第二章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)第一節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)概述第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)1Cellengineering第一節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)概述一、細(xì)胞體外生長的類型

二、細(xì)胞體外培養(yǎng)特點(diǎn)三、組織細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)四、組織細(xì)胞培養(yǎng)的缺點(diǎn)五、細(xì)胞培養(yǎng)的工作方法2Cellengineering一、細(xì)胞體外生長的類型分為貼附型與懸浮型兩種：

大多數(shù)細(xì)胞的體外生長方式采用貼附型。

瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等采用懸浮型生長方式。左031215-031124h25-1204（3）-1發(fā)現(xiàn)一種細(xì)胞切斷式起始生長

生長極為迅速x50

右對(duì)照3Cellengineering貼附型細(xì)胞也稱錨著依存性細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞在體外生長的環(huán)境不同，其貼附方式也不同。大致分為以下四種：①成纖維細(xì)胞型②上皮細(xì)胞型③游走細(xì)胞型④多形型細(xì)胞4Cellengineering①成纖維細(xì)胞型

此類型的細(xì)胞外形與體內(nèi)成纖維細(xì)胞形狀類似。細(xì)胞培養(yǎng)后形成梭形或不規(guī)則三角形，細(xì)胞核圓形位于中央，有較大的細(xì)胞間隙；細(xì)胞質(zhì)向外伸出2~3個(gè)長短不同的突起，細(xì)胞群常連接成網(wǎng)狀、放射狀等各種狀態(tài)，生長時(shí)呈放射狀、漩渦狀走向。5Cellengineering②上皮細(xì)胞型

體外生長的細(xì)胞形狀上類似于上皮細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后為扁平的不規(guī)則多角形，中央有扁圓形核，生長時(shí)彼此緊密聯(lián)結(jié)成單層細(xì)胞。起源于內(nèi)胚層和外胚層的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)可能呈現(xiàn)上皮型，如皮膚表皮、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。6Cellengineering生長特點(diǎn)：

易相連成片，緊密相連成薄層--鋪路石狀生長，呈膜狀移動(dòng)，很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)。

體外培養(yǎng)細(xì)胞類型（1）——上皮細(xì)胞型7Cellengineering③游走細(xì)胞型細(xì)胞在支持物上分散生長，從胞質(zhì)伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運(yùn)動(dòng)，速度快且運(yùn)動(dòng)方向不規(guī)則，在培養(yǎng)器皿上位置不固定，一般不連接成片。④多形型細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)形態(tài)不規(guī)則，一般分為胞體和胞突兩部分，其中胞突為細(xì)長形，類似于絲狀偽足。如神經(jīng)細(xì)胞。8Cellengineering多形型細(xì)胞9Cellengineering實(shí)際上，體外培養(yǎng)的細(xì)胞并不一定呈現(xiàn)某一種典型的形態(tài)，而呈現(xiàn)的是一些過渡形態(tài)。受到生長環(huán)境的影響。隨培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分、血清成分、溫度、pH、氣相環(huán)境等發(fā)生改變。因此，細(xì)胞形態(tài)特征只是一種參考性指標(biāo)。Hela癌細(xì)胞，是1951年從一位美國黑人婦女身上取下的宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)而成的細(xì)胞系。在過酸或過堿的環(huán)境中變成梭形，在酸堿適中時(shí)又恢復(fù)上皮細(xì)胞特征。10Cellengineering非貼附型細(xì)胞（懸浮型）

細(xì)胞懸浮生長，生存空間大，能夠大量繁殖細(xì)胞，傳代方便(只須稀釋而不須消化處理)，易于收獲細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)，易于操作控制，易于大規(guī)模生長，但不易觀察。細(xì)胞常呈球形游動(dòng)，如血液中的淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞以及某些腫瘤細(xì)胞、胚胎細(xì)胞屬于懸浮型細(xì)胞。適于進(jìn)行血液病的研究。

