黃曲霉毒素B1的測(cè)定

主講教師：呂

偉農(nóng)產(chǎn)品食品檢驗(yàn)員——膠體金法——高效液相色譜柱前衍生法目錄測(cè)定黃曲霉毒素B1的意義1膠體金免疫層析法測(cè)定AFTB12膠體金快速測(cè)定法測(cè)定AFTB13高效液相色譜柱前衍生法準(zhǔn)備工作45高效液相色譜柱前衍生法測(cè)定6高效液相色譜柱前衍生法結(jié)果表述3案例：

1960年英國(guó)發(fā)生的10萬只火雞吃了黃曲霉毒素污染的花生粉后的中毒死亡事件，引起人們對(duì)真菌毒素中毒的高度關(guān)注。

我國(guó)學(xué)者首次在國(guó)際會(huì)議上提供了黃曲霉毒素暴露與肝癌發(fā)生直接關(guān)系的證據(jù)，證實(shí)了乙肝表面抗原與黃曲霉毒素暴露對(duì)肝癌有明顯協(xié)同作用，增加肝癌的發(fā)病率。此外，還能誘發(fā)胃癌、直腸癌與乳腺癌等。

測(cè)定黃曲霉毒素B1

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黃曲霉毒素B1限量

1966年FAO/WHO規(guī)定食品中黃曲霉毒素B1允許量≤30μg/L（kg）。1966年至1975年間，WHO/FAO連續(xù)3次修訂了食品中黃曲霉毒素最高允許量標(biāo)準(zhǔn)，將其從30μg/L（kg）逐步降低至15μg/L（kg）。歐盟則規(guī)定從1998年起進(jìn)口花生原料中的黃曲霉毒素限量由20μg/kg，花生制品由10μg/kg統(tǒng)一降至4μg/kg，嬰幼兒食品0.5μg/kg（0.36mg/kg）5

學(xué)習(xí)目標(biāo)

1、掌握膠體金法、柱前衍生法測(cè)定原理。2、學(xué)會(huì)配制黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。3、會(huì)規(guī)范完成樣品取樣與處理操作。

4、會(huì)規(guī)范完成樣品中黃曲霉毒素B1的提取操作。5、學(xué)會(huì)規(guī)范使用膠體金檢測(cè)卡操作與保存。

6、能完成膠體金反應(yīng)判斷與結(jié)果處理。

7、掌握凈化柱操作要求。

8、掌握液相色譜測(cè)定準(zhǔn)備工作要求。

9、會(huì)完成柱前衍生法測(cè)定結(jié)果表述。

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膠體金免疫層析法測(cè)定AFTB1

方法一膠體金免疫層析法測(cè)定AFTB17

膠體金免疫層析法測(cè)定AFTB1的原理

基于特異性抗原抗體反應(yīng)和免疫層析技術(shù)，以膠體金為載體，采用競(jìng)爭(zhēng)法反應(yīng)原理。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取，經(jīng)過濾或離心、吹干、稀釋后，加入檢測(cè)卡中，樣品中的黃曲霉毒素B1會(huì)與膠體金特異性抗體結(jié)合，通過檢測(cè)色帶是否顯色來判定樣品中黃曲霉毒素B1的含量。8（1）試劑為分析純，實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682中一級(jí)水。（2）黃曲霉毒素B1膠體金檢測(cè)卡性能測(cè)定。黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫檢測(cè)卡性能評(píng)價(jià)：①黃曲霉毒素B1膠體金快速檢測(cè)卡的技術(shù)要求；a.基本要求。工作環(huán)境要求：氣溫20~30℃，交叉反應(yīng)：對(duì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素、玉米赤霉烯酮、

赭曲霉毒素及其他真菌毒素均無交叉反應(yīng)。

膠體金免疫層析法測(cè)定AFTB1準(zhǔn)備工作

9b.性能要求，外觀：檢測(cè)卡表面應(yīng)光滑平整，顏色均勻一致，纖維膜面無氣泡、麻點(diǎn)、起皺、刷痕等缺陷；點(diǎn)樣孔應(yīng)潔凈；文字、符號(hào)等標(biāo)志應(yīng)字體端正、清晰、正確。

