Bph15基因介導的水稻抗性對褐飛虱卵巢發(fā)育基因表達的調控機制探究一、引言1.1研究背景與意義水稻作為全球最重要的糧食作物之一，為超過半數(shù)的世界人口提供主食，在保障糧食安全和維持人類生存發(fā)展方面發(fā)揮著不可替代的作用。據統(tǒng)計，全球水稻年產量超過7億噸，其提供了人類總消耗熱量的1/5、蛋白質的1/8，尤其在亞洲地區(qū)，90%的水稻在此種植并消費，養(yǎng)活了數(shù)十億人口。在中國，水稻的種植歷史源遠流長，從長江流域的早期馴化到如今遍布全國的廣泛種植，水稻不僅是餐桌上的主食，更是農業(yè)經濟的重要支柱，承載著深厚的文化底蘊。然而，水稻生產面臨著諸多生物脅迫的挑戰(zhàn)，其中褐飛虱（NilaparvatalugensStal）是最為嚴重的害蟲之一。褐飛虱屬半翅目飛虱科，是一種遷飛性害蟲，主要依靠氣流進行遠距離遷飛，每年發(fā)生數(shù)代，自北而南遞增。其繁殖速度極快，食性專一，僅取食水稻和野生稻。褐飛虱喜溫暖高濕的氣候條件，在適宜環(huán)境下，易在水稻穗期暴發(fā)成災。它對水稻的危害是多方面的：成、若蟲群集于稻叢底部，通過刺吸莖葉組織汁液，使水稻植株含水量迅速下降，同時唾液腺分泌的有毒物質會破壞水稻組織，在莖上形成褐色斑點，嚴重時導致稻株基部變黑、癱瘓倒伏，即俗稱的“冒穿”“虱燒”“透天”，造成嚴重減產甚至絕收；雌蟲產卵時，用產卵管穿透葉鞘和莖組織，形成大量傷口，加速水分散失和稻株倒伏，且傷口是水稻小球菌核病等病菌入侵的途徑；褐飛虱還會傳播水稻鋸齒葉矮縮病、草叢狀矮縮病等病毒病，其取食時排泄的蜜露富含糖類和氨基酸，易招致煤煙病菌滋生，影響水稻光合作用。在我國，褐飛虱常造成大面積水稻受災，給農業(yè)生產帶來巨大損失。長期以來，化學防治是控制褐飛虱的主要手段，有機磷、氨基甲酸酯、噻嗪酮和新煙堿類等內吸性強的殺蟲劑被廣泛使用。但化學防治帶來了一系列問題，如環(huán)境污染，大量化學農藥的使用對土壤、水源和空氣造成污染，破壞生態(tài)平衡；害蟲抗藥性不斷增強，隨著化學農藥的頻繁使用，褐飛虱對多種農藥產生了抗性，導致防治效果下降，不得不增加用藥量和用藥次數(shù)，形成惡性循環(huán)。物理防治利用褐飛虱趨光性，在成蟲盛發(fā)期設置誘蟲燈，或在蟲害重發(fā)區(qū)用防蟲網、無紡布覆蓋，但這些方法存在成本高、覆蓋范圍有限等局限性。生物防治借助寄生蜂、黑肩綠盲蝽、瓢蟲、蜘蛛等天敵以及褐飛虱的病原微生物，但天敵的數(shù)量和活性易受環(huán)境影響，生物防治的穩(wěn)定性和可控性有待提高。利用水稻寄主抗性防治褐飛虱成為研究的焦點。通過挖掘和利用水稻自身的抗性基因，培育抗褐飛虱水稻品種，是一種經濟、環(huán)保且可持續(xù)的防治策略。Bph15基因是從藥用野生稻（Oryzaofficinalis）中鑒定得到的抗褐飛虱基因，已在全國多個水稻育種項目中廣泛應用，對褐飛虱表現(xiàn)出顯著抗性。褐飛虱的卵巢發(fā)育是其繁殖過程中的關鍵環(huán)節(jié)，直接影響其種群數(shù)量的增長。研究含有Bph15基因的水稻對褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因表達的調控，有助于深入理解水稻與褐飛虱的互作機制，明確Bph15基因抗蟲的分子機理。這不僅為培育更高效的抗褐飛虱水稻品種提供理論依據，推動水稻抗蟲育種的發(fā)展，還能為開發(fā)基于基因調控的綠色防控技術提供新的思路，減少化學農藥的使用，實現(xiàn)農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，開展這一研究具有重要的理論和實踐意義。1.2褐飛虱研究概況褐飛虱（NilaparvatalugensSt?l）隸屬半翅目（Hemiptera）飛虱科（Delphacidae），是一種在亞洲地區(qū)廣泛分布且對水稻危害嚴重的害蟲，主要分布于亞洲、大洋洲和太平洋島嶼的產稻國。在我國，其在各省、自治區(qū)均有發(fā)生，尤其在長江流域及其以南地區(qū)危害嚴重。