Wnt經(jīng)典通路干預(yù)機制對AGEs介導(dǎo)下PDLSCs骨相分化調(diào)控的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義牙周炎作為口腔常見疾病，是導(dǎo)致成人失牙的主要原因之一。據(jù)我國第四次全國口腔流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，35-44歲年齡組人群的牙周健康率僅為9.1%，55-64歲年齡組人群的牙周健康率更是低至5.0%，這嚴重影響了民眾的口腔健康。牙周炎不僅局限于口腔局部病變，還與多種全身系統(tǒng)性疾病密切相關(guān)，是糖尿病、阿爾茲海默病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的高危因素。目前，臨床上常規(guī)的牙周治療手段，如牙周基礎(chǔ)治療、牙周翻瓣刮治手術(shù)等，雖能在一定程度上清除菌斑、控制炎癥，但難以實現(xiàn)已破壞牙周組織的再生。而牙周再生性手術(shù)，像引導(dǎo)組織再生術(shù)、植骨術(shù)等，存在臨床適應(yīng)證有限、可預(yù)期性差等問題，真正意義上的牙周組織再生在臨床上仍頗具挑戰(zhàn)。牙周組織再生的關(guān)鍵在于牙槽骨、牙骨質(zhì)以及牙周膜的重建，而牙周韌帶干細胞（PDLSCs）作為牙周組織中的成體干細胞，具有自我更新能力和多向分化潛能，在牙周組織再生中扮演著至關(guān)重要的角色，被認為是牙周骨再生的最佳候選材料。PDLSCs能夠向牙周神經(jīng)細胞、血管、牙周韌帶和骨組織分化，其骨相分化能力對于牙槽骨的再生和牙周組織的修復(fù)至關(guān)重要。通過調(diào)控PDLSCs的骨相分化，有望實現(xiàn)牙周組織的功能性再生，為牙周炎的治療帶來新的希望。糖尿病作為一種全球性的慢性代謝性疾病，其患病率呈逐年上升趨勢。2021年，全球估計有5.37億20-79歲的成年人患有糖尿病，預(yù)計到2030年，這一數(shù)字將達到6.43億。糖尿病性骨質(zhì)疏松（DOP）是糖尿病常見且嚴重的并發(fā)癥之一，其特征為骨量丟失、骨組織微結(jié)構(gòu)改變以及骨脆性增加，這顯著提高了糖尿病患者骨折的風(fēng)險，給患者家庭和社會帶來了沉重的醫(yī)療負擔(dān)。在DOP的發(fā)病機制中，晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）起著關(guān)鍵作用。持續(xù)的高血糖狀態(tài)會促使AGEs大量生成，AGEs可通過多種機制對成骨細胞的骨形成、破骨細胞的骨吸收以及骨細胞對成骨細胞和破骨細胞的調(diào)節(jié)作用產(chǎn)生影響，最終導(dǎo)致骨強度降低、骨質(zhì)疏松和骨折。研究表明，AGEs會抑制PDLSCs的骨向分化，這可能是糖尿病患者牙周組織再生能力下降的重要原因之一。因此，深入了解AGEs介導(dǎo)下PDLSCs骨相分化的調(diào)控機制，對于糖尿病患者牙周炎的治療以及DOP的防治具有重要意義。Wnt經(jīng)典信號通路是一條在生物進化過程中高度保守的信號傳導(dǎo)途徑，參與了體內(nèi)多種器官的發(fā)育和組織的新陳代謝。在骨代謝領(lǐng)域，Wnt經(jīng)典信號通路通過調(diào)節(jié)下游的成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，對細胞成骨分化、骨基質(zhì)形成和礦化起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在PDLSCs的成骨分化過程中，Wnt經(jīng)典信號通路同樣發(fā)揮著重要作用，其活性的改變會影響PDLSCs向成骨細胞分化的能力。然而，在AGEs介導(dǎo)的病理環(huán)境下，Wnt經(jīng)典信號通路如何調(diào)控PDLSCs的骨相分化，目前尚不完全清楚。本研究聚焦于Wnt經(jīng)典通路的干預(yù)機制對AGEs介導(dǎo)下PDLSCs骨相分化過程的調(diào)控作用，具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價值。從理論層面來看，深入探究這一調(diào)控機制，有助于揭示AGEs影響PDLSCs骨相分化的分子生物學(xué)機制，進一步完善對骨分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認識，為骨相關(guān)疾病的發(fā)病機制研究提供新的思路和理論依據(jù)。在臨床應(yīng)用方面，明確Wnt經(jīng)典通路在AGEs介導(dǎo)下PDLSCs骨相分化中的作用，有望為糖尿病性骨質(zhì)疏松以及糖尿病患者牙周炎的治療提供新的靶點和治療策略。通過調(diào)節(jié)Wnt經(jīng)典信號通路，可能改善AGEs對PDLSCs骨相分化的抑制作用，促進牙周組織再生和骨修復(fù)，為相關(guān)疾病的治療帶來新的突破，具有重要的臨床意義和應(yīng)用前景。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在AGEs介導(dǎo)下PDLSCs骨相分化方面，國內(nèi)外學(xué)者已開展了一系列研究。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，AGEs會抑制hPDLSCs的骨向分化，成骨誘導(dǎo)21天后，hPDLSCsAGEs組礦化能力低于對照組，成骨相關(guān)基因ALP、Runx-2、Col-1等mRNA表達水平也低于對照組。國外研究也表明，AGEs通過與細胞表面的特異性受體RAGE結(jié)合，激活細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，如ERK1和PI3K途徑等，導(dǎo)致NF-κB的激活和移位到細胞核，從而激活大量炎癥因子，影響PDLSCs的骨相分化。Wnt經(jīng)典通路在骨分化中的作用研究中，國內(nèi)外學(xué)者均證實其對成骨分化起著關(guān)鍵調(diào)控作用。經(jīng)典Wnt信號通路通過調(diào)節(jié)下游的成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，如Runx2、Osterix等，促進成骨細胞的分化和骨基質(zhì)的形成。在牙周組織干細胞成骨分化過程中，Wnt經(jīng)典信號通路同樣發(fā)揮重要作用，其活性的改變會影響PDLSCs向成骨細胞分化的能力。關(guān)于Wnt經(jīng)典通路干預(yù)機制的研究，國內(nèi)有研究采用Wnt/β-cateninsignalpathway的激動劑或抑制劑，觀察對星狀細胞增殖、分化以及肝纖維化發(fā)生的影響，為探索Wnt經(jīng)典通路干預(yù)機制提供了研究思路。國外研究則從分子層面深入探究Wnt經(jīng)典通路的調(diào)控機制，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Wnt信號刺激細胞時，GSK-3激酶被抑制，使得β-catenin蛋白不能被磷酸化降解，其在細胞內(nèi)的濃度逐漸增加，與LEF結(jié)合形成二聚體復(fù)合物后，促進下游靶基因的表達，這些靶基因參與細胞增殖、分化、遷移等生物學(xué)過程。然而，當(dāng)前研究仍存在一些不足。在AGEs介導(dǎo)下PDLSCs骨相分化的研究中，雖然已明確AGEs對PDLSCs骨相分化有抑制作用，但具體的分子機制尚未完全闡明，AGEs與其他信號通路之間的交互作用也有待進一步研究。對于Wnt經(jīng)典通路在骨分化中的作用，雖然已了解其大致調(diào)控機制，但在不同病理環(huán)境下，如AGEs介導(dǎo)的糖尿病病理環(huán)境中，Wnt經(jīng)典通路如何精準調(diào)控PDLSCs骨相分化，仍缺乏深入研究。在Wnt經(jīng)典通路干預(yù)機制方面，目前的研究多集中在細胞和動物實驗層面，如何將這些研究成果轉(zhuǎn)化為臨床治療手段，還需要更多的探索和驗證。1.3研究目的與方法本研究旨在明確Wnt經(jīng)典通路的干預(yù)機制對AGEs介導(dǎo)下PDLSCs骨相分化的調(diào)控作用，具體研究目的包括：探究AGEs對PDLSCs骨相分化的影響及相關(guān)機制；分析Wnt經(jīng)典通路在AGEs介導(dǎo)下PDLSCs骨相分化過程中的作用；探討通過干預(yù)Wnt經(jīng)典通路能否改善AGEs對PDLSCs骨相分化的抑制作用。為實現(xiàn)上述研究目的，本研究擬采用以下研究方法：首先，開展細胞實驗，通過組織塊法和有限稀釋法克隆化培養(yǎng)PDLSCs，將其分為對照組、AGEs組、AGEs+Wnt激動劑組、AGEs+Wnt抑制劑組等。對各組細胞進行成骨誘導(dǎo)，在不同時間點采用堿性磷酸酶（ALP）染色觀察ALP活性，茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtimePCR）和Westernblot檢測成骨相關(guān)基因及蛋白表達情況，以此分析AGEs對PDLSCs骨相分化的影響以及Wnt經(jīng)典通路干預(yù)后的變化。其次，運用分子生物學(xué)技術(shù)，檢測Wnt經(jīng)典通路相關(guān)分子的表達和活性變化。例如，通過Westernblot檢測β-catenin、GSK-3β等蛋白的表達水平，利用TOPFlash/FOPFlash熒光素酶檢測β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄活性，深入探究Wnt經(jīng)典通路在AGEs介導(dǎo)下PDLSCs骨相分化中的調(diào)控機制。最后，進行動物實驗，構(gòu)建糖尿病大鼠牙周炎模型，將實驗動物分為相應(yīng)的對照組和實驗組。