11Cellengineering二、細(xì)胞體外培養(yǎng)特點(diǎn)1.繁殖代數(shù)有限：與端粒結(jié)構(gòu)有關(guān)。2.貼壁依賴性：細(xì)胞需在貼附物上逐漸伸展生長，形成一定的形態(tài)。一些特殊的物質(zhì)可能參加促進(jìn)細(xì)胞附著的過程。3.密度抑制：因營養(yǎng)物質(zhì)的枯竭、代謝產(chǎn)物堆積發(fā)生生長抑制現(xiàn)象。12Cellengineering4.接觸抑制：一般正常的細(xì)胞不?；顒?dòng)或移動(dòng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)量增多，細(xì)胞間相互接觸使細(xì)胞停止運(yùn)動(dòng)和生長。這種現(xiàn)象稱為接觸抑制。一般密度抑制和接觸抑制是同時(shí)發(fā)生的。

腫瘤細(xì)胞無接觸抑制，因此，腫瘤細(xì)胞能堆積，是區(qū)別正常與癌細(xì)胞的標(biāo)志。5.呈現(xiàn)去分化狀態(tài)：從機(jī)體內(nèi)取出的細(xì)胞具有不同分化狀態(tài)，培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)去分化，以至分不出細(xì)胞

最初的來源。13Cellengineering三、組織細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)1.研究對(duì)象是活細(xì)胞。

可長期地監(jiān)控、檢測(cè)、甚至定量評(píng)估各種指標(biāo)------是其它方法無法達(dá)到的。2.可人為控制培養(yǎng)環(huán)境。

包括溫度、濕度、pH、氧氣、二氧化碳含量等物理化學(xué)的條件，培養(yǎng)液的基本營養(yǎng)成分、某些特定成分及細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞生長和功能的影響。3.研究的樣本基本均一。

經(jīng)過培養(yǎng)一定代數(shù)，可得到基本均一的細(xì)胞。14Cellengineering4.便于觀察、檢測(cè)和記錄。

采用倒置相差顯微鏡、電視、電影等直觀手段來觀察、檢測(cè)和記錄細(xì)胞變化。電鏡分析細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；同位素標(biāo)記、放射免疫等檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的合成、代謝的變化等。5.研究的范圍比較廣泛。

細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等均可利用細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行研究。6.研究的費(fèi)用相對(duì)比較經(jīng)濟(jì)。

相對(duì)動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)經(jīng)濟(jì)且易于觀察。7.篩選有一定特征變異的突變株或細(xì)胞融合體。

有利于進(jìn)行基因功能的研究。15Cellengineering四、細(xì)胞培養(yǎng)的缺點(diǎn)1.最根本的問題----細(xì)胞在體外培養(yǎng)的形態(tài)和功能會(huì)發(fā)生一定程度的改變，不完全等同于體內(nèi)。2.遺傳不穩(wěn)定----體外反復(fù)傳代、長期培養(yǎng)的細(xì)胞易發(fā)生染色體變異。3.對(duì)營養(yǎng)的要求較高----往往需要多種氨基酸、維生素、輔酶、核酸、激素和生長因子等，需要用血清、胚胎浸出液來提供。來源比較稀少、昂貴、成分不確定，目前正在研究無血清培養(yǎng)液來調(diào)控細(xì)胞生長。16Cellengineering4.對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較高。

影響細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的推廣應(yīng)用。5.培養(yǎng)中的污染問題。

動(dòng)物的細(xì)菌、真菌、病毒疾病污染細(xì)胞；操作過程中任何的細(xì)小問題都可能引起污染。

顯著污染的標(biāo)志是培養(yǎng)基pH值迅速改變，外形模糊，甚至出現(xiàn)漂浮的細(xì)胞及其碎片。17Cellengineering五、細(xì)胞培養(yǎng)的工作方法認(rèn)真、仔細(xì)、動(dòng)腦1.標(biāo)準(zhǔn)化的工作方法。2.嚴(yán)格按操作要求配制各種液體。3.標(biāo)明名稱、濃度、制備日期和配制人等信息。3.一切培養(yǎng)用品都要有固定的存放點(diǎn)，尤其重要的是：培養(yǎng)用品與非培養(yǎng)用品嚴(yán)格分開，消毒區(qū)和污染區(qū)嚴(yán)格分開。18Cellengineering第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基本技術(shù)一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過程1.材料選擇