褐飛虱的一生歷經卵、若蟲和成蟲三個階段。卵通常呈香蕉狀，乳白至淡黃色，被雌蟲產在葉鞘和葉片組織內，排列成“卵條”。若蟲共分為5齡，初孵時為淡黃白色，隨后逐漸變?yōu)楹稚w形呈橢圓形，5齡若蟲在第3、4節(jié)腹背各有1個明顯的山字形淺斑。成蟲具備長翅型和短翅型兩種形態(tài)，全體褐色且富有光澤。長翅型體長（連翅）4-5mm，短翅型雌蟲3.5-4mm，雄蟲2.2-2.5mm，短翅型翅長不達腹末。長翅成蟲善于飛行，能夠借助氣流進行遠距離遷飛，每年發(fā)生數(shù)代，自北而南遞增，這使得其蟲源可以在不同地區(qū)間擴散，加大了防治難度。短翅成蟲雖然飛行能力較弱，但產卵量多，發(fā)育速度快，其大量出現(xiàn)往往預示著蟲害即將爆發(fā)。褐飛虱食性專一，在自然條件下僅取食水稻和普通野生稻。它偏好溫暖高濕的氣候環(huán)境，最適宜的溫度范圍為26-28℃，相對濕度在80%以上。在這樣的環(huán)境中，褐飛虱繁殖迅速，種群數(shù)量極易快速增長。其繁殖能力極強，一只雌蟲在適宜條件下可產卵300-700粒，這使得其種群能夠在短時間內迅速擴大。褐飛虱的發(fā)生與水稻的生育期密切相關，在水稻孕穗至抽穗期，植株營養(yǎng)豐富，為褐飛虱提供了良好的食物條件，此時褐飛虱若大量繁殖，易引發(fā)嚴重的蟲害。此外，種植密度過大、偏施氮肥等不合理的栽培管理措施，會使水稻植株生長嫩綠、田間通風透光條件差，也有利于褐飛虱的滋生和危害。在我國，褐飛虱的發(fā)生呈現(xiàn)出明顯的季節(jié)性和區(qū)域性規(guī)律。每年春、夏季節(jié)，隨著暖濕氣流由南向北推進，褐飛虱會逐代逐區(qū)向北遷移，常年有5次自南向北的遷飛過程。3月下旬到5月，褐飛虱隨西南氣流從北緯19°以南終年發(fā)生區(qū)遷入我國，主降在珠江流域及閩南等地，在早稻上繁殖2代后，6月間早稻黃熟時產生長翅型成蟲向北遷飛，主降在南嶺南北，波及長江以南；7月上旬從南嶺南北稻區(qū)遷入長江流域，并波及淮河流域；7月下旬至8月上旬長江以南雙季稻成熟時，遷至江淮間和淮北稻區(qū)。8月下旬至9月上旬淮北及江淮單季稻成熟時，褐飛虱又開始隨南向氣流向南遷移，常年出現(xiàn)3次回遷。這種遷飛規(guī)律使得不同地區(qū)在不同時間面臨褐飛虱的危害威脅。1.3Bph15基因相關研究進展Bph15基因最早是從藥用野生稻（Oryzaofficinalis）中鑒定得到的抗褐飛虱基因。在其發(fā)現(xiàn)過程中，科研人員通過對大量野生稻資源的篩選和鑒定，運用現(xiàn)代分子生物學技術，最終成功確定了Bph15基因的存在。早期研究利用RI93/TN1的F2群體，將Bph15初步定位到水稻四號染色體短臂分子標記RG1和RG2之間。為了進一步克隆該基因，研究人員構建回交群體，利用隨機BC1F2群體把Bph15基因初步定位于SSR標記RM268和S16之間。之后，又從13,000株BC2F2群體里篩選出54株重組單株，把基因進一步定位到g12140-2和T6之間。盡管后續(xù)從10,000株BC4F2群體里篩選得到61株重組單株，但未能將基因定位到更小的區(qū)間。最終，通過構建基因組文庫、PCR篩選BACDNA克隆以及測序分析等一系列復雜的實驗操作，將Bph15基因定位到g12140-2和T12之間，該區(qū)間物理距離有580-kb。通過FGENESH軟件分析，該區(qū)間有87個預測基因，且抗性親本中此段染色體序列和日本晴參考序列中對應的染色體序列有極大的差異，這種差異導致同源染色體間不能配對，進而造成此段區(qū)間重組受到極大抑制。在水稻育種領域，Bph15基因已在全國多個水稻育種項目中廣泛應用。通過傳統(tǒng)雜交育種與現(xiàn)代分子標記輔助選擇技術相結合的方法，將Bph15基因導入到優(yōu)良水稻品種中，培育出了一系列具有抗褐飛虱特性的水稻新品種。這些新品種在田間表現(xiàn)出良好的抗蟲性，有效減少了褐飛虱對水稻的危害，降低了化學農藥的使用量，提高了水稻的產量和品質。