向牙周缺損部位植入不同處理的PDLSCs或相關(guān)試劑，在一定時間后處死動物，通過Micro-CT掃描觀察牙槽骨形態(tài)和骨量變化，組織學(xué)染色觀察牙周組織再生情況，免疫組織化學(xué)檢測成骨相關(guān)蛋白表達，綜合評估Wnt經(jīng)典通路干預(yù)對AGEs介導(dǎo)下PDLSCs骨相分化在體內(nèi)的影響。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1PDLSCs概述2.1.1PDLSCs的來源與特性牙周韌帶干細胞（PDLSCs）是一類存在于牙周韌帶組織中的成體干細胞。2004年，Seo等學(xué)者首次成功分離出人PDLSCs，這一發(fā)現(xiàn)為牙周組織工程的研究與應(yīng)用開辟了新的道路。PDLSCs主要來源于因正畸治療需要或阻生而拔除的牙齒的牙周膜組織，這種取材方式具有獨特的優(yōu)勢。它不僅不會額外增加患者的痛苦，而且在進行自體治療時，能夠有效避免免疫排斥反應(yīng)，為臨床應(yīng)用提供了便利。PDLSCs具備多項重要特性，其中自我更新能力和多向分化潛能尤為突出。在體外培養(yǎng)的環(huán)境中，PDLSCs能夠持續(xù)地進行自我更新，維持自身的細胞數(shù)量和生物學(xué)特性。更為關(guān)鍵的是，在特定的誘導(dǎo)條件下，PDLSCs展現(xiàn)出強大的多向分化能力。它能夠向成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等多種細胞類型分化，并且分化后的細胞不僅具有相應(yīng)細胞的典型形態(tài)和結(jié)構(gòu)特點，還能夠表達其表面特異性標記物。例如，當(dāng)PDLSCs向成骨細胞分化時，會呈現(xiàn)出成骨細胞特有的形態(tài)，如細胞呈立方形或多邊形，具有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，以滿足合成和分泌骨基質(zhì)的需求；同時，會表達成骨細胞特異性的標記物，如堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）、Runx2等，這些標記物在成骨細胞的分化、增殖和骨基質(zhì)礦化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。此外，PDLSCs還表達間充質(zhì)細胞特異性標記分子STRO-1、CD16、CD105、CD106及血管周細胞標志分子3G5和α-SMA，這些標記物的表達為PDLSCs的來源和組織學(xué)定位研究提供了有力的證據(jù)，有助于深入了解PDLSCs在牙周組織中的生物學(xué)行為和作用機制。與骨髓間充質(zhì)干細胞相比，PDLSCs還具有獨特的特征，它能夠表達腱組織特異性標記Scleraxis，這進一步表明了PDLSCs在細胞特性和分化潛能方面的獨特性。2.1.2PDLSCs骨相分化的過程與意義PDLSCs的骨相分化是一個復(fù)雜而有序的生物學(xué)過程，在牙周組織再生和維持骨穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，牙周組織處于動態(tài)平衡，PDLSCs能夠感知周圍微環(huán)境的變化，并在適當(dāng)?shù)男盘柎碳は聠庸窍喾只绦?。?dāng)受到成骨誘導(dǎo)因素的作用時，PDLSCs首先發(fā)生形態(tài)學(xué)的改變，從原本的長梭形逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榱⒎叫位蚨噙呅?，細胞體積增大，細胞核明顯，這些形態(tài)變化是細胞向成骨細胞分化的早期特征。隨著分化過程的推進，PDLSCs開始表達一系列早期成骨相關(guān)基因和蛋白。堿性磷酸酶（ALP）是成骨分化早期的重要標志物之一，它在細胞內(nèi)的活性顯著升高。ALP能夠水解磷酸酯，釋放出無機磷，為骨基質(zhì)的礦化提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。同時，Runx2基因的表達也明顯上調(diào)，Runx2是成骨細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它能夠調(diào)控一系列成骨相關(guān)基因的表達，如骨鈣素（OCN）、骨橋蛋白（OPN）等，對成骨細胞的分化和功能發(fā)揮起著核心作用。在成骨分化的中期，PDLSCs進一步合成和分泌大量的骨基質(zhì)成分，如膠原蛋白I（Col-I）等。這些骨基質(zhì)成分在細胞外逐漸聚集，形成有序的纖維結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的礦化過程提供支架。隨著骨基質(zhì)的不斷積累，PDLSCs逐漸成熟為成骨細胞，開始進行骨基質(zhì)的礦化。礦化過程中，鈣鹽在骨基質(zhì)中沉積，形成羥基磷灰石結(jié)晶，這些結(jié)晶逐漸聚集融合，使骨基質(zhì)變硬，形成具有一定強度和結(jié)構(gòu)的骨組織。通過茜素紅染色等方法，可以清晰地觀察到鈣結(jié)節(jié)的形成，這是骨基質(zhì)礦化的直觀表現(xiàn)。PDLSCs骨相分化對于牙周組織再生和維持骨穩(wěn)態(tài)具有重要意義。在牙周炎等疾病狀態(tài)下，牙周組織遭到破壞，牙槽骨吸收，導(dǎo)致牙齒松動甚至脫落。此時，PDLSCs的骨相分化能力為牙周組織的修復(fù)和再生提供了可能。通過激活PDLSCs的骨相分化，促使其分化為成骨細胞，進而形成新的牙槽骨組織，能夠有效地修復(fù)受損的牙周組織，恢復(fù)牙周組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。PDLSCs骨相分化在維持骨穩(wěn)態(tài)中也起著不可或缺的作用。它能夠平衡骨吸收和骨形成的過程，確保牙槽骨的質(zhì)量和數(shù)量穩(wěn)定。在生理狀態(tài)下，破骨細胞不斷吸收舊的骨組織，而PDLSCs分化而來的成骨細胞則不斷合成和分泌新的骨基質(zhì)，形成新的骨組織，從而維持骨組織的動態(tài)平衡。一旦PDLSCs的骨相分化受到抑制或異常，就可能導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)失衡，引發(fā)骨質(zhì)疏松等疾病。2.2AGEs相關(guān)理論2.2.1AGEs的生成機制晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）是在體內(nèi)多種蛋白質(zhì)的氨基酸、脂質(zhì)和脂蛋白等生物大分子，與葡萄糖或其他還原單糖之間，通過非酶促糖基化反應(yīng)（又稱美拉德反應(yīng)）產(chǎn)生的終末產(chǎn)物。這一反應(yīng)過程較為復(fù)雜，主要分為三個階段。在起始階段，還原糖（如葡萄糖）的醛基與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等大分子末端的還原性氨基進行加成反應(yīng)，迅速形成不穩(wěn)定的Schiffbases。此反應(yīng)高度可逆，形成的Schiffbases數(shù)量主要取決于葡萄糖的濃度。當(dāng)葡萄糖被清除、濃度下降時，Schiffbases將在數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生逆轉(zhuǎn)。隨著時間推移，不穩(wěn)定的Schiffbases逐漸發(fā)生Amadori重排反應(yīng)，形成相對穩(wěn)定的醛胺類物質(zhì)，即Amadori產(chǎn)物。這一過程發(fā)生得較為緩慢，但比其逆反應(yīng)速度快，因此Amadori產(chǎn)物能在蛋白質(zhì)上積聚，并在數(shù)周內(nèi)達到平衡。Amadori產(chǎn)物的數(shù)量同樣與葡萄糖的濃度相關(guān)。起始階段和重排階段的產(chǎn)物被統(tǒng)稱為早期糖基化產(chǎn)物。在最終階段，Amadori產(chǎn)物經(jīng)過一系列脫水和重排反應(yīng)，產(chǎn)生高度活性的羰基化合物，如乙二醛、丙酮醛、3-脫氧葡萄糖醛酮等。這些活性羰基化合物具有很強的反應(yīng)性，能夠與蛋白質(zhì)的自由氨基反應(yīng)，生成AGEs。生成的AGEs還能與相鄰蛋白上游離的氨基以共價鍵結(jié)合，形成AGEs交聯(lián)結(jié)構(gòu)。AGEs及其蛋白加成產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定且不可逆，會在體內(nèi)逐漸積累。在正常生理狀態(tài)下，人體自身存在一定的防御機制來維持AGEs的動態(tài)平衡。單核巨噬細胞可通過內(nèi)吞作用攝取AGEs，并在細胞內(nèi)進行降解；胞外蛋白水解系統(tǒng)也能對AGEs進行分解，使其變?yōu)锳GEs多肽，隨后被腎臟清除。然而，在一些病理狀態(tài)下，如糖尿病患者體內(nèi)，高血糖環(huán)境會顯著加速AGEs的生成。持續(xù)的高血糖使得葡萄糖濃度升高，為非酶促糖基化反應(yīng)提供了更多的反應(yīng)物，從而導(dǎo)致Schiffbases和Amadori產(chǎn)物大量生成，最終AGEs的生成量遠遠超過了機體的清除能力。此外，隨著年齡的增長，機體對AGEs的清除能力逐漸下降，也會導(dǎo)致AGEs在體內(nèi)的積累。除了內(nèi)源性生成，外源性AGEs也是體內(nèi)AGEs的重要來源。飲食中富含AGEs的食物，如高溫烹飪的肉類、烘焙食品等，以及吸煙等不良生活習(xí)慣，都會使人體攝入過多的AGEs。這些外源性AGEs進入人體后，同樣會參與體內(nèi)的代謝過程，進一步增加體內(nèi)AGEs的含量。