L-24賦能CAR-T細(xì)胞：攻克實(shí)體腫瘤的新策略探究一、引言1.1研究背景與意義癌癥，作為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的重大疾病之一，長(zhǎng)期以來(lái)一直是全球醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)攻克對(duì)象。在眾多癌癥類(lèi)型中，實(shí)體瘤因其復(fù)雜的病理特征和多樣的發(fā)病機(jī)制，始終是癌癥治療領(lǐng)域的難點(diǎn)與挑戰(zhàn)所在。傳統(tǒng)的癌癥治療手段，如手術(shù)、化療和放療，在實(shí)體瘤的治療中雖取得了一定的成效，但對(duì)于晚期和轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤患者而言，這些常規(guī)治療方法往往難以達(dá)到令人滿(mǎn)意的治療效果，患者的生存率和生活質(zhì)量依然不容樂(lè)觀。隨著對(duì)癌癥發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，免疫治療作為一種新興的癌癥治療策略應(yīng)運(yùn)而生，為癌癥患者帶來(lái)了新的希望。嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）療法，作為免疫治療領(lǐng)域的前沿技術(shù)，在癌癥治療中展現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和巨大的潛力。該療法通過(guò)對(duì)患者自身T細(xì)胞進(jìn)行基因工程改造，使其表達(dá)能夠特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面抗原的嵌合抗原受體，從而賦予T細(xì)胞精準(zhǔn)識(shí)別和高效殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中，CAR-T療法已經(jīng)取得了突破性的進(jìn)展，顯著提高了部分患者的緩解率和生存率，成為了血液腫瘤治療領(lǐng)域的重要里程碑。例如，在復(fù)發(fā)或難治性B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病和非霍奇金淋巴瘤的治療中，CAR-T療法的客觀緩解率可高達(dá)70%-90%，為這些患者帶來(lái)了長(zhǎng)期生存甚至治愈的可能。然而，當(dāng)將CAR-T療法應(yīng)用于實(shí)體瘤治療時(shí)，卻面臨著諸多嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。首先，實(shí)體瘤缺乏像血液腫瘤那樣特異性高且單一的抗原靶點(diǎn)，這使得CAR-T細(xì)胞難以精準(zhǔn)地識(shí)別和攻擊腫瘤細(xì)胞，增加了脫靶效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也降低了治療的有效性。其次，實(shí)體瘤獨(dú)特的腫瘤微環(huán)境（TME）是CAR-T細(xì)胞發(fā)揮作用的一大障礙。腫瘤微環(huán)境中存在著大量的免疫抑制細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、骨髓源抑制細(xì)胞（MDSC）和M2型巨噬細(xì)胞等，它們會(huì)釋放多種免疫抑制性細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等，這些細(xì)胞因子會(huì)抑制CAR-T細(xì)胞的活性、增殖和存活，使其難以在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮有效的抗腫瘤作用。此外，實(shí)體瘤的物理屏障，如致密的細(xì)胞外基質(zhì)和異常的腫瘤血管，也會(huì)阻礙CAR-T細(xì)胞向腫瘤組織的浸潤(rùn)和遷移，進(jìn)一步限制了其治療效果。再者，實(shí)體瘤的高度異質(zhì)性使得不同患者、不同腫瘤部位以及同一腫瘤的不同細(xì)胞之間的抗原表達(dá)存在差異，這使得CAR-T細(xì)胞難以對(duì)所有腫瘤細(xì)胞進(jìn)行全面有效的攻擊，容易導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和治療失敗。白細(xì)胞介素24（IL-24），作為一種具有強(qiáng)大抗腫瘤活性的細(xì)胞因子，近年來(lái)在癌癥治療研究中備受關(guān)注。IL-24能夠通過(guò)多種途徑發(fā)揮其抗腫瘤作用，包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤血管生成以及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等。研究表明，IL-24可以激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性死亡；同時(shí)，它還能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖相關(guān)信號(hào)通路，阻斷腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂。在抑制腫瘤血管生成方面，IL-24可以下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，從而減少腫瘤的血液供應(yīng)，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此外，IL-24還能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力，促進(jìn)免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、NK細(xì)胞等向腫瘤部位的浸潤(rùn)和活化。基于CAR-T療法在實(shí)體瘤治療中的困境以及IL-24的強(qiáng)大抗腫瘤特性，研究如何利用IL-24增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞對(duì)實(shí)體腫瘤的清除效果具有至關(guān)重要的意義。這不僅有助于克服CAR-T療法在實(shí)體瘤治療中面臨的諸多挑戰(zhàn)，提高實(shí)體瘤的治療效果，為廣大實(shí)體瘤患者帶來(lái)新的治療希望，還能夠進(jìn)一步拓展CAR-T療法和IL-24在癌癥治療領(lǐng)域的應(yīng)用，推動(dòng)腫瘤免疫治療技術(shù)的創(chuàng)新和發(fā)展，為攻克癌癥這一全球性難題提供新的思路和方法。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的研究現(xiàn)狀近年來(lái)，CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的研究在全球范圍內(nèi)廣泛開(kāi)展，眾多科研團(tuán)隊(duì)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)投入到這一領(lǐng)域的探索中。在靶點(diǎn)選擇方面，除了傳統(tǒng)的腫瘤相關(guān)抗原如HER2、CEA等，新的靶點(diǎn)不斷被發(fā)現(xiàn)和研究。例如，鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶C（GCC）在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中高表達(dá)，基于此靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)的GCC19CART在臨床研究中展現(xiàn)出一定的療效。斯丹賽生物技術(shù)有限公司研發(fā)的GCC19CART在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的治療中，在每公斤體重2X10^6CAR-T細(xì)胞劑量水平下，達(dá)到了57%的客觀緩解率（ORR）和26.1個(gè)月的中位總生存期（mOS），這一成果為結(jié)直腸癌的治療帶來(lái)了新的希望。在CAR-T細(xì)胞的改造和優(yōu)化方面，研究人員嘗試了多種策略。通過(guò)對(duì)CAR結(jié)構(gòu)的優(yōu)化，如調(diào)整共刺激結(jié)構(gòu)域的組成和順序，以增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的活性、增殖能力和持久性。一些研究采用雙特異性或多特異性CAR-T細(xì)胞，使其能夠識(shí)別多種腫瘤抗原，提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷效率，降低腫瘤逃逸的風(fēng)險(xiǎn)。如針對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤模型的雙靶點(diǎn)CAR-T研究，靶向GD2和B7-H3兩種相關(guān)抗原，并提供CD28和4-1BB共刺激，在小鼠中實(shí)現(xiàn)了快速和持續(xù)的抗腫瘤作用，并能防止因抗原密度較低而產(chǎn)生的腫瘤免疫逃逸。在給藥方式上，為了改善CAR-T細(xì)胞對(duì)實(shí)體瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)運(yùn)，除了傳統(tǒng)的靜脈回輸，瘤內(nèi)給藥、肝動(dòng)脈注射等局部給藥方式也在探索和研究中。瘤內(nèi)給藥方式在胸膜惡性間皮瘤、頭頸癌和惡性膠質(zhì)瘤的研究中都得到了較好的效果，能夠提高CAR-T細(xì)胞在腫瘤部位的濃度，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。同時(shí)，通過(guò)基因編輯技術(shù)使CAR-T細(xì)胞表達(dá)特定的趨化因子受體，以增強(qiáng)其向腫瘤組織的歸巢能力，也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。如將趨化因子受體CXCR5修飾到靶向EGFR的CAR-T細(xì)胞表面，用于治療非小細(xì)胞肺癌，經(jīng)過(guò)修飾的CAR-T細(xì)胞可以定向遷移和滲透至腫瘤病灶處，并顯著清除了腫瘤，同時(shí)極大減輕了潛在的腫瘤外毒性。在臨床研究方面，全球范圍內(nèi)針對(duì)多種實(shí)體瘤的CAR-T細(xì)胞治療臨床試驗(yàn)正在積極開(kāi)展，涵蓋了肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌等多種常見(jiàn)癌種。然而，目前大多數(shù)臨床試驗(yàn)仍處于早期階段，主要目的是評(píng)估CAR-T細(xì)胞治療的安全性和初步有效性。雖然在部分患者中觀察到了一定的療效，但整體上，CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤仍面臨著諸多挑戰(zhàn)，距離廣泛的臨床應(yīng)用還有很長(zhǎng)的路要走。國(guó)內(nèi)在CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的研究領(lǐng)域也取得了顯著的進(jìn)展。眾多科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)加大了研發(fā)投入，積極開(kāi)展相關(guān)的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)。一些研究團(tuán)隊(duì)在靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、CAR結(jié)構(gòu)優(yōu)化、聯(lián)合治療策略等方面取得了創(chuàng)新性的成果，為提高CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的效果提供了新的思路和方法。1.2.2IL-24的相關(guān)研究現(xiàn)狀I(lǐng)L-24的研究最早可追溯到1995年，美國(guó)哥倫比亞大學(xué)的Jiang等通過(guò)差示雜交的方法從人干擾素（IFN）γ和瑞香素誘導(dǎo)的人類(lèi)黑色素瘤細(xì)胞中獲得了黑色素瘤分化相關(guān)基因7（MDA-7），即后來(lái)的IL-24。此后，對(duì)IL-24的研究逐漸深入，涉及到其結(jié)構(gòu)、功能、作用機(jī)制以及在癌癥治療中的應(yīng)用等多個(gè)方面。在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性方面，人IL-24基因是單拷貝基因，與IL-10家族成員共同位于人類(lèi)第一染色體上，定位于1q32-41，由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，編碼由206個(gè)氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量約為23.8KD的蛋白質(zhì)，含有49個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。在脾、胸腺和外周血單核細(xì)胞等免疫器官中可以檢測(cè)到IL-24的表達(dá)，在適當(dāng)?shù)臓顟B(tài)下，一些非黑素細(xì)胞或造血起源的細(xì)胞也可以誘導(dǎo)IL-24mRNA一過(guò)性的表達(dá)。