2.材料處理

3.細(xì)胞培養(yǎng)和建系4.建立細(xì)胞株（系）二、細(xì)胞的常規(guī)檢查1.生長狀態(tài)

2.形態(tài)和活力測(cè)定

3.生長曲線的測(cè)定

4.營養(yǎng)狀況的觀察

5.污染狀況的觀察19Cellengineering

1.材料選擇

原則上各種動(dòng)物組織都可以進(jìn)行體外培養(yǎng)。

實(shí)際上幼體組織比老齡組織更容易培養(yǎng)成功，尤其是胚胎組織，分化程度低、增生能力強(qiáng)。腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。

取材前要對(duì)動(dòng)物組織進(jìn)行詳細(xì)檢查記錄。一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過程20Cellengineering1)要注意新鮮和保鮮

新鮮的活組織易于培養(yǎng)成功！取材后，應(yīng)盡量在4~6h內(nèi)能制作成細(xì)胞培養(yǎng)；若不能及時(shí)培養(yǎng)，應(yīng)于4℃存放。也可加入含10％二甲基亞礬的培養(yǎng)基，凍存于液氮中。2)應(yīng)嚴(yán)格無菌

所用的所有器皿要嚴(yán)格滅菌！取材也必須在無菌環(huán)境下操作。可在高濃度抗生素培養(yǎng)液內(nèi)，4℃下存放1-2h。應(yīng)避免接觸有毒、有害的化學(xué)物質(zhì)，如碘、汞等。21Cellengineering3)防止細(xì)胞機(jī)械損傷取材時(shí)要用鋒利的器械，盡量減少對(duì)細(xì)胞的損傷。4)避免組織干燥取材、切碎，整個(gè)操作時(shí)避免組織干燥，在含少量培養(yǎng)液的器皿中進(jìn)行。22Cellengineering2.材料處理

用適當(dāng)?shù)纳锘瘜W(xué)方法將剪碎的組織塊分散成細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)。包括材料的清洗、修剪和消化的過程。1)（組織）細(xì)胞的分離懸浮細(xì)胞分離:來自羊水、血液、胸腹水等體液的細(xì)胞，經(jīng)800～1000r/min離心5~10min（可加入淋巴細(xì)胞分離液、Ficoll、Percoll等），棄上清液，存留細(xì)胞。多次反復(fù)，獲得潔凈細(xì)胞。

注：速度不能太高，延時(shí)也不能太長，以避免擠壓或

機(jī)械損傷細(xì)胞。23Cellengineering實(shí)體組織細(xì)胞分離

麻醉（殺死）動(dòng)物─→無菌切取組織塊─→放入滅菌的PBS液中（必要時(shí)加入抗菌素）浸泡、封住瓶口─→帶入層流室─→沖洗血污3~5遍─→修剪、切除多余部分（筋腱、脂肪、血管等）─→切取進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的部位─→剪碎組織成小塊（0.5～1mm3）。24Cellengineering2）細(xì)胞懸液制備

機(jī)械分散法：對(duì)腦組織、部分胚胎組織，采用剪刀剪碎、吸管（或9號(hào)注射針）吹打的方法，充分分離細(xì)胞。此法相對(duì)簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷大。僅適于纖維成分少的軟組織。消化分離法：把剪成小塊(或糊狀)的組織，應(yīng)用酶的生化解離作用，使細(xì)胞間的連接松動(dòng)、膨松，再采用機(jī)械法吹打、分散，使細(xì)胞團(tuán)塊得以充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，此種方式形成的細(xì)胞容易貼壁生長。25Cellengineering具體步驟

