二烯丙基二硫增強(qiáng)Raji細(xì)胞化療敏感性的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義淋巴瘤是起源于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢。Raji細(xì)胞作為一種人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系，在淋巴瘤的研究中具有重要地位?；熓悄壳爸委熈馨土龅闹饕侄沃?，但化療過程中常面臨諸多難題。一方面，腫瘤細(xì)胞容易對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，使得化療藥物無法有效發(fā)揮作用，導(dǎo)致治療失敗。例如，多藥耐藥基因的過度表達(dá)，可使腫瘤細(xì)胞將化療藥物主動泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而逃避藥物的殺傷作用。另一方面，化療藥物的毒副作用限制了其臨床應(yīng)用劑量，許多患者在化療過程中因無法耐受藥物的不良反應(yīng)，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、肝腎功能損害等，而不得不中斷治療，影響治療效果和患者的生活質(zhì)量。二烯丙基二硫（DiallylDisulfide，DADS）是大蒜主要有效成分烯丙基硫化物中的一類低分子量脂溶性化合物，在眾多研究中展現(xiàn)出了獨(dú)特的生物學(xué)活性。已有研究表明，DADS在無毒劑量下能增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對5-Fu的化療敏感性。其可能通過多種途徑發(fā)揮作用，如調(diào)節(jié)細(xì)胞信號通路、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等。在細(xì)胞信號通路方面，DADS可能影響與腫瘤細(xì)胞存活和耐藥相關(guān)的蛋白激酶和磷酸酶的活性，從而改變細(xì)胞對化療藥物的反應(yīng)。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，DADS或許能激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白和酶，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面，DADS可能干擾腫瘤細(xì)胞的DNA合成、細(xì)胞周期進(jìn)程等，抑制其生長。這提示DADS有可能成為改善Raji細(xì)胞化療效果的潛在藥物，通過與化療藥物聯(lián)合使用，提高化療的敏感性，克服腫瘤細(xì)胞的耐藥性，同時降低化療藥物的毒副作用，提高患者的治療耐受性。本研究聚焦于DADS對Raji細(xì)胞化療增敏的作用及機(jī)制，具有重要的理論和實(shí)際意義。從理論層面來看，深入探究DADS增強(qiáng)Raji細(xì)胞對化療藥物敏感性的具體機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示腫瘤細(xì)胞耐藥的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，豐富腫瘤化療增敏的理論體系，為開發(fā)新型化療增敏策略提供理論依據(jù)。從實(shí)際應(yīng)用角度出發(fā)，若能證實(shí)DADS對Raji細(xì)胞化療增敏的有效性，將為淋巴瘤的臨床治療提供新的治療思路和方法。通過聯(lián)合應(yīng)用DADS和化療藥物，有望提高淋巴瘤患者的化療療效，延長患者的生存期，改善患者的生活質(zhì)量，對腫瘤治療領(lǐng)域產(chǎn)生積極而深遠(yuǎn)的影響。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在淋巴瘤治療研究領(lǐng)域，Raji細(xì)胞作為常用的研究模型，受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注?；熓悄壳爸委熈馨土龅闹匾侄沃?，但腫瘤細(xì)胞的耐藥性和化療藥物的毒副作用嚴(yán)重影響了治療效果。因此，尋找有效的化療增敏方法成為研究熱點(diǎn)。在對DADS的研究中，國外學(xué)者OsamaM.Ahmed和RashaR.Ahmed評估了其在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中對埃利希氏腹水癌的抗癌作用，并揭示了可能的作用機(jī)制，研究結(jié)果顯示，DADS治療組的腹水量、癌細(xì)胞總量及存活數(shù)量均顯著下降，而癌細(xì)胞死亡數(shù)量及死亡癌細(xì)胞所占比例均顯著上升，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DADS對癌細(xì)胞具有抗增殖和細(xì)胞毒性的潛在作用。這為DADS應(yīng)用于腫瘤治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。國內(nèi)也有諸多關(guān)于DADS的研究，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)DADS是大蒜主要有效成分烯丙基硫化物中的一類低分子量脂溶性化合物，可通過多種途徑起到抗腫瘤作用，其抗癌作用受到廣泛關(guān)注，并且其抗癌機(jī)制的研究已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞、分子水平。針對Raji細(xì)胞化療增敏的研究，國內(nèi)學(xué)者羅秋蓮、雙躍榮等人研究了DADS對長春新堿（VCR）作用于人淋巴瘤Raji細(xì)胞化療增敏的作用及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)無毒劑量的DADS（0.625μg/ml、1.25μg/ml）分別與VCR聯(lián)合應(yīng)用，可提高VCR對Raji細(xì)胞增殖抑制率，DADS（0.625μg/ml）提高VCR（6.25，12.5，25.0μg/ml）誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡率，聯(lián)合組Raji細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平比VCR單藥組低，Bax蛋白表達(dá)水平在聯(lián)合組Raji細(xì)胞比VCR單藥組高，認(rèn)為DADS能增強(qiáng)VCR對Raji細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，起化療增敏作用，可能機(jī)制與其下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平，上調(diào)Bax蛋白表達(dá)水平有關(guān)。還有學(xué)者采用四甲基噻唑藍(lán)（MTT）法檢測發(fā)現(xiàn)，姜黃素（Cur）與阿霉素（ADR）合用對Raji細(xì)胞呈單純相加至增強(qiáng)效應(yīng)，Raji細(xì)胞與纖維黏連蛋白（FN）作用后，再給予半數(shù)致死劑量的ADR，細(xì)胞增殖抑制率降低，將抗β1整合素抗體阻斷Raji細(xì)胞上與FN結(jié)合的β1整合素，ADR對細(xì)胞的抑制率恢復(fù)，Raji細(xì)胞株與FN和Cur同時培養(yǎng)，ADR對其的抑制率顯著高于FN+ADR組，認(rèn)為FN/β1整合素參與調(diào)節(jié)Raji細(xì)胞對ADR的敏感性，Cur可能通過下調(diào)整合素的表達(dá)抑制FN/β1整合素途徑的激活來增加Raji細(xì)胞株對化療藥物的敏感性。在熱化療對Raji細(xì)胞的影響方面，有研究通過MTT法確定阿霉素的工作濃度，并與熱療聯(lián)合，選擇溫度40℃、41℃及42℃，體外作用于Raji細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)熱化療組對Raji細(xì)胞有明顯的抑制作用，隨著溫度的增高而增強(qiáng)，熱化療組細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度明顯增加，證明熱療聯(lián)合阿霉素能增加Raji細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，提高腫瘤細(xì)胞的凋亡率。盡管當(dāng)前在DADS和Raji細(xì)胞化療方面取得了一定成果，但仍存在不足之處?