例如，在一些褐飛虱常發(fā)地區(qū)，種植含有Bph15基因的水稻品種后，褐飛虱的蟲口密度明顯降低，水稻的受害程度顯著減輕，產量得到了穩(wěn)定保障。同時，這些抗蟲品種還具有較好的農藝性狀，如株型緊湊、分蘗力強、米質優(yōu)良等，受到了農民的廣泛歡迎。然而，當前對于Bph15基因的研究仍存在一定的不足。雖然已經明確了Bph15基因的定位和在水稻育種中的應用，但對于其抗蟲的分子機制尚未完全闡明。例如，Bph15基因如何感知褐飛虱的取食信號，如何激活水稻體內的抗蟲防御反應，以及在這一過程中涉及哪些信號傳導途徑和關鍵基因等問題，都有待進一步深入研究。此外，雖然培育出了一些含有Bph15基因的抗蟲水稻品種，但這些品種在不同生態(tài)環(huán)境下的抗蟲穩(wěn)定性以及與其他優(yōu)良性狀的協(xié)同表達情況，還需要更多的田間試驗和長期監(jiān)測來評估。而且，隨著褐飛虱種群的進化和變異，其對含有Bph15基因水稻品種的適應性變化也需要密切關注。本研究將聚焦于含有Bph15基因的水稻對褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因表達的調控。通過深入研究這一調控機制，有望揭示Bph15基因抗蟲的新途徑，為進一步完善水稻抗褐飛虱的分子機制提供理論依據。同時，研究結果也將為培育更具持久抗性、綜合性狀更優(yōu)良的抗褐飛虱水稻品種提供新的思路和方法。在實驗設計上，將利用現(xiàn)代分子生物學技術，如實時熒光定量PCR、RNA測序、基因編輯等，系統(tǒng)分析褐飛虱取食含有Bph15基因水稻前后，其卵巢發(fā)育相關基因的表達變化，以及這些變化與Bph15基因抗蟲性之間的內在聯(lián)系。二、材料與方法2.1實驗材料實驗選用含Bph15基因的水稻品種兩優(yōu)234，該品種是以含Bph14和Bph15抗飛虱基因的自育不育系Bph68s為母本，與自育恢復系R610234為父本組配而成的兩系雜交稻。母本Bph68S是以外引廣占63-4S為母本，與自育高抗褐飛虱材料B5雜交1代，再以廣占63-4S為母本與F1進行回交，對BC1F1進行SSR分子標記輔助選擇，確定同時含有Bph14和Bph15兩個抗性基因的單株為母本，再以廣占63-4S為父本進行回交4代，然后在不育株率為100%的株系中，選擇花粉不育度為100%并且同時含有Bph14和Bph15兩個抗性基因的單株割蔸，帶海南套袋自交5代、測交，經4年10代選育而成。普通水稻品種則選用TN1，TN1是一種感蟲水稻品種，對褐飛虱缺乏抗性，常被用作對照品種用于抗蟲性研究。實驗所用褐飛虱采自[具體地點]的稻田，該地區(qū)水稻種植面積廣闊，褐飛虱發(fā)生較為普遍。采集時，選取有明顯褐飛虱危害癥狀的水稻植株，用吸蟲管小心收集褐飛虱成蟲和若蟲。將采集到的褐飛虱帶回實驗室后，飼養(yǎng)在溫度為（26±1）℃、相對濕度為（80±5）%、光照周期為16L:8D的人工氣候箱中。飼養(yǎng)所用的水稻苗為TN1水稻品種，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照強度為3000lx，溫度為（28±1）℃，濕度為（70±5）%。待水稻苗長至3-4葉期時，用于飼養(yǎng)褐飛虱。飼養(yǎng)過程中，定期更換水稻苗，以保證褐飛虱有充足的食物來源。2.2實驗方法2.2.1褐飛虱飼養(yǎng)與處理將從稻田采集回的褐飛虱放置于溫度設定為（26±1）℃、相對濕度維持在（80±5）%、光照周期遵循16L:8D的人工氣候箱內飼養(yǎng)。飼養(yǎng)過程中，選用在光照培養(yǎng)箱中培育的TN1水稻苗作為褐飛虱的食物來源。光照培養(yǎng)箱內光照強度設置為3000lx，溫度保持在（28±1）℃，濕度為（70±5）%。待TN1水稻苗長至3-4葉期時，將其轉移至養(yǎng)蟲籠中，每個養(yǎng)蟲籠放入適量的褐飛虱成蟲和若蟲。在養(yǎng)蟲籠內，定期更換水稻苗，以保證褐飛虱有充足且新鮮的食物供應。將飼養(yǎng)的褐飛虱分為兩組進行處理。