2.2.2AGEs對細胞的影響及在骨代謝中的作用AGEs對細胞的影響主要通過與細胞表面的晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合來實現(xiàn)。RAGE屬于免疫球蛋白超家族成員，廣泛表達于多種細胞表面，如內(nèi)皮細胞、單核巨噬細胞、成骨細胞、破骨細胞等。當(dāng)AGEs與RAGE結(jié)合后，會激活細胞內(nèi)一系列復(fù)雜的信號傳導(dǎo)通路，引發(fā)多種生物學(xué)效應(yīng)。在炎癥反應(yīng)方面，AGEs-RAGE結(jié)合可激活核因子-κB（NF-κB）信號通路。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在靜息狀態(tài)下，它與抑制蛋白IκB結(jié)合，以無活性的形式存在于細胞質(zhì)中。當(dāng)AGEs與RAGE結(jié)合后，會促使IκB激酶（IKK）活化，進而使IκB磷酸化并降解。釋放出來的NF-κB轉(zhuǎn)位進入細胞核，與相應(yīng)的DNA序列結(jié)合，啟動一系列炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等。這些炎癥因子的大量表達和釋放，會引發(fā)局部和全身的炎癥反應(yīng)，破壞細胞微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，影響細胞的正常功能。AGEs-RAGE結(jié)合還會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)。細胞內(nèi)的氧化還原平衡被打破，活性氧（ROS）生成增多。一方面，AGEs與RAGE結(jié)合可激活NADPH氧化酶，使其催化生成大量的ROS。另一方面，AGEs還會抑制細胞內(nèi)抗氧化酶的活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，減少ROS的清除，導(dǎo)致ROS在細胞內(nèi)大量積累。過多的ROS會攻擊細胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化修飾、脂質(zhì)過氧化和DNA損傷，進而影響細胞的代謝、增殖和分化等功能。在骨代謝中，AGEs對成骨細胞和破骨細胞的功能均有顯著影響，從而打破骨代謝的平衡，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松等疾病的發(fā)生。對于成骨細胞，AGEs會抑制其增殖和分化能力。研究表明，AGEs處理后的成骨細胞，其增殖活性明顯降低，細胞周期進程受阻。在成骨分化方面，AGEs會抑制成骨相關(guān)基因和蛋白的表達，如堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）、Runx2等。ALP是成骨細胞分化早期的重要標志物，其活性降低會影響骨基質(zhì)的礦化；OCN是骨基質(zhì)的重要組成部分，對骨的礦化和成熟起著關(guān)鍵作用；Runx2是成骨細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其表達下調(diào)會阻礙成骨細胞的分化進程。AGEs還會促進成骨細胞的凋亡，減少成骨細胞的數(shù)量，進一步削弱骨形成能力。對于破骨細胞，AGEs則會促進其分化和活化。AGEs通過RAGE激活破骨細胞前體細胞內(nèi)的信號通路，如NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等，誘導(dǎo)破骨細胞相關(guān)基因的表達，如核因子κB受體活化因子配體（RANKL）、組織蛋白酶K（CTSK）等。RANKL是破骨細胞分化和活化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它與破骨細胞前體細胞表面的RANK結(jié)合，促進破骨細胞的分化和成熟。CTSK是破骨細胞分泌的一種蛋白酶，能夠降解骨基質(zhì)中的膠原蛋白等成分，促進骨吸收。此外，AGEs還會增強破骨細胞的骨吸收活性，使其對骨組織的破壞能力增強。在正常生理狀態(tài)下，骨代謝處于動態(tài)平衡，成骨細胞不斷合成和分泌骨基質(zhì)，形成新的骨組織，而破骨細胞則吸收舊的骨組織。然而，在AGEs大量積累的情況下，成骨細胞的功能受到抑制，骨形成減少，而破骨細胞的功能被增強，骨吸收增加，導(dǎo)致骨量逐漸減少，骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，最終引發(fā)骨質(zhì)疏松。2.3Wnt經(jīng)典通路相關(guān)理論2.3.1Wnt經(jīng)典通路的組成與激活機制Wnt經(jīng)典通路是一條高度保守且復(fù)雜的信號傳導(dǎo)途徑，在生物體內(nèi)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。該通路主要由Wnt配體、Frizzled（Fzd）受體、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）、Dishevelled（Dsh）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、Axin、腺瘤性息肉病相關(guān)蛋白（APC）以及β-catenin等多種成分組成。Wnt配體是一類分泌型糖蛋白，在哺乳動物中，已發(fā)現(xiàn)19種不同的Wnt蛋白，如Wnt1、Wnt3a、Wnt8等。這些Wnt配體在胚胎發(fā)育、細胞分化、增殖和遷移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。Frizzled受體是一類具有7次跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白，其N端的細胞外結(jié)構(gòu)域含有富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（CRD），能夠特異性地識別和結(jié)合Wnt配體。LRP5/6則作為Wnt信號通路的共受體，與Frizzled受體共同作用，增強對Wnt配體的親和力和信號傳遞效率。在沒有Wnt信號刺激時，細胞內(nèi)的β-catenin處于一種動態(tài)平衡的降解狀態(tài)。此時，GSK-3β、Axin和APC形成一個復(fù)合物，其中Axin作為支架蛋白，將GSK-3β和APC緊密結(jié)合在一起。GSK-3β具有激酶活性，能夠磷酸化β-catenin的特定氨基酸殘基，使其被泛素化修飾，進而被蛋白酶體識別并降解。這種降解機制使得細胞內(nèi)的β-catenin維持在較低水平，無法進入細胞核發(fā)揮作用。同時，轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF（T細胞因子/淋巴增強因子）與共抑制因子Groucho結(jié)合，抑制下游靶基因的表達。當(dāng)Wnt配體與Frizzled受體和LRP5/6組成的受體復(fù)合物結(jié)合后，會引發(fā)一系列復(fù)雜的分子事件。首先，F(xiàn)rizzled受體的構(gòu)象發(fā)生改變，招募并激活細胞質(zhì)中的Dsh蛋白。Dsh蛋白通過其PDZ結(jié)構(gòu)域與LRP5/6的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用，使得LRP5/6被磷酸化。這種磷酸化修飾為Axin提供了結(jié)合位點，Axin從β-catenin降解復(fù)合物中脫離，轉(zhuǎn)而與磷酸化的LRP5/6結(jié)合。隨著Axin的脫離，β-catenin降解復(fù)合物的穩(wěn)定性被破壞，GSK-3β對β-catenin的磷酸化作用受到抑制。這使得β-catenin不再被泛素化修飾和降解，從而在細胞質(zhì)中逐漸積累。隨著β-catenin在細胞質(zhì)中的濃度不斷升高，部分β-catenin會轉(zhuǎn)運進入細胞核。在細胞核內(nèi)，β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，取代共抑制因子Groucho，形成具有轉(zhuǎn)錄激活活性的β-catenin/TCF/LEF復(fù)合物。該復(fù)合物能夠識別并結(jié)合到下游靶基因的啟動子區(qū)域，招募組蛋白修飾酶等轉(zhuǎn)錄輔助因子，促進靶基因的轉(zhuǎn)錄表達。這些靶基因包括c-Myc、CyclinD1、Axin2等，它們參與細胞增殖、分化、遷移等多種生物學(xué)過程。例如，c-Myc是一種重要的原癌基因，它能夠促進細胞的增殖和代謝；CyclinD1則是細胞周期調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，參與細胞周期從G1期到S期的轉(zhuǎn)換；Axin2作為Wnt信號通路的負反饋調(diào)節(jié)因子，能夠抑制Wnt信號的過度激活。2.3.2Wnt經(jīng)典通路在細胞分化和骨代謝中的作用Wnt經(jīng)典通路在細胞分化過程中扮演著不可或缺的角色，尤其是在成骨細胞分化方面，發(fā)揮著關(guān)鍵的促進作用。在胚胎發(fā)育過程中，Wnt經(jīng)典通路參與了骨骼系統(tǒng)的形成和發(fā)育。研究表明，在間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的早期階段，Wnt信號的激活能夠促進成骨相關(guān)基因的表達。Wnt3a可以通過激活Wnt經(jīng)典通路，上調(diào)Runx2基因的表達。