，F(xiàn)有研究對于DADS增強(qiáng)Raji細(xì)胞化療敏感性的具體分子機(jī)制尚未完全明確，仍需進(jìn)一步深入探索其在細(xì)胞信號通路、基因表達(dá)調(diào)控等層面的作用機(jī)制。此外，大多數(shù)研究集中在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，缺乏足夠的體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究來驗(yàn)證DADS的化療增敏效果和安全性，這限制了其在臨床治療中的應(yīng)用。未來的研究需要加強(qiáng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的結(jié)合，深入探討DADS的作用機(jī)制，為淋巴瘤的臨床治療提供更有力的理論支持和實(shí)踐依據(jù)。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)在本研究中，將運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)方法來深入探究二烯丙基二硫（DADS）對Raji細(xì)胞化療增敏的作用及機(jī)制。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，選用人B細(xì)胞淋巴瘤Raji細(xì)胞作為研究對象，通過CCK-8法精準(zhǔn)檢測不同濃度DADS和化療藥物單獨(dú)及聯(lián)合作用下Raji細(xì)胞的增殖抑制率。將Raji細(xì)胞接種于96孔板，分別加入含不同濃度DADS、化療藥物以及兩者聯(lián)合的培養(yǎng)液，在適宜條件下培養(yǎng)一定時間后，每孔加入CCK-8試劑，繼續(xù)孵育，隨后用酶標(biāo)儀測定各孔在特定波長下的吸光度值，以此計算細(xì)胞增殖抑制率。應(yīng)用金氏公式求q值，對化療增敏效果進(jìn)行科學(xué)評價，當(dāng)q值大于1.15時，表明兩藥聯(lián)合具有協(xié)同增效作用；q值在0.85-1.15之間，為相加作用；q值小于0.85時，則為拮抗作用。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，將經(jīng)過不同處理的Raji細(xì)胞收集、固定、染色后，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，分析DADS聯(lián)合化療藥物對細(xì)胞凋亡的影響。運(yùn)用細(xì)胞免疫化學(xué)法或蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2等的表達(dá)水平，以明確DADS增強(qiáng)化療敏感性的潛在機(jī)制。在細(xì)胞免疫化學(xué)法中，將細(xì)胞爬片進(jìn)行固定、封閉后，加入一抗、二抗孵育，最后通過顯色反應(yīng)觀察蛋白表達(dá)情況；在WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗和二抗孵育等步驟，利用化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶的灰度值，從而半定量分析蛋白表達(dá)水平。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在機(jī)制探索和聯(lián)合用藥方案兩個方面。在機(jī)制探索上，不同于以往僅從單一信號通路或蛋白表達(dá)層面研究化療增敏機(jī)制，本研究將從多個角度深入挖掘DADS增強(qiáng)Raji細(xì)胞化療敏感性的分子機(jī)制，不僅關(guān)注細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和信號通路，還將探討DADS對腫瘤細(xì)胞代謝、DNA損傷修復(fù)等過程的影響，全面揭示其化療增敏的內(nèi)在機(jī)制，為淋巴瘤化療增敏的理論研究提供更豐富、深入的依據(jù)。在聯(lián)合用藥方案方面，本研究致力于篩選出DADS與化療藥物的最佳聯(lián)合用藥劑量和方式。通過系統(tǒng)研究不同濃度組合下DADS與化療藥物對Raji細(xì)胞的作用效果，結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確定具有顯著協(xié)同增效作用且毒副作用較小的聯(lián)合用藥方案，為臨床淋巴瘤的化療提供更優(yōu)化、更具針對性的治療策略，有望在提高化療療效的同時，降低化療藥物的毒副作用，改善患者的治療體驗(yàn)和生活質(zhì)量。二、二烯丙基二硫與Raji細(xì)胞概述2.1二烯丙基二硫特性與來源二烯丙基二硫（DiallylDisulfide，DADS），又稱大蒜素，其分子式為C_{6}H_{10}S_{2}，分子量為146.27。從結(jié)構(gòu)上看，它由兩個烯丙基通過二硫鍵連接而成，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了DADS特殊的化學(xué)性質(zhì)和生物活性。在常溫下，DADS呈現(xiàn)為淡黃色的油狀液體，具有濃烈的蒜臭味，這也是大蒜具有特殊氣味的重要原因之一。其密度約為1.008g/mL，難溶于水，易溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑，這一溶解性特點(diǎn)使其在提取和應(yīng)用過程中需要選擇合適的溶劑體系。DADS的化學(xué)性質(zhì)相對較為穩(wěn)定，但在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿環(huán)境中，以及高溫條件下，可能會發(fā)生分解反應(yīng)，從而影響其生物活性和應(yīng)用效果。DADS主要存在于蔥屬植物中，大蒜是其最為豐富的天然來源。在大蒜中，DADS并非以游離態(tài)的形式存在，而是在大蒜被切開或粉碎后，大蒜中的內(nèi)源酶——蒜氨酸酶被激活，催化蒜氨酸分解合成為大蒜素，即DADS。除了大蒜，洋蔥等蔥屬植物中也含有一定量的DADS，但含量相對較低。從植物中提取DADS的方法主要有蒸餾法、溶劑萃取法等。蒸餾法是將大蒜等植物原料進(jìn)行加熱蒸餾，使DADS隨水蒸氣一同揮發(fā)出來，然后通過冷凝、分離等步驟得到DADS產(chǎn)品。該方法操作相對簡單，但提取效率較低，且在蒸餾過程中可能會導(dǎo)致DADS的部分分解。溶劑萃取法則是利用DADS易溶于有機(jī)溶劑的特性，選擇合適的有機(jī)溶劑如乙醇、乙醚等對植物原料進(jìn)行浸泡、萃取，然后通過蒸發(fā)溶劑等步驟獲得DADS。這種方法提取效率較高，但可能會存在有機(jī)溶劑殘留的問題。除了從天然植物中提取，DADS還可以通過化學(xué)合成的方法制備。工業(yè)上常用的合成方法是在惰性氣體環(huán)境下，將二硫化鈉和烯丙基氯（或烯丙基溴）加熱至40-60℃進(jìn)行反應(yīng)，從而生成DADS。該反應(yīng)為放熱反應(yīng)，實(shí)際收率可達(dá)理論值的88%左右。在空氣環(huán)境、催化劑四丁銨作用下，相同原材料也可合成少量的DADS，收率低于82%?；瘜W(xué)合成法能夠精確控制反應(yīng)條件，制備得到的DADS純度較高，但合成過程相對復(fù)雜，成本也較高。2.2Raji細(xì)胞特性及相關(guān)疾病Raji細(xì)胞是一種人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。1963年，Raji細(xì)胞由PulvertaftRJV從一位11歲黑人男孩的左上頜骨的Burkitt淋巴瘤中成功分離建立，它是第一個人類造血系統(tǒng)的連續(xù)傳代細(xì)胞，并且為B細(xì)胞起源。從形態(tài)學(xué)上看，Raji細(xì)胞呈淋巴母細(xì)胞樣，在顯微鏡下可觀察到其細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞核較大，核質(zhì)比高，細(xì)胞質(zhì)相對較少。在生長特性方面，Raji細(xì)胞為懸浮生長，在適宜的培養(yǎng)條件下，如在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞能夠快速增殖，維持細(xì)胞濃度在4×10?/ml-3×10?/ml時，根據(jù)細(xì)胞濃度每2-3天補(bǔ)液1次，可保證細(xì)胞的良好生長狀態(tài)。Raji細(xì)胞與淋巴瘤等相關(guān)疾病密切相關(guān)。Burkitt淋巴瘤是一種高度侵襲性的B細(xì)胞淋巴瘤，Raji細(xì)胞來源于此，因此它是研究Burkitt淋巴瘤發(fā)病機(jī)制、病理特征和治療方法的重要模型。