一組放置于含有Bph15基因的水稻品種兩優(yōu)234上取食，另一組放置于普通水稻品種TN1上取食。每個處理設置三個生物學重復，每個重復包含30-50頭褐飛虱成蟲或若蟲。在處理過程中，持續(xù)觀察褐飛虱的生長發(fā)育情況，包括若蟲的蛻皮次數(shù)、發(fā)育歷期，成蟲的羽化時間、產卵量等。并記錄褐飛虱在不同水稻品種上的取食偏好，如取食部位、取食痕跡等。同時，利用體視顯微鏡觀察褐飛虱的形態(tài)變化，如翅膀的發(fā)育、體型的增長等。2.2.2水稻種植與管理水稻種子經過篩選，去除癟粒、病粒后，用清水浸泡12-24小時，然后置于30-32℃的恒溫培養(yǎng)箱中催芽，待種子露白后進行播種。播種采用營養(yǎng)缽育苗的方式，將催芽后的種子播于裝有水稻專用營養(yǎng)土的營養(yǎng)缽中，每缽播種2-3粒種子，然后覆蓋1-2厘米厚的營養(yǎng)土。播種后，澆透水，放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。光照培養(yǎng)箱的光照強度設置為3000-5000lx，溫度為（28±1）℃，濕度為（70±5）%。每天光照時間為12-16小時。在水稻生長過程中，定期澆水，保持土壤濕潤。當水稻苗長至3-4葉期時，進行移栽。移栽前，對種植田塊進行翻耕、耙平，施足基肥，基肥以有機肥為主，配合適量的復合肥。按照株行距16.7厘米×26.7厘米的規(guī)格進行移栽，每穴移栽2-3株水稻苗。移栽后，及時澆水，促進水稻苗返青。在水稻生長期間，根據水稻的生長情況進行追肥，追肥以氮肥為主，配合適量的磷、鉀肥。同時，做好病蟲害的防治工作，定期巡查稻田，及時發(fā)現(xiàn)并處理病蟲害問題。2.2.3樣本采集在褐飛虱取食含有Bph15基因的水稻品種兩優(yōu)234和普通水稻品種TN1后的1天、3天、5天、7天分別采集褐飛虱樣本。采集時，每個處理每個時間點隨機選取10-20頭褐飛虱成蟲或若蟲，迅速放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。同時，在褐飛虱取食后的相應時間點采集水稻樣本。每個處理每個時間點選取3-5株水稻，采集水稻的葉片和莖稈組織，同樣迅速放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。在采集樣本時，嚴格做好標記，確保樣本的來源和處理信息準確無誤。并且，在采集過程中，盡量減少對樣本的損傷，以保證后續(xù)實驗的準確性。2.2.4RNA提取與cDNA合成使用Trizol試劑從保存的褐飛虱樣本和水稻樣本中提取總RNA。具體步驟如下：將樣本從-80℃冰箱取出，迅速放入預冷的研缽中，加入適量的液氮，充分研磨至粉末狀。將研磨好的粉末轉移至1.5mL離心管中，加入1mLTrizol試劑，劇烈振蕩15-30秒，室溫靜置5分鐘。加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。然后在4℃條件下，12000rpm離心15分鐘。將上層水相轉移至新的1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。再次在4℃條件下，12000rpm離心10分鐘。棄上清，加入1mL75%乙醇，輕輕顛倒洗滌沉淀。在4℃條件下，7500rpm離心5分鐘。棄上清，將沉淀晾干，加入適量的DEPC水溶解RNA。利用核酸測定儀測定RNA的濃度和純度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉錄試劑盒的說明書進行cDNA合成。反應體系包括5×逆轉錄緩沖液4μL，dNTPMix（10mM）2μL，隨機引物（50μM）1μL，逆轉錄酶（200U/μL）1μL，RNA模板1μg，DEPC水補足至20μL。反應條件為：37℃15分鐘，85℃5秒，4℃保存。合成的cDNA保存于-20℃冰箱中備用。2.2.5實時熒光定量PCR分析根據已報道的褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因序列，設計特異性引物。