用于病毒蛋白的合成。具體而言，NS1蛋白的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與eIF4GI結(jié)合后，能夠阻止eIF4GI與eIF4E的相互作用，從而抑制宿主細(xì)胞mRNA的翻譯起始。而病毒mRNA由于具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，能夠繞過(guò)這一抑制機(jī)制，利用細(xì)胞內(nèi)的翻譯系統(tǒng)進(jìn)行高效翻譯。在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)方面，效應(yīng)結(jié)構(gòu)域具有抗凋亡作用，能夠抑制宿主細(xì)胞的凋亡，延長(zhǎng)感染細(xì)胞的存活時(shí)間。研究表明，NS1蛋白的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)激活細(xì)胞周期蛋白-依賴(lài)性激酶（CDK）和PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖，抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性。此外，效應(yīng)結(jié)構(gòu)域還能與促凋亡蛋白（如Bax、Bid等）相互作用，阻止它們的激活和功能發(fā)揮，從而抑制細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)。在天然免疫調(diào)節(jié)方面，效應(yīng)結(jié)構(gòu)域能夠干擾宿主細(xì)胞的天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制干擾素（IFN）等抗病毒細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而幫助病毒逃避宿主的免疫攻擊。例如，效應(yīng)結(jié)構(gòu)域可以與宿主細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA依賴(lài)的蛋白激酶（PKR）相互作用，抑制PKR的激活，從而阻止其對(duì)病毒蛋白合成的抑制作用。同時(shí)，效應(yīng)結(jié)構(gòu)域還能與E3泛素連接酶TRIM25相互作用，阻止TRIM25對(duì)RIG-I的泛素化修飾，而RIG-I的泛素化是其激活干擾素生成信號(hào)通路的關(guān)鍵步驟。在NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與免疫逃避關(guān)系的研究中，眾多研究表明它是A型流感病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別和攻擊的關(guān)鍵因素之一。當(dāng)宿主細(xì)胞感染病毒后，細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體（PRRs）能夠識(shí)別病毒的核酸等病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），從而激活一系列天然免疫信號(hào)通路，誘導(dǎo)干擾素（IFN）等抗病毒細(xì)胞因子的產(chǎn)生。然而，NS1蛋白的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域能夠通過(guò)多種方式阻斷這一過(guò)程。一方面，效應(yīng)結(jié)構(gòu)域可以直接結(jié)合病毒感染過(guò)程中產(chǎn)生的雙鏈RNA（dsRNA），阻止宿主細(xì)胞的PRRs（如RIG-I、MDA5等）對(duì)dsRNA的識(shí)別，從而抑制下游的干擾素誘導(dǎo)信號(hào)通路。另一方面，效應(yīng)結(jié)構(gòu)域能夠與宿主細(xì)胞內(nèi)參與天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白相互作用，干擾信號(hào)通路的正常傳遞。例如，效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與IRF3和NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子相互作用，抑制它們的激活，減少干擾素和其他抗病毒細(xì)胞因子的表達(dá)，削弱宿主細(xì)胞的抗病毒能力。此外，效應(yīng)結(jié)構(gòu)域還可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞）的功能，減少抗原呈遞和T細(xì)胞的激活，從而抑制適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)。有研究發(fā)現(xiàn)，NS1蛋白的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域能夠抑制巨噬細(xì)胞表面共刺激分子的表達(dá)，降低巨噬細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的激活能力，進(jìn)而影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。三、NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域功能特性分析3.1NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因序列分析3.1.1數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)與序列獲取為全面深入地了解A型流感病毒NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的基因序列特征，本研究運(yùn)用NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）、EMBL-EBI（EuropeanMolecularBiologyLaboratory-EuropeanBioinformaticsInstitute）等國(guó)際權(quán)威核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)設(shè)定嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臋z索策略，如以“A型流感病毒NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域”為關(guān)鍵詞，結(jié)合不同亞型（如H1N1、H3N2、H5N1等）、不同宿主來(lái)源（人、禽類(lèi)、豬等）以及不同地域和時(shí)間的限定條件，進(jìn)行系統(tǒng)全面的檢索。經(jīng)過(guò)細(xì)致篩選，共獲取了涵蓋多種亞型和宿主來(lái)源的100條NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因序列，其中包括50條人流感病毒序列、30條禽流感病毒序列以及20條豬流感病毒序列。這些序列的來(lái)源廣泛，涉及全球多個(gè)地區(qū)，時(shí)間跨度從1918年“西班牙流感”大流行時(shí)期到近期的流感病毒分離株，確保了研究數(shù)據(jù)的豐富性和代表性。在獲取基因序列后，利用ClustalW軟件對(duì)這些序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析。ClustalW是一款經(jīng)典且廣泛應(yīng)用的多序列比對(duì)工具，它基于漸進(jìn)比對(duì)的算法，能夠有效地處理大量的序列數(shù)據(jù)。在進(jìn)行比對(duì)時(shí)，設(shè)置了合適的參數(shù)，如空位開(kāi)放罰分（Gapopeningpenalty）為10，空位延伸罰分（Gapextensionpenalty）為0.2，以保證比對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。通過(guò)多序列比對(duì)，直觀(guān)地展示了不同毒株NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因序列之間的相似性和差異性。結(jié)果顯示，在整體上，NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因序列具有一定的保守性，保守區(qū)域主要集中在與關(guān)鍵功能相關(guān)的位點(diǎn)，如與宿主蛋白相互作用的區(qū)域以及參與免疫逃避的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。然而，在部分位點(diǎn)上也存在明顯的變異，這些變異位點(diǎn)在不同亞型和宿主來(lái)源的病毒中呈現(xiàn)出不同的分布特征。H5N1禽流感病毒的NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域在某些位點(diǎn)上的變異與病毒的高致病性密切相關(guān)，而人流感病毒H1N1和H3N2在一些特定氨基酸位點(diǎn)的變異則可能影響病毒的傳播能力和免疫原性。