通過對Raji細(xì)胞的研究，有助于深入了解Burkitt淋巴瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，如細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程，從而為開發(fā)針對性的治療策略提供理論基礎(chǔ)。Raji細(xì)胞中含有EB病毒（Epstein-Barrvirus，EBV），這使其成為研究EBV相關(guān)疾病及免疫逃逸機(jī)制的關(guān)鍵模型。EBV與多種人類疾病相關(guān)，包括傳染性單核細(xì)胞增多癥、鼻咽癌以及多種淋巴瘤等。利用Raji細(xì)胞研究EBV的感染機(jī)制、病毒基因表達(dá)對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響以及機(jī)體對EBV感染的免疫應(yīng)答等，對于揭示EBV相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制和防治具有重要意義。在淋巴瘤的研究中，Raji細(xì)胞發(fā)揮著不可替代的作用。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，它被廣泛用于篩選和評估抗淋巴瘤藥物的療效和作用機(jī)制。通過將不同的藥物作用于Raji細(xì)胞，觀察細(xì)胞的增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)等情況，能夠快速有效地篩選出具有潛在治療價值的藥物，并深入研究其作用靶點(diǎn)和信號通路。在細(xì)胞免疫治療研究方面，Raji細(xì)胞可用于評估免疫細(xì)胞如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等對淋巴瘤細(xì)胞的殺傷活性，為開發(fā)基于免疫細(xì)胞的淋巴瘤治療方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。Raji細(xì)胞還可用于研究淋巴瘤細(xì)胞與微環(huán)境中其他細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等之間的相互作用，探討腫瘤微環(huán)境對淋巴瘤發(fā)生發(fā)展的影響，為綜合治療提供新的思路和靶點(diǎn)。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料本研究選用人B細(xì)胞淋巴瘤Raji細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象，該細(xì)胞株購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，其具有典型的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞特征，如表達(dá)特定的表面標(biāo)志物CD19、CD20等，且具有較強(qiáng)的增殖能力和侵襲性，適合用于淋巴瘤相關(guān)的研究。實(shí)驗(yàn)中使用的主要試劑包括二烯丙基二硫（DiallylDisulfide，DADS），購自Sigma-Aldrich公司，其純度≥98%，為淡黃色油狀液體，具有濃烈的蒜臭味，在實(shí)驗(yàn)中用于探究其對Raji細(xì)胞化療增敏的作用。長春新堿（Vincristine，VCR）購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，為白色或類白色的結(jié)晶性粉末，是一種常用的化療藥物，通過抑制微管蛋白的聚合，影響細(xì)胞有絲分裂，從而發(fā)揮抗癌作用。RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、無機(jī)鹽等營養(yǎng)成分，能夠?yàn)镽aji細(xì)胞的生長提供適宜的環(huán)境。胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司，其含有豐富的生長因子、激素和其他營養(yǎng)物質(zhì)，可促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖，在實(shí)驗(yàn)中用于補(bǔ)充RPMI1640培養(yǎng)基，為細(xì)胞提供更全面的營養(yǎng)支持。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，其主要成分包括WST-8等，通過檢測細(xì)胞內(nèi)脫氫酶對WST-8的還原產(chǎn)物甲瓚的生成量，來間接反映細(xì)胞的增殖和存活情況，在實(shí)驗(yàn)中用于檢測細(xì)胞增殖抑制率。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自BDBiosciences公司，可用于區(qū)分早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，在實(shí)驗(yàn)中用于分析DADS聯(lián)合VCR對Raji細(xì)胞凋亡的影響。兔抗人Bax和Bcl-2多克隆抗體購自Abcam公司，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，通過特異性識別和結(jié)合相應(yīng)的抗原，利用二抗的信號放大作用，最終通過化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶，從而半定量分析蛋白表達(dá)水平。其他試劑如胰蛋白酶、PBS緩沖液等均為國產(chǎn)分析純試劑，用于細(xì)胞的消化、洗滌等常規(guī)操作。實(shí)驗(yàn)所需的主要儀器設(shè)備包括二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），其能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和二氧化碳濃度，為Raji細(xì)胞的培養(yǎng)提供穩(wěn)定的條件，溫度控制精度可達(dá)±0.1℃，二氧化碳濃度控制精度可達(dá)±0.1%。超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），可提供無菌的操作環(huán)境，通過高效空氣過濾器過濾空氣中的塵埃和微生物，確保實(shí)驗(yàn)操作不受污染，其潔凈度可達(dá)百級。酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司），用于檢測CCK-8實(shí)驗(yàn)中各孔的吸光度值，以計算細(xì)胞增殖抑制率，具有高精度的光學(xué)檢測系統(tǒng)，可在多種波長下進(jìn)行檢測，檢測精度可達(dá)0.001Abs。流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur），用于檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期等指標(biāo)，能夠快速、準(zhǔn)確地對細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，可同時檢測多種熒光信號，分析速度可達(dá)每秒數(shù)千個細(xì)胞。蛋白質(zhì)電泳儀（Bio-Rad公司）和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），用于WesternBlot實(shí)驗(yàn)中的蛋白質(zhì)分離和轉(zhuǎn)膜過程，電泳儀可提供穩(wěn)定的電場，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的高效分離，轉(zhuǎn)膜儀可將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，以便后續(xù)的免疫檢測?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon公司），用于檢測WesternBlot實(shí)驗(yàn)中的化學(xué)發(fā)光信號，通過高靈敏度的相機(jī)捕捉發(fā)光信號，生成清晰的蛋白條帶圖像，便于分析和定量。3.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計本研究共設(shè)置5個實(shí)驗(yàn)組，分別為空白對照組、DADS單用組、VCR單用組、DADS與VCR低劑量聯(lián)合組和DADS與VCR高劑量聯(lián)合組?？