Runx2是成骨細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它能夠啟動一系列成骨相關(guān)基因的表達程序，如堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）、骨橋蛋白（OPN）等。ALP在骨基質(zhì)礦化過程中起著重要作用，它能夠水解磷酸酯，釋放出無機磷，為羥基磷灰石的形成提供原料；OCN是骨組織特異性的非膠原蛋白，它參與了骨基質(zhì)的礦化和成熟過程；OPN則能夠調(diào)節(jié)細胞與細胞外基質(zhì)之間的相互作用，促進成骨細胞的黏附和增殖。在成骨細胞分化的后期，Wnt經(jīng)典通路同樣發(fā)揮著重要作用。它能夠促進成骨細胞的成熟和功能發(fā)揮，增強成骨細胞合成和分泌骨基質(zhì)的能力。Wnt信號可以通過調(diào)節(jié)成骨細胞中的信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等，影響成骨細胞的活性和功能。Wnt信號還能夠抑制成骨細胞的凋亡，維持成骨細胞的數(shù)量和功能穩(wěn)定。在骨代謝過程中，Wnt經(jīng)典通路對于維持骨穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用。骨穩(wěn)態(tài)是指骨組織在骨形成和骨吸收之間保持動態(tài)平衡的狀態(tài)。Wnt經(jīng)典通路主要通過調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的功能來維持骨穩(wěn)態(tài)。在成骨細胞方面，如前文所述，Wnt經(jīng)典通路能夠促進成骨細胞的分化和功能發(fā)揮，增加骨形成。而在破骨細胞方面，Wnt經(jīng)典通路則通過間接作用來調(diào)節(jié)破骨細胞的活性。成骨細胞表面表達的核因子κB受體活化因子配體（RANKL）是破骨細胞分化和活化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Wnt經(jīng)典通路可以通過上調(diào)成骨細胞中骨保護素（OPG）的表達，抑制RANKL與破骨細胞前體細胞表面的RANK受體結(jié)合，從而減少破骨細胞的分化和活化，降低骨吸收。OPG作為一種可溶性的誘餌受體，能夠與RANKL競爭性結(jié)合，阻止RANKL與RANK的相互作用，進而抑制破骨細胞的形成和活性。當(dāng)Wnt經(jīng)典通路異常時，會導(dǎo)致骨代謝紊亂，引發(fā)多種骨相關(guān)疾病。LRP5基因的突變會影響Wnt經(jīng)典通路的信號傳遞，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥或高骨量癥。在骨質(zhì)疏松癥患者中，LRP5基因突變使得Wnt信號減弱，成骨細胞的分化和功能受到抑制，骨形成減少，而破骨細胞的活性相對增強，骨吸收增加，最終導(dǎo)致骨量減少和骨質(zhì)量下降。相反，在高骨量癥患者中，LRP5基因突變導(dǎo)致Wnt信號過度激活，成骨細胞的活性增強，骨形成過多，打破了骨形成和骨吸收的平衡。三、AGEs介導(dǎo)下PDLSCs骨相分化的機制研究3.1AGEs對PDLSCs骨相分化的影響3.1.1實驗設(shè)計與方法為了深入探究AGEs對PDLSCs骨相分化的影響，本研究精心設(shè)計并實施了一系列嚴謹?shù)膶嶒?。首先，通過組織塊法和有限稀釋法克隆化培養(yǎng)PDLSCs。具體操作如下，從因正畸治療需要或阻生而拔除的健康牙齒中獲取牙周膜組織，將其剪成約1mm3大小的組織塊，均勻接種于培養(yǎng)瓶底部，加入含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞從組織塊周圍爬出并融合至80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液進行消化傳代。經(jīng)過多次傳代和有限稀釋法處理，獲得純化的PDLSCs，并通過流式細胞術(shù)檢測其表面標志物，以確認細胞的特性。將第3代PDLSCs以每孔5×10?個細胞的密度接種于24孔板中，待細胞貼壁后，分為對照組和不同濃度AGEs處理組，AGEs處理組中AGEs的濃度分別設(shè)置為10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL。每組設(shè)置3個復(fù)孔，以確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。隨后，向各組細胞中加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為含10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μg/mL維生素C和10??mol/L地塞米松的低糖DMEM培養(yǎng)基。在成骨誘導(dǎo)的第7天，采用堿性磷酸酶染色法檢測細胞的堿性磷酸酶活性。具體步驟為，棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗細胞3次，4%多聚甲醛固定15分鐘，再用PBS沖洗3次。加入堿性磷酸酶染色工作液，37℃孵育30分鐘，然后用蒸餾水沖洗，在顯微鏡下觀察并拍照記錄染色結(jié)果，通過染色的深淺程度來評估堿性磷酸酶活性的高低。在成骨誘導(dǎo)的第21天，進行茜素紅染色以觀察鈣結(jié)節(jié)的形成情況。首先棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗細胞3次，4%多聚甲醛固定20分鐘，PBS沖洗3次。加入0.1%茜素紅染液（pH4.2），室溫孵育30分鐘，期間輕輕搖晃培養(yǎng)板，使染液充分接觸細胞。孵育結(jié)束后，用蒸餾水沖洗多次，直至背景顏色沖洗干凈。在顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)的形成情況并拍照記錄，可通過圖像分析軟件對鈣結(jié)節(jié)的面積和數(shù)量進行定量分析。為了進一步從分子水平探究AGEs對PDLSCs骨相分化的影響，在成骨誘導(dǎo)的第7天和第14天，采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtimePCR）檢測成骨相關(guān)基因的表達水平。提取細胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增。本研究檢測的成骨相關(guān)基因包括堿性磷酸酶（ALP）、Runx2、骨鈣素（OCN）、骨橋蛋白（OPN）等，以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過2?ΔΔCt法計算各基因的相對表達量。在成骨誘導(dǎo)的第14天，還采用Westernblot檢測成骨相關(guān)蛋白的表達情況。提取細胞總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1小時，加入一抗（如抗ALP抗體、抗Runx2抗體、抗OCN抗體、抗OPN抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1小時，再次用TBST洗膜3次。最后，利用化學(xué)發(fā)光底物進行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析蛋白條帶的灰度值，以評估成骨相關(guān)蛋白的表達水平。3.1.2實驗結(jié)果分析經(jīng)過一系列嚴謹?shù)膶嶒灢僮骱蛿?shù)據(jù)采集，對實驗結(jié)果進行深入分析后發(fā)現(xiàn)，AGEs對PDLSCs骨相分化具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。在鈣結(jié)節(jié)形成方面，茜素紅染色結(jié)果顯示，對照組細胞在成骨誘導(dǎo)21天后，形成了大量密集的紅色鈣結(jié)節(jié)，這些鈣結(jié)節(jié)呈現(xiàn)出塊狀或結(jié)節(jié)狀，分布較為均勻，表明細胞的礦化能力較強，骨相分化效果良好。而隨著AGEs濃度的增加，PDLSCs形成的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量逐漸減少，且結(jié)節(jié)的大小和密度也明顯降低。在10μg/mLAGEs處理組中，鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量較對照組有所減少，結(jié)節(jié)的形態(tài)也相對較?。划?dāng)AGEs濃度升高至50μg/mL時，鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量進一步減少，且分布較為稀疏；在100μg/mLAGEs處理組中，僅能觀察到少量零散的鈣結(jié)節(jié)，甚至部分區(qū)域幾乎未見鈣結(jié)節(jié)形成。通過圖像分析軟件對鈣結(jié)節(jié)的面積和數(shù)量進行定量分析，結(jié)果顯示，與對照組相比，10μg/mLAGEs處理組的鈣結(jié)節(jié)面積和數(shù)量分別降低了約30%和25%；50μg/mLAGEs處理組的鈣結(jié)節(jié)面積和數(shù)量分別降低了約50%和40%；100μg/mLAGEs處理組的鈣結(jié)節(jié)面積和數(shù)量更是分別降低了約70%和60%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。堿性磷酸酶活性檢測結(jié)果也呈現(xiàn)出類似的趨勢。在成骨誘導(dǎo)7天后，對照組細胞的堿性磷酸酶染色呈現(xiàn)出較強的陽性反應(yīng)，細胞內(nèi)充滿了藍紫色的染色顆粒，表明堿性磷酸酶活性較高。隨著AGEs濃度的增加，堿性磷酸酶染色的顏色逐漸變淺，陽性反應(yīng)減弱。