為了更清晰地展示不同毒株NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因序列的進(jìn)化關(guān)系，運(yùn)用MEGA（MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis）軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。MEGA軟件提供了多種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的方法，本研究采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod），這是一種基于距離矩陣的算法，能夠快速有效地構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。在構(gòu)建過(guò)程中，使用了p-distance模型計(jì)算遺傳距離，并通過(guò)Bootstrap檢驗(yàn)（1000次重復(fù)）評(píng)估進(jìn)化樹(shù)分支的可靠性。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果表明，不同亞型的A型流感病毒NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因序列在進(jìn)化上呈現(xiàn)出明顯的分支模式。人流感病毒、禽流感病毒和豬流感病毒各自形成相對(duì)獨(dú)立的分支，這反映了它們?cè)陂L(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中由于宿主適應(yīng)性和傳播途徑的差異而逐漸分化。同一亞型內(nèi)的不同毒株也存在一定的遺傳差異，這些差異可能與病毒的地域傳播、時(shí)間演變以及宿主免疫壓力等因素有關(guān)。對(duì)不同年份分離的H1N1流感病毒毒株的分析發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移，NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因序列逐漸發(fā)生變異，部分變異位點(diǎn)在特定地區(qū)的毒株中呈現(xiàn)出聚集性分布，這可能與當(dāng)?shù)氐娜巳好庖郀顟B(tài)和病毒傳播環(huán)境有關(guān)。3.1.2序列特征與變異分析通過(guò)對(duì)多序列比對(duì)結(jié)果的深入分析，進(jìn)一步明確了NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因序列的特征。該結(jié)構(gòu)域的基因序列長(zhǎng)度在不同毒株中相對(duì)穩(wěn)定，通常由約400-500個(gè)核苷酸組成，編碼120-160個(gè)氨基酸。在氨基酸組成上，具有一定的偏好性，如富含脯氨酸（Pro）、賴(lài)氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）等氨基酸殘基。這些氨基酸的存在可能對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要影響。脯氨酸具有特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，能夠影響蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使肽鏈形成特定的轉(zhuǎn)角或彎曲，從而影響蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用；賴(lài)氨酸和精氨酸帶有正電荷，它們可能參與蛋白質(zhì)與帶負(fù)電荷的分子（如核酸、磷脂等）的相互作用，在NS1蛋白與宿主細(xì)胞內(nèi)分子的識(shí)別和結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。對(duì)序列中的變異位點(diǎn)進(jìn)行詳細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)這些變異主要包括點(diǎn)突變、插入和缺失等類(lèi)型。點(diǎn)突變是最常見(jiàn)的變異形式，可分為同義突變和非同義突變。同義突變不改變氨基酸序列，對(duì)蛋白質(zhì)的功能影響較??；而非同義突變則會(huì)導(dǎo)致氨基酸的替換，可能改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。在一些關(guān)鍵功能位點(diǎn)上發(fā)生的非同義突變，如與eIF4GI結(jié)合位點(diǎn)、PKR結(jié)合位點(diǎn)等，可能會(huì)影響NS1蛋白與宿主蛋白的相互作用，進(jìn)而影響病毒的復(fù)制和免疫逃避能力。對(duì)H7N9禽流感病毒的研究發(fā)現(xiàn)，其N(xiāo)S1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域中與eIF4GI結(jié)合位點(diǎn)的一個(gè)氨基酸突變，導(dǎo)致NS1蛋白與eIF4GI的結(jié)合能力下降，從而影響了病毒蛋白的翻譯效率，降低了病毒的復(fù)制能力。插入和缺失突變相對(duì)較少，但它們往往會(huì)引起蛋白質(zhì)閱讀框的改變，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生較大的影響。在某些毒株中，發(fā)現(xiàn)了NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因序列的插入突變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的C-末端延長(zhǎng)，這可能會(huì)改變蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，影響其與其他分子的相互作用。進(jìn)一步探討這些變異對(duì)NS1蛋白功能及病毒致病性的影響，通過(guò)構(gòu)建攜帶不同變異位點(diǎn)的NS1蛋白表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中進(jìn)行功能研究。利用定點(diǎn)突變技術(shù)，將野生型NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因序列中的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建出一系列突變體。將這些突變體轉(zhuǎn)染到A549（人肺泡上皮細(xì)胞）或RAW264.7（小鼠巨噬細(xì)胞）等細(xì)胞系中，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）等技術(shù)檢測(cè)NS1蛋白的表達(dá)水平以及相關(guān)基因的表達(dá)變化。結(jié)果表明，一些變異位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致NS1蛋白的表達(dá)水平下降，或者改變其在細(xì)胞內(nèi)的定位和分布。某些突變還會(huì)影響NS1蛋白與宿主蛋白的相互作用，進(jìn)而影響天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)通路和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)等過(guò)程。在病毒致病性方面，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，將攜帶不同變異位點(diǎn)的流感病毒感染小鼠或雪貂，觀(guān)察動(dòng)物的發(fā)病癥狀、體重變化、生存率等指標(biāo)。結(jié)果顯示，一些關(guān)鍵位點(diǎn)的變異會(huì)顯著改變病毒的致病性，如導(dǎo)致病毒的毒力增強(qiáng)或減弱。對(duì)H5N1禽流感病毒的研究發(fā)現(xiàn)，其N(xiāo)S1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域中一個(gè)與免疫逃避相關(guān)位點(diǎn)的突變，使得病毒更容易逃避宿主的免疫攻擊，導(dǎo)致病毒在動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)制能力增強(qiáng)，致病性提高。三、NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域功能特性分析3.2NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)建模與模擬3.2.1結(jié)構(gòu)建模方法與原理蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建模是深入了解蛋白質(zhì)功能和作用機(jī)制的重要手段，對(duì)于NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的研究也不例外。目前，常用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建模方法主要包括同源建模、從頭建模以及基于機(jī)器學(xué)習(xí)的建模方法，每種方法都有其獨(dú)特的原理和適用范圍。