無菌挑戰(zhàn)性驗證方案本發(fā)明屬于檢測方法技術領域，涉及灌裝機無菌系統(tǒng)挑戰(zhàn)性實驗的方法；具體涉及對無菌紙基復合材料灌裝成型包裝機(以下簡稱：灌裝機)無菌系統(tǒng)進行挑戰(zhàn)性實驗的方法。背景技術：灌裝機是在密閉的無菌室內灌注無菌產品，并有較長的保質期，無菌室滅菌不徹底或無菌空氣滅菌不徹底就會使包裝成品出現壞包，以前國內同類灌裝機只是在客戶處安裝調試好后，做三批(每批2400包)中性產品在恒溫室內7天無壞包來驗證灌裝機的無菌性能。由于包裝數量和菌種的局限性，灌裝機質量可接受水平的可信度為90％。技術實現要素：灌裝機無菌系統(tǒng)挑戰(zhàn)性實驗是驗證碧海灌裝機的無菌空氣滅菌能力、無菌室的最大滅菌能力、包裝材料在雙氧水槽中的最大滅菌能力，大大提高了碧海灌裝機的質量可接受水平的可信度。本發(fā)明的目的在于公開了灌裝機無菌系統(tǒng)挑戰(zhàn)性實驗的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現的：灌裝機無菌系統(tǒng)挑戰(zhàn)性實驗的方法，其中，所述方法包括以下檢驗過程：(1)、對無菌室進行貼鋼片檢驗；(2)、包裝材料外表面殺菌效果檢驗；(3)、包裝材料內表面殺菌效果檢驗；(4)、無菌室無菌空氣沉降菌測試檢驗。上述技術方案所述的方法，其中，所述對無菌室進行貼鋼片檢驗的過程為：(1)、將接種有bacillussubtilisatcc9372芽孢的鋼片放入無菌室內不同位置，灌裝機對無菌室進行升溫滅菌，滅菌完成后取出鋼片放置于無菌采樣袋中；加入100ml無菌0.1％tween/0.1％蛋白胨水到放置鋼片的無菌袋；放入超聲波清洗儀超聲波作用20min；所述鋼片上的芽孢濃度為10^7cfu/鋼片；(2)、將放置鋼片的無菌袋加入100ml無菌0.1％tween/0.1％蛋白胨水進行清洗，劇烈震蕩1min，用0.45μm濾膜膜過濾，將過濾后的濾膜放到pca平板35攝氏度培養(yǎng)5天；(3)、殺菌后的鋼片對應平板如果有枯草芽孢桿菌類菌落生長，對其菌落進行鑒定。上述技術方案所述的方法，其中，所述包裝材料外表面殺菌效果檢驗的過程為：(1)、灌裝機升溫滅菌，將外表面接種有bacillussubtilisatcc9372芽孢的包裝材料按照7.4s的速度通過灌裝機雙氧水槽，使包材在雙氧水槽中滅菌，滅菌后封合成包裝由排包口排出；所述包裝材料上的芽孢濃度為10^7cfu/包裝材料；(2)、用無菌袋在排包口處收集200個殺菌后包裝樣品，其中包裝樣品不灌裝液體；(3)、用無菌剪刀將接種處的包裝面剪下來，轉入新的無菌袋；(4)、陽性對照：進行梯度稀釋，對芽孢濃度為10^7cfu/包裝材料的菌落總數進行10-2、10-3、10-4三個等級的稀釋，然后取10-2、10-3、10-4的稀釋液各0.1ml到平板上，每個稀釋度要做2個平板，用pca培養(yǎng)基在35℃條件下培養(yǎng)5天，與實驗后包裝樣品對照，出現同類枯草芽孢桿菌才算滅菌后剩余芽孢數量；(5)、將100ml無菌0.1％tween/0.1％蛋白胨水加入裝有包裝樣品的無菌袋進行清洗，劇烈震蕩1min，然后膜過濾。將過濾后0.45μm濾膜放到pca平板35攝氏度培養(yǎng)5天；(6)、殺菌后或者陰性對照的包裝材料對應平板如果有枯草芽孢桿菌類菌落生長，對其菌落進行鑒定。