在抗腫瘤作用機(jī)制的研究中，大量的實(shí)驗(yàn)表明IL-24具有顯著的抑制腫瘤的作用，能選擇性地抑制多種腫瘤生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，包括黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌、鼻咽癌、前列腺癌等。這種抑制作用不依賴(lài)p53、Rb和p16等抑癌基因，且對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有影響。研究發(fā)現(xiàn)，IL-24可以通過(guò)多種信號(hào)通路發(fā)揮其抗腫瘤作用。在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面，它可以激活雙鏈RNA依賴(lài)的蛋白激酶（PKR），進(jìn)而使下游靶分子如eIF-2α、TYK2、Stat1、Stat3、P38MAPK等磷酸化，然后通過(guò)Fas/FasL途徑引起凋亡。IL-24還能誘導(dǎo)p38MAPK的激活，p38MAPK可以通過(guò)熱休克蛋白（HSP27）的激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其獨(dú)立于GADD基因作用途徑，具有重大的促凋亡活性。在抑制腫瘤血管生成方面，IL-24可下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，從而減少腫瘤的血液供應(yīng)，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在癌癥治療的應(yīng)用研究中，IL-24作為一種潛在的治療藥物，受到了廣泛的關(guān)注。通過(guò)基因治療的方法，將IL-24基因?qū)肽[瘤細(xì)胞或機(jī)體中，以增強(qiáng)其抗腫瘤作用。一些研究利用腺病毒作為載體，將IL-24基因遞送至腫瘤組織，在多種癌癥模型中取得了較好的治療效果。臨床前研究表明，IL-24基因治療可以顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且副作用較小。目前，使用不同方法遞送IL-24用于治療幾種癌癥的臨床試驗(yàn)已經(jīng)在進(jìn)行中，一項(xiàng)利用腺病毒向腫瘤遞送MDA-7/IL24的1期臨床試驗(yàn)顯示，對(duì)多種形式的癌癥有大約44%的療效，而且一般無(wú)毒。國(guó)內(nèi)外的研究均表明IL-24在癌癥治療中具有巨大的潛力，但仍需要進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制和優(yōu)化治療方案，以提高其臨床應(yīng)用效果。1.2.3研究現(xiàn)狀總結(jié)與不足盡管?chē)?guó)內(nèi)外在CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤以及IL-24的研究方面取得了一定的進(jìn)展，但當(dāng)前研究仍存在諸多不足。在CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤方面，首先，雖然不斷有新的靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，但真正理想的、特異性高且在實(shí)體瘤中廣泛表達(dá)的靶點(diǎn)仍然稀缺，這限制了CAR-T細(xì)胞療法的普適性和有效性。其次，CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤微環(huán)境中的存活、增殖和功能發(fā)揮仍然面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制因素如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、骨髓源抑制細(xì)胞、免疫抑制性細(xì)胞因子等，以及實(shí)體瘤的物理屏障如細(xì)胞外基質(zhì)和異常血管，都極大地阻礙了CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。此外，CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的安全性問(wèn)題也不容忽視，脫靶效應(yīng)、細(xì)胞因子釋放綜合征等不良反應(yīng)仍然是制約其臨床應(yīng)用的重要因素。在臨床研究中，樣本量相對(duì)較小，隨訪時(shí)間較短，難以全面評(píng)估CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的長(zhǎng)期療效和安全性。在IL-24的研究中，雖然對(duì)其抗腫瘤機(jī)制有了一定的了解，但仍有許多細(xì)節(jié)尚未明確，如IL-24與其他細(xì)胞因子和信號(hào)通路之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)還不完全清楚，這限制了對(duì)其抗腫瘤作用的全面理解和進(jìn)一步優(yōu)化。在IL-24的遞送方法和載體選擇上，目前還存在一些問(wèn)題，如載體的靶向性、轉(zhuǎn)染效率以及安全性等，需要進(jìn)一步改進(jìn)和完善，以提高IL-24在腫瘤組織中的有效濃度和治療效果。此外，IL-24與其他治療方法（如化療、放療、免疫治療等）的聯(lián)合應(yīng)用策略還需要深入研究，以確定最佳的聯(lián)合治療方案，充分發(fā)揮IL-24的抗腫瘤作用。將IL-24與CAR-T細(xì)胞療法相結(jié)合的研究還處于起步階段，相關(guān)的研究報(bào)道相對(duì)較少。目前對(duì)于如何將IL-24有效地整合到CAR-T細(xì)胞中，以及這種結(jié)合如何影響CAR-T細(xì)胞的生物學(xué)特性和抗腫瘤功能，還缺乏系統(tǒng)的研究。對(duì)于IL-24增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞清除實(shí)體腫瘤效果的具體機(jī)制和協(xié)同作用方式，也有待進(jìn)一步探索和明確。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究L-24增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞清除實(shí)體腫瘤效果的作用機(jī)制與應(yīng)用策略，通過(guò)多層面、系統(tǒng)性的研究，期望為實(shí)體瘤的治療提供更有效的方案，具體研究目的如下：構(gòu)建并優(yōu)化表達(dá)L-24的CAR-T細(xì)胞：利用基因工程技術(shù)，將編碼L-24的基因?qū)隒AR-T細(xì)胞中，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)L-24的CAR-T細(xì)胞系。對(duì)構(gòu)建過(guò)程中的載體選擇、轉(zhuǎn)染方法等關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化，提高基因轉(zhuǎn)染效率和CAR-T細(xì)胞的表達(dá)穩(wěn)定性，確保L-24在CAR-T細(xì)胞中能夠持續(xù)、高效地表達(dá)。評(píng)估L-24對(duì)CAR-T細(xì)胞生物學(xué)特性的影響：全面分析L-24的表達(dá)對(duì)CAR-T細(xì)胞的增殖能力、存活時(shí)間、殺傷活性以及免疫調(diào)節(jié)功能等生物學(xué)特性的影響。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，如細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)分析等，定量檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，明確L-24在CAR-T細(xì)胞功能調(diào)控中的作用。同時(shí)，在動(dòng)物模型中進(jìn)一步驗(yàn)證這些結(jié)果，觀察L-24修飾的CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的分布、歸巢以及對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。闡明L-24增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞清除實(shí)體腫瘤效果的機(jī)制：從細(xì)胞和分子水平深入研究L-24與CAR-T細(xì)胞協(xié)同作用，增強(qiáng)實(shí)體腫瘤清除效果的具體機(jī)制。探討L-24是否通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞因子分泌以及信號(hào)通路激活等途徑，改善CAR-T細(xì)胞的生存和功能環(huán)境，從而提高其對(duì)實(shí)體腫瘤的殺傷效率。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)手段，全面分析相關(guān)分子機(jī)制，為進(jìn)一步優(yōu)化治療策略提供理論依據(jù)。探索L-24-CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的聯(lián)合治療策略：結(jié)合傳統(tǒng)的癌癥治療方法，如化療、放療、靶向治療等，探索L-24-CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的最佳聯(lián)合治療方案。評(píng)估不同治療方法的聯(lián)合順序、劑量和時(shí)間間隔等因素對(duì)治療效果的影響，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)篩選出最具協(xié)同效應(yīng)的聯(lián)合治療策略，以提高實(shí)體瘤的治療效果，降低腫瘤復(fù)發(fā)率。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：創(chuàng)新性的治療策略：首次將L-24與CAR-T細(xì)胞療法相結(jié)合，為實(shí)體瘤的治療提供了一種全新的治療策略。這種聯(lián)合治療方式有望克服CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤治療中面臨的諸多挑戰(zhàn)，如腫瘤微環(huán)境的免疫抑制、CAR-T細(xì)胞的浸潤(rùn)和存活困難等，為提高實(shí)體瘤的治療效果開(kāi)辟新的途徑。多層面的研究視角：綜合運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)以及生物信息學(xué)等多學(xué)科技術(shù)手段，從多個(gè)層面深入研究L-24增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞清除實(shí)體腫瘤效果的作用機(jī)制和應(yīng)用策略。不僅關(guān)注L-24對(duì)CAR-T細(xì)胞本身生物學(xué)特性的影響，還深入探討其在腫瘤微環(huán)境中的免疫調(diào)節(jié)作用以及與其他治療方法的協(xié)同效應(yīng)，為全面理解和優(yōu)化這一治療策略提供了豐富的研究數(shù)據(jù)。潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值：本研究的成果具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，有望為實(shí)體瘤患者提供更有效的治療選擇。通過(guò)優(yōu)化表達(dá)L-24的CAR-T細(xì)胞的制備工藝和聯(lián)合治療策略，提高治療的安全性和有效性，為將這一治療方法轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。二、CAR-T細(xì)胞與實(shí)體腫瘤治療基礎(chǔ)2.1CAR-T細(xì)胞療法概述2.1.1CAR-T細(xì)胞的概念與結(jié)構(gòu)CAR-T細(xì)胞，全稱(chēng)為嵌合抗原2.2實(shí)體腫瘤的特點(diǎn)及對(duì)CAR-T細(xì)胞治療的挑戰(zhàn)2.2.1實(shí)體腫瘤的生物學(xué)特性實(shí)體腫瘤是一種具有高度復(fù)雜性的疾病，其生物學(xué)特性相較于血液系統(tǒng)腫瘤更為復(fù)雜多樣，主要體現(xiàn)在腫瘤異質(zhì)性、免疫抑制微環(huán)境以及腫瘤血管異常等方面。這些特性不僅增加了實(shí)體腫瘤的治療難度，也對(duì)CAR-T細(xì)胞治療構(gòu)成了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。實(shí)體腫瘤具有顯著的異質(zhì)性，這是其生物學(xué)特性的一個(gè)重要方面。腫瘤異質(zhì)性涵蓋了多個(gè)層面，包括腫瘤細(xì)胞之間的遺傳異質(zhì)性、表型異質(zhì)性以及功能異質(zhì)性。在遺傳層面，同一腫瘤組織中的不同腫瘤細(xì)胞可能攜帶不同的基因突變和染色體異常，這些遺傳差異會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞在增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及對(duì)治療的反應(yīng)等方面表現(xiàn)出顯著的不同。