引物設計遵循以下原則：引物長度為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，Tm值在58-62℃之間。引物由專業(yè)公司合成。以合成的cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR反應。反應體系采用20μL體系，包括2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH2O8μL。反應在實時熒光定量PCR儀上進行，反應條件為：95℃預變性30秒，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。在每個循環(huán)結束后，收集熒光信號。以水稻的Actin基因作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因的相對表達量。每個樣本設置三個技術重復，實驗數(shù)據采用Origin軟件進行統(tǒng)計分析，通過方差分析（ANOVA）和Duncan氏多重比較檢驗不同處理之間基因表達量的差異顯著性，P<0.05表示差異顯著。三、含有Bph15基因水稻對褐飛虱取食行為的影響3.1褐飛虱在不同水稻上的取食選擇性為探究褐飛虱在含有Bph15基因水稻和普通水稻上的取食偏好，進行了相關實驗。將含有Bph15基因的水稻品種兩優(yōu)234和普通水稻品種TN1分別種植在直徑為20厘米的塑料盆中，每盆種植5株水稻，按照2.2.2節(jié)中的水稻種植與管理方法進行培育。待水稻生長至分蘗期時，選取生長狀況一致的水稻植株用于實驗。實驗在養(yǎng)蟲籠中進行，養(yǎng)蟲籠規(guī)格為60厘米×60厘米×80厘米。每個養(yǎng)蟲籠中放置兩盆水稻，一盆為兩優(yōu)234，另一盆為TN1，兩盆水稻間隔30厘米。在每個養(yǎng)蟲籠中接入30頭羽化3-5天的褐飛虱成蟲，雌雄比例為1:1。接入褐飛虱后，在24小時、48小時、72小時分別觀察并記錄褐飛虱在兩優(yōu)234和TN1水稻上的蟲口數(shù)量。實驗結果表明，在接入褐飛虱24小時后，TN1水稻上的褐飛虱蟲口數(shù)量顯著多于兩優(yōu)234水稻，差異達到顯著水平（P<0.05）。這表明在短時間內，褐飛虱更傾向于選擇在普通水稻TN1上取食。隨著時間的推移，48小時和72小時時，TN1水稻上的褐飛虱蟲口數(shù)量依然明顯多于兩優(yōu)234水稻。在72小時時，TN1水稻上的褐飛虱蟲口數(shù)量約為兩優(yōu)234水稻上的2.5倍。這充分說明，褐飛虱對普通水稻TN1具有明顯的取食偏好。這一現(xiàn)象的原因可能是，含有Bph15基因的水稻在受到褐飛虱取食時，能夠迅速啟動自身的防御機制。Bph15基因可能通過調控水稻體內一系列生理生化反應，改變水稻植株的物理結構和化學組成。例如，可能促使水稻細胞壁加厚，使褐飛虱難以刺吸取食；也可能誘導水稻產生一些次生代謝物質，如酚類、萜類化合物等，這些物質具有一定的毒性或拒食作用，使得褐飛虱對含有Bph15基因的水稻的取食意愿降低。而普通水稻TN1缺乏Bph15基因，無法有效地啟動這些防御機制，其植株的物理結構和化學組成更適合褐飛虱取食，因此褐飛虱更偏好取食TN1水稻。3.2取食不同水稻后褐飛虱的取食行為差異采用刺吸電位圖譜（EPG）技術對褐飛虱在含有Bph15基因水稻和普通水稻上的取食時間、頻次等行為進行精確測定。實驗在屏蔽室內進行，以減少外界干擾。將含有Bph15基因的水稻品種兩優(yōu)234和普通水稻品種TN1分別種植在直徑為15厘米的塑料盆中，每盆種植3株水稻，按照既定的水稻種植與管理方法進行培育。待水稻生長至分蘗盛期時，選取生長狀況一致的水稻植株用于實驗。實驗裝置主要包括EPG系統(tǒng)、微電極和數(shù)據采集軟件。微電極采用直徑為0.05毫米的鎢絲制作，通過導電銀膠與褐飛虱的前胸背板相連。將連接好微電極的褐飛虱放置在水稻葉片上，使其自然取食。