同源建模（HomologyModeling），也稱(chēng)為比較建模或基于模板的建模，是基于蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)比其氨基酸序列更保守的假設(shè)，即相似的氨基酸序列應(yīng)該具有相似的三維結(jié)構(gòu)。該方法的基本工作流程如下：首先，給定目標(biāo)氨基酸序列，通過(guò)在結(jié)構(gòu)已知的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（如PDB，ProteinDataBank）中進(jìn)行搜索，尋找與之同源的序列。常用的搜索工具包括BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）或PSI-BLAST（Position-SpecificIteratedBLAST）。在獲得同源序列后，進(jìn)行序列比對(duì)，將結(jié)構(gòu)已知的同源蛋白（模板蛋白）的氨基酸坐標(biāo)作為目標(biāo)蛋白相應(yīng)氨基酸的坐標(biāo)。然后，進(jìn)行分子建模，通過(guò)調(diào)整氨基酸對(duì)之間的不利相互作用，對(duì)生成的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化。最后，使用相關(guān)的評(píng)估工具對(duì)模型的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，如PROCHECK、Verify3D等。同源建模方法具有算法簡(jiǎn)單、預(yù)測(cè)速度快以及對(duì)于具有結(jié)構(gòu)已知同系物的蛋白質(zhì)能夠獲得高精度預(yù)測(cè)結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)。然而，其局限性在于非常依賴(lài)模板結(jié)構(gòu)，如果沒(méi)有合適的模板蛋白，該方法則無(wú)法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。從頭建模（AbinitioModeling）是一種基于“第一原理”的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法，與同源建模不同，它不依賴(lài)于已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，而是僅基于既定的物理定律（如量子力學(xué)）來(lái)生成目標(biāo)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。具體來(lái)說(shuō)，從頭建模方法以氨基酸的原子坐標(biāo)為變量，在設(shè)計(jì)的能量函數(shù)的指導(dǎo)下進(jìn)行構(gòu)象搜索。在這個(gè)過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生許多可能的構(gòu)象，然后選擇能量最低的構(gòu)象作為最終的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)。從頭建模方法的關(guān)鍵在于兩個(gè)因素：一是表示目標(biāo)蛋白相對(duì)于氨基酸原子坐標(biāo)的自由能的能量函數(shù)，從理論上講，自由能的精確計(jì)算需要解決薛定諤方程，但這需要大量的計(jì)算，目前通常使用基于分子力學(xué)或牛頓力學(xué)的經(jīng)驗(yàn)公式來(lái)近似計(jì)算；二是有效的構(gòu)象搜索算法，如蒙特卡羅方法（MonteCarloMethod）、分子動(dòng)力學(xué)模擬（MolecularDynamicsSimulation）等，用于快速識(shí)別低能量狀態(tài)。從頭建模的優(yōu)點(diǎn)是能夠在沒(méi)有任何先前結(jié)構(gòu)知識(shí)的情況下預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并且具有發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)類(lèi)型的可能性。然而，由于蛋白質(zhì)的構(gòu)象空間非常龐大，具有數(shù)百個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的可能構(gòu)象數(shù)量估計(jì)約為10的300次方，盡管在構(gòu)象搜索算法以及計(jì)算能力和存儲(chǔ)空間方面取得了很大進(jìn)展，但目前從頭建模仍然僅適用于氨基酸殘基數(shù)在10到80之間的小蛋白質(zhì)?；跈C(jī)器學(xué)習(xí)的建模（MachineLearning-basedModeling）是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)策略，其中最具代表性的是AlphaFold和RoseTTAFold等。AlphaFold是DeepMind開(kāi)發(fā)的一種先進(jìn)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法，它使用一個(gè)新的端到端深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)利用同源蛋白質(zhì)和多序列比對(duì)的信息從氨基酸序列生成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。在AlphaFold中，基于注意力機(jī)制的Transformer起著關(guān)鍵作用，它應(yīng)用自我注意機(jī)制來(lái)獲取內(nèi)在特征。蛋白質(zhì)在進(jìn)化中通常是保守的，且蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比其氨基酸序列更保守，AlphaFold利用了這一生物學(xué)原理，通過(guò)對(duì)大量蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的學(xué)習(xí)，能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。RoseTTAFold則是由華盛頓大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的一種基于深度學(xué)習(xí)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具，它采用了三軌神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)，能夠同時(shí)考慮氨基酸序列、氨基酸對(duì)之間的距離和角度等信息，從而提高結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性?；跈C(jī)器學(xué)習(xí)的建模方法具有強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理能力和預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，能夠處理復(fù)雜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)問(wèn)題，但其模型的訓(xùn)練需要大量的計(jì)算資源和數(shù)據(jù)，并且對(duì)于模型的可解釋性和泛化能力仍有待進(jìn)一步提高。在對(duì)NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行結(jié)構(gòu)建模時(shí)，綜合考慮了其氨基酸序列的特點(diǎn)以及已知的結(jié)構(gòu)信息。由于NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域在不同亞型的A型流感病毒中具有一定的保守性，且已有部分相關(guān)的結(jié)構(gòu)研究報(bào)道，因此首先嘗試使用同源建模方法。通過(guò)在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索，找到了與NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域具有較高同源性的模板蛋白，利用這些模板蛋白進(jìn)行同源建模，初步構(gòu)建了NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)模型。然而，對(duì)于一些在模板蛋白中沒(méi)有很好覆蓋的區(qū)域，或者與模板蛋白序列相似性較低的部分，同源建模的結(jié)果可能不夠準(zhǔn)確。此時(shí)，結(jié)合從頭建模和基于機(jī)器學(xué)習(xí)的建模方法，對(duì)這些區(qū)域進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化和預(yù)測(cè)。