一、制定意義及任務來源

1目的意義

目前，通過分子生物學和生物信息學相結合的方法在基因水平對種質資源生物多樣性進行鑒定

已經成為作物學領域研究熱點。2015年4月，農業(yè)部印發(fā)《農作物品種DNA身份鑒定體系構建

實施方案》中指出“現(xiàn)代種業(yè)是國家戰(zhàn)略性、基礎性核心產業(yè)，品種創(chuàng)新是現(xiàn)代種業(yè)發(fā)展的核心，

品種保護與管理是品種創(chuàng)新的必要保障。目前，生物技術的快速發(fā)展，移動互聯(lián)、大數(shù)據引發(fā)的產

業(yè)變革，為品種管理向田間表型身份鑒定與室內基因型（DNA，即脫氧核糖核酸）身份鑒定相結合

的方向發(fā)展提供了有力的技術支撐。因此構建品種DNA身份鑒定體系是加強種子管理、保障市場

公平競爭、保護農民合法權益、提升品種創(chuàng)新能力和推進種業(yè)信息化發(fā)展的需要。

分子標記鑒定是從DNA水平直接反映品種或親子間的差異，不受植物發(fā)育階段、組織器官、

季節(jié)、環(huán)境和表達等條件的限制，同時DNA標記具有數(shù)量大、多態(tài)性豐富等諸多特點，現(xiàn)已在品

種鑒定、圖譜構建、基因定位等研究中廣泛應用。分子標記技術之一SSR即簡單重復序列（Simple

SequenceRepeat）或微衛(wèi)星DNA（MicrosatelliteDNA）。它通常是指以2~5個核甘酸為單位的多次

串聯(lián)重復DNA序列，長度大多在100~200bp。SSR在基因組中分布廣泛，由于重復次數(shù)的不同而

引起不同材料間的差異，通常表現(xiàn)為共顯性。SSR兩端有一段相對保守的序列，根據保守序列設計

引物進行PCR擴增就可獲得SSR片段。由于SSR分布廣泛，具有多態(tài)性好、表現(xiàn)為共顯性、對

DNA質量要求低且用量少的諸多特點，已經廣泛應用于植物遺傳多樣性分析、雜種鑒定、指紋圖

譜構建、基因定位等方面。可以用于植物品種權的精準授權、打假與維權，為《種子法》的實施提

供了可靠的技術手段。

西番蓮（Passifloraedulis）是西番蓮科（Passifloraceae）西番蓮屬（PassifloraL.）植物，原產

于巴西南部、巴拉圭和阿根廷北部。其又名百香果、熱情果，因外形像雞蛋又名雞蛋果。中國自20

世紀80年代左右開始引種西番蓮，在我國種植已經有40多年歷史，目前西番蓮種植主要分布于

臺灣、云南、貴州、廣西、廣東和福建等省。

廣西是全國最大的百香果種植基地，據《2019年廣西壯族自治區(qū)國民經濟和社會發(fā)展統(tǒng)計公報》

百香果產量31.28萬噸，約占全國60%。主栽品種為“紫香一號”、“臺農一號”和“滿天星”（芭

樂味黃金果）。有研究表明，單一品種的廣泛應用，會導致品種的遺傳基礎狹窄、多樣性下降，進

而導致對逆境反應的遺傳脆弱性，是各種病害嚴重發(fā)生的主要原因。因此，對現(xiàn)有栽種的西番蓮進

行遺傳改良非常必要。

植物種質資源是植物遺傳研究和新品種培育的重要物質基礎。利用分子標記技術對西番蓮品種

進行遺傳多樣性分析，從而方便種質資源的深入評價、研究和利用。我國已出臺了一系列主要農作

物品種的SSR分子標記鑒定行業(yè)標準和地方標準，而目前尚無利用SSR標記技術鑒定百香果品種

真?zhèn)蔚姆椒藴?。制定相應的廣西地方標準，規(guī)范利用SSR標記技術鑒定百香果品種真實性，對

品種管理、質量監(jiān)控等方面具有重要意義，且對雜種優(yōu)勢群的劃分、種質創(chuàng)新及新品種的選育等具

有指導意義。

2任務來源

2018年由廣西檢驗檢疫標準化技術委員會提出的《百香果品種鑒定技術規(guī)程SSR分子標記法》

的制定計劃，2018年廣西壯族自治區(qū)質量技術監(jiān)督局在關于下達《2018年第一批廣西地方標準制

定項目計劃的通知》附件文中批準將其列入2018年第一批廣西地方標準制定項目計劃（序號：