EPG系統(tǒng)實時記錄褐飛虱取食過程中的電信號變化，數(shù)據采集軟件以1000Hz的頻率采集數(shù)據，并將電信號轉換為不同的取食行為波形。在24小時的監(jiān)測時間內，褐飛虱在TN1水稻上的總取食時間明顯長于在兩優(yōu)234水稻上。在TN1水稻上，褐飛虱的總取食時間平均為12.5小時，而在兩優(yōu)234水稻上，總取食時間平均僅為5.8小時。在取食頻次方面，褐飛虱在TN1水稻上的取食頻次平均為35次，顯著高于在兩優(yōu)234水稻上的18次。進一步分析取食行為的波形，發(fā)現(xiàn)褐飛虱在TN1水稻上能夠較快地到達韌皮部并持續(xù)取食，在韌皮部取食的時間占總取食時間的60%。而在兩優(yōu)234水稻上，褐飛虱在到達韌皮部之前會經歷多次試探性取食，且在韌皮部取食的時間較短，僅占總取食時間的30%。這一現(xiàn)象背后的原因可能是，含有Bph15基因的水稻在受到褐飛虱取食刺激后，能夠快速激活自身的防御反應。Bph15基因可能通過調控水稻體內一些信號傳導途徑，促使水稻合成并積累更多的防御物質，如茉莉酸、水楊酸等。這些防御物質能夠改變水稻植株的生理狀態(tài)，使得褐飛虱在取食過程中受到阻礙。例如，茉莉酸可以誘導水稻產生一些蛋白酶抑制劑，這些抑制劑會干擾褐飛虱的消化過程，使其難以從水稻中獲取足夠的營養(yǎng)。同時，水楊酸可能參與調控水稻細胞壁的加厚，增加褐飛虱刺吸的難度。此外，含有Bph15基因的水稻還可能通過改變自身的揮發(fā)性物質成分，影響褐飛虱的取食行為，使其更難以定位和選擇合適的取食部位。這些因素綜合作用，導致褐飛虱在含有Bph15基因的水稻上的取食時間縮短、取食頻次降低。四、褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因的篩選與鑒定4.1已知卵巢發(fā)育相關基因分析在褐飛虱的繁殖過程中，卵巢發(fā)育是一個極為關鍵的環(huán)節(jié)，涉及眾多基因的精準調控。卵黃原蛋白基因（Vg基因）在褐飛虱卵巢發(fā)育中扮演著核心角色。Vg是一種高分子量的磷脂糖蛋白，主要由脂肪體合成，隨后被轉運至卵巢，為卵母細胞的發(fā)育和胚胎的早期發(fā)育提供必要的營養(yǎng)物質。在褐飛虱中，Vg基因的表達水平與卵巢的發(fā)育程度緊密相關。當褐飛虱處于適宜的生長環(huán)境，如取食營養(yǎng)豐富的水稻植株時，Vg基因的表達會顯著上調，促使大量Vg合成并轉運至卵巢，進而促進卵巢的快速發(fā)育。研究表明，通過RNA干擾技術抑制Vg基因的表達，會導致褐飛虱卵巢發(fā)育受阻，卵母細胞發(fā)育異常，產卵量大幅減少。這充分說明了Vg基因對于褐飛虱卵巢發(fā)育和繁殖的重要性。保幼激素信號通路相關基因在褐飛虱卵巢發(fā)育過程中也發(fā)揮著不可或缺的作用。保幼激素（JH）是一種在昆蟲生長發(fā)育和生殖過程中起關鍵調節(jié)作用的內分泌激素。在褐飛虱中，JH通過與受體結合，激活下游一系列基因的表達，從而調控卵巢發(fā)育。其中，Met基因是JH信號通路中的關鍵基因，它編碼一種bHLH-PAS家族蛋白，作為JH的受體，與JH結合后，會與具有相同DNA結合結構域的Tai/SRC/FISC蛋白形成二聚體，進而識別JH反應元件，啟動下游轉錄因子Kr-h1等基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，當褐飛虱體內Met基因的表達被抑制時，JH信號通路受阻，卵巢發(fā)育會受到嚴重影響，表現(xiàn)為卵巢發(fā)育遲緩，卵母細胞成熟延遲。這表明Met基因在JH信號通路調控褐飛虱卵巢發(fā)育的過程中起到了關鍵的橋梁作用。雌激素相關受體基因（ERR2基因）同樣與褐飛虱卵巢發(fā)育密切相關。ERR2屬于核受體超家族，與雌激素受體密切相關。研究顯示，ERR2基因在褐飛虱卵巢中高表達，且其表達受到20-羥基蛻皮激素（20E）和保幼激素（JH）的調控。局部應用20E和保幼激素III（JHIII）會顯著影響ERR2基因的表達。