上述技術方案所述的方法，其中，所述包裝材料內表面殺菌效果檢驗的過程為：(1)、灌裝機升溫滅菌，將內表面接種有bacillussubtilisatcc9372芽孢的包裝材料按照7.4s的速度通過灌裝機雙氧水槽，使包材在雙氧水槽中滅菌，滅菌后封合成包裝由排包口排出；所述包裝材料上的芽孢濃度為10^7cfu/包裝材料；(2)、用無菌袋在排包口處收集200個殺菌后包裝樣品，其中包裝樣品不灌裝液體；(3)、用無菌剪刀將接種處的包裝面剪下來，轉入新的無菌袋；(4)、陽性對照：進行梯度稀釋，對芽孢濃度為10^7cfu/包裝材料的菌落總數進行10-2、10-3、10-4三個等級的稀釋，然后取10-2、10-3、10-4的稀釋液各0.1ml到平板上，每個稀釋度要做2個平板，用pca培養(yǎng)基在35℃條件下培養(yǎng)5天，與實驗后包裝樣品對照，出現同類枯草芽孢桿菌才算滅菌后剩余芽孢數量；(5)、將100ml無菌0.1％tween/0.1％蛋白胨水加入裝有包裝樣品的無菌袋進行清洗，劇烈震蕩1min，然后膜過濾。將過濾后0.45μm濾膜放到pca平板35攝氏度培養(yǎng)5天；(6)、殺菌后或者陰性對照的包裝材料對應平板如果有枯草芽孢桿菌類菌落生長，對其菌落進行鑒定。上述技術方案所述的方法，其中，所述無菌室無菌空氣沉降測試檢驗的過程為：(1)、灌裝機管封結束后，在上部無菌室內平臺、后無菌室內部平臺、下部無菌室平臺各放入sda和pca平板中的一種；其中pca平板接種有apc菌種，sda平板接種有yeast和mold菌種；(2)、灌裝機升溫干燥步驟結束后計時30分鐘打開無菌室門，立即蓋好平板利用封口膜對其進行封口，防止交叉污染；(3)、陰性對照樣：將測試平板放置在無菌室外部檢測沉降菌，與pca和sda平板對比，排除開無菌室門過程中灌裝間沉降菌對無菌室平板造成的影響；(4)、無菌環(huán)境測試平板和陰性對照將放在35攝氏度條件下培養(yǎng)2天；無菌環(huán)境測試平板和陰性對照將放在25攝氏度條件下培養(yǎng)5天；(5)、檢測pca和sda平板上是否有微生物生長；當排除外部沉降菌影響時有微生物生長，說明無菌系統(tǒng)滅菌不合格。本發(fā)明具有以下有益效果：1、通過本發(fā)明可驗證灌裝機的最大滅菌效率，從而對灌裝機的無菌系統(tǒng)的生產、維護提供可靠的參考數據；指導灌裝機生產的產品達到食品安全要求。2、通過本發(fā)明可驗證灌裝機的最大滅菌效率，使灌裝機的無菌系統(tǒng)更有保障；從而也保證了經由灌裝機生產的產品的安全性。具體實施方式：為使本發(fā)明的技術方案便于理解，以下結合具體實施例對本發(fā)明灌裝機無菌系統(tǒng)挑戰(zhàn)性實驗的方法作進一步的說明。本發(fā)明的技術方案同樣適用于現成型灌裝機無菌檢驗的方法，也可用于預成型類灌裝機、塑料袋型灌裝機、瓶裝灌裝機的無菌檢驗方法。實施例1：灌裝機無菌系統(tǒng)挑戰(zhàn)性實驗的方法：山東碧海機械科技有限公司委托諾安實力科商品檢驗(上海)有限公司對其bh7500系列灌裝機無菌系統(tǒng)進行挑戰(zhàn)性無菌驗證。bh7500系列灌裝機的無菌室利用高溫(270℃)空氣混合濃度為35％的雙氧水霧對無菌灌裝的空間(即該機無菌室，以下簡稱無菌室)進行殺菌。另外，bh7500系列無菌灌裝機利用雙氧水(約35％)在70-73攝氏度條件下對包裝材料內外表面作用7.4s，從而實現對包裝材料的殺菌。