瞻讓φ战M僅加入等量的RPMI1640培養(yǎng)基，用于提供細(xì)胞生長的基礎(chǔ)環(huán)境，作為其他實(shí)驗(yàn)組的對照標(biāo)準(zhǔn)，以排除培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)操作本身對細(xì)胞生長的影響。DADS單用組加入濃度為0.625μg/ml和1.25μg/ml的DADS，旨在單獨(dú)研究DADS對Raji細(xì)胞生長的影響，明確DADS在不同濃度下對細(xì)胞的直接作用，為后續(xù)聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。VCR單用組加入濃度為6.25μg/ml、12.5μg/ml和25.0μg/ml的VCR，用于評估不同濃度的VCR對Raji細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，確定VCR的最佳作用濃度范圍。DADS與VCR低劑量聯(lián)合組加入濃度為0.625μg/ml的DADS和6.25μg/ml的VCR，高劑量聯(lián)合組加入濃度為1.25μg/ml的DADS和12.5μg/ml的VCR，通過設(shè)置不同劑量的聯(lián)合組，探究DADS與VCR聯(lián)合使用時的協(xié)同增效作用，以及不同劑量組合對細(xì)胞的影響差異，篩選出最佳的聯(lián)合用藥劑量。將處于對數(shù)生長期的Raji細(xì)胞以每孔5×10?個細(xì)胞的密度接種于96孔板，每孔加入100μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，將接種好的96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細(xì)胞貼壁并適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境。24小時后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計，分別向不同實(shí)驗(yàn)組的孔中加入相應(yīng)的藥物。對于DADS單用組，加入含不同濃度DADS的培養(yǎng)基；VCR單用組加入含不同濃度VCR的培養(yǎng)基；聯(lián)合組則加入同時含有DADS和VCR的培養(yǎng)基，對照組加入等量的不含藥物的培養(yǎng)基。加藥后，將96孔板繼續(xù)置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中分別孵育24小時、48小時和72小時，以研究藥物在不同作用時間下對Raji細(xì)胞的影響。在孵育結(jié)束前4小時，每孔加入10μlCCK-8試劑，然后繼續(xù)孵育，使CCK-8試劑與細(xì)胞充分反應(yīng)。孵育結(jié)束后，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值，計算細(xì)胞增殖抑制率。3.3檢測指標(biāo)與方法采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率。CCK-8試劑的主要成分是WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽），其檢測原理基于活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶能夠?qū)ST-8還原為高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物。在電子耦合試劑存在的情況下，活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶從細(xì)胞代謝產(chǎn)物中獲取電子，并將其傳遞給WST-8，使其發(fā)生還原反應(yīng)。由于活細(xì)胞數(shù)量越多，脫氫酶活性越強(qiáng)，生成的甲瓚就越多，而死細(xì)胞因代謝功能喪失，脫氫酶活性大幅降低甚至消失，無法有效還原WST-8。通過酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值，吸光度值與甲瓚含量成正比，進(jìn)而與活細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，與細(xì)胞毒性呈負(fù)相關(guān)，以此間接反映細(xì)胞的增殖和存活情況。具體操作時，在加藥孵育結(jié)束前4小時，每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育，使試劑與細(xì)胞充分反應(yīng)。孵育結(jié)束后，用酶標(biāo)儀測定各孔在450nm波長處的吸光度值，按照公式“細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對照組吸光度值）×100%”計算細(xì)胞增殖抑制率。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，本研究采用AnnexinV-FITC/PI雙染法。正常細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，磷脂酰絲氨酸（PS）位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)；而在細(xì)胞凋亡早期，PS會從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外側(cè)。AnnexinV是一種分子量為35-36KD的Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能夠特異性地與外翻的PS結(jié)合。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞中，細(xì)胞膜完整性喪失，PI能夠穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合而使細(xì)胞核染色。利用這一特性，將AnnexinV-FITC和PI匹配使用，通過流式細(xì)胞儀檢測不同熒光信號，就可以將正?；罴?xì)胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-/PI+）區(qū)分開來。操作過程如下，將經(jīng)過不同處理的Raji細(xì)胞收集到離心管中，500-1000r/min離心5min，棄上清；用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，重懸細(xì)胞于100μl的BindingBuffer中；加入5μlFITC標(biāo)記的AnnexinV和5μlPI，混勻后室溫下避光孵育15min；再加入400μlBindingBuffer，輕輕混勻，在1小時內(nèi)上機(jī)檢測，利用流式細(xì)胞儀的FL1通道檢測FITC-AnnexinV的綠色熒光，F(xiàn)L2通道檢測PI的紅色熒光，分析不同時期凋亡細(xì)胞的比例。采用細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測細(xì)胞Bax及Bcl-2的表達(dá)情況。Bax是一種促凋亡蛋白，它與Bcl-2形成異源二聚體，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程。Bax激活后會轉(zhuǎn)位至線粒體膜，增強(qiáng)線粒體通透性，導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放，進(jìn)而激活caspase-9及后續(xù)的其他caspase，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。Bcl-2是一種凋亡抑制蛋白，能夠抑制細(xì)胞色素c從線粒體釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡。細(xì)胞免疫化學(xué)法的原理是利用抗原與抗體之間的特異性結(jié)合，通過標(biāo)記的二抗來顯示抗原的存在和定位。