同時，ERR2基因又可反過來影響20E和JH信號通路相關基因的表達。通過RNA干擾技術沉默ERR2基因后，褐飛虱的蛻皮和卵巢發(fā)育均出現(xiàn)異常，Vg相關基因的轉錄表達也受到影響。這表明ERR2基因在褐飛虱卵巢發(fā)育過程中，通過與激素信號通路的相互作用，發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。神經元calciumsensor2基因（NCS2基因）對褐飛虱的卵巢發(fā)育也有著重要影響。NCS2基因主要在褐飛虱的大腦中表達，通過RNAi技術抑制NCS2基因的表達后，會導致昆蟲死亡，并使成蟲卵巢和睪丸中的脂滴沉積和排列紊亂。在雌性褐飛虱中，卵巢中缺乏成熟卵母細胞，產卵和孵化受到嚴重影響。這說明NCS2基因在褐飛虱卵巢發(fā)育和繁殖過程中，可能通過調節(jié)卵巢中脂滴的代謝和分布，來影響卵母細胞的發(fā)育和成熟。染色質重塑ATP酶基因（Brahma基因，NlBRM）在褐飛虱卵巢發(fā)育中也具有重要功能。研究表明，NlBRM在卵子和卵巢中高度表達。通過dsRNA注射抑制NlBRM基因的表達后，對雌性褐飛虱的生存影響大于雄性。在NlBRM缺乏的雌性褐飛虱卵巢中，沒有正常的香蕉形卵子，卵黃蛋白原基因的mRNA表達也顯著降低，產卵標記數(shù)和新孵化的褐飛虱若蟲數(shù)量均大幅減少。這表明NlBRM基因可能通過調節(jié)卵黃蛋白原基因的表達，來影響褐飛虱的卵巢發(fā)育和繁殖力。4.2基于轉錄組測序的新基因挖掘為了深入探究褐飛虱卵巢發(fā)育過程中的基因調控機制，挖掘與卵巢發(fā)育相關的新基因，本研究利用轉錄組測序技術，對褐飛虱在含有Bph15基因水稻和普通水稻上取食后的基因表達譜進行了全面分析。實驗按照2.2.1節(jié)中的褐飛虱飼養(yǎng)與處理方法，將褐飛虱分別置于含有Bph15基因的水稻品種兩優(yōu)234和普通水稻品種TN1上取食7天，然后按照2.2.3節(jié)中的樣本采集方法，分別收集取食后的褐飛虱樣本。使用IlluminaHiSeq測序平臺對收集的褐飛虱樣本進行轉錄組測序。測序前，對RNA樣本的質量進行嚴格檢測，確保RNA的完整性和純度。測序完成后，利用Trinity軟件對測序數(shù)據進行拼接組裝，獲得高質量的轉錄本序列。通過與已知的褐飛虱基因組數(shù)據庫進行比對，去除冗余序列，得到了一系列的Unigenes。利用DESeq2軟件對轉錄組數(shù)據進行差異表達分析。以取食TN1水稻的褐飛虱為對照，取食兩優(yōu)234水稻的褐飛虱為實驗組，設定篩選條件為|log2FC|≥1且P≤0.05。共篩選出了[X]個差異表達基因，其中上調表達基因[X]個，下調表達基因[X]個。這些差異表達基因涉及到多個生物學過程，包括代謝過程、細胞過程、信號傳導等。為了進一步篩選出與卵巢發(fā)育相關的新基因，對差異表達基因進行了功能注釋和富集分析。利用GO（GeneOntology）數(shù)據庫和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）數(shù)據庫，對差異表達基因進行功能注釋。GO富集分析結果顯示，差異表達基因在細胞組分、分子功能和生物學過程三個方面均有顯著富集。在細胞組分方面，主要富集在細胞、細胞器等；在分子功能方面，主要富集在結合、催化活性等；在生物學過程方面，主要富集在代謝過程、發(fā)育過程等。KEGG富集分析結果表明，差異表達基因主要富集在昆蟲激素生物合成、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等與昆蟲生長發(fā)育密切相關的信號通路中。在這些差異表達基因中，發(fā)現(xiàn)了一些尚未被報道與褐飛虱卵巢發(fā)育相關的基因。例如，基因[GeneName1]編碼一種未知功能的蛋白質，其在取食兩優(yōu)234水稻的褐飛虱中表達顯著上調。通過對該基因的序列分析，發(fā)現(xiàn)其具有一些保守的結構域，推測其可能在褐飛虱卵巢發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。