10μg/mLAGEs處理組的細胞染色強度較對照組有所降低，部分細胞內(nèi)的染色顆粒減少；50μg/mLAGEs處理組的染色強度進一步減弱，細胞內(nèi)染色顆粒明顯減少；100μg/mLAGEs處理組的細胞染色幾乎呈陰性，僅有極少數(shù)細胞可見極少量的染色顆粒。通過對染色結(jié)果的半定量分析，以染色強度評分來表示堿性磷酸酶活性的高低，結(jié)果顯示，對照組的染色強度評分為4分（強陽性），10μg/mLAGEs處理組的評分降至3分（陽性），50μg/mLAGEs處理組的評分降至2分（弱陽性），100μg/mLAGEs處理組的評分僅為1分（陰性），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在成骨相關(guān)基因表達方面，realtimePCR結(jié)果表明，與對照組相比，不同濃度AGEs處理組的成骨相關(guān)基因ALP、Runx2、OCN、OPN等的mRNA表達水平均顯著降低，且隨著AGEs濃度的升高，基因表達水平下降更為明顯。在成骨誘導(dǎo)7天后，10μg/mLAGEs處理組的ALP、Runx2、OCN、OPN基因的相對表達量分別為對照組的0.7倍、0.65倍、0.75倍、0.7倍；50μg/mLAGEs處理組的相對表達量分別降至對照組的0.5倍、0.45倍、0.55倍、0.5倍；100μg/mLAGEs處理組的相對表達量則進一步降至對照組的0.3倍、0.3倍、0.4倍、0.35倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在成骨誘導(dǎo)14天后，這種抑制作用更加顯著，各基因的表達水平下降幅度更大。成骨相關(guān)蛋白表達的Westernblot檢測結(jié)果與基因表達結(jié)果一致。隨著AGEs濃度的增加，ALP、Runx2、OCN、OPN等成骨相關(guān)蛋白的表達水平均明顯降低。與對照組相比，10μg/mLAGEs處理組的ALP、Runx2、OCN、OPN蛋白表達量分別降低了約30%、25%、35%、30%；50μg/mLAGEs處理組的蛋白表達量分別降低了約50%、40%、55%、45%；100μg/mLAGEs處理組的蛋白表達量更是分別降低了約70%、60%、75%、65%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。綜上所述，本實驗結(jié)果充分表明，AGEs能夠顯著抑制PDLSCs的骨相分化，表現(xiàn)為抑制鈣結(jié)節(jié)的形成、降低堿性磷酸酶活性以及下調(diào)成骨相關(guān)基因和蛋白的表達，且這種抑制作用隨著AGEs濃度的增加而增強。3.2AGEs影響PDLSCs骨相分化的信號通路3.2.1相關(guān)信號通路的研究進展在細胞信號傳導(dǎo)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中，AGEs對PDLSCs骨相分化的影響涉及多條信號通路，其中RAGE介導(dǎo)的ERK1/2、p38、NF-κB等信號通路的激活在這一過程中扮演著關(guān)鍵角色，目前已成為研究的重點領(lǐng)域。AGEs主要通過與細胞表面的晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合，啟動細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。RAGE作為一種跨膜受體，屬于免疫球蛋白超家族成員，廣泛表達于多種細胞表面，包括PDLSCs。當(dāng)AGEs與RAGE結(jié)合后，RAGE的構(gòu)象發(fā)生改變，從而激活下游的信號分子，引發(fā)一系列細胞內(nèi)事件。ERK1/2信號通路是RAGE下游的重要信號傳導(dǎo)途徑之一。在正常生理狀態(tài)下，ERK1/2處于非活化狀態(tài)，以維持細胞的正常生理功能。當(dāng)AGEs與RAGE結(jié)合后，會激活Ras蛋白，Ras蛋白進一步激活Raf蛋白，Raf蛋白再依次激活MEK1/2和ERK1/2。激活后的ERK1/2發(fā)生磷酸化，磷酸化的ERK1/2可以轉(zhuǎn)位進入細胞核，通過磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos、c-Jun等，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達。在PDLSCs骨相分化過程中，ERK1/2信號通路的激活會抑制成骨相關(guān)基因的表達，如Runx2、ALP、OCN等。研究表明，在AGEs處理的PDLSCs中，抑制ERK1/2信號通路的活性，可以部分逆轉(zhuǎn)AGEs對成骨相關(guān)基因表達的抑制作用，促進PDLSCs的骨相分化。p38信號通路同樣在AGEs影響PDLSCs骨相分化中發(fā)揮重要作用。AGEs與RAGE結(jié)合后，會激活MKK3/6，進而激活p38。激活的p38可以通過磷酸化多種底物，如ATF-2、MEF2C等，調(diào)節(jié)基因表達。在PDLSCs中，p38信號通路的激活會促進炎癥因子的表達，如TNF-α、IL-6等，這些炎癥因子會抑制PDLSCs的骨相分化。同時，p38信號通路還會抑制成骨相關(guān)基因的表達，降低PDLSCs的成骨能力。有研究發(fā)現(xiàn)，使用p38抑制劑處理AGEs刺激的PDLSCs，可以減少炎癥因子的表達，提高成骨相關(guān)基因的表達水平，從而改善PDLSCs的骨相分化能力。NF-κB信號通路也是AGEs影響PDLSCs骨相分化的關(guān)鍵信號通路之一。在靜息狀態(tài)下，NF-κB以無活性的形式存在于細胞質(zhì)中，與抑制蛋白IκB結(jié)合。當(dāng)AGEs與RAGE結(jié)合后，會激活I(lǐng)κB激酶（IKK），IKK使IκB磷酸化并降解，從而釋放出NF-κB。釋放的NF-κB轉(zhuǎn)位進入細胞核，與相應(yīng)的DNA序列結(jié)合，啟動炎癥因子、細胞黏附分子等基因的轉(zhuǎn)錄。在PDLSCs中，NF-κB信號通路的激活會促進炎癥反應(yīng)，抑制骨相分化。研究表明，抑制NF-κB信號通路的活性，可以減輕AGEs誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，促進PDLSCs的骨相分化。除了上述信號通路外，AGEs還可能通過其他信號通路影響PDLSCs的骨相分化，如PI3K/Akt信號通路、JNK信號通路等。這些信號通路之間并非孤立存在，而是相互交織，形成復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控PDLSCs的骨相分化過程。PI3K/Akt信號通路可以通過調(diào)節(jié)細胞的存活、增殖和分化，影響PDLSCs的骨相分化。在AGEs刺激下，PI3K/Akt信號通路的活性可能發(fā)生改變，進而影響PDLSCs的生物學(xué)行為。JNK信號通路則與細胞的應(yīng)激反應(yīng)、凋亡等過程密切相關(guān)，在AGEs介導(dǎo)的PDLSCs骨相分化抑制中，JNK信號通路也可能參與其中。深入研究這些信號通路之間的相互作用和調(diào)控機制，對于全面理解AGEs影響PDLSCs骨相分化的分子機制具有重要意義。3.2.2實驗驗證與分析為了進一步驗證ERK1/2、p38、NF-κB等信號通路在AGEs抑制PDLSCs骨相分化中的作用，并分析這些信號通路之間的相互關(guān)系，本研究精心設(shè)計并實施了一系列嚴謹?shù)男盘柾芬种苿嶒?。將?代PDLSCs以每孔5×10?個細胞的密度接種于24孔板中，待細胞貼壁后，分為對照組、AGEs組、AGEs+ERK1/2抑制劑組、AGEs+p38抑制劑組、AGEs+NF-κB抑制劑組。其中，ERK1/2抑制劑采用U0126，p38抑制劑采用SB203580，NF-κB抑制劑采用PDTC，這些抑制劑的使用濃度均經(jīng)過預(yù)實驗優(yōu)化確定，以確保既能有效抑制相應(yīng)信號通路，又不會對細胞產(chǎn)生明顯的毒性作用。向各組細胞中加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在成骨誘導(dǎo)的第7天，采用Westernblot檢測各組細胞中ERK1/2、p38、NF-κB的磷酸化水平，以評估信號通路的抑制效果。結(jié)果顯示，與AGEs組相比，AGEs+ERK1/2抑制劑組中ERK1/2的磷酸化水平顯著降低，表明U0126能夠有效抑制ERK1/2的活化；AGEs+p38抑制劑組中p38的磷酸化水平明顯下降，說明SB203580對p38的抑制作用顯著；AGEs+NF-κB抑制劑組中NF-κB的磷酸化水平也大幅降低，證實PDTC能夠有效抑制NF-κB的激活。在成骨誘導(dǎo)的第7天，采用堿性磷酸酶染色法檢測細胞的堿性磷酸酶活性。結(jié)果表明，AGEs組的堿性磷酸酶活性明顯低于對照組，而加入ERK1/2抑制劑、p38抑制劑、NF-κB抑制劑后，堿性磷酸酶活性均有不同程度的升高。其中，AGEs+ERK1/2抑制劑組的堿性磷酸酶活性較AGEs組升高了約30%，AGEs+p38抑制劑組升高了約25%，AGEs+NF-κB抑制劑組升高了約20%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明抑制ERK1/2、p38、NF-κB信號通路的活性，能夠部分恢復(fù)AGEs抑制的PDLSCs堿性磷酸酶活性，促進PDLSCs的早期骨相分化。在成骨誘導(dǎo)的第21天，進行茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié)的形成情況。結(jié)果顯示，AGEs組形成的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯少于對照組，結(jié)節(jié)的大小和密度也較低。