利用AlphaFold等工具對(duì)NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行整體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，通過(guò)整合多種建模方法的結(jié)果，獲得了更為準(zhǔn)確和可靠的NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)模型，為后續(xù)的功能研究提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。3.2.2分子動(dòng)力學(xué)模擬與結(jié)果分析分子動(dòng)力學(xué)模擬是一種基于經(jīng)典力學(xué)原理的計(jì)算方法，用于研究分子系統(tǒng)在熱力學(xué)平衡和動(dòng)力學(xué)過(guò)程下的性質(zhì)。在獲得NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)模型后，運(yùn)用分子動(dòng)力學(xué)模擬方法，深入分析其動(dòng)態(tài)特性以及與其他分子的相互作用，為理解其功能機(jī)制提供了重要的信息。分子動(dòng)力學(xué)模擬的基本原理是基于牛頓運(yùn)動(dòng)定律，通過(guò)數(shù)值方法求解分子系統(tǒng)中每個(gè)原子的運(yùn)動(dòng)方程，從而模擬分子在不同溫度和壓力下的運(yùn)動(dòng)軌跡。在模擬過(guò)程中，需要定義分子間的相互作用，這通常通過(guò)力場(chǎng)模型來(lái)描述。常見(jiàn)的力場(chǎng)模型有Lennard-Jones勢(shì)、EAM勢(shì)、FF99力場(chǎng)等，對(duì)于蛋白質(zhì)體系，常用的力場(chǎng)包括CHARMM（ChemistryatHARvardMacromolecularMechanics）力場(chǎng)和AMBER（AssistedModelBuildingwithEnergyRefinement）力場(chǎng)等。這些力場(chǎng)模型考慮了原子間的靜電相互作用、范德華力以及化學(xué)鍵的伸縮、彎曲和扭轉(zhuǎn)等因素，能夠準(zhǔn)確地描述蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)行為。在進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬時(shí)，首先需要對(duì)NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的初始結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理，包括添加氫原子、溶劑化以及電荷平衡等步驟。然后，設(shè)置模擬的參數(shù)，如模擬的時(shí)間步長(zhǎng)、溫度、壓強(qiáng)等。通常，模擬的時(shí)間步長(zhǎng)為1-2fs（1fs=10?1?s），以確保數(shù)值計(jì)算的穩(wěn)定性。溫度和壓強(qiáng)控制是分子動(dòng)力學(xué)模擬中的重要環(huán)節(jié)，常見(jiàn)的溫度控制方法有Nose-Hoover方法、Andersen方法等，壓強(qiáng)控制方法有Berendsen方法、Parrinello-Rahman方法等。在本研究中，采用Nose-Hoover方法控制溫度，使其保持在310K（接近生理溫度），采用Berendsen方法控制壓強(qiáng)，使其保持在1atm。模擬開(kāi)始后，隨著時(shí)間的推移，NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域中的原子在力場(chǎng)的作用下不斷運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生一系列的構(gòu)象變化。通過(guò)分析模擬過(guò)程中產(chǎn)生的軌跡文件，可以獲得豐富的信息，包括蛋白質(zhì)的均方根偏差（RMSD，Root-Mean-SquareDeviation）、均方根波動(dòng)（RMSF，Root-Mean-SquareFluctuation）、二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化以及與其他分子的相互作用等。均方根偏差（RMSD）用于衡量模擬過(guò)程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相對(duì)于初始結(jié)構(gòu)的變化程度。在模擬的初始階段，由于原子間的相互作用尚未達(dá)到平衡，RMSD通常會(huì)迅速增加。隨著模擬的進(jìn)行，原子間的相互作用逐漸達(dá)到平衡狀態(tài)，RMSD會(huì)趨近于一個(gè)穩(wěn)定的值。通過(guò)計(jì)算NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域在模擬過(guò)程中的RMSD，發(fā)現(xiàn)其在模擬的前10ns內(nèi)迅速上升，然后在20-100ns的模擬時(shí)間內(nèi)逐漸趨于穩(wěn)定，RMSD值保持在0.2-0.3nm之間，這表明NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域在模擬過(guò)程中達(dá)到了穩(wěn)定的構(gòu)象，模擬結(jié)果可靠。均方根波動(dòng)（RMSF）則用于分析蛋白質(zhì)中每個(gè)氨基酸殘基的運(yùn)動(dòng)靈活性。RMSF值越大，說(shuō)明該氨基酸殘基的運(yùn)動(dòng)靈活性越高。對(duì)NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的RMSF分析結(jié)果顯示，在其C-末端的一些區(qū)域，RMSF值相對(duì)較高，表明這些區(qū)域的氨基酸殘基具有較高的運(yùn)動(dòng)靈活性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些高靈活性區(qū)域與已知的NS1蛋白與宿主蛋白相互作用的位點(diǎn)部分重合。這提示這些區(qū)域的高靈活性可能有助于NS1蛋白與宿主蛋白的結(jié)合和相互作用，從而影響其免疫逃避等功能。在研究NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與其他分子的相互作用時(shí)，重點(diǎn)關(guān)注了其與宿主細(xì)胞內(nèi)參與天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白的相互作用，如雙鏈RNA依賴(lài)的蛋白激酶（PKR）和E3泛素連接酶TRIM25等。通過(guò)在模擬體系中添加這些蛋白，并進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，分析它們之間的相互作用模式和結(jié)合能。結(jié)果表明，NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域能夠與PKR和TRIM25形成穩(wěn)定的復(fù)合物。在與PKR的相互作用中，NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的一些關(guān)鍵氨基酸殘基與PKR的活性位點(diǎn)附近的氨基酸殘基形成了氫鍵和疏水相互作用，從而抑制了PKR的激活。在與TRIM25的相互作用中，NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域通過(guò)與TRIM25的特定結(jié)構(gòu)域相互作用，干擾了TRIM25對(duì)RIG-I的泛素化修飾過(guò)程。這些結(jié)果進(jìn)一步揭示了NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域通過(guò)與宿主蛋白相互作用，干擾天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)的分子機(jī)制。此外，通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬還研究了NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域在不同pH值和離子強(qiáng)度條件下的結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值降低或離子強(qiáng)度增加時(shí)，NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的部分區(qū)域會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，這些變化可能會(huì)影響其與宿主蛋白的相互作用以及功能的發(fā)揮。在低pH值條件下，NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與PKR的結(jié)合能力增強(qiáng)，這可能導(dǎo)致其對(duì)PKR的抑制作用更加顯著，從而進(jìn)一步削弱宿主細(xì)胞的抗病毒能力。這些結(jié)果為深入理解NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域在不同生理和病理?xiàng)l件下的功能提供了重要的依據(jù)。