為了驗證bh7500系列無菌灌裝機的無菌室和包裝材料內外的殺菌效果，本項目將對其無菌灌裝系統(tǒng)的殺菌效果和無菌室無菌狀態(tài)的維持進行評估。本驗證工作會分為以下4個方面進行。一、貼鋼片實驗：貼鋼片實驗是為了驗證雙氧水和熱的無菌空氣混合物對其無菌室的殺菌效果。貼鋼片實驗會選擇含有10^7cfubacillussubtilisatcc9372芽孢的鋼片進行測試。studymatrix如下：接種微生物：bacillussubtilisatcc9372濃度條件：10^7cfu/鋼片批次：1(建議3個不同批次)鋼片數量：陽性對照/濃度；5個(共10個)陰性對照/濃度；5個(共10個)貼鋼片數量：21個鋼片/濃度(至少42個)1、實驗前材料的準備：1.1、細菌懸濁液，濃度為10^9cfu/ml；1.2、鋼片要與灌裝機無菌室材料、粗糙度相同。規(guī)格為長×寬×厚＝50×20×3mm。接種位置將會位于鋼片一端，所有接種的位置將會用記號筆標記。1.3、pca培養(yǎng)基(枯草芽孢桿菌檢測瓊脂)和平皿(一次性無菌塑料平皿)1.4、移液槍(1ml，0.1ml，0.01ml)以及滅菌槍頭1.5、無菌水1.6、超聲波清洗器1.7、錫箔紙1.8、不銹鋼托盤1.9、0.45μmmillipore細菌過濾膜和膜過濾系統(tǒng)1.10、雙面膠帶以及其它微生物實驗室儀器耗材等2、污染控制：凡是接觸或可能接觸過菌種的地方都要進行消毒或者相對應的處理。3、鋼片接種：3.1、鋼片用錫紙包裹，與培養(yǎng)基、無菌水、托盤等一起殺菌，待用；3.2、接種前，利用渦旋震湯器把菌種的懸濁液混勻。用無菌水制成規(guī)定濃度的細菌溶液備用；3.3、10^7接種：接種0.1ml1×10^9cfu/ml菌懸液至滅菌鋼片上(此時菌種濃度為1×10^8)。干燥期間細菌數量可能減少一個數量級，最終接種量會依照預實驗情況，進行接種；3.4、接種完畢之后，用滅菌的不銹鋼托盤，墊一層滅菌的錫箔紙，把鋼片接種面向上，整齊排列在錫箔紙覆蓋的托盤之上，放置完畢之后，再用一層錫箔紙覆蓋在托盤之上，干燥12-24小時。3.5、干燥后將鋼片放置于定做的鋼片盒中以避免交叉污染。3.6、現場驗證之前對于接種的芽孢是否達到相應的接種濃度要求隨機選擇三個鋼片進行確認(10^7cfu/鋼片)。3.7、接種鋼片為40個：其中5個作為陽性對照，后續(xù)不放入無菌室；5個利用無菌水接種，作為陰性對照。4、鋼片現場放置和取出：4.1、鋼片干燥后，由技術人員帶到現場(放在含有冰袋的采樣箱中)。接種后鋼片利用雙面膠貼到指定位置；4.2、進行現場貼鋼片實驗以前，山東碧海將其bh7500-250無菌灌裝機和其環(huán)境用過氧乙酸進行熏蒸；4.3、安置鋼片時可由三人進行操作，一人安置，其余兩人則協(xié)助鋼片安置，比如為其用酒精消毒，穿戴鞋套，遞送工具等。鋼片安置完畢之后，關閉灌裝機無菌室門。鋼片放置時間段為管封結束后。在鋼片放置的過程中避免鋼片的接種區(qū)域和任何的區(qū)域、人員等進行物理性接觸，如有接觸，此鋼片將不能用于后續(xù)測試。4.4、灌裝機升溫完成后鋼片取出時可由三人進行操作，一人取出，其余兩人則協(xié)助鋼片取出，比如為其用酒精消毒，穿戴鞋套，遞送工具等。鋼片背部以及邊緣，需使用酒精等進行消毒，但是酒精絕對不允許接觸鋼片正面。然后將鋼片放置于1l無菌采樣袋中。并放在含有冰袋的采樣箱中轉移至4度冰箱冷藏儲存。