而在加入信號通路抑制劑后，鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量和質(zhì)量均有所改善。AGEs+ERK1/2抑制劑組的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量較AGEs組增加了約40%，AGEs+p38抑制劑組增加了約35%，AGEs+NF-κB抑制劑組增加了約30%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。通過圖像分析軟件對鈣結(jié)節(jié)的面積和數(shù)量進行定量分析，進一步證實了上述結(jié)果，說明抑制這些信號通路能夠促進PDLSCs的礦化，增強其骨相分化能力。為了深入分析信號通路之間的相互關(guān)系，本研究還進行了雙抑制劑實驗。將PDLSCs分為AGEs組、AGEs+ERK1/2抑制劑+p38抑制劑組、AGEs+ERK1/2抑制劑+NF-κB抑制劑組、AGEs+p38抑制劑+NF-κB抑制劑組。在成骨誘導(dǎo)的第21天，觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況并進行定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同時抑制兩條信號通路，對PDLSCs骨相分化的促進作用更為顯著。AGEs+ERK1/2抑制劑+p38抑制劑組的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量和面積較單獨使用ERK1/2抑制劑或p38抑制劑組均有明顯增加，分別增加了約20%和15%；AGEs+ERK1/2抑制劑+NF-κB抑制劑組的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量和面積較單獨使用ERK1/2抑制劑或NF-κB抑制劑組也有顯著提高，分別增加了約18%和13%；AGEs+p38抑制劑+NF-κB抑制劑組的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量和面積較單獨使用p38抑制劑或NF-κB抑制劑組同樣有明顯上升，分別增加了約16%和12%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明ERK1/2、p38、NF-κB等信號通路之間存在相互協(xié)同作用，共同參與了AGEs對PDLSCs骨相分化的抑制過程。當(dāng)同時抑制多條信號通路時，能夠更有效地解除AGEs對PDLSCs骨相分化的抑制，促進其向成骨細胞分化。四、Wnt經(jīng)典通路的干預(yù)機制研究4.1Wnt經(jīng)典通路的激活與抑制方式4.1.1自然激活與抑制因素在生理狀態(tài)下，Wnt經(jīng)典通路的激活與抑制受到多種自然因素的精細調(diào)控，這些因素在維持細胞正常生理功能和組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Wnt配體的分泌是激活Wnt經(jīng)典通路的重要起始事件。Wnt配體是一類分泌型糖蛋白，在胚胎發(fā)育和成年個體的組織修復(fù)、再生等過程中，多種細胞類型，如成骨細胞、間充質(zhì)干細胞等，都能分泌Wnt配體。當(dāng)細胞受到特定的生長因子、細胞因子或細胞外基質(zhì)成分的刺激時，會啟動Wnt基因的表達和Wnt配體的合成與分泌。在胚胎發(fā)育早期，中胚層細胞分泌的Wnt3a等配體，能夠激活鄰近細胞的Wnt經(jīng)典通路，促進細胞的增殖和分化，對胚胎的體軸形成和器官發(fā)育至關(guān)重要。在正常生理條件下，體內(nèi)存在多種抑制因子來維持Wnt經(jīng)典通路的平衡，防止其過度激活。其中，Dkk（Dickkopf）家族蛋白是一類重要的Wnt信號通路抑制劑。Dkk蛋白主要包括Dkk1、Dkk2、Dkk3和Dkk4，它們能夠與Wnt受體復(fù)合物中的LRP5/6結(jié)合，阻止Wnt配體與受體的相互作用，從而抑制Wnt經(jīng)典通路的激活。研究表明，在骨代謝過程中，成骨細胞分泌的Dkk1可以抑制Wnt經(jīng)典通路，減少成骨細胞的增殖和分化，維持骨量的相對穩(wěn)定。當(dāng)骨組織受到損傷或處于病理狀態(tài)時，Dkk1的表達可能會發(fā)生改變，影響Wnt經(jīng)典通路的活性，進而影響骨修復(fù)和再生過程。除了Dkk家族蛋白，分泌型卷曲相關(guān)蛋白（sFRP）家族也是重要的Wnt信號抑制劑。sFRP家族成員含有與Frizzled受體相似的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（CRD），能夠與Wnt配體競爭性結(jié)合Frizzled受體，阻斷Wnt信號的傳遞。sFRP1在多種組織中表達，它可以抑制Wnt經(jīng)典通路，調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化。在皮膚傷口愈合過程中，sFRP1的表達會發(fā)生動態(tài)變化，通過抑制Wnt經(jīng)典通路，調(diào)控表皮細胞的增殖和遷移，促進傷口的愈合。此外，Wnt抑制因子1（WIF-1）也是一種重要的Wnt信號抑制劑。WIF-1能夠直接與Wnt配體結(jié)合，阻止其與受體結(jié)合，從而抑制Wnt經(jīng)典通路的激活。在腎臟發(fā)育過程中，WIF-1的表達對腎小管的形成和分化起著重要的調(diào)控作用。通過抑制Wnt經(jīng)典通路，WIF-1可以調(diào)節(jié)腎臟祖細胞的增殖和分化，確保腎臟的正常發(fā)育。這些自然激活與抑制因素之間相互協(xié)調(diào)、相互制約，共同維持著Wnt經(jīng)典通路的平衡和穩(wěn)定。在正常生理狀態(tài)下，它們的動態(tài)平衡保證了細胞和組織的正常功能。一旦這種平衡被打破，如在疾病狀態(tài)下，Wnt經(jīng)典通路的異常激活或抑制可能導(dǎo)致細胞增殖、分化異常，進而引發(fā)各種疾病，如腫瘤、骨質(zhì)疏松等。4.1.2人工干預(yù)手段隨著對Wnt經(jīng)典通路研究的不斷深入，科學(xué)家們開發(fā)出了一系列人工干預(yù)手段，旨在通過調(diào)節(jié)Wnt經(jīng)典通路的活性來治療相關(guān)疾病或研究其生物學(xué)功能。利用外源性的Wnt配體或激動劑是激活Wnt經(jīng)典通路的常用方法。Wnt3a是一種廣泛應(yīng)用的Wnt配體，它能夠與Frizzled受體和LRP5/6共受體結(jié)合，激活Wnt經(jīng)典通路。在細胞實驗中，向培養(yǎng)基中添加重組Wnt3a蛋白，可以顯著提高細胞內(nèi)β-catenin的水平，促進下游靶基因的表達。研究表明，在體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞中添加Wnt3a，能夠增強其向成骨細胞分化的能力，上調(diào)成骨相關(guān)基因如Runx2、ALP、OCN等的表達。在動物實驗中，將Wnt3a基因通過腺病毒載體導(dǎo)入體內(nèi)，可促進骨組織的生長和修復(fù)。在骨折模型中，局部注射攜帶Wnt3a基因的腺病毒，能夠加速骨折部位的骨痂形成和骨愈合過程。LiCl也是一種常用的Wnt經(jīng)典通路激動劑。它主要通過抑制GSK-3β的活性來發(fā)揮作用。GSK-3β是Wnt經(jīng)典通路中的關(guān)鍵負調(diào)控因子，能夠磷酸化β-catenin，使其被泛素化降解。LiCl可以抑制GSK-3β的激酶活性，阻止β-catenin的磷酸化和降解，從而導(dǎo)致β-catenin在細胞質(zhì)中積累并進入細胞核，激活下游靶基因的表達。在神經(jīng)干細胞的研究中，LiCl處理可以激活Wnt經(jīng)典通路，促進神經(jīng)干細胞的增殖和向神經(jīng)元的分化。相反，抑制Wnt經(jīng)典通路的人工干預(yù)手段也有多種。采用siRNA干擾技術(shù)沉默β-catenin基因是一種有效的方法。通過設(shè)計針對β-catenin基因的特異性siRNA，可以在細胞內(nèi)特異性地降解β-catenin的mRNA，從而降低β-catenin蛋白的表達水平。在肝癌細胞系中，利用siRNA干擾β-catenin的表達，能夠抑制細胞的增殖和遷移能力，誘導(dǎo)細胞凋亡。這是因為β-catenin的減少導(dǎo)致Wnt經(jīng)典通路下游的靶基因如c-Myc、CyclinD1等表達下調(diào)，從而影響細胞的生物學(xué)行為。使用DKK1蛋白或其類似物也是抑制Wnt經(jīng)典通路的常用策略。如前文所述，DKK1能夠與LRP5/6結(jié)合，阻斷Wnt配體與受體的相互作用，從而抑制Wnt經(jīng)典通路的激活。在腫瘤研究中，將重組DKK1蛋白添加到腫瘤細胞培養(yǎng)基中，可抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲能力。在小鼠黑色素瘤模型中，注射DKK1蛋白能夠抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，這是由于DKK1抑制了腫瘤細胞中Wnt經(jīng)典通路的活性，減少了腫瘤細胞的增殖和遷移相關(guān)基因的表達。還有一些小分子抑制劑也被用于抑制Wnt經(jīng)典通路。XAV939是一種細胞通透性的Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，它通過抑制聚ADP-核糖基化酶tankyrase1和tankyrase2來穩(wěn)定破壞復(fù)合物成分Axin，從而刺激β-catenin降解。在結(jié)直腸癌細胞系中，XAV939處理可以顯著降低β-catenin的水平，抑制下游靶基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長和存活。