膠體金免疫層析法測(cè)定AFTB1準(zhǔn)備工作

10C準(zhǔn)確性

樣品的檢測(cè)結(jié)果誤判率應(yīng)不超過10%；不允許存在假陰性。檢測(cè)卡對(duì)不同種類的谷物檢測(cè)有不同的檢測(cè)誤差范圍，如大米糙米樣品檢測(cè)卡的檢測(cè)誤差范圍是±2μg/kg；玉米樣品檢測(cè)卡的檢測(cè)誤差范圍是±4μg/kg。d穩(wěn)定性

同批次檢測(cè)卡，不同批次檢測(cè)卡的誤判率均應(yīng)不超過10%。

膠體金免疫層析法測(cè)定AFTB1準(zhǔn)備工作

11（3）乙酸乙酯。（4）磷酸氫二鈉（Na2HPO4）。（5）氯化鈉（NaCl）。（6）氯化鉀（KCl）。（7）濃鹽酸（HCl）。（8）PBS緩沖液。分別稱取1.42g磷酸氫二鈉、8g氯化鈉、0.2g氟化鉀，加800mL水充分?jǐn)嚢瑁芙?，加入濃鹽酸

調(diào)整PH至7.4，用水定容至1L。

膠體金免疫層析法測(cè)定AFTB1準(zhǔn)備工作

12（1）天平：分度值0.01g量程210g。（2）粉碎機(jī)。（3）離心機(jī)。轉(zhuǎn)速4000r/min。（4）振蕩器。（5）計(jì)時(shí)器。（6）電吹風(fēng)機(jī)。500~1000W。（7）離心管。

膠體金免疫層析法測(cè)定AFTB1準(zhǔn)備工作

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膠體金免疫層析法測(cè)定AFTB1-主要流程

扦樣與分樣樣品粉碎處理待測(cè)液制備

加樣

免疫反應(yīng)顯色反應(yīng)結(jié)果判定14①采取有代表性樣品。②對(duì)局部發(fā)霉變質(zhì)的樣品單獨(dú)取樣。③大樣經(jīng)粗碎與連續(xù)多次用四分法縮減至0.5~1kg，全部粉碎，糧食過20目篩，花生過10目篩，混勻。膠體金免疫層析法測(cè)定AFTB1-取樣15膠體金免疫層析法測(cè)定AFTB1–提取稱取樣品2.0g于離心管加入2mL水和8mL乙酸乙酯，注意密封，振蕩3~5min4000r/min轉(zhuǎn)速離心1min取2mL上清液到玻璃燒杯中，用電吹風(fēng)機(jī)吹干上清液加0.4mLPBS緩沖液復(fù)溶燒杯底的殘留物16

不同品種糧食黃曲霉毒素B1限量的不同，選擇不同體積的PBS緩沖液復(fù)溶燒杯底的殘留物。黃曲霉毒素B1限量為5μg/kg，則加0.4mLPBS緩沖液復(fù)溶燒杯底的殘留物；黃曲霉毒素B1限量為10μg/kg，則加0.8mLPBS緩沖液復(fù)溶燒杯底的殘留物，黃曲霉毒素B1限量為20μg/kg，則加1.6mLPBS緩沖液復(fù)溶燒杯中的殘留物。膠體金免疫層析法測(cè)定AFTB1–提取17

取3~4滴待測(cè)溶液緩慢滴加到檢測(cè)卡加樣小孔中，開始計(jì)時(shí)，5min后判讀結(jié)果。

結(jié)果符合檢測(cè)誤差范圍要求，玉米樣品檢測(cè)卡

檢測(cè)誤差范圍是±4μg/kg。

同批次檢測(cè)卡，不同批次檢測(cè)卡的誤判率均應(yīng)