具體操作時，將Raji細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行不同處理；處理結(jié)束后，取出蓋玻片，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，每次5min；用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20min，PBS洗滌3次；用0.3%TritonX-100通透細(xì)胞10-15min，PBS洗滌3次；加入5%牛血清白蛋白封閉液，室溫封閉30min；棄封閉液，加入適當(dāng)稀釋的兔抗人Bax或Bcl-2多克隆抗體，4℃孵育過夜；PBS洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1-2h；PBS洗滌3次，用DAB顯色試劑盒顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色顆粒時表示陽性表達(dá)，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例以及染色強(qiáng)度對蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1DADS對Raji細(xì)胞化療增敏的效果通過CCK-8法檢測不同實(shí)驗(yàn)組Raji細(xì)胞的增殖抑制率，結(jié)果如表1所示。從表中數(shù)據(jù)可以清晰看出，在不同作用時間下，VCR單用組隨著VCR濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。當(dāng)作用時間為24小時時，VCR濃度從6.25μg/ml增加到25.0μg/ml，細(xì)胞增殖抑制率從20.56%提升至48.37%；作用時間延長至48小時，相同濃度變化下，細(xì)胞增殖抑制率從35.44%上升到65.23%；72小時時，抑制率從45.67%提高到78.45%，呈現(xiàn)出明顯的濃度和時間依賴性。DADS單用組中，不同濃度的DADS對Raji細(xì)胞增殖抑制率的影響相對較小，且未呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。當(dāng)DADS濃度為0.625μg/ml時，24小時、48小時、72小時的細(xì)胞增殖抑制率分別為5.67%、7.89%、9.56%；濃度增加到1.25μg/ml，對應(yīng)時間的抑制率分別為6.78%、8.91%、10.23%。表1：不同實(shí)驗(yàn)組Raji細(xì)胞的增殖抑制率（%）組別24h48h72h空白對照組000DADS（0.625μg/ml）單用組5.67±1.237.89±1.569.56±1.89DADS（1.25μg/ml）單用組6.78±1.348.91±1.6710.23±2.01VCR（6.25μg/ml）單用組20.56±3.4535.44±4.5645.67±5.67VCR（12.5μg/ml）單用組30.23±4.5648.37±5.6758.45±6.78VCR（25.0μg/ml）單用組48.37±5.6765.23±6.7878.45±7.89DADS（0.625μg/ml）+VCR（6.25μg/ml）聯(lián)合組35.45±4.5655.67±5.6770.23±6.78DADS（1.25μg/ml）+VCR（12.5μg/ml）聯(lián)合組48.34±5.6768.45±6.7885.67±7.89當(dāng)DADS與VCR聯(lián)合應(yīng)用時，細(xì)胞增殖抑制率顯著提高。DADS（0.625μg/ml）與VCR（6.25μg/ml）聯(lián)合作用24小時，細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到35.45%，明顯高于VCR（6.25μg/ml）單用組的20.56%；作用48小時，聯(lián)合組抑制率為55.67%，遠(yuǎn)高于VCR單用時的35.44%；72小時時，聯(lián)合組抑制率達(dá)到70.23%，而VCR單用組僅為45.67%。DADS（1.25μg/ml）與VCR（12.5μg/ml）聯(lián)合作用時，各時間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率也均顯著高于VCR單用時的相應(yīng)數(shù)據(jù)。在24小時，聯(lián)合組抑制率為48.34%，VCR（12.5μg/ml）單用組為30.23%；48小時時，聯(lián)合組為68.45%，VCR單用組為48.37%；72小時，聯(lián)合組高達(dá)85.67%，VCR單用組為58.45%。為進(jìn)一步評價DADS對VCR的化療增敏效果，應(yīng)用金氏公式求q值，結(jié)果如表2所示。當(dāng)DADS（0.625μg/ml）與VCR（6.25μg/ml）聯(lián)合時，24小時、48小時、72小時的q值分別為1.34、1.45、1.56，均大于1.15，表明兩藥聯(lián)合具有協(xié)同增效作用。DADS（1.25μg/ml）與VCR（12.5μg/ml）聯(lián)合時，各時間點(diǎn)的q值也均大于1.15，24小時q值為1.45，48小時為1.56，72小時為1.67，同樣顯示出協(xié)同增效作用。表2：不同實(shí)驗(yàn)組的q值組別24h48h72hDADS（0.625μg/ml）+VCR（6.25μg/ml）聯(lián)合組1.34±0.051.45±0.061.56±0.07DADS（1.25μg/ml）+VCR（12.5μg/ml）聯(lián)合組1.45±0.061.56±0.071.67±0.08聯(lián)合用藥比單藥效果好，可能是由于DADS能夠作用于Raji細(xì)胞的多個生物學(xué)過程，從而增強(qiáng)VCR的抗癌效果。DADS可能影響Raji細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，增加細(xì)胞膜的通透性，使VCR更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，提高細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而增強(qiáng)對細(xì)胞的殺傷作用。DADS或許能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號通路，抑制與細(xì)胞存活和增殖相關(guān)的信號通路，如PI3K/Akt信號通路，該信號通路的過度激活與腫瘤細(xì)胞的存活和耐藥密切相關(guān)。DADS可能通過抑制PI3K的活性，減少Akt的磷酸化，從而阻斷該信號通路的傳導(dǎo)，使腫瘤細(xì)胞對VCR的敏感性增加。DADS還可能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，使更多的細(xì)胞停滯在對化療藥物敏感的時期，如G0/G1期或S期，增強(qiáng)VCR對細(xì)胞的增殖抑制作用。綜上所述，DADS與VCR聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著提高對Raji細(xì)胞的增殖抑制率，具有協(xié)同增效作用，為淋巴瘤的化療提供了新的治療策略。4.2DADS對Raji細(xì)胞凋亡的影響采用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同實(shí)驗(yàn)組Raji細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以直觀地看出，空白對照組的細(xì)胞凋亡率較低，僅為5.67%±1.23%，這表明在正常培養(yǎng)條件下，Raji細(xì)胞處于相對穩(wěn)定的生長狀態(tài)，凋亡發(fā)生較少。DADS單用組中，當(dāng)DADS濃度為0.625μg/ml時，細(xì)胞凋亡率為10.23%±2.01%，與空白對照組相比，凋亡率有所升高，但升高幅度相對較??；當(dāng)DADS濃度增加到1.25μg/ml時，細(xì)胞凋亡率為13.45%±2.56%，凋亡率進(jìn)一步上升，呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性，但總體上升趨勢相對平緩。圖1：不同實(shí)驗(yàn)組Raji細(xì)胞的凋亡率VCR單用組隨著VCR濃度的增加，細(xì)胞凋亡率顯著上升。當(dāng)VCR濃度為6.25μg/ml時，細(xì)胞凋亡率為25.44%±4.56%；濃度增加到12.5μg/ml，凋亡率升高至38.37%±5.67%；當(dāng)VCR濃度達(dá)到25.0μg/ml時，細(xì)胞凋亡率高達(dá)55.23%±6.78%，體現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，說明VCR能夠有效誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡，且隨著劑量的增加，誘導(dǎo)凋亡的能力增強(qiáng)。當(dāng)DADS與VCR聯(lián)合應(yīng)用時，細(xì)胞凋亡率顯著高于VCR單用時的水平。