2018-0113），由廣西益譜檢測技術有限公司、廣西出入境檢驗檢疫局技術中心、南寧維爾凱生物科

技有限公司主要負責起草該地方標準的制定任務。

二、工作概述

1國內外相關研究

西番蓮為西番蓮科西番蓮多年生藤本植物,別名百香果、雞蛋果,亦有“熱情之果”(passion

fruit)的雅稱。西番蓮的花形奇特,色彩艷麗,極具觀賞價值.西番蓮的嫩枝、嫩葉是一道美味的蔬

菜,栽植于庭園,既可觀賞、又可食用.西番蓮的果實甜酸可口、止渴生津、風味濃郁、芳香怡人,已

知含有超過135種香味物質,是世界上已知最芳香的水果之一,有“果汁之王”的美譽。隨著人們

日益認識到西番蓮的重要價值,被譽為第三代新興果樹的西番蓮,已在我國熱帶、亞熱帶等地區(qū)形

成了一定的商業(yè)規(guī)模。隨著人們生活水平的提高，對西番蓮的消費需求日益增加，其種植面積亦快

速增長。國內外雖然對西番蓮的化學成分、藥理作用、臨床應用及離體培養(yǎng)等方面進行研究,但針

對西番蓮種質資源的研究上相對滯后,嚴重限制了西番蓮種質資源的利用和開發(fā)。利用分子標記技

術對西番蓮品種進行遺傳多樣性分析，對方便種質資源的深入評價、研究和利用尤為重要。

KhétrinSilvaMaciel等利用微衛(wèi)星標記（SSR）和簡單序列間重復序列（ISSR）對不同海拔地

區(qū)百香果的遺傳多樣性進行了評價（Geneticdiversityinpassionfruitplantsatdifferentaltitudes）。

DianaCarolinaOrtiz?AdrianaBohorquez等利用AFLP和SSR技術在DNA水平上評價毛百香

果的種內變異。從Antioquia、Boyaca、Cundinamarca、Huila和Tolima等省的哥倫比亞商業(yè)種植園

收集了大約60個標本，評價哥倫比亞商業(yè)種植園紫色西番蓮（百香果）個體遺傳變異，不同紫百

香果實材料的相似性系數(shù)在0.75~1.00之間，平均為0.96，遺傳多樣性較低（Evaluatingpurplepassion

fruit(PassifloraedulisSimsf.edulis)geneticvariabilityinindividualsfromcommercialplantationsin

Colombia）。

應東山、張如蓮等采用SSR標記對24份西番蓮材料的遺傳多樣性進行研究，從45對引物組

合中篩選出16對擴增帶清晰、重復性好的引物組合。結果表明：16對SSR引物共產生68條擴增

帶，其中58條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比率平均為85.3%,24份材料的遺傳相似系數(shù)(GS)的

范圍為0.09-1.0;UPGMA法聚類分析結果表明，24份西番蓮種質以0.45為閥值可分為7大類。SSR

標記豐富的多態(tài)性可在西番蓮分子生物學領域中廣泛應用。

吳艷艷，田青蘭等為了明確38份廣西西番蓮種質的親緣關系，利用11對完全型SSR標記2

份野生種和36份栽培種西番蓮進行遺傳多樣性分析。結果表明，11對SSR標記共檢測到37個等

位基因，每對分子標記檢測到的等位基因數(shù)為2～4個，平均數(shù)為3.37個；預期雜合度（He）為0.32～

0.76，平均數(shù)為0.53；實際雜合度（Ho）為0.00～0.46，平均數(shù)為0.34；PIC為0.26～0.70，平均數(shù)

為0.46。在遺傳相似系數(shù)為0.67處，38份西番蓮可分為8個類群，說明廣西種植的西番蓮種質遺

傳多樣性豐富。

百香果的SSR標記遺傳多樣性的相關文獻資料有：

1、KhétrinSilvaMaciel,PaulaAparecidaMunizdeLima,FernandoZanottiMadalon,atc.Genetic

diversityinpassionfruitplantsatdifferentaltitudes[J].AustralianJournalofCropScience,

2019,13(07):1083-1093.