不超過10%。

膠體金免疫層析法測(cè)定AFTB1–測(cè)定18

存放在密封的容器中，在干燥、避光以及陰涼的環(huán)境（2~8℃）中保存。避免暴露于日光下或潮濕、溫度升高、具有化學(xué)氣體的環(huán)境中。在適當(dāng)條件下存放時(shí)，試紙條在指定有效期內(nèi)性能是穩(wěn)定的。

膠體金免疫層析法-檢測(cè)卡儲(chǔ)存191、無效。質(zhì)控色帶不顯色，此檢測(cè)卡無效。2、陰陽性樣品。

質(zhì)控色帶顯色，檢測(cè)色帶顯色，判為陰性，即樣品中不含黃曲霉毒素B1或黃曲霉毒素B1含量低于本次檢測(cè)所設(shè)定的限量值。

質(zhì)控色帶顯色，檢測(cè)色帶不顯色或顏色非常模糊時(shí)，判為陽性，即樣品中黃曲霉毒素B1含量高于本次檢測(cè)所設(shè)定的限量值。

膠體金免疫層析法-結(jié)果判斷201、測(cè)試卡性能測(cè)試2、質(zhì)控色帶顯色3、結(jié)果分析

膠體金免疫層析法-說明21

方法二

膠體金快速定量測(cè)定AFTB1

適用于小麥、大米和玉米等谷物中黃曲霉毒素

B1快速定量篩查，檢測(cè)限為2μg/kg。

膠體金快速定量測(cè)定AFTB122

試樣提取液中黃曲霉毒素B1與檢測(cè)條中膠體金微粒發(fā)生顯色反應(yīng)，顏色深淺與試樣中黃曲霉毒素B1含量相關(guān)。用讀數(shù)儀測(cè)定檢測(cè)線和質(zhì)控線顏色深淺，根據(jù)顏色深淺和儀器內(nèi)置曲線自動(dòng)計(jì)算出試樣中黃曲霉毒素B1含量。

膠體金快速定量測(cè)定AFTB1-原理231、實(shí)驗(yàn)室用水應(yīng)符合GB/T6682中三級(jí)水。2、稀釋緩沖液。3、提取液（70%甲醇溶液）4、天平（分度值0.01g）、小型粉碎機(jī)（20目）5、離心機(jī)（不低于4000r/min）、渦旋振蕩器。6、孵育器。7、讀數(shù)儀。8、針頭過濾器。（R15，孔徑0.45μm）9、濾紙。采用Whatman2V（或等效）濾紙。

膠體金快速定量測(cè)定AFTB1-準(zhǔn)備工作241、準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)

采用2、10和40μg/kg三個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)樣品，每個(gè)濃度水平測(cè)定不低于6次，計(jì)算檢測(cè)條檢測(cè)結(jié)果與實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)品的偏差，3個(gè)濃度水平的偏差均應(yīng)控制在-20%~+20%。2、精密度評(píng)價(jià)

采用黃曲霉毒素B110μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)樣品，每個(gè)濃度水平測(cè)定不低于6次，計(jì)算檢測(cè)條批內(nèi)變異系數(shù)，變異系數(shù)應(yīng)≤25%。

膠體金快速定量測(cè)定AFTB1-檢測(cè)卡評(píng)價(jià)25

膠體金快速定量黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1、AFTB1標(biāo)準(zhǔn)品純度≥98%，經(jīng)國(guó)家授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書。2、黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：準(zhǔn)確稱取0.02mg黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，加入甲醇溶解，配置成1mg/ml溶液，甲醇-PBS溶液（20+80）稀釋至10μg/mL，避光，于4℃冰箱保存。263、檢測(cè)限：測(cè)定20份陰性樣品，計(jì)算平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差，其結(jié)果應(yīng)小于或等于產(chǎn)品靈敏度標(biāo)示值。4、批間穩(wěn)定性評(píng)價(jià)：采用10μg/kg左右濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)樣品，不得低于6個(gè)批次，批次測(cè)定取平均值，計(jì)算批間變異系數(shù)，變異系數(shù)應(yīng)≤20%。

