有機(jī)溶劑沉淀法第二節(jié)第二章固相析出技術(shù)有機(jī)溶劑對(duì)于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一，常用丙酮、異丙酮、乙醇、甲醇等。定義：向水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法，稱(chēng)為有機(jī)溶劑沉淀法。第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法基本原理：①降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀；②有機(jī)溶劑的親水性比溶質(zhì)分子的親水性強(qiáng)，會(huì)搶奪本來(lái)與親水溶質(zhì)結(jié)合的自由水，破壞其表面的水化膜，導(dǎo)致溶質(zhì)分子間相互作用增強(qiáng)而發(fā)生聚集，從而沉淀析出。一、

有機(jī)溶劑沉淀的特點(diǎn)和基本原理溶劑介電常數(shù)溶劑介電常數(shù)水802.5mol/L尿素8420%乙醇702.5mol/L甘氨酸13740%乙醇60丙酮2260%乙醇48甲醇33100%乙醇24丙醇23部分常用溶劑介電常數(shù)介電常數(shù):表征介質(zhì)在外電場(chǎng)作用下極化程度介電常數(shù)越大,絕緣性越大優(yōu)點(diǎn)：分辨能力比鹽析高,即一種生物分子或其他溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉析；有機(jī)溶劑沸點(diǎn)低，容易除去或回收，產(chǎn)品更純凈，分離容易。缺點(diǎn)：是某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，沉淀操作需在低溫下進(jìn)行；需用大量的有機(jī)溶劑，成本較高，且易燃易爆。第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法（一）有機(jī)溶劑選擇的基本標(biāo)準(zhǔn)

1.介電常數(shù)要小，沉淀作用強(qiáng)2.致變性作用要小，對(duì)生物大分子的變性作用小3.毒性要小、揮發(fā)性適中4.水溶性要好，與水無(wú)限互溶二、

常用的有機(jī)溶劑及其選擇（二）常用的有機(jī)溶劑

沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法二、

常用的有機(jī)溶劑及其選擇溶劑用量V=V0（S2－S1）/（100－S2）

V:需加入有機(jī)溶劑體積；V0：原溶液體積；S1：原溶液中有機(jī)溶劑的體積分?jǐn)?shù)，%；S2：所需要的有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)，%。第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法二、

常用的有機(jī)溶劑及其選擇案例：果膠是一種廣泛分布在植物體內(nèi)的膠體性多糖物質(zhì)，包括原果膠、水溶性果膠和果膠酸三大類(lèi)。用酸提取沉淀法時(shí)可以選擇乙醇沉淀法或者鹽析法。請(qǐng)選擇較為優(yōu)化的方法，并說(shuō)明理由。第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法（一）溫度

（低溫）進(jìn)行有機(jī)溶劑沉淀，溫度重要的因素。大多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度降低減小，故低溫沉淀較為完全；生物大分子在有機(jī)溶劑中對(duì)溫度敏感，易變性，且有機(jī)溶劑與水混合時(shí)產(chǎn)生放熱反應(yīng)。在用有機(jī)溶劑沉淀生物大分子時(shí)，操作是在低溫下進(jìn)行的，同時(shí)要保持低溫的恒定。三、影響有機(jī)溶劑沉淀的因素第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法（一）溫度

（低溫）具體操作，待分離的溶液和有機(jī)溶劑分別進(jìn)行預(yù)冷。有機(jī)溶劑必須預(yù)先冷至較低溫度，一般在0℃以下，操作時(shí)要在冰浴中進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑必須緩慢，并不斷攪拌以免局部濃度過(guò)濃。為減少變性作用，通常低溫沉淀短時(shí)間（0.5-2h）后進(jìn)行過(guò)濾或離心分離；真空抽去剩余溶劑或者沉淀溶于緩沖液中，減少目的物與有機(jī)溶劑的接觸。三、影響有機(jī)溶劑沉淀的因素第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法（二）樣品濃度樣品濃度低時(shí)增加有機(jī)溶劑投入量和損耗，降低了溶質(zhì)回收率，易產(chǎn)生稀釋變性，但共沉的作用小，有利于提高分離效果；對(duì)于高濃度的生物樣品，節(jié)省了有機(jī)溶劑，減少了變性的危險(xiǎn)，但共沉作用大，分離效果下降。

蛋白質(zhì)（5-20mg/ml）0.5％～2％，粘多糖（10-20mg/ml）1％～2％三、影響有機(jī)溶劑沉淀的因素第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法（三）pH盡可能選擇樣品溶解度最低的pH，通常是選在等電點(diǎn)附近，以提高該沉析的分辨能力;要選擇在樣品穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，少數(shù)生物分子在等電點(diǎn)附近不穩(wěn)定，影響其活性。盡量避免目的物與雜質(zhì)帶相反電荷而加劇共沉現(xiàn)象的發(fā)生。三、影響有機(jī)溶劑沉淀的因素注意：使溶液中大多數(shù)蛋白質(zhì)帶相同電荷，不要讓目的物與主要雜質(zhì)分子帶相反電荷，以致出現(xiàn)較嚴(yán)重的共沉作用。第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法（四）離子強(qiáng)度