2、Evaluatingpurplepassionfruit(PassifloraedulisSimsf.edulis)geneticvariabilityinindividuals

fromcommercialplantationsinColombia評價哥倫比亞商業(yè)種植園紫色百香果(西番蓮)個體遺傳變

異[J].GenetResourCropEvol.2012,59:1089–1099.

3、FernandoH.L.Silva,PatricioR.Munoz,ChristopherI.Vincent,atc.Generatingrelevant

informationforbreedingPassifloraedulis:geneticparametersandpopulationstructure[J].Euphytica.

SpringerScience+BusinessMediaDordrecht2015

4、HELENALVESPENHA,GUILHERMEDASILVAPEREIRA,MARIAIMACULADA

ZUCCHI,atc.Developmentofmicrosatellitemarkersinsweetpassionfruit,andidentificationoflength

andconformationpolymorphismswithinrepeatsequences(甜百香果實微衛(wèi)星標記的開發(fā)及重復序列長

度和構象多態(tài)性的鑒定)[J].PlantBreeding2013,132:731-735.

5、ZirlanePortugaldaCosta,CarladeFreitasMunhozandMariaLuciaCarneiroVieira.Reportonthe

developmentofputativefunctionalSSRandSNPmarkersinpassionfruits(西番蓮果實功能性SSR和

SNP標記的研究進展)[J].daCostaetal.BMCResNotes,2017,10:445-454

6、PaulaMauriBernardes,CatarinyFontanaNicoli,RodrigoSobreiraAlexandre.Vegetativeand

reproductiveperformanceofspeciesofthegenusPassiflora（西番蓮屬植物的營養(yǎng)和繁殖性能）[J].

ScientiaHorticulturae265(2020)109193.

7、GilmaraAlvarengaFachardoOliveiral,JulianoGomesPadua,JulianaLelesCosta.Cross-species

amplificationofmicrosatellitelocidevelopedforPassifloraedulisSims.inrelatedPassifloraSpecies西番

蓮微衛(wèi)星位點跨種擴展研究-在相近西番蓮種[J].BRAZILIANARCHIVESOFBIOLOGYAND

TECHNOLOGY,2013,56(5):785-792.

8、G.S.Pereira,E.S.Nunes,L.D.C.Laperuta,Molecularpolymorphismandlinkageanalysisinsweet

passionfruit,anoutcrossingspecies（異交品種香百香果實的分子多態(tài)性與連鎖分析.annalsofapplied

biology.2013,162:347-361.

9、應東山,張如蓮,王明,等.24份西番蓮種質SSR分子標記分析[J].熱帶農業(yè)工程.

2019,38(5):5-9.

10、吳艷艷,田青蘭,劉潔云,等.基于完全型SSR標記的西番蓮（Passifloraedulis）遺傳多樣性分

析[J].分子植物育種.2019,17(24):8178-8183.

11、吳艷艷,黃偉華,黃永才,等.栽培種西番蓮完全型SSR的高通量鑒定及標記開發(fā)[J].分子植物

育種.2018,16(20):6738-6743.

12、嚴佳文,解璞,袁啟鳳,等.紫果西番蓮基因組調查及SSR特征分析[J].分子植物育

種.2020,18(24):8171-8177.

13、吳田,謝江,藍增全.西番蓮基因組DNA的提取及ISSR-PCR的優(yōu)化[J].西南大學學報(自然科

學版).2011,33(6):25-29.

