第50講微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用1.________________，__________________________是研究和應(yīng)用微生物的前提，也是發(fā)酵工程的重要基礎(chǔ)。在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物，一方面要為人們需要的微生物提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件；另一方面要確保其他微生物無法混入，并將需要的微生物分離出來。2.培養(yǎng)基（1）培養(yǎng)基的概念：人們按照微生物_____________________，配制出_______________________________。（2）培養(yǎng)基的用途：用以________、________、________、________微生物或________________________。（3）培養(yǎng)基的種類：①按物理性質(zhì)劃分Ⅰ________培養(yǎng)基：常用于工業(yè)生產(chǎn)、微生物的擴(kuò)大培養(yǎng)；Ⅱ________培養(yǎng)基：常用于微生物的分離與鑒定，活菌計(jì)數(shù)，保藏菌種，配制時(shí)需加入______________。②按化學(xué)成分劃分Ⅰ________培養(yǎng)基：（成分明確）將所需的營養(yǎng)物質(zhì)按種類和所需量嚴(yán)格配制而成的培養(yǎng)基。Ⅱ________培養(yǎng)基：（成分不明確）如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。③按用途劃分Ⅰ________培養(yǎng)基：___________________________________________________________________________。如，為了篩選出能分解尿素的細(xì)菌，可以配制以__________為唯一______源的培養(yǎng)基。為了篩選出能分解纖維素的微生物，可以配制以__________為唯一______源的培養(yǎng)基。為了篩選出自養(yǎng)微生物，可以配制不含______源的培養(yǎng)基。為了篩選出固氮微生物，可以配制不含______源的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入高濃度的NaCl，可以篩選________微生物。在培養(yǎng)基中加入青霉素（只能殺死細(xì)菌），可以篩選____________菌在使用選擇培養(yǎng)基時(shí)，一般還需要設(shè)置兩種對照：一是未接種的相同的培養(yǎng)基，其作用是：________________________________________；二是接種相同菌液的含完全營養(yǎng)的培養(yǎng)基（如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基），其作用是：__________________Ⅱ________培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入特殊化學(xué)物質(zhì)或指示劑，使目的菌的菌落呈現(xiàn)特定顏色或菌落周圍出現(xiàn)圈（透明圈、有顏色圈），從而在多種雜菌中鑒別出目的菌的培養(yǎng)基。加入的物質(zhì)不會影響微生物的生長。如，在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中同時(shí)加入__________指示劑，培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果尿素被分解，PH將________，指示劑將變_________。在鑒定纖維素分解菌的培養(yǎng)基中加入_________染料，當(dāng)培養(yǎng)基中的纖維素被分解后，會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的________，其越大，說明___________________________；（4）雖然各種培養(yǎng)基的配方不同，但一般都含有_______、_______、_______和_______等營養(yǎng)物質(zhì)。在提供上述幾種主要營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長對_____、_____________以及______的需求。例如，在培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)，需要在培養(yǎng)基中添加_______；在培養(yǎng)霉菌時(shí)，一般需要將培養(yǎng)基調(diào)至_______；在培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，一般需要將培養(yǎng)基調(diào)至__________；在培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)，需要提供_____的條件。（5）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成培養(yǎng)基組分提供的主要營養(yǎng)牛肉膏蛋白胨NaCl無機(jī)鹽H2O水3.無菌技術(shù)（1）獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵____________________________。（2）無菌技術(shù)應(yīng)圍繞著如何避免雜菌的污染展開，主要包括________和________。消毒滅菌概念使用____________的物理、化學(xué)或生物等方法殺死物體表面或內(nèi)部__________微生物，不包括_______和________使用____________的理化方法殺死物體內(nèi)外__________微生物，包括_______和________常用方法________消毒法、________消毒法、________消毒法（如酒精、氯氣）、紫外線消毒法等_________滅菌法、_________滅菌法、_________滅菌法（高壓蒸汽滅菌）適用對象操作空間、液體、雙手等接種環(huán)、接種針一般用________滅菌、玻璃器皿一般用________滅菌、培養(yǎng)基只能用__________滅菌（3）巴氏消毒法的優(yōu)點(diǎn)是：_______________________________________________________________。（4）做好消毒和滅菌工作后，要注意避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸。為了避免周圍環(huán)境中微生物的污染，接下來的許多操作都應(yīng)在_____________上并在___________________進(jìn)行。4.微生物的純培養(yǎng)（1）培養(yǎng)物：_______________________________________________________________________________。（2）純培養(yǎng)物：_______________________________________________________________________________。（3）純培養(yǎng)：_______________________________________________________________________________。