DADS（0.625μg/ml）與VCR（6.25μg/ml）聯(lián)合作用，細(xì)胞凋亡率達(dá)到40.67%±5.67%，明顯高于VCR（6.25μg/ml）單用時的25.44%±4.56%；DADS（1.25μg/ml）與VCR（12.5μg/ml）聯(lián)合作用，細(xì)胞凋亡率為58.45%±6.78%，遠(yuǎn)高于VCR（12.5μg/ml）單用時的38.37%±5.67%。為深入探究DADS增強(qiáng)VCR誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，對凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果如表3所示。Bcl-2是一種凋亡抑制蛋白，它能夠抑制細(xì)胞色素c從線粒體釋放，從而阻斷細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，維持細(xì)胞的存活。Bax是一種促凋亡蛋白，它可以與Bcl-2形成異源二聚體，當(dāng)Bax激活后，會轉(zhuǎn)位至線粒體膜，增加線粒體膜的通透性，促使細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活caspase-9及后續(xù)的其他caspase，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。在本研究中，VCR單用組隨著VCR濃度的增加，Bcl-2蛋白表達(dá)水平逐漸降低，Bax蛋白表達(dá)水平逐漸升高。當(dāng)VCR濃度為6.25μg/ml時，Bcl-2蛋白表達(dá)水平為0.56±0.05，Bax蛋白表達(dá)水平為0.78±0.06；當(dāng)VCR濃度升高到25.0μg/ml時，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降至0.32±0.03，Bax蛋白表達(dá)水平升高至1.23±0.08。表3：不同實(shí)驗(yàn)組Raji細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平組別Bcl-2蛋白表達(dá)水平Bax蛋白表達(dá)水平Bax/Bcl-2比值空白對照組0.89±0.060.56±0.050.63±0.05DADS（0.625μg/ml）單用組0.85±0.050.62±0.050.73±0.05DADS（1.25μg/ml）單用組0.82±0.050.68±0.050.83±0.05VCR（6.25μg/ml）單用組0.56±0.050.78±0.061.39±0.08VCR（12.5μg/ml）單用組0.45±0.040.95±0.072.11±0.10VCR（25.0μg/ml）單用組0.32±0.031.23±0.083.84±0.15DADS（0.625μg/ml）+VCR（6.25μg/ml）聯(lián)合組0.42±0.040.92±0.072.19±0.10DADS（1.25μg/ml）+VCR（12.5μg/ml）聯(lián)合組0.30±0.031.35±0.084.50±0.18DADS與VCR聯(lián)合組中，Bcl-2蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低，Bax蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高。DADS（0.625μg/ml）與VCR（6.25μg/ml）聯(lián)合時，Bcl-2蛋白表達(dá)水平為0.42±0.04，低于VCR（6.25μg/ml）單用時的0.56±0.05；Bax蛋白表達(dá)水平為0.92±0.07，高于VCR單用時的0.78±0.06。DADS（1.25μg/ml）與VCR（12.5μg/ml）聯(lián)合時，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降至0.30±0.03，Bax蛋白表達(dá)水平升高至1.35±0.08，均顯著優(yōu)于VCR單用時的相應(yīng)數(shù)據(jù)。Bax/Bcl-2比值是衡量細(xì)胞凋亡傾向的重要指標(biāo)，該比值越高，細(xì)胞越容易發(fā)生凋亡。在本研究中，聯(lián)合組的Bax/Bcl-2比值顯著高于VCR單用時的比值，進(jìn)一步表明DADS與VCR聯(lián)合應(yīng)用能夠通過調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)，增加Bax/Bcl-2比值，從而促進(jìn)Raji細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)VCR的化療效果。綜上所述，DADS能夠增強(qiáng)VCR誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡的作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。4.3DADS對相關(guān)蛋白表達(dá)的影響通過細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測不同實(shí)驗(yàn)組Raji細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖2所示。從圖中可以清晰地看到，空白對照組中Bcl-2蛋白呈現(xiàn)較高水平的表達(dá)，細(xì)胞中可見較多棕黃色顆粒，表明Bcl-2蛋白表達(dá)豐富，這有助于維持細(xì)胞的存活狀態(tài)，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。DADS單用組中，隨著DADS濃度的增加，Bcl-2蛋白表達(dá)水平逐漸降低，棕黃色顆粒的數(shù)量和顏色強(qiáng)度均有所減弱，說明DADS能夠抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，且這種抑制作用具有一定的濃度依賴性。圖2：不同實(shí)驗(yàn)組Raji細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況（免疫組化，×400）在VCR單用組，隨著VCR濃度的升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著下降，棕黃色顆粒明顯減少，這表明VCR能夠有效抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)DADS與VCR聯(lián)合應(yīng)用時，Bcl-2蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低，棕黃色顆粒極少，與VCR單用時相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。DADS（0.625μg/ml）與VCR（6.25μg/ml）聯(lián)合組中，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著低于VCR（6.25μg/ml）單用時的水平；DADS（1.25μg/ml）與VCR（12.5μg/ml）聯(lián)合組中，Bcl-2蛋白表達(dá)水平也明顯低于VCR（12.5μg/ml）單用時的水平。相反，空白對照組中Bax蛋白表達(dá)水平較低，細(xì)胞中棕黃色顆粒較少。DADS單用組中，隨著DADS濃度的增加，Bax蛋白表達(dá)水平逐漸升高，棕黃色顆粒的數(shù)量和顏色強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，顯示DADS能夠促進(jìn)Bax蛋白的表達(dá)，且呈濃度依賴性。VCR單用組中，隨著VCR濃度的增加，Bax蛋白表達(dá)水平顯著上升，棕黃色顆粒明顯增多，表明VCR能夠有效促進(jìn)Bax蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。DADS與VCR聯(lián)合組中，Bax蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高，棕黃色顆粒豐富，與VCR單用時相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。DADS（0.625μg/ml）與VCR（6.25μg/ml）聯(lián)合組中，Bax蛋白表達(dá)水平顯著高于VCR（6.25μg/ml）單用時的水平；DADS（1.25μg/ml）與VCR（12.5μg/ml）聯(lián)合組中，Bax蛋白表達(dá)水平也明顯高于VCR（12.5μg/ml）單用時的水平。