2標準起草的主要工作過程

2.1引物的來源

本技術規(guī)范編制過程中使用的31對SSR引物主要來源于廣西農科院、廣西大學等科研院所和

高校發(fā)表的文章和相關文獻。

2.2百香果品種類型的收集

本實驗收集了廣西常見的4個百香果品種，分別是原生黃果、雜交種黃金百香果、滿天星、臺

農1號，其主要來源于廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室的里建種植基地（南寧-東盟經

濟技術開發(fā)區(qū)）。

2.3技術路線與實驗

選取4個廣西區(qū)內種植的不同百香果品種。用篩選出的31對SSR引物進行PCR擴增，用聚丙

烯酰胺凝膠電泳檢測，對SSR引物的擴增穩(wěn)定性及多態(tài)性進行分析，并采用毛細管電泳對擴增產

物進行同步分析驗證。

根據峰圖簡單易讀取、多態(tài)性高、擴增穩(wěn)定性高、染色體上分布均勻的原則，確定31對核心

引物用于百香果品種鑒定。

2.4技術驗證

經廣西益譜檢測技術有限公司、廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室和南寧國拓生物科

技有限公司等三家單位，對技術規(guī)程的可操作性和檢測數(shù)據的可重現(xiàn)性進行了驗證。三家單位分別

對4個廣西區(qū)內種植的不同百香果品種，用31對SSR引物的PCR擴增產物進行聚丙烯酰胺凝膠電

泳檢測驗證，用6對SSR引物的PCR擴增產物進行毛細管電泳檢測驗證。經驗證，《百香果品種鑒

定技術規(guī)程SSR分子標記法》技術規(guī)程中的DNA提取、PCR擴增及產物檢測方法具有可操作性，

按照技術規(guī)程中的聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶明顯，清晰可辯；毛細管電泳檢測方法中擴增的PCR

產物均能獲得清晰、穩(wěn)定的主峰，且易于識別。

三、標準編制原則和標準的主要內容

1標準編制原則

規(guī)范性原則：本技術規(guī)范的制定符合法律法規(guī)，符合有關標準規(guī)范的要求，包括GB/T1.1-2020

《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》、NY/T2594《植物品種鑒定DNA

分子標記法總則》、NY/T2517-2013《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南西番蓮》、GB/T

6682《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》。

適用性原則：本規(guī)程的全部內容具有可操作性。

統(tǒng)一性原則：本規(guī)程與現(xiàn)行相關標準協(xié)調統(tǒng)一，不發(fā)生沖突。

先進性原則：本規(guī)程采用目前國內外品種鑒定領域均認可的、成熟的SSR標記技術，以非變

性聚丙烯酰胺凝膠電泳平臺為主，兼顧毛細管電泳檢測平臺的百香果品種鑒定技術，與田間小區(qū)鑒

定方法對比，該方法的先進性在于不受環(huán)境影響和季節(jié)約束，檢驗周期短。

2標準主要內容

標準編寫主要內容包括樣品處理、聚合酶鏈式反應法（PCR）、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細管

電泳操作過程以及結果判定，適用于百香果種質資源真?zhèn)蔚臋z測鑒定。

標準規(guī)程編制的過程主要進行了以下試驗和工作：

2.1原理

不同品種百香果的遺傳組成不同，其基因組（DNA）中SSR的重復次數(shù)存在差異，根據SSR的

差異，通過PCR擴增及電泳技術可以鑒定百香果品種。

2.2樣品來源

樣品采自廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室的里建種植基地（南寧-東盟經濟技術開

發(fā)區(qū)）種植的百香果嫩葉片。

2.3儀器

電子天平、高速冷凍離心機、水浴鍋、PCR擴增儀、垂直板電泳系統(tǒng)、毛細管電泳儀、膠片觀

察燈等。

2.4試劑

液氮、無水乙醇、三氯甲烷、甲醛、三羥甲基氨基甲烷、DNA分子量標準、2×TaqPlusPCR預

混試劑、40%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺溶液、氯化鈉、氫氧化鈉、硝酸銀、硼酸、過硫酸銨、十六

烷基三甲基溴化銨、乙二胺四乙酸二鈉、四甲基乙二胺、瓊脂糖、去離子甲酰胺、DNA分析儀用

丙烯酰胺膠液、DNA分析儀用LIZ500分子量內標、DNA分析儀用電泳緩沖液、DNA分析儀用光

譜校準基質。

2.5SSR引物

引物序列見表1

表1引物編號及引物擴增信息

序條帶大小引物退火溫度

引物名稱引物序列（5’-3’）

號（bp）（℃）

正向：GCATGGACTTGATTTGTATATTCT

1PeRM1000195-10750

反向：GAGAACAATGATGTCACTTTCATA

正向：TAGTGACATAACTGAAAACGCTAT

2PeRM1000598-14050

反向：GAGTTACCGCTGAAGTTTTCTA

正向：TCATTAACATCGTAAACAAAGATT

3PeRM10006149-19050

反向：AATTCGACAAGATTTACTGATACA

正向：GTAGTAGGAGAATATTTGAGGGAA

4PeRM1000795-10650

反向：CTATTTTGTGATCCAAGGAAGT

正向：GTCACTATCATCCCATAAAAATTC

5PeRM10008105-12350

反向：AGGTAAAATTAATATGATAAGCGAA

正向：GATTGATTTGTGGATGGATACT

6PeRM10009135-14550

反向：CACTTGTTTCACTCGTACAATAAT

120-130正向：ATGGAGAAGACTTCAGAGTCAC’