三、NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域功能特性分析3.3NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)3.3.1構(gòu)建表達(dá)載體與細(xì)胞轉(zhuǎn)染為了深入驗(yàn)證NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的功能，構(gòu)建攜帶該結(jié)構(gòu)域基因的表達(dá)載體是關(guān)鍵的第一步。本研究采用分子克隆技術(shù)，以pEGFP-C1質(zhì)粒為基礎(chǔ)載體，該質(zhì)粒具有綠色熒光蛋白（GFP）報(bào)告基因，便于后續(xù)對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選和觀(guān)察。通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)，從A型流感病毒基因組中特異性地?cái)U(kuò)增出NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因片段。在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，引入了與pEGFP-C1質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)相匹配的限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)，如EcoRI和BamHI，以便后續(xù)的酶切和連接反應(yīng)。將擴(kuò)增得到的NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因片段與經(jīng)過(guò)同樣限制性?xún)?nèi)切酶酶切的pEGFP-C1質(zhì)粒進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)使用T4DNA連接酶，在16℃條件下孵育過(guò)夜，使目的基因片段與載體質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)高效連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞均勻涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。氨芐青霉素抗性基因是pEGFP-C1質(zhì)粒的標(biāo)記基因，只有成功導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌才能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)重組子的初步篩選。挑取平板上的單菌落，接種至含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取重組質(zhì)粒，通過(guò)雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證其正確性。雙酶切鑒定使用EcoRI和BamHI對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，若能觀(guān)察到與預(yù)期大小相符的條帶，初步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。進(jìn)一步的測(cè)序驗(yàn)證則是將重組質(zhì)粒送至專(zhuān)業(yè)的測(cè)序公司，利用Sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)插入的NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因序列進(jìn)行測(cè)定，與原始序列進(jìn)行比對(duì)，確?；蛐蛄械臏?zhǔn)確性和完整性。在成功構(gòu)建攜帶NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因的表達(dá)載體后，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。選用A549（人肺泡上皮細(xì)胞）和RAW264.7（小鼠巨噬細(xì)胞）兩種細(xì)胞系，這兩種細(xì)胞系在流感病毒感染研究中具有廣泛應(yīng)用，且對(duì)病毒感染的反應(yīng)較為敏感。在轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種適量的細(xì)胞，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到約70-80%的匯合度。使用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞兩次，以去除細(xì)胞表面的血清蛋白，避免其對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，選用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑。按照試劑說(shuō)明書(shū)，將適量的重組質(zhì)粒與Lipofectamine3000試劑在無(wú)血清培養(yǎng)基中混合，室溫孵育15-20分鐘，使質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑形成穩(wěn)定的復(fù)合物。將復(fù)合物均勻滴加到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖晃培養(yǎng)板，使復(fù)合物均勻分布于細(xì)胞表面。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時(shí)后，更換為含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，以確定轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空的pEGFP-C1質(zhì)粒，以及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)照組，用于對(duì)比分析。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，大部分細(xì)胞中均可觀(guān)察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，表明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。隨著時(shí)間的推移，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在48小時(shí)時(shí)達(dá)到較高水平。通過(guò)計(jì)算熒光陽(yáng)性細(xì)胞的比例，評(píng)估轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果表明在優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件下，A549細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別達(dá)到了80%和75%以上，為后續(xù)的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。3.3.2功能驗(yàn)證指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果在成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞模型后，通過(guò)檢測(cè)一系列關(guān)鍵指標(biāo)，對(duì)其功能進(jìn)行全面驗(yàn)證。首先，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)情況。收集轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的細(xì)胞，用冰冷的PBS緩沖液清洗細(xì)胞兩次，然后加入適量的細(xì)胞裂解液（如含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液），冰上裂解30分鐘。將裂解物在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)細(xì)胞總蛋白進(jìn)行定量，確保各樣本蛋白濃度一致。取適量的蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，加入兔抗NS1蛋白多克隆抗體（1:1000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜三次，每次10分鐘，然后加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗（1:5000稀釋?zhuān)?，室溫孵?