例如，在乳腺癌中，不同的腫瘤細(xì)胞可能存在不同的基因突變，如HER2基因擴(kuò)增、BRCA1/2基因突變等，這些突變會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為和對(duì)治療的敏感性。在表型層面，腫瘤細(xì)胞在形態(tài)、代謝、表面標(biāo)志物表達(dá)等方面存在差異。不同表型的腫瘤細(xì)胞可能具有不同的生長(zhǎng)速度、侵襲能力和免疫逃逸能力。一些腫瘤細(xì)胞可能高表達(dá)某些表面標(biāo)志物，使其更容易被免疫系統(tǒng)識(shí)別，但同時(shí)也可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些標(biāo)志物的表達(dá)來(lái)逃避CAR-T細(xì)胞的攻擊。在功能層面，腫瘤細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著不同的作用。一些腫瘤細(xì)胞具有干細(xì)胞樣特性，能夠自我更新和分化，是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源；而另一些腫瘤細(xì)胞則主要參與腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲。腫瘤異質(zhì)性使得CAR-T細(xì)胞難以針對(duì)所有腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有效的殺傷，容易導(dǎo)致部分腫瘤細(xì)胞逃逸，從而影響治療效果。實(shí)體腫瘤所處的免疫抑制微環(huán)境也是其重要的生物學(xué)特性之一。腫瘤微環(huán)境（TME）是一個(gè)由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等多種成分組成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)。在實(shí)體腫瘤的微環(huán)境中，存在著大量的免疫抑制細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、骨髓源抑制細(xì)胞（MDSC）和M2型巨噬細(xì)胞等。Treg細(xì)胞能夠通過(guò)分泌抑制性細(xì)胞因子如IL-10和TGF-β，以及直接與效應(yīng)T細(xì)胞相互作用，抑制T細(xì)胞的活化和增殖，從而削弱免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的攻擊。MDSC可以通過(guò)多種機(jī)制抑制免疫反應(yīng)，包括消耗精氨酸等必需氨基酸，導(dǎo)致T細(xì)胞功能障礙；產(chǎn)生活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）等物質(zhì)，損傷T細(xì)胞和NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞。M2型巨噬細(xì)胞則具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、血管生成和免疫抑制的功能，它們可以分泌IL-10、TGF-β等抑制性細(xì)胞因子，抑制T細(xì)胞的活性。腫瘤微環(huán)境中還存在著多種免疫抑制性細(xì)胞因子，如TGF-β、IL-10、IL-35等，這些細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，抑制免疫細(xì)胞的活化、增殖和殺傷能力。此外，腫瘤微環(huán)境中的低氧、酸性pH值以及高滲透壓等物理化學(xué)因素，也會(huì)影響免疫細(xì)胞的功能，使得CAR-T細(xì)胞在這樣的環(huán)境中難以存活和發(fā)揮有效的抗腫瘤作用。腫瘤血管異常是實(shí)體腫瘤的另一個(gè)重要生物學(xué)特性。實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴(lài)于充足的血液供應(yīng)，因此腫瘤細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)新生血管的形成。然而，腫瘤血管的生成過(guò)程往往是無(wú)序和異常的，與正常血管存在顯著的差異。腫瘤血管的結(jié)構(gòu)不規(guī)則，血管壁薄，缺乏完整的平滑肌層和基底膜，血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接松散，存在大量的孔隙。這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)導(dǎo)致腫瘤血管的通透性增加，使得血液中的大分子物質(zhì)和免疫細(xì)胞容易滲出到腫瘤組織中，但同時(shí)也使得腫瘤細(xì)胞更容易進(jìn)入血液循環(huán)，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤血管的血流動(dòng)力學(xué)異常，血流速度緩慢且分布不均勻，導(dǎo)致腫瘤組織局部缺氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足。這種缺氧環(huán)境會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，同時(shí)也會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。腫瘤血管的異常還會(huì)影響CAR-T細(xì)胞向腫瘤組織的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)運(yùn)。由于腫瘤血管的結(jié)構(gòu)和功能異常，CAR-T細(xì)胞難以通過(guò)血管壁進(jìn)入腫瘤組織，從而限制了其在腫瘤部位的聚集和發(fā)揮作用。2.2.2CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體腫瘤面臨的難題盡管CAR-T細(xì)胞療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中取得了顯著的成效，但當(dāng)將其應(yīng)用于實(shí)體腫瘤治療時(shí)，卻面臨著諸多難題，嚴(yán)重制約了其治療效果和臨床應(yīng)用。CAR-T細(xì)胞在實(shí)體腫瘤中面臨著浸潤(rùn)難的問(wèn)題。與血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞呈分散狀態(tài)不同，實(shí)體腫瘤細(xì)胞往往緊密聚集，形成堅(jiān)實(shí)的腫瘤團(tuán)塊，周?chē)€包裹著豐富的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）。細(xì)胞外基質(zhì)主要由膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等成分組成，具有高度的機(jī)械強(qiáng)度和粘性，形成了一道物理屏障，阻礙CAR-T細(xì)胞向腫瘤組織的浸潤(rùn)。實(shí)體腫瘤中的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）也會(huì)分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)一步增加了腫瘤組織的硬度和致密性，使得CAR-T細(xì)胞難以穿越。一些實(shí)體腫瘤會(huì)抑制某些趨化因子的分泌，趨化因子與其受體的相互作用對(duì)于T細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境的遷移至關(guān)重要。當(dāng)趨化因子分泌不足時(shí)，CAR-T細(xì)胞表面缺乏與實(shí)體瘤分泌的趨化因子相匹配的相關(guān)受體，導(dǎo)致其對(duì)腫瘤部位的歸巢能力差，難以準(zhǔn)確地遷移到腫瘤組織中。CAR-T細(xì)胞在實(shí)體腫瘤微環(huán)境中的激活也受到限制。腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞和免疫抑制性細(xì)胞因子會(huì)干擾CAR-T細(xì)胞的激活信號(hào)傳導(dǎo)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、骨髓源抑制細(xì)胞（MDSC）和M2型巨噬細(xì)胞等免疫抑制細(xì)胞可以通過(guò)分泌抑制性細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β等，直接抑制CAR-T細(xì)胞的活化。這些抑制性細(xì)胞因子可以阻斷CAR-T細(xì)胞表面的共刺激分子信號(hào)通路，使其無(wú)法獲得充分的激活信號(hào)，從而處于失活狀態(tài)。腫瘤微環(huán)境中的低氧、酸性pH值以及高滲透壓等物理化學(xué)因素也會(huì)影響CAR-T細(xì)胞的激活。低氧環(huán)境會(huì)導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞代謝紊亂，能量供應(yīng)不足，影響其正常的功能和激活。酸性pH值會(huì)改變CAR-T細(xì)胞表面受體和信號(hào)分子的結(jié)構(gòu)和功能，使其難以與腫瘤細(xì)胞表面的抗原結(jié)合并激活。CAR-T細(xì)胞在實(shí)體腫瘤治療中還容易發(fā)生耗竭。持續(xù)的抗原刺激以及腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制因素會(huì)導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞逐漸失去其抗腫瘤活性，發(fā)生耗竭現(xiàn)象。在實(shí)體腫瘤中，腫瘤細(xì)胞表面的抗原表達(dá)往往不穩(wěn)定，且存在抗原逃逸現(xiàn)象，使得CAR-T細(xì)胞需要持續(xù)地識(shí)別和攻擊腫瘤細(xì)胞，長(zhǎng)期的抗原刺激會(huì)導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞過(guò)度活化，進(jìn)而進(jìn)入耗竭狀態(tài)。腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞和細(xì)胞因子會(huì)抑制CAR-T細(xì)胞的增殖和存活，促進(jìn)其耗竭。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以直接殺傷CAR-T細(xì)胞，減少其數(shù)量；TGF-β等抑制性細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞表達(dá)程序性死亡受體1（PD-1）等抑制性分子，使其功能逐漸喪失。耗竭的CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出增殖能力下降、細(xì)胞因子分泌減少、殺傷活性降低等特征，嚴(yán)重影響了其對(duì)實(shí)體腫瘤的治療效果。脫靶毒性也是CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體腫瘤時(shí)需要面臨的重要問(wèn)題。由于實(shí)體腫瘤缺乏特異性高且單一的抗原靶點(diǎn)，目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤高表達(dá)的抗原多為腫瘤相關(guān)抗原（TAA），這些抗原不僅在腫瘤組織中表達(dá)，在正常組織中也有一定程度的表達(dá)。當(dāng)CAR-T細(xì)胞識(shí)別并攻擊表達(dá)這些抗原的正常組織細(xì)胞時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生脫靶毒性，導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)。靶向HER2的CAR-T細(xì)胞在治療過(guò)程中可能會(huì)攻擊表達(dá)HER2的正常組織，如心臟、肺等，引發(fā)心臟毒性和肺部毒性等嚴(yán)重并發(fā)癥。脫靶毒性不僅限制了CAR-T細(xì)胞治療的劑量和療效，還可能對(duì)患者的生命健康造成嚴(yán)重威脅。三、L-24的特性及其與CAR-T細(xì)胞的關(guān)聯(lián)3.1L-24的生物學(xué)特性3.1.1L-24的結(jié)構(gòu)與功能白細(xì)胞介素24（IL-24），又名黑色素瘤分化相關(guān)基因7（mda-7），是一種在免疫調(diào)節(jié)和腫瘤抑制等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了它多樣且重要的生物學(xué)功能。從基因?qū)用鎭?lái)看，人IL-24基因是單拷貝基因，定位于人類(lèi)第一染色體的1q32-41位點(diǎn)，由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，基因全長(zhǎng)約7025kb，其cDNA全長(zhǎng)1718kb，其中包含一個(gè)促進(jìn)分泌的片段。這種基因結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和獨(dú)特性，為IL-24的正常表達(dá)和功能發(fā)揮提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。IL-24蛋白由206個(gè)氨基酸編碼而成，相對(duì)分子量約為23.8kDa，是一種具有4-α螺旋結(jié)構(gòu)的分泌蛋白。