7PeRM1001155

109反向：AGAGATATTTTTCACTCACTGGAT

135-180正向：CTCCATATCAGATTAAGTAACCAC

8PeRM1001250

151反向：CTCAAATAAAAACAAACCTGTTAC

正向：CATTTATAAAGGAATTGACAAGAA

9PeRM10014130-14050

反向：CTGAGTTAATGCTGTGATTAAGAT

正向：AATTTTCTTGGCTTAAAACACTAC

10PeRM1001614950

反向：TTGACTTCACTGCTATGGTATTAG

正向：AAGACACTGATAGTTCTCTGAGG

11PeRM10017146-17650

反向：CAAATTATGATAAGAAACTTGGAA

正向：ACAGAAAAGAAAGATAAAGCAAAT

12PeRM10018160-17050

反向：TTCAGTATCCAACTGAACACAC

正向：TGGTAGTCAATCAGAAAACTAAGA

13PeRM10019142-15050

反向：GAGTTGTTAGGTCTCCTCAACTTA

正向：AACAGGGTATACTGTAAATCATTG

14PeRM10020132-14250

反向：GTTTATTCCTTTCTCTTCTAGTGC

正向：TGGAATGTGATTTGCATGG

15Pa_F-P10A1022050

反向：TAGGTATTGCTGGCGAAG

正向：CTTGCCTCTCTCCCTCTC

16Pa_F+R-Contig11429050

反向：GGGTTTTGGGTTTGACAG

表A.1引物編號及引物擴增信息（續(xù)）

序條帶大小引物退火溫度

引物名稱引物序列（5’-3’）

號（bp）（℃）

正向：CAGAAGGAAAACCAGCAAG

17Pa_F-Contig1329350

反向：CCCCATCATCATCACTTTC

正向：TTAATGCCACAGCCCAAC

18Pa_F-P7E10240-25550

反向：TGACCCAAAATCAAACACC

正向：TGTTCAAGCCCATCTTCG

19Pa_F+R-Contig80360-38055

反向：GCTCTCGCTCTTGTCGTAG

正向：GAATAGGGTCAGCAGGAGG

20Pa_F-P6H04280-29555

反向：GAGTGTGTCATCGGAGTCC

正向：GATCGGTCCTCGGTTAGAC

21PE222353

反向：AGTCACACAGCATGAGAAATC

正向：GCAATTTCACCATCTTCTGCT

22PE625853

反向：CCACGGTCATGGATGTTC

正向：TTGCTCATTGCACTCATCCT

23PE10145-15055

反向：GCAGACATTTCCTGGAGCA

正向：CCATAGTCCCAACAAGCATC

24PE12260-29055

反向：GCTGTGGACCCTAACTCAGTC

正向：TCAGGAAGATTGCATGTTAGT

25PE1326050

反向：CTGGGTTTTGTTTATGTTGC

正向：CCGTGAACCAACCATTTCTC

26PE15230-27053

反向：TTGCAGCACAAACAAGTCAA

正向：AGGATCACCATAGAAAACCAT

27PE16180-27053

反向：GTTAGGTTGGCATTGCTCTT

正向：GTCACTTCATTCTTCCTTTCC

28PE18210-23050

反向：TTAGCCCACTCAAACACAA

正向：CACATTTGCCGTCACTGG

29PE2725053

反向：CGGCATACGATAAATCTCCTG

正向：TCTAATGAGCGGAGGAAAGC

30PA827053

反向：CCGGATACCCACGCATTA

正向：GGGCCTTTATCCATGTTTGA

31PA9265-32053

反向：GGAAATCCGAAAACTGGTTG

表2毛細管電泳驗證所用的4個百香果品種與6對引物

序號百香果品種名稱引物名稱

1臺農1號PeRM10005

2原生黃果PeRM10007

3雜交種黃金百香果PeRM10009

4滿天星PeRM10017

5PeRM10018

6Pa_F-P7E10

2.6操作步驟

2.6.1樣品采集

用不銹鋼剪刀采集種植的已知品種的百香果嫩葉放入塑料樣品袋中，做好標識，放入0-8℃保

溫箱中，帶回實驗室，于-18℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6.2DNA的提取

取2.6.1中適量百香果葉片用自來水沖洗干凈，再用去離子水沖洗兩遍，自然晾干后用不銹鋼

剪刀剪碎放入研缽中，加入液氮研磨成粉末狀，分取100mg放入1.5mL離心管中，加入750μLCTAB

提取溶液，渦旋振蕩混勻后于65℃水浴45min~60min，期間每隔15min顛倒離心管混勻；加入500μL

的三氯甲烷，顛倒混勻，12000rpm離心3min，轉移上清液約0.5mL至新離心管中，加入等體積

（即0.5mL）預冷至約4℃的無水乙醇，顛倒混勻，-18℃冰箱下靜置1h，12000rpm離心3min，

去上清液，室溫下干燥沉淀。加入50μL無菌純水于-18℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