4.5、將陽性對照，陰性對照和現場殺菌后的樣品分別放于不同的5l的無菌采樣袋中并將其分別放置于不同的采樣箱/容器內進行存儲和運輸(整個運輸過程要保持低溫≤4度)。5、樣品測試：5.1、100ml無菌0.1％tween/0.1％蛋白胨水到放置鋼片的無菌袋。放入超聲波清洗儀超聲波作用20min。5.2、陽性對照：進行梯度稀釋，對芽孢濃度為10^7cfu/包裝材料的菌落總數進行10-2、10-3、10-4三個等級的稀釋，然后取10-2、10-3、10-4的稀釋液各0.1ml到平板上，每個稀釋度要做2個平板，用pca培養(yǎng)基在35℃條件下培養(yǎng)5天，與實驗后包裝樣品對照，出現同類枯草芽孢桿菌才算滅菌后剩余芽孢數量。5.3、陰性對照和殺菌后鋼片樣品：將放置鋼片的無菌袋加入100ml無菌0.1％tween/0.1％蛋白胨水進行清洗，劇烈震蕩1min，然后用0.45μm膜過濾，將過濾后濾膜放到pca平板35攝氏度培養(yǎng)5天。5.4、殺菌后的鋼片對應平板如果有枯草芽孢桿菌類菌落生長，對菌落進行鑒定。6、限值和計算方法：本項目可接受的殺菌效果最低為平均大于7log。計算方法為：r＝log(c0)-log(ct)r＝枯草芽孢桿菌芽孢log降低c0＝起始枯草芽孢桿菌芽孢的平均含量ct＝殺菌后枯草芽孢桿菌的平均含量二、包裝材料外表面挑戰(zhàn)性實驗：包裝材料外表面挑戰(zhàn)性實驗是為了驗證bh7500系列無菌灌裝機對于包裝材料外表面的殺菌效果，實驗的步驟如下：接種微生物：bacillussubtilisatcc9372濃度：10^7cfu/包裝材料批次：1(建議3個不同批次)樣品數量：陽性對照/濃度：5個(共10個)陰性性對照/濃度：5個(共10個)測試數量：100個包裝樣品/濃度(共200個)1、實驗前材料的準備：1.1、細菌懸濁液：濃度為10^9cfu/ml。1.2、包裝材料600個。1.3、pca培養(yǎng)基(枯草芽孢桿菌檢測瓊脂)和平皿(一次性無菌塑料平皿)。1.4、移液槍(1ml，0.1ml，0.01ml)以及滅過菌槍頭。1.5、無菌水。1.6、超聲波清洗器。1.7、0.45μmmillipore細菌過濾膜和膜過濾系統(tǒng)。1.8、其它微生物實驗室儀器耗材等。2、污染控制：凡是接觸或可能接觸過菌種的地方都要進行消毒或者相對應的處理。3、包裝材料接種：3.1、接種前，利用渦旋震湯器把菌種的懸濁液混勻。用無菌水制成規(guī)定濃度的細菌溶液備用。3.2、10^7接種：從1×10^9cfu/ml菌懸液吸1ml到9ml試管，稀釋成1×10^8的菌懸液，然后接種0.1ml稀釋后的菌懸液到包裝表面3×5cm范圍。干燥12-24h。共需接種200個樣品。干燥期間細菌數量可能減少一個數量級，最終接種量會依照預實驗情況，進行接種；4、包裝材料菌濃的測定和運輸：4.1、包裝材料接種干燥后，將包裝材料卷起。選擇5個樣品在進行現場驗證前進行接種濃度測定。4.2、測定濃度達到接種要求后，將包裝材料利用無菌錫箔紙進行包裝，包裝材料殺菌驗證以前低溫4攝氏度冷藏保存。5、現場驗證：5.1、在試驗前要對試驗空間用過氧乙酸熏蒸。包裝材料可能接觸到的區(qū)域進行三次以上徹底的酒精殺菌消毒，防止交叉污染。灌裝機升到管封步驟后,把接種的包裝材料接到沒有接種的包裝材料上，拼接包裝材料過程中要避免接觸接種區(qū)域，拼接區(qū)域進行三次以上殺菌消毒，防止交叉污染。