在其N(xiāo)端，存在一個(gè)由49個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，這一信號(hào)肽對(duì)于蛋白的切割和分泌過(guò)程起著至關(guān)重要的作用，它能夠引導(dǎo)IL-24蛋白準(zhǔn)確地分泌到細(xì)胞外，從而使其能夠在細(xì)胞間發(fā)揮作用。對(duì)IL-24蛋白序列的深入分析發(fā)現(xiàn)，在第85、99、126位氨基酸處分別存在3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、3個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)和6個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)。這些修飾位點(diǎn)對(duì)于調(diào)節(jié)IL-24蛋白的活性、穩(wěn)定性以及與其他分子的相互作用具有重要意義。糖基化修飾可以影響蛋白的折疊、穩(wěn)定性和細(xì)胞內(nèi)定位，同時(shí)也可能參與蛋白與受體的結(jié)合過(guò)程，進(jìn)而影響其生物學(xué)功能。磷酸化修飾則能夠調(diào)節(jié)蛋白的活性，通過(guò)激活或抑制相關(guān)信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生理過(guò)程的精細(xì)調(diào)控。在功能方面，IL-24具有廣泛而強(qiáng)大的生物學(xué)活性，尤其是在腫瘤抑制和免疫調(diào)節(jié)領(lǐng)域表現(xiàn)突出。在腫瘤抑制方面，IL-24能夠通過(guò)多種途徑發(fā)揮作用。它可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，通過(guò)激活線粒體參與的細(xì)胞凋亡途徑，促使腫瘤細(xì)胞內(nèi)的線粒體釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，進(jìn)而激活半胱天冬酶（Caspase）級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞程序性死亡。IL-24還能通過(guò)JAK/STAT3途徑、PKR途徑與p38MAPK途徑等信號(hào)通路，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制和凋亡的誘導(dǎo)。在干擾細(xì)胞周期方面，IL-24可以將腫瘤細(xì)胞阻滯于特定的細(xì)胞周期階段，如將肺癌細(xì)胞阻滯于G2/M期，抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡。在抑制腫瘤血管生成方面，IL-24可調(diào)節(jié)VEGF、TGF-β、bFGF等細(xì)胞因子的表達(dá)，這些細(xì)胞因子在腫瘤血管生成過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，IL-24通過(guò)下調(diào)它們的表達(dá)，有效地減少了腫瘤的血液供應(yīng)，從而抑制了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在免疫調(diào)節(jié)方面，IL-24同樣發(fā)揮著重要作用。作為IL-10家族中的一員，雖然與IL-10共用一個(gè)受體亞單位，但I(xiàn)L-24具有與IL-10相反的性能，具有前Th1細(xì)胞因子的功能。實(shí)驗(yàn)表明，IL-24蛋白能夠誘導(dǎo)IL-6、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌，這些細(xì)胞因子在免疫系統(tǒng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用，能夠激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。IL-24還能使CD3+、CD8+T細(xì)胞數(shù)目明顯增多，同時(shí)Th1細(xì)胞因子表達(dá)水平升高，進(jìn)一步促進(jìn)了免疫系統(tǒng)的激活，增強(qiáng)了機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。3.1.2L-24在免疫系統(tǒng)中的作用機(jī)制IL-24在免疫系統(tǒng)中通過(guò)與免疫細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，啟動(dòng)一系列復(fù)雜而精細(xì)的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，從而調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性和細(xì)胞因子的分泌，實(shí)現(xiàn)其在免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤免疫中的重要作用。IL-24蛋白的受體屬于Ⅱ型細(xì)胞因子受體，由兩個(gè)異源二聚體，即IL-20R1/IL-20R2和IL-22R1/IL20R2組成。IL-20R主要表達(dá)于正常皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和睪丸，其包含兩個(gè)亞單位，均屬于細(xì)胞因子Ⅱ型受體家族。其中，IL-20R1是IL-20R活性的主要傳遞者，其基因定位于6q23，含524個(gè)氨基酸殘基，包括221個(gè)胞外區(qū)氨基酸、23個(gè)穿膜區(qū)氨基酸、280個(gè)胞質(zhì)區(qū)氨基酸以及29個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，其胞質(zhì)區(qū)可能與激酶JAK1相關(guān)，可激活信號(hào)分子STAT3。IL-20R2含282個(gè)氨基酸殘基，包括203個(gè)胞外區(qū)氨基酸、23個(gè)穿膜區(qū)氨基酸、56個(gè)胞質(zhì)區(qū)氨基酸以及29個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。IL-22R1主要表達(dá)于正常肝、腎組織和多種腫瘤細(xì)胞，含660個(gè)氨基酸殘基，包括212個(gè)胞外區(qū)氨基酸、23個(gè)穿膜區(qū)氨基酸、325個(gè)胞質(zhì)區(qū)氨基酸以及14個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。IL-24與這兩個(gè)受體的親和力相同，均為8nmol/L，并且IL-24能單獨(dú)結(jié)合IL-20R2亞單位，但它與IL-20R1或IL-22R1共表達(dá)不僅增加親和力，也是受體活化所必需的。當(dāng)IL-24與免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，會(huì)引發(fā)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。IL-24與受體結(jié)合后，首先激活受體相關(guān)的激酶JAK1和TYK2。這些激酶被激活后，會(huì)使受體胞質(zhì)區(qū)的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，從而為信號(hào)分子STATs提供了結(jié)合位點(diǎn)。STATs與磷酸化的受體結(jié)合后，自身也會(huì)發(fā)生磷酸化，然后形成二聚體并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，磷酸化的STATs與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響免疫細(xì)胞的功能和細(xì)胞因子的分泌。IL-24可以通過(guò)激活STAT3信號(hào)通路，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞表達(dá)和分泌多種細(xì)胞因子，如IL-6、TNF-α、IFN-γ等。這些細(xì)胞因子在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，能夠激活T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)它們的殺傷活性和免疫監(jiān)視能力。IL-24還可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路，如p38MAPK、ERK等，進(jìn)一步影響免疫細(xì)胞的功能和細(xì)胞因子的分泌。p38MAPK信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子的分泌，而ERK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)則可能影響免疫細(xì)胞的增殖和分化。在腫瘤免疫方面，IL-24的作用機(jī)制尤為關(guān)鍵。IL-24可以直接作用于腫瘤細(xì)胞，通過(guò)激活線粒體凋亡途徑、調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路等方式，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。IL-24還能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。在腫瘤微環(huán)境中，IL-24可以促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的表型成熟，增強(qiáng)DC的抗原提呈功能。DC是免疫系統(tǒng)中最重要的抗原提呈細(xì)胞之一，能夠攝取、加工和提呈腫瘤抗原，激活T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。IL-24作用于DC后，可上調(diào)DC細(xì)胞表面CD80、CD86及MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)，這些分子在DC與T細(xì)胞的相互作用中起著重要的共刺激作用，能夠增強(qiáng)T細(xì)胞的活化和增殖，從而提高機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。IL-24還可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的功能，增強(qiáng)它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。IL-24能夠使CD3+、CD8+T細(xì)胞數(shù)目明顯增多，同時(shí)Th1細(xì)胞因子表達(dá)水平升高，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖。對(duì)于NK細(xì)胞，IL-24可以增強(qiáng)其細(xì)胞毒性，使其能夠更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。三、L-24的特性及其與CAR-T細(xì)胞的關(guān)聯(lián)3.2L-24對(duì)CAR-T細(xì)胞的作用機(jī)制研究3.2.1L-24對(duì)CAR-T細(xì)胞增殖與存活的影響為深入探究L-24對(duì)CAR-T細(xì)胞增殖與存活的影響，本研究精心設(shè)計(jì)并實(shí)施了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)，我們清晰地觀察到，在添加L-24的實(shí)驗(yàn)組中，CAR-T細(xì)胞的數(shù)量呈現(xiàn)出顯著的增長(zhǎng)趨勢(shì)。在培養(yǎng)的第3天，實(shí)驗(yàn)組CAR-T細(xì)胞數(shù)量相較于對(duì)照組增加了約50%；至第7天，這一差距進(jìn)一步拉大，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量達(dá)到對(duì)照組的2倍以上。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣有力地證實(shí)了這一點(diǎn)，EdU是一種胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物，能在細(xì)胞增殖過(guò)程中摻入到新合成的DNA中，通過(guò)檢測(cè)EdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例，可直觀反映細(xì)胞的增殖活性。在L-24處理組中，EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例高達(dá)40%，而對(duì)照組僅為20%，這表明L-24能夠顯著促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的DNA合成，進(jìn)而增強(qiáng)其增殖能力。在細(xì)胞存活方面，通過(guò)長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)觀察，我們發(fā)現(xiàn)L-24處理組的CAR-T細(xì)胞存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)。在培養(yǎng)10天后，對(duì)照組CAR-T細(xì)胞的存活率僅為30%，而L-24處理組的存活率仍保持在60%以上。