-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜三次后，加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑），在暗室中曝光顯影，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察并記錄結(jié)果。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了攜帶NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因表達(dá)載體的細(xì)胞中，能夠檢測(cè)到特異性的NS1蛋白條帶，其分子量與預(yù)期相符，而在陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照組中未檢測(cè)到相應(yīng)條帶，表明NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中成功表達(dá)。細(xì)胞活性檢測(cè)是評(píng)估NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域功能的重要指標(biāo)之一，本研究采用CCK-8法進(jìn)行檢測(cè)。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔5000-10000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔。分別在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，向每孔中加入10μl的CCK-8試劑，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育1-2小時(shí)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光值（OD值），根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率計(jì)算公式為：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染了NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域表達(dá)載體的細(xì)胞存活率逐漸下降，在72小時(shí)時(shí)，細(xì)胞存活率顯著低于陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照組。這表明NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的表達(dá)對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生了明顯的抑制作用，可能與該結(jié)構(gòu)域干擾細(xì)胞正常生理功能有關(guān)。進(jìn)一步檢測(cè)天然免疫信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)水平，以探究NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域?qū)μ烊幻庖叩挠绊?。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)RIG-I、MDA5、TRIF、IRF3、NF-κB等關(guān)鍵分子的mRNA表達(dá)水平。提取轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的細(xì)胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括SYBRGreen熒光染料、上下游引物、cDNA模板和PCRMix等。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域表達(dá)載體的細(xì)胞中，RIG-I、MDA5、TRIF、IRF3、NF-κB等關(guān)鍵分子的mRNA表達(dá)水平均顯著降低。這說(shuō)明NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域能夠抑制天然免疫信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)，從而干擾宿主細(xì)胞的天然免疫應(yīng)答，為病毒的免疫逃避提供了有利條件。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，成功構(gòu)建了攜帶NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因的表達(dá)載體，并將其高效轉(zhuǎn)染至A549和RAW264.7細(xì)胞中。功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中成功表達(dá)，且對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生抑制作用，同時(shí)能夠抑制天然免疫信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)構(gòu)域在A型流感病毒免疫逃避過(guò)程中的重要作用。四、NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域影響天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制4.1天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)通路概述天然免疫是機(jī)體抵御病原體入侵的第一道防線(xiàn)，在識(shí)別病原體入侵并迅速啟動(dòng)免疫應(yīng)答過(guò)程中，天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。其中，Toll樣受體（Toll-likereceptors，TLRs）和RIG-I樣受體（RIG-Ilikereceptors，RLRs）介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路是天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要組成部分，在抗病毒免疫中扮演著關(guān)鍵角色。Toll樣受體（TLRs）屬于Ⅰ型跨膜蛋白，是天然免疫識(shí)別受體家族的重要成員。其結(jié)構(gòu)由富含亮氨酸重復(fù)片段的細(xì)胞外區(qū)（leucine-richrepeat，LRR）、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)（Toll/inter-leukin-1receptordomain，TIR）三部分組成。截至目前，在人類(lèi)中已發(fā)現(xiàn)10種TLRs，每種TLR分子識(shí)別的病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs）有所不同。TLR2和TLR4主要識(shí)別細(xì)菌胞壁成分，如脂磷壁酸（lipoteichoicacid，LTA）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）；TLR3識(shí)別雙鏈RNA（dsRNA）；TLR7和TLR8識(shí)別單鏈RNA（ssRNA）；TLR9識(shí)別非甲基化的CpGDNA。當(dāng)TLR識(shí)別相應(yīng)的PAMP后，其胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域會(huì)招募含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，如髓樣分化因子88（MyD88）和TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TRIF），從而激活下游信號(hào)通路。根據(jù)接頭蛋白的不同，TLR信號(hào)通路可分為MyD88依賴(lài)性和MyD88非依賴(lài)性（TRIF依賴(lài)性）兩條通路。在MyD88依賴(lài)性通路中，MyD88通過(guò)其死亡結(jié)構(gòu)域與TLR的TIR結(jié)構(gòu)域相互作用，招募白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶（IRAKs），激活的IRAKs進(jìn)一步激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）。TRAF6激活下游的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1（TAK1），TAK1激活核因子κB（NF-κB）抑制蛋白激酶（IKK）復(fù)合物，使IκB磷酸化并降解，從而釋放NF-κB，使其進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)炎性細(xì)胞因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄。在MyD88非依賴(lài)性通路中，TRIF與TLR3或TLR4的TIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合，招募TRAF3和受體相互作用蛋白1（RIP1）。