然后灌裝機升溫滅菌，升溫結束后按照7.4s生產速度使接種包裝材料通過雙氧水槽進行滅菌，雙氧水濃度為35％，溫度為70攝氏度。5.2利用5l無菌袋在灌裝機排包口處收集殺菌后包裝樣品(包裝材料不完成灌裝)。樣品包裝取出時可由四人進行操作，兩人取出，其余兩人則協(xié)助樣品取出，比如為其用酒精消毒，穿戴鞋套，遞送工具等。收集200個樣品，最后將其分別放置于無菌采樣袋中。最后選擇100個含有接種的樣品進行測試。5.3、樣品收集完后完成編號并立即裝箱運到冷庫并進行低溫存儲(小于等于4攝氏度)。6、樣品測試：6.1、利用無菌剪刀將包裝正面剪下來，轉入新的無菌袋；6.2、陽性對照：進行梯度稀釋，對芽孢濃度為10^7cfu/包裝材料的菌落總數進行10-2、10-3、10-4三個等級的稀釋，然后取10-2、10-3、10-4的稀釋液各0.1ml到平板上，每個稀釋度要做2個平板，用pca培養(yǎng)基在35℃條件下培養(yǎng)5天，與實驗后包裝樣品對照，出現同類枯草芽孢桿菌才算滅菌后剩余芽孢數量；6.3、陰性對照和殺菌后鋼片樣品：將放置鋼片的無菌袋加入100ml無菌0.1％tween/0.1％蛋白胨水進行清洗，劇烈震蕩1min，然后用0.45μm膜過濾，將過濾后濾膜放到pca平板35攝氏度培養(yǎng)5天。6.4、殺菌后或者陰性對照的包裝材料對應平板如果有枯草芽孢桿菌類菌落生長，對菌落進行鑒定。7、限值和計算方法：本項目可接受的殺菌效果最低為平均大于7log的降低。計算方法為：r＝log(c0)-log(ct)r＝枯草芽孢桿菌芽孢log平均降低c0＝起始枯草芽孢桿菌芽孢的平均含量ct＝殺菌后枯草芽孢桿菌的平均含量三、包裝材料內表面挑戰(zhàn)性實驗：包裝材料內表面實驗挑戰(zhàn)性實驗是為了驗證bh7500系列無菌灌裝機對于包裝材料內表面(食品直接接觸側的)殺菌效果，實驗的步驟如下：接種微生物：bacillussubtilisatcc9372。濃度：10^7cfu/包裝材料。批次：1樣品數量：陽性對照/濃度：5個(共10個)。陰性對照/濃度：5個(共10個)。測試包裝數量：100個內包裝樣品/濃度(共300個)。1、實驗前材料的準備：1.1、細菌懸濁液。濃度為10^9cfu/ml。1.2、包裝材料600個。1.3、pca培養(yǎng)基(枯草芽孢桿菌檢測瓊脂)和平皿(一次性無菌塑料平皿)。1.4、移液槍(1ml，0.1ml，0.01ml)以及滅過菌槍頭。1.5、無菌水1.6、超聲波清洗器.1.7、0.45μmmillipore細菌過濾膜和膜過濾系統(tǒng)1.8、其它微生物實驗室儀器耗材等2、污染控制：凡是接觸或可能接觸過菌種的地方都要進行消毒或者相對應的處理。3、包裝材料接種：3.1、接種前，利用渦旋震湯器把菌種的懸濁液混勻。用無菌水制成規(guī)定濃度的細菌溶液備用；3.2、10^7接種：從1×10^9cfu/ml菌懸液吸取0.1ml的菌懸液到包裝表面3×5cm范圍。干燥12-24h。共需接種200個樣品。干燥期間細菌數量可能減少一個數量級，最終接種量會依照預實驗情況，進行接種。4、包裝材料菌濃的測定：4.1、包裝材料接種干燥后，將包裝材料卷起并進行標記。選擇5個樣品在進行現場驗證前進行菌濃度測定.4.2、測定濃度達到接種要求后，將包裝材料利用無菌錫箔紙進行包裝，包裝材料殺菌驗證以前低溫4攝氏度冷藏保存。5、現場驗證：5.1、在試驗前要對試驗空間用過氧乙酸熏蒸。包裝材料可能接觸到的區(qū)域進行三次以上徹底的酒精殺菌消毒，防止交叉污染。