將充分剪碎的細(xì)小組織塊─→加入5~10倍體積比的消化酶，37℃酶解10~20分鐘─→不時(shí)觀察細(xì)胞間隙的變化─→細(xì)胞間疏松后，加入10倍于消化液的含鈣的培養(yǎng)液中止消化─→4層紗布或100目不銹鋼網(wǎng)過濾除去殘余組織塊─→800～1000r/min離心3~5min，棄上清液，加培養(yǎng)液，吹打懸浮細(xì)胞─→再離心，反復(fù)2～3次，徹底清除消化液─→最后一次離心后，加培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞后，計(jì)數(shù)─→按一定濃度接種到培養(yǎng)皿培養(yǎng)。26Cellengineering細(xì)胞計(jì)數(shù)

計(jì)數(shù)方法與微生物細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法類似。通常以“細(xì)胞個(gè)數(shù)/mL”來表示。注意1.若細(xì)胞團(tuán)數(shù)超過10%，則消化不充分；若細(xì)胞數(shù)少于20個(gè)/mm3或多于50個(gè)/mm3，說明稀釋不當(dāng)，都要重新操作。一般每個(gè)大方格中細(xì)胞數(shù)量以20~50個(gè)為宜。2.細(xì)胞密度低于104，則無法計(jì)數(shù)。3.細(xì)胞懸液密度計(jì)算公式：

（個(gè)/ml）=四個(gè)計(jì)數(shù)室細(xì)胞之和/4×10427Cellengineering3.細(xì)胞培養(yǎng)和建系28Cellengineering①消化培養(yǎng)法

將消化后的細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，5%CO2、37℃條件培養(yǎng)。

一般原代培養(yǎng)，細(xì)胞生長較慢，最好前2天減少移動(dòng)和觀察的次數(shù)。3~5天左右，觀察細(xì)胞貼壁和生長狀況，根據(jù)情況換液，此時(shí)培養(yǎng)液最好不要有大的調(diào)整，維持培養(yǎng)至細(xì)胞基本接近融合（75%~80%）時(shí)，開始傳代。29Cellengineering②懸浮培養(yǎng)法

1907年由Harrison最早創(chuàng)立。在蓋玻片滴上用培養(yǎng)液稀釋到一定濃度的細(xì)胞懸液，翻轉(zhuǎn)蓋玻片，使組織塊及營養(yǎng)液懸掛于培養(yǎng)液表面張力所形成的水滴中，細(xì)胞可向四周遷移生長、單獨(dú)或聚集生長。

缺點(diǎn)

細(xì)胞生長空間狹小，營養(yǎng)不足，細(xì)胞不能持續(xù)、長時(shí)間生長。30Cellengineering31Cellengineering③細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

吸去細(xì)胞培養(yǎng)液（或再用PBS沖洗一次）─→加入0.25%的胰蛋白酶，以覆蓋細(xì)胞為宜─→37℃消化3~5分鐘，不時(shí)觀察細(xì)胞─→發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞變圓、細(xì)胞間隙增大，加入含血清的培養(yǎng)液或含鈣離子的Hanks液終止消化─→輕輕吹打細(xì)胞，至所有細(xì)胞脫離皿底─→吸取細(xì)胞懸液到離心管中，500~1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘─→棄去上清液，用培養(yǎng)液再次懸浮細(xì)胞，離心清洗一次去除消化液─→棄去上清液，用培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)（一般105～106個(gè)/ml）接種。32Cellengineering每次傳代后細(xì)胞的生長過程

實(shí)際是指細(xì)胞在每次傳代后，對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)和生長恢復(fù)的過程。33Cellengineering體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線潛伏期34Cellengineering潛伏期（LatentPhase）

包括懸浮期及潛伏期。

當(dāng)細(xì)胞接種后，細(xì)胞的胞質(zhì)先回縮，胞體呈圓球形。進(jìn)入新的培養(yǎng)器皿后先懸浮，短時(shí)間后，開始附著于底物，并逐漸伸展，恢復(fù)其原來的形態(tài)。

再經(jīng)過一段時(shí)間，細(xì)胞恢復(fù)代謝及運(yùn)動(dòng)后，才出現(xiàn)細(xì)胞分裂并逐漸增多。一般細(xì)胞潛伏期約為24~96小時(shí)。腫瘤細(xì)胞及連續(xù)（生長）細(xì)胞系，則更短，可少于24小時(shí)。35Cellengineering指數(shù)增生期（LogarithmicgrowthPhase）