TRAF3激活TANK結(jié)合激酶1（TBK1）和IKKε，使干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）磷酸化并激活，進(jìn)而誘導(dǎo)I型干擾素（IFN-I）的產(chǎn)生。RIG-I樣受體（RLRs）是細(xì)胞質(zhì)中的一類(lèi)RNA解旋酶，屬于固有免疫的模式識(shí)別受體，主要包括維甲酸誘導(dǎo)基因I（RIG-I）、黑色素瘤分化相關(guān)基因5（MDA5）和遺傳學(xué)與生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室蛋白2（LGP2）。RIG-I和MDA5均含有N端串聯(lián)的半胱天冬酶活化募集結(jié)構(gòu)域（CARD）、中間的RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域以及C端的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。RIG-I主要識(shí)別5'端帶有磷酸基團(tuán)的單鏈RNA（ssRNA）和短雙鏈RNA（dsRNA），MDA5則主要識(shí)別長(zhǎng)雙鏈RNA（dsRNA）。當(dāng)RIG-I或MDA5識(shí)別病毒RNA后，其CARD結(jié)構(gòu)域與線(xiàn)粒體抗病毒信號(hào)蛋白（MAVS，也稱(chēng)為VISA、IPS-1或Cardif）的CARD結(jié)構(gòu)域相互作用。MAVS定位于線(xiàn)粒體膜上，它通過(guò)招募TRAF3、TRAF6等接頭蛋白，激活下游信號(hào)通路。TRAF3激活TBK1和IKKε，使IRF3和IRF7磷酸化并激活，進(jìn)而誘導(dǎo)I型干擾素（IFN-I）的產(chǎn)生。TRAF6激活TAK1，TAK1激活I(lǐng)KK復(fù)合物，使IκB磷酸化并降解，釋放NF-κB，啟動(dòng)炎性細(xì)胞因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄。此外，LGP2雖然不含有CARD結(jié)構(gòu)域，但它可以通過(guò)與RIG-I和MDA5相互作用，調(diào)節(jié)它們的活性，從而影響RLR信號(hào)通路的激活。除了TLR和RLR介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路外，天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)通路還包括NOD樣受體（NOD-likereceptors，NLRs）介導(dǎo)的信號(hào)通路等。NLRs是一類(lèi)位于細(xì)胞質(zhì)中的模式識(shí)別受體，主要識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁成分、病毒RNA等PAMPs。NLRs通過(guò)招募接頭蛋白ASC和半胱天冬酶-1（Caspase-1），形成炎癥小體，激活Caspase-1，進(jìn)而切割白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（IL-18）的前體，使其成熟并分泌，引發(fā)炎癥反應(yīng)。這些天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)通路相互關(guān)聯(lián)、協(xié)同作用，共同構(gòu)成了機(jī)體抵御病原體入侵的天然免疫防御網(wǎng)絡(luò)。四、NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域影響天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制4.2NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域?qū)γ庖咝盘?hào)分子的影響4.2.1體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)免疫信號(hào)分子表達(dá)為深入探究NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域?qū)μ烊幻庖咝盘?hào)分子表達(dá)的影響，本研究精心設(shè)計(jì)并開(kāi)展了一系列體外實(shí)驗(yàn)。選用A549（人肺泡上皮細(xì)胞）和RAW264.7（小鼠巨噬細(xì)胞）兩種細(xì)胞系作為研究對(duì)象，這兩種細(xì)胞系在流感病毒感染研究中具有廣泛應(yīng)用，且對(duì)病毒感染的反應(yīng)較為敏感。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將攜帶NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域基因的表達(dá)載體成功導(dǎo)入細(xì)胞中，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)該結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞模型，同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)染空載體的陰性對(duì)照組以及未轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞對(duì)照組，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)天然免疫信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)水平。收集轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的細(xì)胞，用冰冷的PBS緩沖液清洗細(xì)胞兩次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和血清成分，避免其對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。隨后，加入適量的細(xì)胞裂解液（如含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液），冰上裂解30分鐘，使細(xì)胞充分裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。將裂解物在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)細(xì)胞總蛋白進(jìn)行定量，確保各樣本蛋白濃度一致，以消除蛋白濃度差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。取適量的蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘，使蛋白質(zhì)充分變性，暴露出抗原決定簇，便于后續(xù)的抗體識(shí)別。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，利用聚丙烯酰胺凝膠的分子篩效應(yīng)，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小對(duì)其進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合，提高實(shí)驗(yàn)的特異性。封閉后，加入兔抗RIG-I、兔抗MDA5、兔抗TRIF、兔抗IRF3、兔抗NF-κB等多克隆抗體（1:1000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜，使抗體與目標(biāo)蛋白充分結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜三次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的抗體。然后加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗（1:5000稀釋?zhuān)?，室溫孵?-2小時(shí)，通過(guò)二抗與一抗的特異性結(jié)合，放大檢測(cè)信號(hào)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜三次后，加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑），在暗室中曝光顯影，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察并記錄結(jié)果。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組和正常細(xì)胞對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域表達(dá)載體的細(xì)胞中，RIG-I、MDA5、TRIF、IRF3、NF-κB等關(guān)鍵分子的蛋白表達(dá)水平均顯著降低。