檢測(cè)條自帶陰性質(zhì)控和陽性質(zhì)控樣品，陰性質(zhì)控的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)小于2ug/kg，陽性質(zhì)控樣品的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)在12~28μg/kg范圍內(nèi)，表明檢測(cè)條質(zhì)量合格。

膠體金快速定量測(cè)定AFTB1-檢測(cè)卡評(píng)價(jià)27

膠體金快速定量測(cè)定AFTB1-主要流程

扦樣與分樣樣品粉碎處理提取與過濾

加樣

孵育反應(yīng)觀察質(zhì)控帶結(jié)果判定

重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果分析28

稱取10.00g樣品于具塞錐形瓶中，加入20.0mL

70%甲醇溶液，密閉，用渦旋振蕩器振蕩1~2min，靜置后濾紙過濾，加入1.0mL稀釋緩沖液。

取1.0~1.5mL樣品混合液于離心管中，用離心機(jī)（4000r/min）離心1min。取上清液100uL于另一離心管中，加入1.0mL稀釋緩沖液。

膠體金快速定量測(cè)定AFTB1-樣品處理29

膠體金快速定量法測(cè)定AFTB1–樣品測(cè)定取300μL待測(cè)溶液，加入檢測(cè)條加樣孔中，關(guān)閉加樣孔及孵育器。孵育5min后，取出檢測(cè)條觀察C線（質(zhì)控線）和T線（檢測(cè)線）C線（質(zhì)控線）不出現(xiàn)。C線彌散或嚴(yán)重不均勻。C線出現(xiàn)，但T1或T2線（檢測(cè)線）嚴(yán)重不均。設(shè)定基質(zhì)為0（MATRIX00），樣品測(cè)（2min）結(jié)果讀取μg/kg讀數(shù)儀“+30”，取300μL稀釋提取液+1.0mL稀釋緩沖液混勻重新測(cè)定，基質(zhì)設(shè)定為01（MATRIX01）2次測(cè)試結(jié)果絕對(duì)差值＞算數(shù)平均數(shù)20%（5%）質(zhì)控合格301、測(cè)試卡性能測(cè)試2、質(zhì)控線觀察3、結(jié)果判斷

膠體金快速定量測(cè)定AFTB1-說明31

方法三

高效液相色譜柱前衍生法

高效液相色譜柱前衍生法測(cè)定AFTB132

試樣中的黃曲霉毒素B1用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取，提取液經(jīng)黃曲霉毒素固相凈化柱凈化去除脂肪、蛋白質(zhì)、色素及碳水化合物等干擾物質(zhì)，凈化液用三氟乙酸柱前衍生，液相色譜分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。

高效液相色譜柱前衍生法測(cè)定AFTB1原理33

甲醇、乙腈、正己烷色譜純

三氟乙酸(CF,COOH)

乙腈-水溶液(84+16)

甲醇-水溶液(70+30)

乙腈-水溶液(50+50)

乙腈-甲醇溶液(50+50)

高效液相色譜柱前衍生法準(zhǔn)備工作34勻漿機(jī)6500r/min~24000r/min高速粉碎機(jī)、組織搗碎機(jī)、渦旋振蕩器

天平（0.01g、0.00001g）離心機(jī)轉(zhuǎn)速≥6000r/min玻璃纖維濾紙:快速、高載量、顆粒保留1.6μm氮吹儀。

高效液相色譜柱前衍生法準(zhǔn)備工作35液相色譜儀（配熒光檢測(cè)器）。色譜分離柱。黃曲霉毒素專用型固相萃取凈化柱一次性微孔濾頭，帶0.22um微孔濾膜(所選用濾膜應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)溶液檢驗(yàn)確認(rèn)無吸附現(xiàn)象)。篩網(wǎng):1mm~2mm試驗(yàn)篩孔徑

高效液相色譜柱前衍生法準(zhǔn)備工作36

AFTB1標(biāo)準(zhǔn)品配制

AFTB1標(biāo)準(zhǔn)品純度98%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(10μg/mL)稱取AFTB11mg（精確0.01mg），用乙腈溶解并定容至100mL，-20℃下避光保存，備用，臨用前進(jìn)行濃度校準(zhǔn)。