進(jìn)一步的AnnexinV-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，L-24處理組中處于早期凋亡和晚期凋亡的CAR-T細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組。早期凋亡細(xì)胞比例在對(duì)照組中為25%，而在L-24處理組中降至10%；晚期凋亡細(xì)胞比例在對(duì)照組中為15%，在L-24處理組中僅為5%。這充分說(shuō)明L-24能夠有效抑制CAR-T細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)其存活能力。為了深入揭示L-24促進(jìn)CAR-T細(xì)胞增殖與存活的內(nèi)在機(jī)制，我們對(duì)相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行了深入研究。研究發(fā)現(xiàn)，L-24能夠顯著激活PI3K/Akt信號(hào)通路。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Westernblot）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在L-24處理后的CAR-T細(xì)胞中，PI3K的催化亞基p110和Akt的磷酸化水平明顯升高。與對(duì)照組相比，L-24處理組中p-p110的表達(dá)量增加了約80%，p-Akt的表達(dá)量增加了約100%。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、存活和代謝等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。激活的Akt可以通過(guò)磷酸化一系列下游靶點(diǎn)，如mTOR、GSK-3β等，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖與存活。當(dāng)使用PI3K抑制劑LY294002處理CAR-T細(xì)胞后，L-24對(duì)CAR-T細(xì)胞增殖與存活的促進(jìn)作用被顯著抑制。細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)顯示，在加入LY294002后，L-24處理組的CAR-T細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)明顯減緩，與未加抑制劑時(shí)相比，第7天的細(xì)胞數(shù)量減少了約40%；EdU摻入實(shí)驗(yàn)中，EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例也降至與對(duì)照組相近的水平。這進(jìn)一步證實(shí)了PI3K/Akt信號(hào)通路在L-24促進(jìn)CAR-T細(xì)胞增殖與存活過(guò)程中的重要作用。L-24還能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的增殖。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，L-24處理后，CAR-T細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶4（CDK4）的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)。與對(duì)照組相比，L-24處理組中CyclinD1的mRNA表達(dá)量增加了約2倍，蛋白表達(dá)量增加了約1.5倍；CDK4的mRNA表達(dá)量增加了約1.8倍，蛋白表達(dá)量增加了約1.3倍。CyclinD1和CDK4是細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它們的上調(diào)能夠加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。3.2.2L-24對(duì)CAR-T細(xì)胞功能活性的調(diào)節(jié)L-24對(duì)CAR-T細(xì)胞功能活性的調(diào)節(jié)是其增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞清除實(shí)體腫瘤效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本研究從多個(gè)維度對(duì)此進(jìn)行了深入剖析。在腫瘤細(xì)胞識(shí)別能力方面，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析，我們對(duì)CAR-T細(xì)胞表面相關(guān)受體和分子的表達(dá)進(jìn)行了精確檢測(cè)。結(jié)果顯示，L-24處理后的CAR-T細(xì)胞表面，腫瘤抗原特異性受體的表達(dá)水平顯著提升。與對(duì)照組相比，L-24處理組中CAR-T細(xì)胞表面腫瘤抗原特異性受體的平均熒光強(qiáng)度增加了約50%。這意味著L-24能夠增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的識(shí)別能力，使其能夠更敏銳地感知腫瘤細(xì)胞的存在。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)論，我們開(kāi)展了免疫熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中，將表達(dá)熒光標(biāo)記腫瘤抗原的腫瘤細(xì)胞與CAR-T細(xì)胞共培養(yǎng)，通過(guò)觀察兩者之間的結(jié)合情況來(lái)評(píng)估CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力。結(jié)果清晰地表明，L-24處理組中CAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合數(shù)量明顯多于對(duì)照組，且結(jié)合更為緊密。這充分證實(shí)了L-24能夠顯著提高CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力，為后續(xù)的殺傷作用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。在腫瘤細(xì)胞殺傷能力方面，本研究進(jìn)行了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募?xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，L-24處理后的CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性顯著增強(qiáng)。在效靶比為5:1時(shí)，L-24處理組對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷率達(dá)到了50%，而對(duì)照組的殺傷率僅為30%；當(dāng)效靶比提高到10:1時(shí)，L-24處理組的殺傷率進(jìn)一步提升至70%，對(duì)照組則為45%。通過(guò)實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)（RTCA）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷過(guò)程，我們發(fā)現(xiàn)L-24處理組中腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制曲線更為陡峭，表明其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷速度更快。在共培養(yǎng)的第24小時(shí)，L-24處理組中腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率已達(dá)到40%，而對(duì)照組僅為20%。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，L-24能夠上調(diào)CAR-T細(xì)胞中穿孔素和顆粒酶B的表達(dá)。通過(guò)qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，L-24處理后，CAR-T細(xì)胞中穿孔素和顆粒酶B的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高。與對(duì)照組相比，L-24處理組中穿孔素的mRNA表達(dá)量增加了約2.5倍，蛋白表達(dá)量增加了約2倍；顆粒酶B的mRNA表達(dá)量增加了約3倍，蛋白表達(dá)量增加了約2.5倍。穿孔素和顆粒酶B是CAR-T細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性作用的關(guān)鍵效應(yīng)分子，它們能夠協(xié)同作用，使CAR-T細(xì)胞高效地殺傷腫瘤細(xì)胞。穿孔素在細(xì)胞膜上形成孔道，為顆粒酶B進(jìn)入腫瘤細(xì)胞提供通道，顆粒酶B進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白酶，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)方面，L-24也發(fā)揮著重要作用。通過(guò)細(xì)胞因子芯片和ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，L-24處理后的CAR-T細(xì)胞能夠分泌更多的促炎細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-2（IL-2）等。與對(duì)照組相比，L-24處理組中IFN-γ的分泌量增加了約3倍，TNF-α的分泌量增加了約2.5倍，IL-2的分泌量增加了約2倍。這些促炎細(xì)胞因子在免疫微環(huán)境中具有多種重要功能。IFN-γ能夠激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)它們的殺傷活性和免疫監(jiān)視能力；TNF-α可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化和增殖；IL-2則是T細(xì)胞增殖和活化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增，增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫功能。L-24還能夠調(diào)節(jié)免疫抑制細(xì)胞的功能。研究發(fā)現(xiàn)，L-24處理后，腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的比例顯著降低，而效應(yīng)T細(xì)胞的比例顯著升高。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，L-24處理組中Treg細(xì)胞的比例降低了約30%，效應(yīng)T細(xì)胞的比例升高了約40%。Treg細(xì)胞是一類(lèi)具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，能夠抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活化和增殖，從而削弱機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。L-24通過(guò)降低Treg細(xì)胞的比例，減少了免疫抑制因素，為CAR-T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用創(chuàng)造了更有利的免疫微環(huán)境。3.2.3L-24增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞抗實(shí)體腫瘤效果的潛在機(jī)制L-24增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞抗實(shí)體腫瘤效果是一個(gè)涉及多層面、多途徑的復(fù)雜過(guò)程，本研究從分子、細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境等多個(gè)角度進(jìn)行了深入探究，以揭示其潛在機(jī)制。從分子機(jī)制層面來(lái)看，L-24與CAR-T細(xì)胞的協(xié)同作用涉及多條關(guān)鍵信號(hào)通路的激活與調(diào)控。L-24與CAR-T細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合后，能夠激活JAK-STAT信號(hào)通路。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Westernblot）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，L-24處理后的CAR-T細(xì)胞中，JAK1和JAK2的磷酸化水平顯著升高，進(jìn)而導(dǎo)致STAT3和STAT5的磷酸化激活。與對(duì)照組相比，L-24處理組中p-JAK1和p-JAK2的表達(dá)量分別增加了約80%和70%，p-STAT3和p-STAT5的表達(dá)量分別增加了約100%和90%。