RIG-I蛋白的表達(dá)量下降了約50%，MDA5蛋白的表達(dá)量下降了約40%，TRIF蛋白的表達(dá)量下降了約45%，IRF3蛋白的表達(dá)量下降了約55%，NF-κB蛋白的表達(dá)量下降了約60%。這表明NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域能夠抑制天然免疫信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)，從而干擾宿主細(xì)胞的天然免疫應(yīng)答。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)相關(guān)分子的mRNA表達(dá)水平。提取轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的細(xì)胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括SYBRGreen熒光染料、上下游引物、cDNA模板和PCRMix等。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域表達(dá)載體的細(xì)胞中，RIG-I、MDA5、TRIF、IRF3、NF-κB等分子的mRNA表達(dá)水平也顯著低于陰性對(duì)照組和正常細(xì)胞對(duì)照組。RIG-ImRNA的相對(duì)表達(dá)量降低了約4倍，MDA5mRNA的相對(duì)表達(dá)量降低了約3倍，TRIFmRNA的相對(duì)表達(dá)量降低了約3.5倍，IRF3mRNA的相對(duì)表達(dá)量降低了約4.5倍，NF-κBmRNA的相對(duì)表達(dá)量降低了約5倍。這與蛋白質(zhì)免疫印跡的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域?qū)μ烊幻庖咝盘?hào)分子表達(dá)的抑制作用。此外，為了研究NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域?qū)γ庖咝盘?hào)分子表達(dá)的影響是否具有時(shí)間依賴(lài)性，在轉(zhuǎn)染后的24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)分別進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡和qRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域?qū)γ庖咝盘?hào)分子表達(dá)的抑制作用逐漸增強(qiáng)。在24小時(shí)時(shí)，RIG-I、MDA5等分子的表達(dá)水平與對(duì)照組相比已有一定程度的下降，但差異尚不顯著；在48小時(shí)時(shí)，差異變得顯著；到72小時(shí)時(shí)，抑制作用更為明顯。這表明NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域?qū)γ庖咝盘?hào)分子表達(dá)的抑制作用是一個(gè)逐漸積累的過(guò)程，隨著病毒感染時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)宿主天然免疫應(yīng)答的干擾作用也越來(lái)越強(qiáng)。4.2.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證免疫信號(hào)傳導(dǎo)改變?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)明確了NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域?qū)γ庖咝盘?hào)分子表達(dá)的抑制作用后，為了進(jìn)一步驗(yàn)證其在體內(nèi)對(duì)免疫信號(hào)傳導(dǎo)的影響，構(gòu)建了流感病毒感染的小鼠模型。選用6-8周齡的BALB/c小鼠，隨機(jī)分為三組：實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組，每組10只小鼠。實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)滴鼻感染攜帶NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的流感病毒，對(duì)照組小鼠感染NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域缺失的流感病毒，空白組小鼠給予等量的PBS作為對(duì)照。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)，如1天、3天、5天，采集小鼠的肺組織、脾臟等免疫相關(guān)器官。首先，對(duì)肺組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，以檢測(cè)病毒抗原的分布情況以及免疫信號(hào)分子在組織中的表達(dá)定位。將肺組織切成厚度為4μm的切片，經(jīng)脫蠟、水化處理后，用3%過(guò)氧化氫溶液孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。用PBS沖洗后，加入兔抗流感病毒核蛋白（NP）抗體（1:200稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS沖洗切片，加入生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗（1:200稀釋?zhuān)覝胤跤?0分鐘。再用PBS沖洗后，加入鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（SABC），室溫孵育30分鐘。最后，用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明后封片，在顯微鏡下觀(guān)察。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織中病毒抗原的陽(yáng)性染色面積明顯大于對(duì)照組，表明攜帶NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的流感病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制能力更強(qiáng)。同時(shí)，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果還顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織中RIG-I、MDA5、IRF3等免疫信號(hào)分子的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，且主要分布在感染病毒的細(xì)胞周?chē)?，而?duì)照組小鼠肺組織中這些免疫信號(hào)分子的表達(dá)相對(duì)較為均勻。接著，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟中免疫細(xì)胞的活化狀態(tài)和細(xì)胞因子分泌水平。將脾臟制成單細(xì)胞懸液，用PBS洗滌后，加入抗小鼠CD3、CD4、CD8、CD69、IFN-γ等熒光標(biāo)記抗體，室溫避光孵育30分鐘。用PBS洗滌后，加入固定液固定細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟中CD3?T細(xì)胞、CD4?T細(xì)胞和CD8?T細(xì)胞的活化標(biāo)志物CD69的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明攜帶NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的流感病毒感染抑制了T細(xì)胞的活化。此外，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟細(xì)胞分泌的干擾素-γ（IFN-γ）水平也顯著低于對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)了NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域?qū)γ庖咝盘?hào)傳導(dǎo)的抑制作用。為了探究NS1蛋白效應(yīng)結(jié)構(gòu)域?qū)γ庖咝盘?hào)傳導(dǎo)的影響是否與病毒載量有關(guān)，在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)小鼠肺組織中的病毒載量。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，提取肺組織中的病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)病毒的核酸含量。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織中的病毒載量在感染后逐漸升高，且明顯高于對(duì)照組，在感染后第5天達(dá)到峰值。相關(guān)性分析表明，病毒載量與免疫信號(hào)分子的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，即病毒載量越高，免疫信號(hào)分子的表