高效液相色譜柱前衍生法準(zhǔn)備工作37

用苯-乙腈(98+2)或甲苯-乙腈(9+1)或甲醇或乙腈溶液配制8μg/mL~10μg/mL的AFTB1,在最大吸收波段處測(cè)定溶液的吸光度，確定AFTB1濃度。

用分光光度計(jì)在340nm~370nm處測(cè)定,經(jīng)扣除溶劑的空白試劑本底，校正比色皿系統(tǒng)誤差后，讀取標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大吸收波長(zhǎng)處吸光度值A(chǔ)。

高效液相色譜柱前衍生法準(zhǔn)備工作38ρ=AXMx1000/ερ-校準(zhǔn)測(cè)定的AFTB1的實(shí)際濃度ug/mLA--在λmax處測(cè)得的吸光度值;M-AFTB1摩爾質(zhì)量g/molε-溶液中的AFTB1的吸光系數(shù)m2/mol

高效液相色譜柱前衍生法準(zhǔn)備工作391、液體樣品(植物油、醬油、醋等)采樣量需大于1L，對(duì)于袋裝、瓶裝等包裝樣品需至少采集3個(gè)包裝，將所有液體樣品在一個(gè)容器中用勻漿機(jī)混勻后，其中任意的100g(mL)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

高效液相色譜柱前衍生法-樣品制備402、固體樣品(谷物及其制品、堅(jiān)果及籽類、嬰幼兒谷類輔助食品)采樣量需大于1kg，用高速粉碎機(jī)將其粉碎，過

篩，使其粒徑小于2mm孔徑試驗(yàn)篩，混合均勻后縮分至100g，儲(chǔ)存于樣品瓶中，密封保存。

高效液相色譜柱前衍生法-樣品制備413、半流體(腐乳、豆豉等)采樣量需大于1kg(L),對(duì)于袋裝、瓶裝等包裝樣品需至少采集3個(gè)包裝,用組織搗碎機(jī)搗碎混勻后，儲(chǔ)存于樣品瓶中，密封保存。

高效液相色譜柱前衍生法-樣品制備421、植物油脂稱取5g試樣(精確至0.01g)于50ml離心管中，加人20ml乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30)，渦旋混勻，置于渦旋振蕩器振蕩20min或用均質(zhì)器均質(zhì)3min，在6000r/min離心10min，取上清液備用。

高效液相色譜柱前衍生法-樣品提取432、醬油、醋稱取5g試樣(精確至0.01g)于50mL離心管中，用乙腈或甲醇定容至25mL(精確至0.1mL)，渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20min或用均質(zhì)器均質(zhì)3min，在6000r/min下離心10min或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過濾，取上清液備用。

高效液相色譜柱前衍生法-樣品提取443、一般固體樣品取5g試樣(精確至0.01g)于50mL離心管中，加入

20.0mL乙腈-水溶液(84+16)或甲醇水混勻，置于渦旋振蕩器振蕩20min或用均質(zhì)器均質(zhì)3min，在6000r/min下離心10min，取上清液備用。

高效液相色譜柱前衍生法-樣品提取45

高效液相色譜柱前衍生法測(cè)定AFTB1-凈化凈化柱室溫平衡過柱:樣品提取稀釋液上柱，可以加壓或抽真空，流速1-2滴/秒。黃曲霉毒素B1計(jì)為150ng。蒸餾水清洗凈化柱，氣體吹掃或抽真空除去柱子中的殘余的水份。1ml甲醇洗脫柱子，可洗2次，第一次加入的甲醇需在柱子中保持5min進(jìn)行活化柱子。洗脫液稀釋或濃縮，以便達(dá)到HPLC檢測(cè)要求;或?qū)⑾疵撘盒⌒牡貪饪s至干，在低溫避光條件下進(jìn)行保存。46

高效液相色譜柱前衍生法測(cè)定AFTB1-衍生