注：以上為推薦的DNA提取方法。其他能夠達到PCR擴增質量要求的DNA提取方法也適用于本

規(guī)程。

2.6.3PCR擴增

2.6.3.1PCR反應體系

PCR反應體系見表3。

表3PCR反應體系

試劑終濃度體積

滅菌純水-8.5μL

2×TaqTaqPlusPCR預混試劑1×12.5μL

10μmol/L正向引物0.4μmol/L1.0μL

10μmol/L反向引物0.4μmol/L1.0μL

25ng/μLDNA模板2.0ng/μL2.0μL

總體積25.0μL

2.6.3.2PCR反應程序

94℃預變性5min；94℃變性30s，退火30s（退火溫度見表1推薦引物表），72℃延伸30s，35

個循環(huán)；最后72℃下延伸7min。

2.6.4PCR產物檢測

2.6.4.1非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

2.6.4.1.1聚丙烯酰胺凝膠制備

在一對玻璃板間插入1.0mm寬的間隔片，在封口處注入1%瓊脂糖溶液，讓其凝固密封。在50mL

量杯中依次加入7.5mL5×TBE緩沖液，7.5mL40%Acryl/BisSolution(29:1)，攪拌并用純凈水定容至

30mL；加入200μL10%過硫酸銨和12μL四甲基乙二胺溶液，混勻后倒入凝膠板之間，隨即插好樣

品梳，使其在50min~60min內聚合凝固，凝膠高度應不小于10cm。

2.6.4.1.2電泳

將玻璃板固定于垂直電泳槽上，在電泳槽中加入電泳緩沖液，小心拔下樣品梳。用加樣器吸取

1μL不同引物（表1）PCR產物，加入樣品孔中，同時在同一塊膠中加入1μLDNAmarker。電泳選

用的電壓梯度為1~5V/cm，2×TaqPlus預混試劑的藍色指示帶從上到下分別到達膠板1/2、2/3處（大

約1h）后結束電泳。

2.6.4.1.3銀染顯色

將附著凝膠的玻璃板用去離子水沖洗30s~60s后，將凝膠放入方形不銹鋼盤中，加入染色液覆

蓋凝膠，輕搖5min~10min進行染色；倒掉染色液，用去離子水快速漂洗，放入顯色液中，輕搖至

顯色出清晰帶紋；取出凝膠用去離子水沖洗兩遍，瀝干后進行拍照。

2.6.4.2毛細管電泳檢測

2.6.4.2.1PCR產物樣品準備

分別取等體積的稀釋后不同引物（表2）PCR擴增產物溶液混合，從混合液中吸取1μL按序號加

入到DNA分析儀專用96孔板孔中，板中各孔分別再加入0.1μLDNALIZ500分子量內標和8.9μL去離

子甲酰胺。將樣品在PCR儀上95℃變性5min，取出，迅速置于碎冰塊上，冷卻10-15min。將整個96

孔板置于離心機中，離心10s后放置到DNA分析儀上待檢。

2.6.4.2.2電泳檢測

按照儀器操作規(guī)程，編輯樣品表及運行程序，執(zhí)行運行程序，儀器自動給出檢測結果，保存

并記錄數(shù)據。

2.7數(shù)據記錄與統(tǒng)計

樣品每個SSR位點的等位變異采用擴增片段長度的形式表示。對于非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