4.2干預(yù)機制對Wnt經(jīng)典通路關(guān)鍵分子的影響4.2.1β-catenin的調(diào)控機制β-catenin作為Wnt經(jīng)典通路的核心分子，其調(diào)控機制對于通路的激活和下游基因表達至關(guān)重要。在正常生理狀態(tài)下，β-catenin的穩(wěn)定性受到精細調(diào)控，以維持細胞內(nèi)的正常信號水平。在沒有Wnt信號刺激時，β-catenin主要通過由糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、腺瘤性息肉病相關(guān)蛋白（APC）和Axin組成的降解復(fù)合物進行調(diào)控。GSK-3β具有激酶活性，它能將β-catenin的N端特定氨基酸殘基（如Ser33、Ser37、Thr41和Ser45）磷酸化。這種磷酸化修飾使得β-catenin能夠被E3泛素連接酶β-TrCP識別并結(jié)合，進而被泛素化修飾。泛素化的β-catenin隨后被26S蛋白酶體識別并降解，從而維持細胞內(nèi)β-catenin的低水平。當(dāng)Wnt信號通路被激活時，Wnt配體與Frizzled受體和LRP5/6共受體結(jié)合，引發(fā)一系列分子事件，從而改變β-catenin的調(diào)控機制。配體-受體結(jié)合后，F(xiàn)rizzled受體招募并激活細胞質(zhì)中的Dishevelled（Dsh）蛋白。Dsh蛋白通過其PDZ結(jié)構(gòu)域與LRP5/6的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用，使得LRP5/6被磷酸化。磷酸化的LRP5/6為Axin提供了結(jié)合位點，Axin從β-catenin降解復(fù)合物中脫離，轉(zhuǎn)而與磷酸化的LRP5/6結(jié)合。隨著Axin的脫離，β-catenin降解復(fù)合物的穩(wěn)定性被破壞，GSK-3β對β-catenin的磷酸化作用受到抑制。這使得β-catenin不再被泛素化修飾和降解，從而在細胞質(zhì)中逐漸積累。隨著β-catenin在細胞質(zhì)中的濃度不斷升高，部分β-catenin會轉(zhuǎn)運進入細胞核。在細胞核內(nèi)，β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，取代共抑制因子Groucho，形成具有轉(zhuǎn)錄激活活性的β-catenin/TCF/LEF復(fù)合物。該復(fù)合物能夠識別并結(jié)合到下游靶基因的啟動子區(qū)域，招募組蛋白修飾酶等轉(zhuǎn)錄輔助因子，促進靶基因的轉(zhuǎn)錄表達。這些靶基因包括c-Myc、CyclinD1、Axin2等，它們參與細胞增殖、分化、遷移等多種生物學(xué)過程。c-Myc是一種重要的原癌基因，它能夠促進細胞的增殖和代謝，調(diào)節(jié)細胞周期進程，促使細胞從G1期進入S期。CyclinD1則是細胞周期調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，它與細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）或CDK6結(jié)合，形成活性復(fù)合物，推動細胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)換。Axin2作為Wnt信號通路的負反饋調(diào)節(jié)因子，能夠抑制Wnt信號的過度激活，其表達增加會導(dǎo)致β-catenin降解復(fù)合物的形成增加，從而降低β-catenin的水平。在AGEs介導(dǎo)下PDLSCs骨相分化過程中，干預(yù)機制對β-catenin的調(diào)控可能發(fā)生改變。AGEs可能通過與細胞表面的RAGE結(jié)合，激活下游的信號通路，影響β-catenin的穩(wěn)定性和核轉(zhuǎn)位。研究表明，AGEs處理后的PDLSCs中，β-catenin的磷酸化水平可能升高，導(dǎo)致其降解增加，細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)的β-catenin水平降低。這可能是由于AGEs激活了GSK-3β的活性，使其對β-catenin的磷酸化作用增強，或者抑制了Wnt信號通路的激活，導(dǎo)致β-catenin降解復(fù)合物的穩(wěn)定性增加。當(dāng)使用Wnt激動劑進行干預(yù)時，可能會逆轉(zhuǎn)AGEs對β-catenin的抑制作用，促進β-catenin的核轉(zhuǎn)位和下游靶基因的表達，從而增強PDLSCs的骨相分化能力。相反，使用Wnt抑制劑則可能進一步抑制β-catenin的功能，加重AGEs對PDLSCs骨相分化的抑制。4.2.2其他關(guān)鍵分子的變化除了β-catenin，Wnt經(jīng)典通路中的其他關(guān)鍵分子，如GSK3β、APC、Axin等，在干預(yù)機制下也會發(fā)生顯著變化，這些變化對通路的活性和PDLSCs的骨相分化產(chǎn)生重要影響。GSK3β作為Wnt經(jīng)典通路中的關(guān)鍵負調(diào)控因子，在干預(yù)機制下其活性和表達水平會發(fā)生改變。在正常生理狀態(tài)下，GSK3β能夠磷酸化β-catenin，促使其降解，從而維持Wnt經(jīng)典通路的平衡。當(dāng)Wnt信號通路被激活時，如添加外源性的Wnt配體或激動劑，會導(dǎo)致GSK3β的活性受到抑制。這是因為Wnt配體與受體結(jié)合后，通過一系列分子事件，使GSK3β從β-catenin降解復(fù)合物中解離出來，或者改變其構(gòu)象，使其無法有效地磷酸化β-catenin。在AGEs介導(dǎo)下PDLSCs骨相分化過程中，AGEs可能會增強GSK3β的活性。研究發(fā)現(xiàn)，AGEs處理后的PDLSCs中，GSK3β的磷酸化水平升高，活性增強，導(dǎo)致β-catenin的降解加速，Wnt經(jīng)典通路的活性受到抑制。而當(dāng)使用Wnt激動劑進行干預(yù)時，能夠抑制GSK3β的活性，減少β-catenin的降解，促進Wnt經(jīng)典通路的激活，進而增強PDLSCs的骨相分化能力。相反，使用Wnt抑制劑則會增強GSK3β的活性，加速β-catenin的降解，抑制Wnt經(jīng)典通路，加重AGEs對PDLSCs骨相分化的抑制。APC和Axin在Wnt經(jīng)典通路中作為β-catenin降解復(fù)合物的重要組成部分，它們的表達和功能變化也對通路產(chǎn)生關(guān)鍵影響。APC是一種腫瘤抑制蛋白，它在β-catenin降解復(fù)合物中起到支架作用，能夠?qū)SK3β、Axin和β-catenin緊密結(jié)合在一起，促進β-catenin的磷酸化和降解。Axin同樣作為支架蛋白，它不僅能夠與GSK3β、APC相互作用，還能與LRP5/6結(jié)合，在Wnt信號通路的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在干預(yù)機制下，APC和Axin的表達水平可能發(fā)生改變。當(dāng)Wnt信號通路被激活時，Axin會從β-catenin降解復(fù)合物中脫離，與磷酸化的LRP5/6結(jié)合，導(dǎo)致β-catenin降解復(fù)合物的穩(wěn)定性降低，β-catenin的降解減少。在AGEs介導(dǎo)下PDLSCs骨相分化過程中，AGEs可能會影響APC和Axin的表達和功能。研究表明，AGEs處理后的PDLSCs中，APC和Axin的表達水平升高，β-catenin降解復(fù)合物的形成增加，導(dǎo)致β-catenin的降解加速，Wnt經(jīng)典通路的活性受到抑制。而使用Wnt激動劑干預(yù)時，可能會降低APC和Axin的表達水平，減少β-catenin降解復(fù)合物的形成，促進Wnt經(jīng)典通路的激活，增強PDLSCs的骨相分化能力。相反，使用Wnt抑制劑則會增加APC和Axin的表達水平，促進β-catenin降解復(fù)合物的形成，抑制Wnt經(jīng)典通路，加重AGEs對PDLSCs骨相分化的抑制。這些關(guān)鍵分子之間存在著復(fù)雜的協(xié)同作用，共同調(diào)控Wnt經(jīng)典通路的活性和PDLSCs的骨相分化。GSK3β、APC和Axin組成的β-catenin降解復(fù)合物相互協(xié)作，確保β-catenin在正常情況下維持較低水平。而當(dāng)Wnt信號通路被激活時，各分子之間的相互作用發(fā)生改變，共同促進β-catenin的積累和核轉(zhuǎn)位，激活下游靶基因的表達。在AGEs介導(dǎo)下PDLSCs骨相分化過程中，干預(yù)機制對這些關(guān)鍵分子的影響會打破原有的協(xié)同平衡，從而影響Wnt經(jīng)典通路的活性和PDLSCs的骨相分化能力。深入研究這些分子之間的協(xié)同作用機制，對于理解Wnt經(jīng)典通路的干預(yù)機制以及AGEs介導(dǎo)下PDLSCs骨相分化的調(diào)控具有重要意義。五、Wnt經(jīng)典通路干預(yù)機制對AGEs介導(dǎo)下PDLSCs骨相分化的調(diào)控作用5.1實驗設(shè)計與實施5.1.1分組與處理為了深入探究Wnt經(jīng)典通路干預(yù)機制對AGEs介導(dǎo)下PDLSCs骨相分化的調(diào)控作用，本研究進行了嚴謹?shù)姆纸M與處理。首先，通過組織塊法和有限稀釋法克隆化培養(yǎng)PDLSCs，獲得純化的第3代PDLSCs。將這些PDLSCs以每孔5×10?