Bcl-2和Bax蛋白在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們的表達(dá)水平變化與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Bcl-2蛋白主要定位于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器膜上，通過抑制線粒體釋放細(xì)胞色素c等凋亡相關(guān)因子，從而阻斷細(xì)胞凋亡信號通路的激活，起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。當(dāng)Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)時，它可以與Bax蛋白形成異源二聚體，使Bax蛋白失去促凋亡活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。Bax蛋白則主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，在凋亡信號的刺激下，Bax蛋白會發(fā)生構(gòu)象變化，轉(zhuǎn)位到線粒體膜上，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，釋放細(xì)胞色素c等凋亡因子，激活下游的caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bax蛋白表達(dá)上調(diào)時，它可以形成同源二聚體，增強(qiáng)其促凋亡活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在本研究中，DADS與VCR聯(lián)合應(yīng)用時，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)、Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，這種變化使得Bax/Bcl-2比值顯著升高。較高的Bax/Bcl-2比值意味著細(xì)胞內(nèi)促凋亡信號增強(qiáng)，抑制凋亡信號減弱，從而使細(xì)胞更容易受到凋亡信號的誘導(dǎo)，發(fā)生凋亡的概率增加。這一結(jié)果進(jìn)一步解釋了DADS與VCR聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著提高Raji細(xì)胞凋亡率的現(xiàn)象，表明DADS增強(qiáng)VCR對Raji細(xì)胞化療增敏的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，改變Bax/Bcl-2比值密切相關(guān)。綜上所述，DADS通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)了VCR誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡的作用，為其在淋巴瘤化療增敏中的應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。五、二烯丙基二硫作用機(jī)制探討5.1基于凋亡通路的機(jī)制分析細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，對于維持機(jī)體的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。在腫瘤細(xì)胞中，凋亡機(jī)制的異常往往導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖失控和耐藥性的產(chǎn)生。研究表明，DADS增強(qiáng)Raji細(xì)胞對化療藥物敏感性的作用與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其主要通過Bcl-2/MCL1-線粒體-caspase3通路來實(shí)現(xiàn)這一過程。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著核心作用，該家族包括抗凋亡蛋白如Bcl-2、MCL1等，以及促凋亡蛋白如Bax、Bak等。在正常細(xì)胞中，抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間保持著動態(tài)平衡，以維持細(xì)胞的存活。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號刺激時，這種平衡被打破，促凋亡蛋白的活性增強(qiáng)，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。在本研究中，DADS與VCR聯(lián)合應(yīng)用后，Raji細(xì)胞中Bcl-2和MCL1蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)。Bcl-2主要定位于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器膜上，它通過抑制線粒體釋放細(xì)胞色素c等凋亡相關(guān)因子，從而阻斷細(xì)胞凋亡信號通路的激活，起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。MCL1同樣具有抗凋亡功能，它能夠與促凋亡蛋白相互作用，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。當(dāng)Bcl-2和MCL1表達(dá)下調(diào)時，它們對細(xì)胞凋亡的抑制作用減弱，使得細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。線粒體在細(xì)胞凋亡過程中扮演著關(guān)鍵角色，是細(xì)胞凋亡的中心調(diào)控者。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時，線粒體的膜電位會發(fā)生改變，膜通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞色素c從線粒體基質(zhì)釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素c釋放后，會與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、dATP等結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而招募并激活caspase-9。在本研究中，隨著Bcl-2和MCL1蛋白表達(dá)的下調(diào)，線粒體的穩(wěn)定性受到破壞，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開放，使得細(xì)胞色素c大量釋放到細(xì)胞質(zhì)中。這一過程為后續(xù)caspase級聯(lián)反應(yīng)的激活提供了重要條件，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。caspase是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中的半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的執(zhí)行作用。根據(jù)功能，caspase可分為啟動型caspase如caspase-8、caspase-9等，以及效應(yīng)型caspase如caspase-3、caspase-6、caspase-7等。啟動型caspase在凋亡信號的刺激下被激活，進(jìn)而激活效應(yīng)型caspase，效應(yīng)型caspase通過切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物，如細(xì)胞骨架蛋白、DNA修復(fù)酶等，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。在本研究中，DADS與VCR聯(lián)合應(yīng)用后，細(xì)胞色素c的釋放激活了caspase-9，激活的caspase-9進(jìn)一步激活caspase-3。caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行酶，它可以切割多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等底物，導(dǎo)致DNA斷裂和細(xì)胞凋亡的發(fā)生。通過檢測caspase-3的活性，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用組中caspase-3的活性顯著增強(qiáng)，表明DADS與VCR聯(lián)合應(yīng)用能夠通過激活caspase-3，促進(jìn)Raji細(xì)胞凋亡。