（4）菌落：_______________________________________________________________________________。（5）微生物的純培養(yǎng)包括____________、_________、_________、_________和_________等步驟。5.酵母菌的純培養(yǎng)（1）制備培養(yǎng)基第一步：配制培養(yǎng)基第二步：滅菌（培養(yǎng)基只能用_________滅菌；培養(yǎng)基必須先調(diào)PH再滅菌）第三步：倒平板（待培養(yǎng)基冷卻至______℃左右時(shí)，在____________________倒平板；等待培養(yǎng)基冷卻凝固后，將培養(yǎng)皿倒過來放置，目的是_____________________________________________________________）（2）接種和分離酵母菌接種方法一：平板劃線法①平板劃線法的原理：通過_________在固體培養(yǎng)基表面___________的操作，將聚集的菌種逐步_________到培養(yǎng)基的表面。經(jīng)數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離得到________。②用途：用于對微生物的純化、鑒定和分離，但是不能用于微生物的________。③操作步驟Ⅰ.在操作的第一步灼燒接種環(huán)（是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)基。）Ⅱ.每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)（是為了殺死上次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。）Ⅲ.劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)（能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。）Ⅳ.在灼燒接種環(huán)之后，要等其冷卻后再進(jìn)行劃線（以避免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種）Ⅴ.在做第二次以及其后的劃線操作時(shí)，要從上一次劃線的末端開始劃線（劃線后，線條末端的細(xì)菌數(shù)目比起始處要少，每次從上一次的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨劃線次數(shù)的增加而逐漸減少，最終得到單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。）接種方法二：稀釋涂布平板法①稀釋涂布平板法的原理：當(dāng)______________________時(shí)，培養(yǎng)基表面生長的一個(gè)________，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)___________。通過統(tǒng)計(jì)平板上的_________，就能推測出樣品中大約含有多少__________。②用途：用于對微生物的純化、鑒定和分離，也常用來統(tǒng)計(jì)樣品中_______的數(shù)目。③計(jì)數(shù)原則：為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)為_____________的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，應(yīng)至少對3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值。④誤差分析：統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目________，這是因?yàn)開___________________________________________________________________________________________________________________。因此，統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用________數(shù)而不是用_________數(shù)來表示。⑤操作步驟Ⅰ.系列稀釋操作：該操作常用在將細(xì)胞接種到培養(yǎng)基之前，通過液體稀釋的方法分散細(xì)胞，隨著稀釋程度的增大，單位體積中的微生物細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞得以分散。Ⅱ.涂布平板操作步驟：（3）培養(yǎng)酵母菌完成平板劃線后，待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板和一個(gè)__________的平板_________，放入28℃左右（培養(yǎng)溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h。6.微生物的數(shù)量測定方法（1）稀釋涂布平板法——統(tǒng)計(jì)出的是樣品中_____菌的數(shù)目。（2）顯微鏡直接計(jì)數(shù)法——統(tǒng)計(jì)的結(jié)果一般是____________________________。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法本身不能區(qū)分細(xì)菌的死活，但是通過一定的輔助處理，可以實(shí)現(xiàn)活菌計(jì)數(shù)，如在計(jì)數(shù)前用臺盼藍(lán)染液進(jìn)行染色，可以通過統(tǒng)計(jì)無色細(xì)胞的個(gè)數(shù)來對活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。7.土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)（1）實(shí)驗(yàn)原理：①絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成__________的微生物才能分解尿素。②利用__________________________的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌。（2）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Ⅰ.土壤取樣細(xì)菌適宜在酸堿度接近______性的潮濕土壤中生長，絕大多數(shù)分布在距地表3-8cm的土壤層。因此，取樣時(shí)一般要____________。取土樣時(shí)用的鐵鏟和取樣紙袋在使用前都需要_________。Ⅱ.樣品的稀釋Ⅲ.微生物的培養(yǎng)與觀察a.不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌一般在30-37℃的溫度下培養(yǎng)1-2d。b.每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，選取____________________的記錄作為結(jié)果。c.一般來說，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。菌落特征包括菌落的_________