灌裝機升到管封步驟后,把接種的包裝材料接到沒有接種的包裝材料上，拼接包裝材料過程中要避免接觸接種區(qū)域，拼接區(qū)域進行三次以上殺菌消毒，防止交叉污染。然后灌裝機升溫滅菌，升溫結束后按照7.4s生產速度使接種包裝材料通過雙氧水槽進行滅菌，雙氧水濃度為35％，溫度為70攝氏度。5.2、利用5l無菌袋在灌裝機排包口處收集殺菌后包裝樣品(包裝材料不完成灌裝)。樣品包裝取出時可由四人進行操作，兩人取出，其余兩人則協(xié)助樣品取出，比如為其用酒精消毒，穿戴鞋套，遞送工具等。收集200個樣品，最后將其分別放置于無菌采樣袋中。最后選擇100個含有接種的樣品進行測試。5.3、樣品收集完后完成編號并立即裝箱運到冷庫并進行低溫存儲(小于等于4攝氏度)；6、樣品測試：6.1、利用無菌剪刀將包裝正面剪下來，轉入新的無菌袋；6.2、陽性對照：進行梯度稀釋，取0.1ml/10-2-10-4(10^7cfu/包裝材料)的稀釋液pca平板在35攝氏度條件下培養(yǎng)5天。6.3、陰性對照和殺菌后鋼片樣品：將放置鋼片的無菌袋加入100ml無菌0.1％tween/0.1％蛋白胨水進行清洗，劇烈震蕩1min，然后用0.45μm膜過濾，將過濾后濾膜放到pca平板35攝氏度培養(yǎng)5天。6.4、殺菌后或者陰性對照的包裝材料對應平板如果有枯草芽孢桿菌類菌落生長，對其菌落進行鑒定。7、限值和計算方法：本項目可接受的殺菌效果最低為平均大于7log。計算方法為：r＝log(c0)-log(ct)r＝枯草芽孢桿菌芽孢log平均降低c0＝起始枯草芽孢桿菌芽孢的平均含量ct＝殺菌后枯草芽孢桿菌的平均含量四、無菌室空氣沉降測試：本實驗是為了驗證bh7500系列無菌灌裝系統(tǒng)無菌室在灌裝的過程中是否能夠維持無菌環(huán)境，實驗的步驟如下：測試微生物：apc、yeast和mold。測試方式：空氣沉降菌。批次：3樣品數量：apc：5個/次(共15個)。酵母菌和霉菌：5/次(共15個)。陰性對照：apc：5個/次(共15個)。酵母菌和霉菌：5/次(共15個)。1、實驗前材料的準備：1.1、pca培養(yǎng)基(tpc)和平皿(玻璃平皿)1.2、sda培養(yǎng)基(霉菌和酵母菌)和平皿(玻璃平皿)1.3、無菌水1.4、其它微生物實驗室儀器耗材等2、污染控制：凡是接觸或可能接觸過菌種的地方都要進行消毒或者相對應的處理。3、平板的準備：3.1、按照實力可標準流程進行pca和sda的準備。所有的平板在凝固后利用封口膜對其封口，防止交叉污染。并在4攝氏度條件下保存。3.2、分別選擇細菌、霉菌和酵母菌進行對應平板的促生長實驗，驗證該培養(yǎng)基的有效性。3.3、分別隨機選擇3個pca(35攝氏度2天)和sda(25攝氏度5天)平板在相應的培養(yǎng)條件下驗證其無菌性。4、平板的運輸：當pca和sda平板通過促生長和無菌性實驗后，將其分別放入不同無菌袋中。將所有無菌袋放到含有冰袋的采樣箱中，保證整個運輸過程低溫。5、現場驗證：5.1試驗前對試驗空間與與灌裝機用過氧乙酸熏蒸。5.2灌裝機管封結束后，在上部無菌室內平臺、后無菌室內部平臺、下部無菌室平臺各放入sda和pca平板中的一種；其中pca平板接種有apc菌種，sda平板接種有yeast和mold菌種；5.3平板的放入時可由三人進行操作，一人放入，其余兩人則協(xié)助樣品放入，比如為其用酒精消毒，穿戴鞋套，遞送工具等。放入后迅速關上無菌室和