又稱對(duì)數(shù)期。細(xì)胞增殖旺盛，成倍增長，活力最佳，適用于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

只要有理想的培養(yǎng)條件，細(xì)胞將不斷生長繁殖，數(shù)量日漸增加。逐漸接觸連成一片，長滿培養(yǎng)器皿底面。此期的時(shí)間長短因細(xì)胞特性及培養(yǎng)條件而不同，一般可持續(xù)3~5天。

36Cellengineering停止期（StagnatePhase）

又稱平臺(tái)期，當(dāng)細(xì)胞生長區(qū)域逐漸減少甚至消失。因接觸抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)停止、密度抑制細(xì)胞終止分裂。

細(xì)胞尚有活力，但已不再分裂增殖。若及時(shí)分離培養(yǎng)、進(jìn)行傳代，細(xì)胞將在新的培養(yǎng)器皿繼續(xù)生長，再次繁殖。否則，細(xì)胞因代謝中毒而發(fā)生改變，甚至脫落、死亡。

37Cellengineering④細(xì)胞的純化

一般分自然純化和人工純化兩種。自然純化

在長期傳代生長中，利用細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)，不斷排擠其他生長慢的細(xì)胞，靠自然淘汰法，留下生長旺盛的細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。缺點(diǎn)

無法按需要選擇細(xì)胞；花費(fèi)時(shí)間長，多數(shù)是成纖維細(xì)胞；僅有惡變腫瘤細(xì)胞或突變細(xì)胞可保留下來。38Cellengineering人工純化①依賴細(xì)胞因子純化----如加入IL-2形成依賴IL-2的T細(xì)胞系。②酶消化法----常用。胰蛋白酶消化時(shí)，成纖維細(xì)胞先脫壁、上皮細(xì)胞后脫壁，采用多次差別消化將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開。③反復(fù)貼壁法----常用。成纖維細(xì)胞貼壁快(10-20min)，上皮細(xì)胞慢（1h以上），反復(fù)貼壁分離、純化細(xì)胞。39Cellengineering④機(jī)械刮除法----采用機(jī)械刮取需要的細(xì)胞克隆片，或除掉不需要的細(xì)胞片，再進(jìn)行傳代培養(yǎng)。⑤細(xì)胞克隆法----將細(xì)胞稀釋到幾個(gè)或單個(gè)細(xì)胞，使之生長；或預(yù)置小蓋玻片或用金屬套環(huán)，來獲取部分克隆細(xì)胞。⑥流式細(xì)胞儀分離法----根據(jù)細(xì)胞核酸、細(xì)胞表面標(biāo)識(shí)或細(xì)胞結(jié)構(gòu)、大小等差別，利用流式細(xì)胞儀來篩選。40Cellengineering⑤細(xì)胞的冷凍和復(fù)蘇

常用5～20％甘油或5～12.5％二甲基亞砜（DMSO）作為保護(hù)劑，幫助細(xì)胞渡過冰晶期。在-70℃~-90℃保存半年以上，-196℃長期保存。操作方法①將生長良好的細(xì)胞按傳代方法消化，離心制成細(xì)胞壓積后，用10%DMSO+20%血清+培養(yǎng)液，現(xiàn)配冷凍液0.6~0.8mL將細(xì)胞稀釋制成細(xì)胞懸液，做好標(biāo)記。②緩慢降溫：大約每分鐘1～3℃，至-20℃。與冰塊放在一起，在4℃中10分鐘，再放入-20℃20分鐘。③快速降溫：每分鐘15～30℃至-196℃。將細(xì)胞直接投入液氮罐中，長期保存。41Cellengineering細(xì)胞的復(fù)蘇

一般采用快速融化法。從液氮罐-196℃溫度下迅速取出細(xì)胞冷凍管，放到37℃水浴中，輕輕搖動(dòng)試管，使內(nèi)容物在20～60s內(nèi)完全溶解，將冷凍細(xì)胞液吸出加入到20倍于冷凍液的培養(yǎng)液中，離心1~3次，去除冷凍液，制成細(xì)胞懸液，按一定的密度進(jìn)行培養(yǎng)。42Cellengineering4.建立細(xì)胞株（系）a.建立細(xì)胞系（株）