低鹽：有利于沉淀，還有保護(hù)蛋白質(zhì)，防止變性。高鹽：增大蛋白質(zhì)溶解度，降低效果，沉淀物中可能夾帶鹽。

一般中性鹽濃度以0.01～0.05mol/L為好，常用的中性鹽為醋酸鈉、醋酸銨、氯化鈉等。三、影響有機(jī)溶劑沉淀的因素第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法三、影響有機(jī)溶劑沉淀的因素（五）多價(jià)金屬離子的影響某些金屬離子具有助沉作用，蛋白質(zhì)與Zn2+、Ca2+等形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)在水和有機(jī)溶液中的溶解度大大降低而不影響生物活性，有利于沉析形成，并降低有機(jī)溶劑的耗量；0.005～0.02mol/L的Zn2+可使有機(jī)溶劑用量減少l/3至1/2；使用時(shí)要避免會(huì)與這些金屬離子形成難溶鹽的陰離子(如磷酸根)的存在。實(shí)際操作時(shí)，經(jīng)常預(yù)先加入有機(jī)溶劑除雜蛋白，再加陽(yáng)離子Zn2+、Ca2+沉淀目的物。第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法總結(jié)：1、有機(jī)溶劑沉淀法經(jīng)常用于蛋白質(zhì)、酶、多糖和核酸等生物大分子的沉淀分離，使用時(shí)先選擇合適的有機(jī)溶劑，然后注意調(diào)整樣品的濃度、溫度、pH和離子強(qiáng)度，來(lái)達(dá)到最佳效果。2、沉淀所得到的固體樣品，盡可能抽干沉淀，減少其中有機(jī)溶劑的含量。第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法三、

影響有機(jī)溶劑沉淀的因素應(yīng)用實(shí)例胰島素的精制胰島素粗提液調(diào)pH4.2加30%丙酮調(diào)pH6.0加Zn2+上清液上清液（回收）沉析(胰島素鋅鹽)沉析（雜蛋白）應(yīng)用實(shí)例-乙醇沉淀法提取柑橘皮中的果膠材料新鮮柑橘皮50g正磷酸、0.2mol/L鹽酸、焦磷酸鈉（又稱(chēng)磷酸四鈉）組織搗碎機(jī)、大燒杯（≥500mL）、磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、搪瓷桶、酸度計(jì)、不銹鋼鍋提取液分離將提取液加入1％的硅藻土作助濾劑，然后送入板框壓濾機(jī)，過(guò)濾后得無(wú)色透明的果膠稀溶液，濾渣棄去。濃縮將過(guò)濾收集的濾液置于真空濃縮裝置中，于75℃溫度下濃縮，直至濃縮到果膠濃度為4％左右。沉析將濃縮液置于搪瓷桶中，并冷至室溫，然后乙醇以噴淋方式加至已濃縮好的果膠溶液中，乙醇含量控制在40-50％的范圍內(nèi)，不斷攪動(dòng)，果膠聚結(jié)成海綿狀析出。分離將果膠/乙醇混合物經(jīng)1~2h靜置后，送入板框壓濾機(jī)過(guò)濾。收集濾餅(果膠)，然后用80％乙醇溶液洗滌濾餅1~2次，再用95％的乙醇洗滌1~2次，洗完后壓干。干燥將以上濾好的果膠置于真空干燥器中于55℃左右干燥，即得果膠純品。應(yīng)用實(shí)例-銀耳多糖的提取純化銀耳多糖主要成分含有酸性雜多糖、中性雜多糖、胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖不含核酸、蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)實(shí)驗(yàn)儀器：燒杯、布氏漏斗、抽濾瓶、分液漏斗、量筒、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、透析袋、濾紙、組織搗碎機(jī)、不銹鋼鍋。實(shí)驗(yàn)試劑：（1）1％復(fù)合酶制劑(含果膠酶、纖維素酶和中性蛋白酶食品級(jí)復(fù)合酶)；（2）2％溴化十六烷基三甲銨（CTAB）配制：取2gCTAB溶于100mL蒸餾水中，搖勻備用；（3）α-萘酚配制：α-萘酚5g溶于95％乙醇；（4）5%三氯乙酸-正丁醇溶液；（5）2mol／L的氫氧化鈉溶液；（6）0.5％甲苯胺乙醇溶液；（7）2mol／L氯化鈉溶液；（8）2mol／L鹽酸溶液；（9）活性炭；硅藻土。（10）1％融菌酶制劑；（11）無(wú)水乙醇；（12）濃硫酸；（13）乙醚。1.銀耳預(yù)處理

20g不銹鋼鍋中

加水1600mL

20℃～25℃浸泡30min

搗碎機(jī)中搗碎

銀耳漿液

2mol／L鹽酸溶液調(diào)pH至6.3

加入1％復(fù)合酶制劑

50℃下酶促反應(yīng)40min

銀耳漿液

2.酶浸提

80℃滅酶，保溫浸提約1.5h

80℃水浴濃縮

等體積5％三氯乙酸-正丁醇溶液

搖勻

離心（3000r/min）15min

濃縮液

3.多糖的沉淀（有機(jī)酸除雜）

下層清液備用

吸去上層正丁醇中層變性蛋白

2mol／L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7

搖勻

抽濾

3.多糖的沉淀（脫色、透析

）

下層清液備用

加1％活性炭