檢測方法，將每個擴增位點的等位變異與相應的對照品種的等位變異片段大小進行比較，確定待檢

樣品在該位點的等位變異。對于毛細管電泳檢測方法，通過使用對照品種，消除同型號不同批次間

或不同型號DNA分析儀間可能存在的系統(tǒng)誤差，使用片段分析軟件讀取待檢樣品在該位點的等位變

異。

純點結合的等位變異大小數(shù)據記為X/X，其中X為該位點等位變異的大??；雜合位點的等位變

異大小數(shù)據記錄為X/Y，其中X、Y分別為該位點上的2個等位變異的大小，小片段數(shù)據在前、大片

段數(shù)據在后。缺失位點在等位變異大小數(shù)據記錄為0/0。

示例1：樣品在某個位點上僅出現(xiàn)1個等位變異，大小為160bp，則該位點的等位變異數(shù)據記錄

為160/160。

示例2：樣品在某個位點上僅出現(xiàn)2個等位變異，大小為160bp、165bp，則該位點的等位變異數(shù)

據記錄為160/165。

2.8判定方法

當待檢樣品和對照品種間差異位點數(shù)≥2，則判定為“不同品種”；當待檢樣品和對照品種間

差異位點數(shù)=1，判定為“近似品種”；當樣品間差異位點數(shù)=0，判定為“極近似品種或相同品種”。

2.9結果與記錄

2.9.1用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細管電泳檢測，結果見附件原始記錄圖譜。

2.9.1.1廣西益譜檢測技術有限公司結果原始記錄圖譜（見附件1）

2.9.1.2廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室結果原始記錄圖譜（見附件2）

2.9.1.3南寧國拓生物科技有限公司結果原始記錄圖譜（見附件3）

四、制定標準的原則和依據，與現(xiàn)行法律、法規(guī)的關系，與有關國家標準、行業(yè)標準

的協(xié)調情況。

本標準的編制依據現(xiàn)行的法律、法規(guī)和國家強制性標準，與這些文件中的規(guī)定不存在矛盾，協(xié)