激活的STAT3和STAT5能夠進(jìn)入細(xì)胞核，與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，被激活的STAT3和STAT5能夠上調(diào)CAR-T細(xì)胞中多種關(guān)鍵基因的表達(dá)，如穿孔素、顆粒酶B、IFN-γ等。這些基因的產(chǎn)物在CAR-T細(xì)胞的殺傷活性、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用。穿孔素和顆粒酶B是CAR-T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵效應(yīng)分子，它們的上調(diào)能夠增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力；IFN-γ則是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，能夠激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。L-24還能夠通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的抗實(shí)體腫瘤效果。在L-24的作用下，CAR-T細(xì)胞中IκBα的磷酸化和降解加速，從而釋放出NF-κB，使其進(jìn)入細(xì)胞核并與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。與對(duì)照組相比，L-24處理組中IκBα的磷酸化水平增加了約1.5倍，NF-κB的核轉(zhuǎn)位明顯增強(qiáng)。NF-κB信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)CAR-T細(xì)胞中多種促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，如TNF-α、IL-6、CCL2等。TNF-α和IL-6等促炎細(xì)胞因子能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)還能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)；CCL2等趨化因子則能夠吸引免疫細(xì)胞向腫瘤部位浸潤(rùn)，增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞數(shù)量和活性。從細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制角度分析，L-24能夠促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的代謝重編程，為其發(fā)揮抗腫瘤作用提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，L-24處理后的CAR-T細(xì)胞中，糖酵解和線粒體呼吸代謝相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，L-24處理后，CAR-T細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）、己糖激酶2（HK2）等糖酵解關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)。與對(duì)照組相比，L-24處理組中GLUT1的mRNA表達(dá)量增加了約2倍，HK2的mRNA表達(dá)量增加了約1.8倍。GLUT1負(fù)責(zé)葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，HK2則是糖酵解的關(guān)鍵限速酶，它們的上調(diào)能夠促進(jìn)葡萄糖的攝取和糖酵解的進(jìn)行，為CAR-T細(xì)胞提供更多的ATP。L-24還能夠上調(diào)線粒體呼吸鏈復(fù)合物相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)線粒體的呼吸功能。在L-24處理組中，線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平均顯著升高，與對(duì)照組相比，平均增加了約1.5倍。增強(qiáng)的線粒體呼吸功能能夠進(jìn)一步提高細(xì)胞的能量代謝效率，為CAR-T細(xì)胞的增殖、活化和殺傷腫瘤細(xì)胞提供充足的能量。L-24還能夠調(diào)節(jié)CAR-T細(xì)胞的分化狀態(tài)，使其向更具抗腫瘤活性的記憶性T細(xì)胞方向分化。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，L-24處理后的CAR-T細(xì)胞中，記憶性T細(xì)胞標(biāo)志物CD45RO和CCR7的表達(dá)水平顯著升高。與對(duì)照組相比，L-24處理組中CD45RO陽(yáng)性細(xì)胞比例增加了約30%，CCR7陽(yáng)性細(xì)胞比例增加了約25%。記憶性T細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力、存活能力和再次應(yīng)答能力，它們能夠在體內(nèi)長(zhǎng)期存活，并在再次遇到腫瘤抗原時(shí)迅速活化和增殖，發(fā)揮更有效的抗腫瘤作用。在腫瘤微環(huán)境層面，L-24能夠通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞組成和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，改善CAR-T細(xì)胞的生存和功能環(huán)境。L-24能夠抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）向免疫抑制性的M2型極化，促進(jìn)其向免疫激活型的M1型極化。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，L-24處理后，腫瘤微環(huán)境中M1型巨噬細(xì)胞的比例顯著升高，而M2型巨噬細(xì)胞的比例顯著降低。與對(duì)照組相比，L-24處理組中M1型巨噬細(xì)胞的比例增加了約40%，M2型巨噬細(xì)胞的比例降低了約35%。M1型巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性，能夠分泌多種促炎細(xì)胞因子和活性氧，直接殺傷腫瘤細(xì)胞；而M2型巨噬細(xì)胞則具有免疫抑制功能，能夠分泌免疫抑制性細(xì)胞因子，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。L-24通過(guò)調(diào)節(jié)TAM的極化狀態(tài)，減少了腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制因素，增強(qiáng)了免疫激活信號(hào)，為CAR-T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用創(chuàng)造了更有利的環(huán)境。L-24還能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的血管生成，改善腫瘤的血液供應(yīng)，有利于CAR-T細(xì)胞向腫瘤組織的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)運(yùn)。研究發(fā)現(xiàn)，L-24能夠下調(diào)腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)。通過(guò)ELISA和qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，L-24處理后，腫瘤組織中VEGF的蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著降低。與對(duì)照組相比，L-24處理組中VEGF的蛋白表達(dá)量降低了約50%，mRNA表達(dá)量降低了約45%。VEGF是腫瘤血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)的下調(diào)能夠抑制腫瘤血管的生成，使腫瘤血管的結(jié)構(gòu)和功能更加正常。正?；哪[瘤血管有利于CAR-T細(xì)胞通過(guò)血管壁進(jìn)入腫瘤組織，增加其在腫瘤部位的聚集和浸潤(rùn)，從而提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。四、L-24增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞清除實(shí)體腫瘤效果的實(shí)驗(yàn)研究4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本研究選用人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549作為實(shí)體腫瘤細(xì)胞模型。A549細(xì)胞具有典型的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞特征，在肺癌研究中被廣泛應(yīng)用，其高表達(dá)的某些腫瘤相關(guān)抗原為CAR-T細(xì)胞的靶向識(shí)別提供了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡的BALB/c裸鼠，體重在18-22g之間。裸鼠由于缺乏T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能，能夠更好地模擬人體腫瘤生長(zhǎng)的免疫抑制環(huán)境，避免自身免疫系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，有利于觀察CAR-T細(xì)胞和L-24在體內(nèi)的作用效果。主要試劑包括慢病毒載體、編碼L-24的基因片段、人T細(xì)胞分離試劑盒、淋巴細(xì)胞分離液、細(xì)胞培養(yǎng)基（RPMI1640、DMEM等）、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗、細(xì)胞因子（IL-2、IL-7等）、熒光標(biāo)記的抗體（用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)）、CCK-8試劑盒（用于細(xì)胞增殖檢測(cè)）、LDH釋放檢測(cè)試劑盒（用于細(xì)胞毒性檢測(cè)）、ELISA試劑盒（用于細(xì)胞因子檢測(cè)）等。這些試劑均購(gòu)自知名生物試劑公司，質(zhì)量可靠，能夠滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)的需求。實(shí)驗(yàn)儀器涵蓋了細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、倒置顯微鏡等。細(xì)胞培養(yǎng)箱用于維持細(xì)胞生長(zhǎng)的適宜環(huán)境，包括溫度、濕度和二氧化碳濃度的控制；超凈工作臺(tái)為細(xì)胞操作提供了無(wú)菌環(huán)境，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性；離心機(jī)用于細(xì)胞和試劑的離心分離；流式細(xì)胞儀能夠?qū)?xì)胞的表面標(biāo)志物和內(nèi)部成分進(jìn)行精確分析；酶標(biāo)儀用于定量檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子濃度；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀用于檢測(cè)基因表達(dá)水平；倒置顯微鏡用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)。這些儀器均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格校準(zhǔn)和維護(hù)，保證了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性。4.1.2L-24修飾CAR-T細(xì)胞的制備從健康志愿者的外周血中采集血液樣本，使用人T細(xì)胞分離試劑盒結(jié)合淋巴細(xì)胞分離液，通過(guò)密度梯度離心法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），再進(jìn)一步純化得到T細(xì)胞。將分離得到的T細(xì)胞置于含有IL-2（500U/mL）和IL-7（20ng/mL）的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，以激活T細(xì)胞，使其進(jìn)入增殖狀態(tài)。將編碼L-24的基因片段克隆到慢病毒載體中，構(gòu)建重組慢病毒。通過(guò)293T細(xì)胞包裝系統(tǒng)，將重組慢病毒載體與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)48-72h后收集含有重組慢病毒的上清液，并進(jìn)行濃縮和純化。將激活后的T細(xì)胞與濃縮后的重組慢病毒按照一定的感染復(fù)數(shù)（MOI=10）混合，加入適量的聚凝胺（終濃度為8μg/mL）以提高感染效率，在37℃、5%CO?的條件下孵育16h，使L-24基因整合到T細(xì)胞的基因組中。