實(shí)際是指細(xì)胞傳代再培養(yǎng)的過程，也就是建立細(xì)胞系的過程。正常培養(yǎng)的細(xì)胞系有兩種：有限細(xì)胞系和無限細(xì)胞系。一般確立的是無限細(xì)胞系。43Cellengineeringb.細(xì)胞系

原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功或多次傳代成功后所得培養(yǎng)物。前期細(xì)胞類型多種多樣，后期的傳代不僅使細(xì)胞繼續(xù)生長，而且逐步演變?yōu)轭愋途鶆颉⑻卣骶坏募?xì)胞。經(jīng)過20次傳代，細(xì)胞逐漸死亡稱為（有）限定細(xì)胞系；細(xì)胞持續(xù)培養(yǎng)和生長為連續(xù)細(xì)胞系（無限細(xì)胞系）。c．細(xì)胞株

通過選擇或克隆形成具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的培養(yǎng)物。在細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，挑選單一細(xì)胞進(jìn)行克隆，形成具有特殊性質(zhì)、組成單一的細(xì)胞株，稱為克隆細(xì)胞株。從變異的細(xì)胞系中篩選細(xì)胞株成功率比較高。44Cellengineering二、細(xì)胞的常規(guī)檢查

細(xì)胞培養(yǎng)后，要2~3天對(duì)細(xì)胞做常規(guī)檢查，主要有：細(xì)胞的生長狀態(tài)、pH、是否污染、活力等情況，隨時(shí)掌握細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化及時(shí)處理有關(guān)異常情況。1.細(xì)胞的生長

主要四個(gè)時(shí)期：游離期、吸附期、繁殖期、

退化期。45Cellengineering2.細(xì)胞的形態(tài)觀察和活力測(cè)定形態(tài)生長良好的細(xì)胞，鏡下觀察：透明、輪廓清楚；若生長不好，則細(xì)胞折光性不勻，細(xì)胞間隙加大，形態(tài)不規(guī)則等。46Cellengineering活力測(cè)定臺(tái)盼藍(lán)染色法

細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，某些染料可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的DNA結(jié)合，使其著色。而活細(xì)胞能阻止這類染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。借此可以鑒別死細(xì)胞與活細(xì)胞。常用的這類染料有臺(tái)盼藍(lán)、伊紅Y和苯胺黑等。

取9滴一定濃度的細(xì)胞懸液，加入1滴0.4％臺(tái)盼藍(lán)溶液，混勻。3分鐘內(nèi)計(jì)數(shù)活（死）細(xì)胞數(shù)（死細(xì)胞染成淡藍(lán)色，活細(xì)胞無色）。計(jì)算以活細(xì)胞數(shù)百分比。47CellengineeringMTT比色法

是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長的方法。顯色劑四唑鹽商品名是噻唑藍(lán)，簡(jiǎn)稱為MTT。

該方法被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)，大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。特點(diǎn)是靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速、易自動(dòng)化，無放射性污染，與其他檢測(cè)細(xì)胞活力的方法(如細(xì)胞計(jì)數(shù)法、臺(tái)盼藍(lán)染色法等)有良好的相關(guān)性。48CellengineeringMTT法實(shí)驗(yàn)原理活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，因此，溶液的顏色深淺可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長處測(cè)定其光吸收值，代表活細(xì)胞數(shù)量的多少。49Cellengineering50Cellengineering操作過程1.接種細(xì)胞：傳代消化細(xì)胞以（103~104）濃度接種于96孔板，每孔200μL。2.培養(yǎng)細(xì)胞：37℃、5％CO2、飽和濕度下培養(yǎng)3～5天。3.呈色：第3～5天后，每孔加入MTT溶液(5mg／m1)20μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)。棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。4.比色：設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照調(diào)零。490nm波長測(cè)定各孔光吸收值，記錄。以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。51Cellengine