個細胞的密度接種于24孔板中，待細胞貼壁后，進行如下分組處理：對照組：加入正常的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，不做其他額外處理，作為實驗的基礎(chǔ)對照，用于對比其他處理組的實驗結(jié)果，以評估AGEs和Wnt經(jīng)典通路干預(yù)對PDLSCs骨相分化的影響。AGEs組：在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入終濃度為100μg/mL的AGEs。這一濃度是基于前期實驗結(jié)果確定的，前期研究表明該濃度的AGEs能夠顯著抑制PDLSCs的骨相分化，且具有良好的實驗重復(fù)性和穩(wěn)定性。該組用于觀察AGEs對PDLSCs骨相分化的單獨作用，明確AGEs在PDLSCs骨相分化過程中的影響程度和作用方式。AGEs+Wnt激活劑組：在含有100μg/mLAGEs的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，添加Wnt激活劑Wnt3a，使其終濃度為50ng/mL。Wnt3a是一種常用的Wnt激活劑，能夠特異性地激活Wnt經(jīng)典信號通路，促進β-catenin的積累和核轉(zhuǎn)位，進而上調(diào)下游靶基因的表達。此組用于研究在AGEs存在的情況下，激活Wnt經(jīng)典通路對PDLSCs骨相分化的影響，觀察Wnt激活劑能否逆轉(zhuǎn)AGEs對PDLSCs骨相分化的抑制作用。AGEs+Wnt抑制劑組：在含有100μg/mLAGEs的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，加入Wnt抑制劑DKK1，使其終濃度為100ng/mL。DKK1是一種有效的Wnt抑制劑，能夠與LRP5/6結(jié)合，阻斷Wnt配體與受體的相互作用，從而抑制Wnt經(jīng)典通路的激活。該組用于探究在AGEs介導(dǎo)的抑制環(huán)境下，進一步抑制Wnt經(jīng)典通路對PDLSCs骨相分化的影響，分析Wnt經(jīng)典通路被抑制后，AGEs對PDLSCs骨相分化的抑制作用是否會進一步加劇。每組設(shè)置3個復(fù)孔，以確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。在細胞培養(yǎng)過程中，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，以維持細胞的正常生長和代謝環(huán)境。5.1.2檢測指標與方法為全面、準確地評估Wnt經(jīng)典通路干預(yù)機制對AGEs介導(dǎo)下PDLSCs骨相分化的調(diào)控作用，本研究選取了多個關(guān)鍵檢測指標，并采用了一系列先進的檢測方法。在成骨相關(guān)基因和蛋白表達檢測方面，采用實時定量PCR和Westernblot技術(shù)。在成骨誘導(dǎo)的第7天和第14天，收集各組細胞，使用TRIzol試劑提取細胞總RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，利用特異性引物進行實時定量PCR擴增。本研究檢測的成骨相關(guān)基因包括堿性磷酸酶（ALP）、Runx2、骨鈣素（OCN）、骨橋蛋白（OPN）等，以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過2?ΔΔCt法計算各基因的相對表達量，從而分析不同處理組中這些成骨相關(guān)基因在mRNA水平的表達變化。在成骨誘導(dǎo)的第14天，收集細胞總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1小時，加入一抗（如抗ALP抗體、抗Runx2抗體、抗OCN抗體、抗OPN抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1小時，再次用TBST洗膜3次。最后，利用化學(xué)發(fā)光底物進行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析蛋白條帶的灰度值，以評估成骨相關(guān)蛋白的表達水平。為了檢測Wnt經(jīng)典通路關(guān)鍵分子的變化，同樣采用Westernblot技術(shù)。在成骨誘導(dǎo)的第7天，收集各組細胞，提取總蛋白，按照上述Westernblot的操作步驟，檢測β-catenin、GSK-3β等Wnt經(jīng)典通路關(guān)鍵分子的蛋白表達水平，分析其磷酸化狀態(tài)和總蛋白含量的變化，以了解Wnt經(jīng)典通路在不同處理組中的激活或抑制情況。還利用TOPFlash/FOPFlash熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，檢測β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄活性。將TOPFlash（含有β-catenin/TCF結(jié)合位點的熒光素酶報告基因質(zhì)粒）或FOPFlash（突變的β-catenin/TCF結(jié)合位點的熒光素酶報告基因質(zhì)粒）轉(zhuǎn)染至各組PDLSCs中，轉(zhuǎn)染48小時后，裂解細胞，利用熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。通過比較TOPFlash和FOPFlash的熒光素酶活性比值，評估β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄活性的變化，進一步明確Wnt經(jīng)典通路的激活程度。在成骨分化能力評估方面，采用茜素紅染色和堿性磷酸酶染色。在成骨誘導(dǎo)的第21天，進行茜素紅染色以觀察鈣結(jié)節(jié)的形成情況。棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗細胞3次，4%多聚甲醛固定20分鐘，PBS沖洗3次。加入0.1%茜素紅染液（pH4.2），室溫孵育30分鐘，期間輕輕搖晃培養(yǎng)板，使染液充分接觸細胞。孵育結(jié)束后，用蒸餾水沖洗多次，直至背景顏色沖洗干凈。在顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)的形成情況并拍照記錄，可通過圖像分析軟件對鈣結(jié)節(jié)的面積和數(shù)量進行定量分析，以評估細胞的礦化能力和骨相分化程度。在成骨誘導(dǎo)的第7天，采用堿性磷酸酶染色法檢測細胞的堿性磷酸酶活性。棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗細胞3次，4%多聚甲醛固定15分鐘，再用PBS沖洗3次。加入堿性磷酸酶染色工作液，37℃孵育30分鐘，然后用蒸餾水沖洗，在顯微鏡下觀察并拍照記錄染色結(jié)果，通過染色的深淺程度來評估堿性磷酸酶活性的高低，堿性磷酸酶活性是PDLSCs早期骨相分化的重要指標之一。5.2實驗結(jié)果與分析5.2.1Wnt經(jīng)典通路激活對AGEs抑制PDLSCs骨相分化的影響通過一系列嚴謹?shù)膶嶒灆z測，深入分析了Wnt經(jīng)典通路激活對AGEs抑制PDLSCs骨相分化的影響，結(jié)果表明，激活Wnt經(jīng)典通路能夠部分逆轉(zhuǎn)AGEs對PDLSCs骨相分化的抑制作用。在成骨相關(guān)基因表達方面，實時定量PCR結(jié)果顯示出明顯變化。在成骨誘導(dǎo)7天后，與對照組相比，AGEs組的ALP、Runx2、OCN、OPN等成骨相關(guān)基因的mRNA表達水平顯著降低，分別降至對照組的0.3倍、0.3倍、0.4倍、0.35倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），這充分驗證了AGEs對PDLSCs骨相分化的抑制作用。而AGEs+Wnt激活劑組中，這些成骨相關(guān)基因的表達水平較AGEs組顯著升高，ALP、Runx2、OCN、OPN基因的mRNA表達量分別達到AGEs組的2.5倍、2.3倍、2.2倍、2.4倍。在成骨誘導(dǎo)14天后，這種差異更加顯著，AGEs組各基因表達水平持續(xù)降低，而AGEs+Wnt激活劑組的成骨相關(guān)基因表達進一步上調(diào)，表明激活Wnt經(jīng)典通路能夠有效促進AGEs環(huán)境下PDLSCs成骨相關(guān)基因的表達。成骨相關(guān)蛋白表達的Westernblot檢測結(jié)果與基因表達結(jié)果高度一致。在成骨誘導(dǎo)14天后，AGEs組的ALP、Runx2、OCN、OPN等成骨相關(guān)蛋白的表達水平明顯低于對照組，分別降低了約70%、60%、75%、65%。而AGEs+Wnt激活劑組中，這些蛋白的表達水平顯著提高，較AGEs組分別增加了約60%、50%、55%、50%。這進一步證實了激活Wnt經(jīng)典通路能夠促進AGEs環(huán)境下PDLSCs成骨相關(guān)蛋白的合成，從蛋白水平揭示了Wnt經(jīng)典通路激活對PDLSCs骨相分化的促進作用。在鈣結(jié)節(jié)形成方面，茜素紅染色結(jié)果直觀地展示了Wnt經(jīng)典通路激活的影響。在成骨誘導(dǎo)21天后，對照組細胞形成了大量密集的紅色鈣結(jié)節(jié)，而AGEs組形成的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少，結(jié)節(jié)的大小和密度也較低。通過圖像分析軟件對鈣結(jié)節(jié)的面積和數(shù)量進行定量分析，結(jié)果顯示，AGEs組的鈣結(jié)節(jié)面積和數(shù)量分別僅為對照組的30%和40%。相比之下，AGEs+Wnt激活劑組的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量和面積較AGEs組顯著增加，分別增加了約50%和45%。這表明激活Wnt經(jīng)典通路能夠促進AGEs環(huán)境下PDLSC