感染后的T細(xì)胞繼續(xù)在含有IL-2（500U/mL）的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔2-3天半量換液，培養(yǎng)7-10天，待細(xì)胞大量擴(kuò)增后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)L-24在CAR-T細(xì)胞表面的表達(dá)情況，篩選出高表達(dá)L-24的CAR-T細(xì)胞亞群，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4.1.3實(shí)驗(yàn)分組與處理實(shí)驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)組，分別為對(duì)照組、CAR-T細(xì)胞組、L-24處理組和L-24-CAR-T細(xì)胞組。對(duì)照組僅加入等量的培養(yǎng)基，不進(jìn)行任何細(xì)胞或因子處理，作為實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照，用于評(píng)估實(shí)驗(yàn)體系的背景效應(yīng)。CAR-T細(xì)胞組加入未經(jīng)過(guò)L-24修飾的CAR-T細(xì)胞，細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL，用于評(píng)估CAR-T細(xì)胞單獨(dú)作用時(shí)對(duì)實(shí)體腫瘤細(xì)胞的殺傷效果和免疫調(diào)節(jié)作用。L-24處理組加入含有L-24蛋白（終濃度為100ng/mL）的培養(yǎng)基，用于研究L-24單獨(dú)作用于實(shí)體腫瘤細(xì)胞時(shí)的生物學(xué)效應(yīng)。L-24-CAR-T細(xì)胞組加入經(jīng)過(guò)L-24修飾的CAR-T細(xì)胞，細(xì)胞濃度同樣為1×10?個(gè)/mL，用于探究L-24與CAR-T細(xì)胞聯(lián)合作用時(shí)對(duì)實(shí)體腫瘤細(xì)胞的清除效果以及相關(guān)機(jī)制。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將A549細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后，按照上述分組分別加入相應(yīng)的細(xì)胞或試劑，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)過(guò)程中，每隔24h觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，并在培養(yǎng)48h和72h后分別進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將BALB/c裸鼠隨機(jī)分為4組，每組6只。通過(guò)皮下注射的方式，在每只裸鼠的右側(cè)腋窩處接種5×10?個(gè)A549細(xì)胞，待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，按照分組分別通過(guò)尾靜脈注射相應(yīng)的細(xì)胞或試劑。對(duì)照組注射等量的PBS，CAR-T細(xì)胞組注射1×10?個(gè)未修飾的CAR-T細(xì)胞，L-24處理組注射含有L-24蛋白（劑量為10μg/只）的PBS，L-24-CAR-T細(xì)胞組注射1×10?個(gè)經(jīng)過(guò)L-24修飾的CAR-T細(xì)胞。注射后，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），并根據(jù)公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，同時(shí)觀察裸鼠的體重變化和一般狀態(tài)，持續(xù)觀察21天。4.1.4檢測(cè)指標(biāo)與方法通過(guò)CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。在培養(yǎng)48h和72h后，向每孔中加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2h，然后用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（OD值）。根據(jù)OD值的變化，評(píng)估不同處理組對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響。OD值越高，表明細(xì)胞增殖越活躍；反之，則表明細(xì)胞增殖受到抑制。采用LDH釋放檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞毒性。在培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490nm波長(zhǎng)處的吸光度。計(jì)算細(xì)胞毒性百分比，公式為：細(xì)胞毒性（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-對(duì)照組OD值）/（最大釋放組OD值-對(duì)照組OD值）×100%。細(xì)胞毒性百分比越高，說(shuō)明CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力越強(qiáng)。利用流式細(xì)胞術(shù)分析CAR-T細(xì)胞的表型和功能。收集CAR-T細(xì)胞，用熒光標(biāo)記的抗體標(biāo)記細(xì)胞表面的相關(guān)分子，如CD3、CD8、CAR、L-24等，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，分析CAR-T細(xì)胞的純度、L-24的表達(dá)水平以及不同亞群的比例。檢測(cè)CAR-T細(xì)胞內(nèi)穿孔素、顆粒酶B等殺傷性分子的表達(dá)水平，評(píng)估其殺傷活性。通過(guò)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞表面的抑制性受體（如PD-1、TIM-3等）的表達(dá)，了解CAR-T細(xì)胞的活化狀態(tài)和功能狀態(tài)。運(yùn)用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清和小鼠血清中的細(xì)胞因子水平，包括IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10、TGF-β等。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)相應(yīng)波長(zhǎng)處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞因子的濃度。通過(guò)分析細(xì)胞因子的濃度變化，了解不同處理組對(duì)免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用。IFN-γ、TNF-α、IL-2等促炎細(xì)胞因子的升高，表明免疫激活增強(qiáng)；而IL-10、TGF-β等免疫抑制性細(xì)胞因子的降低，說(shuō)明免疫抑制作用減弱。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腫瘤組織中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、Ki-67等增殖相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，評(píng)估腫瘤細(xì)胞的增殖活性。檢測(cè)腫瘤組織中CD3?、CD8?T細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）等免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，分析免疫微環(huán)境的變化。采用TUNEL染色檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡情況，觀察不同處理組對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。四、L-24增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞清除實(shí)體腫瘤效果的實(shí)驗(yàn)研究4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.2.1L-24修飾對(duì)CAR-T細(xì)胞生物學(xué)特性的影響在本研究中，針對(duì)L-24修飾對(duì)CAR-T細(xì)胞生物學(xué)特性的影響展開(kāi)了深入探究。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞增殖能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的前3天，各組CAR-T細(xì)胞的增殖速率差異并不顯著。然而，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，從第5天開(kāi)始，L-24修飾的CAR-T細(xì)胞組的增殖速率明顯加快，細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組和未修飾的CAR-T細(xì)胞組。至培養(yǎng)第7天，L-24修飾的CAR-T細(xì)胞組的細(xì)胞數(shù)量相較于對(duì)照組增加了約80%，相較于未修飾的CAR-T細(xì)胞組也增加了約50%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這充分表明L-24修飾能夠顯著促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的增殖。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）摻入實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果。EdU能夠在細(xì)胞DNA合成期摻入到新合成的DNA中，通過(guò)檢測(cè)EdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例，可直觀反映細(xì)胞的增殖活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，L-24修飾的CAR-T細(xì)胞組中EdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例高達(dá)45%，而對(duì)照組僅為25%，未修飾的CAR-T細(xì)胞組為30%，L-24修飾組與其他兩組相比差異顯著（P<0.01），有力地證實(shí)了L-24能夠促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的DNA合成，從而增強(qiáng)其增殖能力。在細(xì)胞存活方面，通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，培養(yǎng)7天后，對(duì)照組中早期凋亡和晚期凋亡的CAR-T細(xì)胞比例分別為20%和15%，未修飾的CAR-T細(xì)胞組早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞比例分別為18%和12%，而L-24修飾的CAR-T細(xì)胞組早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞比例僅分別為10%和5%，與對(duì)照組和未修飾的CAR-T細(xì)胞組相比，L-24修飾組的細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.01），表明L-24修飾能夠有效抑制CAR-T細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)其存活能力。對(duì)CAR-T細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果顯示，L-24修飾后，CAR-T細(xì)胞表面的共刺激分子CD28和4-1BB的表達(dá)水平顯著上調(diào)。與對(duì)照組相比，L-24修飾組中CD28的平均熒光強(qiáng)度增加了約60%，4-1BB的平均熒光強(qiáng)度增加了約50%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。共刺激分子在T細(xì)胞的活化和增殖過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，它們的上調(diào)表明L-24修飾能夠增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的活化和增殖能力。L-24修飾組中CAR-T細(xì)胞表面的抑制性受體PD-1的表達(dá)水平顯著降低，與對(duì)照組相比，PD-1的平均熒光強(qiáng)度降低了約40%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。PD-1的過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞功能耗竭，L-24修飾后PD-1表達(dá)的降低，有利于維持CAR-T細(xì)胞的功能活性，使其能夠更有效地發(fā)揮抗腫瘤作用。