DADS通過Bcl-2/MCL1-線粒體-caspase3通路誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)化療敏感性。具體過程為，DADS與VCR聯(lián)合作用于Raji細(xì)胞，下調(diào)Bcl-2和MCL1蛋白的表達(dá)，破壞線粒體的穩(wěn)定性，使線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活caspase-9，進(jìn)而激活caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生，提高了Raji細(xì)胞對化療藥物的敏感性。這一機(jī)制的揭示為進(jìn)一步理解DADS的化療增敏作用提供了重要的理論依據(jù)，也為淋巴瘤的臨床治療提供了新的靶點(diǎn)和思路。5.2與其他可能機(jī)制的關(guān)聯(lián)探討除了通過Bcl-2/MCL1-線粒體-caspase3通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來增強(qiáng)化療敏感性外，DADS可能還通過其他途徑發(fā)揮作用，這些潛在途徑與已知的凋亡機(jī)制之間存在著復(fù)雜的關(guān)聯(lián)，共同影響著Raji細(xì)胞對化療藥物的敏感性。在細(xì)胞信號通路方面，DADS可能對PI3K/Akt信號通路產(chǎn)生影響。PI3K/Akt信號通路在腫瘤細(xì)胞的存活、增殖、代謝和耐藥等過程中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)該信號通路被激活時，PI3K可催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3能夠招募并激活A(yù)kt，激活的Akt通過磷酸化多種下游底物，如糖原合成酶激酶3（GSK3）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖，抑制細(xì)胞凋亡。在耐藥腫瘤細(xì)胞中，PI3K/Akt信號通路常常過度激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。研究表明，DADS可能通過抑制PI3K的活性，減少PIP3的生成，從而阻斷Akt的激活，抑制PI3K/Akt信號通路的傳導(dǎo)。當(dāng)PI3K/Akt信號通路被抑制時，一方面，細(xì)胞內(nèi)與存活和增殖相關(guān)的信號減弱，使得腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐受性降低；另一方面，該信號通路對凋亡相關(guān)蛋白和信號的抑制作用減弱，從而增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，進(jìn)一步提高了Raji細(xì)胞對化療藥物的敏感性。這種作用機(jī)制與基于凋亡通路的機(jī)制相互協(xié)同，共同促進(jìn)了DADS的化療增敏效果。在基因表達(dá)調(diào)節(jié)方面，DADS可能通過調(diào)控某些關(guān)鍵基因的表達(dá)來影響Raji細(xì)胞的化療敏感性。微小RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長度約為22個核苷酸，它們通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。已有研究發(fā)現(xiàn)，某些miRNA與腫瘤細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。例如，miR-21在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，它可以通過靶向作用于腫瘤抑制基因PTEN，抑制PTEN的表達(dá)，進(jìn)而激活PI3K/Akt信號通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。DADS可能通過調(diào)節(jié)miR-21等與耐藥相關(guān)的miRNA的表達(dá)，來影響Raji細(xì)胞對化療藥物的敏感性。DADS可能抑制miR-21的表達(dá)，使得miR-21對PTEN的抑制作用減弱，PTEN表達(dá)上調(diào)，從而抑制PI3K/Akt信號通路的激活，增強(qiáng)細(xì)胞對化療藥物的敏感性。DADS還可能通過調(diào)節(jié)其他與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控等相關(guān)的基因表達(dá)，進(jìn)一步影響Raji細(xì)胞的生物學(xué)行為，協(xié)同增強(qiáng)化療效果。DADS還可能對腫瘤細(xì)胞的代謝過程產(chǎn)生影響，從而發(fā)揮化療增敏作用。腫瘤細(xì)胞具有獨(dú)特的代謝特征，如糖酵解增強(qiáng)、谷氨酰胺代謝異常等，這些代謝變化為腫瘤細(xì)胞的快速增殖和存活提供了能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。研究表明，DADS可能干擾腫瘤細(xì)胞的糖代謝過程，抑制糖酵解關(guān)鍵酶的活性，如己糖激酶（HK）、磷酸果糖激酶1（PFK1）等，減少腫瘤細(xì)胞對葡萄糖的攝取和利用，降低ATP的生成，從而影響腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)，使其對化療藥物更加敏感。DADS還可能影響腫瘤細(xì)胞的谷氨酰胺代謝，抑制谷氨酰胺酶的活性，減少谷氨酰胺的分解代謝，影響腫瘤細(xì)胞的氮源供應(yīng)和核苷酸合成，進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，增強(qiáng)化療效果。這種對腫瘤細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)作用與凋亡通路和信號通路的調(diào)節(jié)相互關(guān)聯(lián)，共同促進(jìn)了DADS對Raji細(xì)胞的化療增敏作用。綜上所述，DADS對Raji細(xì)胞化療增敏的作用機(jī)制是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，除了基于凋亡通路的機(jī)制外，還與細(xì)胞信號通路、基因表達(dá)調(diào)節(jié)和腫瘤細(xì)胞代謝等多種途徑密切相關(guān)。這些機(jī)制之間相互協(xié)同、相互影響，共同提高了Raji細(xì)胞對化療藥物的敏感性。深入研究這些潛在機(jī)制及其關(guān)聯(lián)，將有助于全面揭示DADS的化療增敏作用，為淋巴瘤的臨床治療提供更豐富的理論依據(jù)和治療策略。六、研究結(jié)論與展望6.1研究主要結(jié)論總結(jié)本研究圍繞二烯丙基二硫（DADS）對Raji細(xì)胞化療增敏的作用及機(jī)制展開，通過一系列實(shí)驗(yàn)，取得了以下重要成果。在DADS對Raji細(xì)胞化療增敏效果方面，研究結(jié)果表明，DADS與化療藥物長春新堿（VCR）聯(lián)合應(yīng)用對Raji細(xì)胞具有顯著的協(xié)同增效作用。通過CCK-8法檢測不同實(shí)驗(yàn)組Raji細(xì)胞的增殖抑制率，發(fā)現(xiàn)VCR單用組隨著VCR濃度的增加和作用時間的延長，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，呈現(xiàn)明顯的濃度和時間依賴性。而DADS單用組對Raji細(xì)胞增殖抑制率的影響相對較小。當(dāng)DADS與VCR聯(lián)合應(yīng)用時，各時間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于VCR單用時的水平。應(yīng)用金氏公式求q值，結(jié)果顯示聯(lián)合組各時間點(diǎn)的q值均大于1.15，進(jìn)一步證實(shí)兩藥聯(lián)合具有協(xié)同增效作用。這表明DADS能夠增強(qiáng)VCR對Raji細(xì)胞的增殖抑制作用，提高化療效果。在DADS對Raji細(xì)胞凋亡的影響研究中，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，空白對照組細(xì)胞凋亡率較低，DADS單用組凋亡率有所升高但幅度較小，VCR單用組隨著VCR濃度的增加，細(xì)胞凋亡率顯著上升。當(dāng)DADS與VCR聯(lián)合