調一致。

五、重大意見分歧的處理結果和依據

無

六、提出標準強制實施或推薦實施的建議和理由

本項標準的制訂，已經實驗室的驗證，可作為推薦性地方標準，用于百香果種質資源真?zhèn)蔚臋z

測鑒定。

廣西地方標準《百香果品種鑒定技術規(guī)程SSR分子標記法》編寫組

2022.4.18

附件1：

廣西益譜檢測技術有限公司結果原始記錄及圖譜

1.非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

M123456789101112131415161718192021222324M252627282930313233343536

圖1.不同百香果品種SSR擴增產物電泳結果

備注：百香果品種順序依次為：臺農1號、原生黃果、雜交種黃金百香果、滿天星

引物名稱：1-4：PE2，5-8：PE6，9-12：PE10，13-16：PE12，17-20：PE13，21-24：

PE18，25-28：PE15，29-32：PE16，33-36：PE27。

M12345678910111213141516M17181920212223242526272829303132333435363738394041424344

圖2.不同百香果品種SSR擴增產物電泳結果

備注：百香果品種順序依次為：臺農1號、原生黃果、雜交種黃金百香果、滿天星

引物名稱：1-4：PeRM10001，5-8：PeRM10005，9-12：PeRM10006，13-16：PeRM10007，

17-20：PeRM10008，21-24：PeRM10009，25-28：PeRM10011，29-32：PeRM10012，33-36：

Pa_F+R-Contig114，37-40：Pa_F-Contig13，41-44：PeRM10014。

M1234567891011121314151617181920M21222324252627282930313233343536

圖3.不同百香果品種SSR擴增產物電泳結果

備注：百香果品種順序依次為：臺農1號、原生黃果、雜交種黃金百香果、滿天星

引物名稱：1-4：PeRM10016，5-8：PeRM10017，9-12：PeRM10018，13-16：PeRM10019，

17-20：PeRM10020，21-24：Pa_F-P10A10，25-28：Pa_F+R-Contig80，29-32：Pa_F-P6H04，

33-36：Pa_F-P7E10。

M12345678

圖4.不同百香果品種SSR擴增產物電泳結果

備注：百香果品種順序依次為：臺農1號、原生黃果、雜交種黃金百香果、滿天星

引物名稱：1-4：PA8，5-8：PA9。

2毛細管電泳圖譜

圖1臺農1號基于引物PeRM10005的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖2原生黃果基于引物PeRM10005的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖3雜交種黃金百香果基于引物PeRM10005的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖4滿天星基于引物PeRM10005的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖5臺農1號基于引物PeRM10007的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖6原生黃果基于引物PeRM10007的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖7雜交種黃金百香果基于引物PeRM10007的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖8滿天星基于引物PeRM1007的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖9臺農1號基于引物PeRM10009的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖10原生黃果基于引物PeRM10009的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖11雜交種黃金百香果基于引物PeRM10009的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖12滿天星基于引物PeRM10009的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖13臺農1號基于引物PeRM10017的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖14原生黃果基于引物PeRM10017的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖15雜交種黃金百香果基于引物PeRM10017的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖16滿天星基于引物PeRM10017的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖17臺農1號基于引物PeRM10018的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖18原生黃果基于引物PeRM10018的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖19雜交種黃金百香果基于引物PeRM10018的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖20滿天星基于引物PeRM10018的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖21臺農1號基于引物Pa_F-P7E10的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖22原生黃果基于引物Pa_F-P7E10的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖23雜交種黃金百香果基于引物Pa_F-P7E10的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖24滿天星基于引物Pa_F-P7E10的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

附件2：

廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室結果原始記錄及圖譜

1.非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

M123456789101112131415161718192021222324M252627282930313233343536

圖1.不同百香果品種SSR擴增產物電泳結果

備注：百香果品種順序依次為：臺農1號、原生黃果、雜交種黃金百香果、滿天星

引物名稱：1-4：PE2，5-8：PE6，9-12：PE10，13-16：PE12，17-20：PE13，21-24：PE18，

25-28：PE15，29-32：PE16，33-36：PE27。

M12345678910111213141516M17181920212223242526272829303132333435363738394041424344

圖2.不同百香果品種SSR擴增產物電泳結果

備注：百香果品種順序依次為：臺農1號、原生黃果、雜交種黃金百香果、滿天星

引物名稱：1-4：PeRM10001，5-8：PeRM10005，9-12：PeRM10006，13-16：PeRM10007，17-20：PeRM10008，

21-24：PeRM10009，25-28：PeRM10011，29-32：PeRM10012，33-36：Pa_F+R-Contig114，37-40：

Pa_F-Contig13，41-44：PeRM10014。

M1234567891011121314151617181920M21222324252627282930313233343536

圖3.不同百香果品種SSR擴增產物電泳結果

備注：百香果品種順序依次為：臺農1號、原生黃果、雜交種黃金百香果、滿天星

引物名稱：1-4：PeRM10016，5-8：PeRM10017，9-12：PeRM10018，13-16：PeRM10019，17-20：PeRM10020，

21-24：Pa_F-P10A10，25-28：Pa_F+R-Contig80，29-32：Pa_F-P6H04，33-36：Pa_F-P7E10。

M12345678

圖4.不同百香果品種SSR擴增產物電泳結果

備注：百香果品種順序依次為：臺農1號、原生黃果、雜交種黃金百香果、滿天星

引物名稱：1-4：PA8，5-8：PA9。

2.毛細管電泳圖譜

圖1臺農1號基于引物PeRM1005的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖2原生黃果基于引物PeRM1005的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖3雜交黃金百香果基于引物PeRM10005的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖4滿天星基于引物PeRM10005的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖5臺農1號基于引物PeRM1007的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖6原生黃果基于引物PeRM1007的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖7雜交黃金百香果基于引物PeRM10007的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖8滿天星基于引物PeRM10007的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖9臺農1號基于引物PeRM1009的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖10原生黃果基于引物PeRM1009的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖11雜交黃金百香果基于引物PeRM10009的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖12滿天星基于引物PeRM10009的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖13臺農1號基于引物PeRM10017的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖14原生黃果基于引物PeRM10017的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖15雜交黃金百香果基于引物PeRM10017的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖16滿天星基于引物PeRM10017的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖17臺農1號基于引物PeRM10018的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖18原生黃果基于引物PeRM10018的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖19雜交黃金百香果基于引物PeRM10018的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖20滿天星基于引物PeRM10018的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖21臺農1號基于引物Pa_F-P7E10的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖22原生黃果基于引物Pa_F-P7E10的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖23雜交種黃金百香果基于引物Pa_F-P7E10的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

圖24滿天星基于引物Pa_F-P7E10的擴增產物毛細管電泳檢測圖譜

附件3：

南寧國拓生物科技有限公司結果原始記錄及圖譜

1.非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

M123456789101112131415161718192021222324M252627282930313233343536

圖1.不同百香果品種SSR擴增產物電泳結果

備注：百香果品種順序依次為：臺農1號、原生黃果、雜交種黃金百香果、滿天星

引物名稱：1-4：PE2，5-8：PE6，9-12：PE10，13-16：PE12，17-20：PE13，21-24：P