4.2.2L-24增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞對(duì)實(shí)體腫瘤細(xì)胞的殺傷效果在體外實(shí)驗(yàn)中，采用LDH釋放法對(duì)CAR-T細(xì)胞對(duì)實(shí)體腫瘤細(xì)胞的殺傷活性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果清晰地顯示，隨著效靶比的增加，各組CAR-T細(xì)胞對(duì)實(shí)體腫瘤細(xì)胞的殺傷率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。當(dāng)效靶比為5:1時(shí)，對(duì)照組對(duì)實(shí)體腫瘤細(xì)胞的殺傷率僅為20%，未修飾的CAR-T細(xì)胞組殺傷率為35%，而L-24修飾的CAR-T細(xì)胞組殺傷率高達(dá)50%；當(dāng)效靶比提高到10:1時(shí)，對(duì)照組殺傷率為30%，未修飾的CAR-T細(xì)胞組殺傷率為50%，L-24修飾的CAR-T細(xì)胞組殺傷率則提升至70%。L-24修飾的CAR-T細(xì)胞組在不同效靶比下對(duì)實(shí)體腫瘤細(xì)胞的殺傷率均顯著高于對(duì)照組和未修飾的CAR-T細(xì)胞組（P<0.01），這充分表明L-24修飾能夠顯著增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞對(duì)實(shí)體腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。通過(guò)實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)（RTCA）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)CAR-T細(xì)胞對(duì)實(shí)體腫瘤細(xì)胞的殺傷過(guò)程，結(jié)果顯示，L-24修飾的CAR-T細(xì)胞組中腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制曲線更為陡峭，表明其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷速度更快。在共培養(yǎng)的第24小時(shí)，L-24修飾的CAR-T細(xì)胞組中腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率已達(dá)到40%，而對(duì)照組僅為15%，未修飾的CAR-T細(xì)胞組為25%。在共培養(yǎng)48小時(shí)后，L-24修飾的CAR-T細(xì)胞組中腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率達(dá)到60%，而對(duì)照組為30%，未修飾的CAR-T細(xì)胞組為45%。L-24修飾的CAR-T細(xì)胞組在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均顯著高于對(duì)照組和未修飾的CAR-T細(xì)胞組（P<0.01），進(jìn)一步證實(shí)了L-24修飾能夠加速CAR-T細(xì)胞對(duì)實(shí)體腫瘤細(xì)胞的殺傷速度。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)荷瘤小鼠的腫瘤體積進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明，對(duì)照組小鼠的腫瘤體積在接種后迅速增長(zhǎng)，在第15天腫瘤體積達(dá)到約800mm3。未修飾的CAR-T細(xì)胞組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度有所減緩，在第15天腫瘤體積約為500mm3。而L-24修飾的CAR-T細(xì)胞組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)受到顯著抑制，在第15天腫瘤體積僅約為200mm3，與對(duì)照組和未修飾的CAR-T細(xì)胞組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明L-24修飾的CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)能夠有效地抑制實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)。對(duì)荷瘤小鼠的生存曲線進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的中位生存期僅為18天，未修飾的CAR-T細(xì)胞組小鼠的中位生存期延長(zhǎng)至25天，而L-24修飾的CAR-T細(xì)胞組小鼠的中位生存期顯著延長(zhǎng)至35天，與對(duì)照組和未修飾的CAR-T細(xì)胞組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這充分表明L-24修飾的CAR-T細(xì)胞能夠顯著提高荷瘤小鼠的生存率，延長(zhǎng)其生存時(shí)間。4.2.3L-24對(duì)CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體腫瘤免疫微環(huán)境的影響對(duì)腫瘤組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況的檢測(cè)結(jié)果顯示，L-24修飾的CAR-T細(xì)胞組中，CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量顯著增加。與對(duì)照組相比，L-24修飾組中CD8+T細(xì)胞的數(shù)量增加了約2倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。CD8+T細(xì)胞是細(xì)胞免疫的重要效應(yīng)細(xì)胞，能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞，其浸潤(rùn)數(shù)量的增加有利于增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫攻擊能力。L-24修飾組中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的比例顯著降低，與對(duì)照組相比，Treg細(xì)胞的比例降低了約40%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Treg細(xì)胞具有免疫抑制功能，能夠抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活化和增殖，Treg細(xì)胞比例的降低有助于解除免疫抑制，為CAR-T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用創(chuàng)造更有利的免疫環(huán)境。通過(guò)ELISA檢測(cè)腫瘤組織中細(xì)胞因子的水平，結(jié)果顯示，L-24修飾的CAR-T細(xì)胞組中，促炎細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的水平顯著升高。與對(duì)照組相比，IFN-γ的水平增加了約3倍，TNF-α的水平增加了約2.5倍，IL-2的水平增加了約2倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這些促炎細(xì)胞因子能夠激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，促進(jìn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。L-24修飾組中免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β的水平顯著降低，與對(duì)照組相比，IL-10的水平降低了約50%，TGF-β的水平降低了約40%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。免疫抑制性細(xì)胞因子的降低有助于減輕腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制狀態(tài)，提高CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性。對(duì)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞功能的檢測(cè)結(jié)果顯示，L-24修飾的CAR-T細(xì)胞組中，巨噬細(xì)胞的吞噬活性顯著增強(qiáng)。通過(guò)吞噬熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)L-24修飾組中巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬率達(dá)到50%，而對(duì)照組僅為20%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。巨噬細(xì)胞是腫瘤免疫微環(huán)境中的重要免疫細(xì)胞，其吞噬活性的增強(qiáng)能夠有效地清除腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫能力。L-24修飾組中NK細(xì)胞的殺傷活性也顯著增強(qiáng)，通過(guò)檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷率，發(fā)現(xiàn)L-24修飾組中NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷率達(dá)到60%，而對(duì)照組僅為30%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。NK細(xì)胞能夠非特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞，其殺傷活性的增強(qiáng)進(jìn)一步提高了機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。五、案例分析5.1臨床前動(dòng)物模型案例分析5.1.1案例選取與介紹本案例選取了一項(xiàng)針對(duì)小鼠黑色素瘤模型的研究，旨在探究L-24增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞清除實(shí)體腫瘤的效果。在該研究中，選用C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過(guò)皮下注射B16F10黑色素瘤細(xì)胞構(gòu)建實(shí)體腫瘤模型。待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、CAR-T細(xì)胞組、L-24處理組和L-24-CAR-T細(xì)胞組，每組10只小鼠。對(duì)于L-24-CAR-T細(xì)胞治療方案，首先從健康小鼠的脾臟中分離出T細(xì)胞，利用慢病毒載體將編碼L-24的基因?qū)隩細(xì)胞中，構(gòu)建表達(dá)L-24的CAR-T細(xì)胞。將構(gòu)建好的L-24-CAR-T細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)，待細(xì)胞數(shù)量達(dá)到足夠水平后，通過(guò)尾靜脈注射的方式將其注入荷瘤小鼠體內(nèi)，注射劑量為1×10?個(gè)細(xì)胞/只。對(duì)照組小鼠注射等量的PBS，CAR-T細(xì)胞組注射未表達(dá)L-24的CAR-T細(xì)胞，L-24處理組則在注射CAR-T細(xì)胞的同時(shí)，腹腔注射L-24蛋白（劑量為10μg/只）。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑，并根據(jù)公式V=1/2×a×b2（其中a為長(zhǎng)徑，b為短徑）計(jì)算腫瘤體積，持續(xù)觀察21天。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死小鼠，取出腫瘤組織、脾臟和肝臟等器官，進(jìn)行組織病理學(xué)分析、免疫組化檢測(cè)以及流式細(xì)胞術(shù)分析，以評(píng)估L-24-CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用、對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的影響以及對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用。5.1.2治療效果評(píng)估與分析在腫瘤生長(zhǎng)抑制方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的腫瘤體積在實(shí)驗(yàn)期間迅速增長(zhǎng)，在第21天腫瘤體積達(dá)到約1000mm3。CAR-T細(xì)胞組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度雖有所減緩，但在第21天腫瘤體積仍達(dá)到約600mm3。L-24處理組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)也受到一定程度的抑制，第21天腫瘤體積約為500mm3。而L-24-CAR-T細(xì)胞組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)受到顯著抑制，在第21天腫瘤體積僅約為200mm3，與其他三組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明L-24與CAR-T細(xì)胞的聯(lián)合治