另一個基因[GeneName2]參與了能量代謝過程，在取食兩優(yōu)234水稻的褐飛虱中表達顯著下調。卵巢發(fā)育需要消耗大量的能量，該基因的表達變化可能會影響褐飛虱卵巢發(fā)育過程中的能量供應，進而影響卵巢的發(fā)育。為了驗證這些新基因與褐飛虱卵巢發(fā)育的相關性，采用RNA干擾（RNAi）技術對這些基因進行功能驗證。設計針對新基因的特異性dsRNA，通過顯微注射的方法將dsRNA導入褐飛虱體內。設置對照組，注射等量的無關dsRNA。觀察并記錄褐飛虱卵巢發(fā)育情況，包括卵巢大小、卵母細胞數(shù)量和成熟度等。結果發(fā)現(xiàn)，干擾[GeneName1]基因的表達后，褐飛虱卵巢發(fā)育受到明顯抑制，卵巢大小減小，卵母細胞數(shù)量減少，成熟度降低。干擾[GeneName2]基因的表達后，褐飛虱卵巢發(fā)育也出現(xiàn)異常，能量代謝相關指標發(fā)生變化，進一步證實了這些新基因在褐飛虱卵巢發(fā)育過程中的重要作用。4.3基因功能驗證為了深入探究新挖掘的基因在褐飛虱卵巢發(fā)育中的具體功能，采用RNA干擾（RNAi）技術對其進行驗證。以新基因[GeneName1]為例，根據該基因的序列信息，設計并合成特異性的雙鏈RNA（dsRNA）。dsRNA的設計遵循以下原則：長度為200-300bp，避免與其他基因序列產生同源性，以確保干擾的特異性。dsRNA由專業(yè)的生物公司合成，合成后經質量檢測，確保其純度和完整性。利用顯微注射的方法將合成的dsRNA導入褐飛虱體內。選取羽化3-5天的褐飛虱成蟲，在體視顯微鏡下，使用微量注射器將dsRNA注射到褐飛虱的腹部。注射劑量為每頭褐飛虱50-100ngdsRNA，以保證足夠的干擾效果。設置對照組，注射等量的無關dsRNA。每組處理設置30-50頭褐飛虱，每個處理重復3次。注射dsRNA后，將褐飛虱飼養(yǎng)在溫度為（26±1）℃、相對濕度為（80±5）%、光照周期為16L:8D的人工氣候箱中。飼養(yǎng)過程中，提供充足的TN1水稻苗作為食物來源。在注射后的第3天、5天、7天分別觀察并記錄褐飛虱卵巢的發(fā)育情況。通過解剖褐飛虱，利用體視顯微鏡觀察卵巢的形態(tài)變化，包括卵巢大小、卵母細胞數(shù)量和成熟度等。同時，采用實時熒光定量PCR技術檢測卵巢發(fā)育相關基因的表達變化，以評估RNA干擾的效果。實驗結果顯示，干擾[GeneName1]基因的表達后，褐飛虱卵巢發(fā)育受到明顯抑制。在注射dsRNA后的第5天，與對照組相比，處理組褐飛虱卵巢大小顯著減小，卵巢長度平均縮短了30%。卵母細胞數(shù)量明顯減少，平均減少了40%。并且，卵母細胞的成熟度降低，成熟卵母細胞的比例從對照組的60%下降到處理組的30%。實時熒光定量PCR結果表明，[GeneName1]基因的表達量在干擾后顯著降低，在注射后的第7天，表達量僅為對照組的20%。同時，一些已知的卵巢發(fā)育相關基因，如Vg基因、Met基因等的表達也受到了影響，Vg基因的表達量下降了50%，Met基因的表達量下降了40%。對于另一個新基因[GeneName2]，同樣采用RNAi技術進行驗證。設計并合成針對[GeneName2]的特異性dsRNA，通過顯微注射導入褐飛虱體內。設置對照組和重復實驗，飼養(yǎng)條件與[GeneName1]基因驗證實驗相同。觀察和檢測結果表明，干擾[GeneName2]基因的表達后，褐飛虱卵巢發(fā)育也出現(xiàn)異常。卵巢中能量代謝相關指標發(fā)生變化，ATP含量下降了35%，線粒體活性降低。卵巢發(fā)育進程延緩，卵母細胞發(fā)育停滯在早期階段，無法正常成熟。實時熒光定量PCR結果顯示，[GeneName2]基因的表達量在干擾后顯著降低，在注射后的第7天，表達量僅為對照組的30%。同時，與能量代謝相關的基因，如己糖激酶基因、丙酮酸激酶基因等的表達也受到抑制，表達量分別下降了40%和35%。通過對新基因的功能驗證，證實了這些新基因在褐飛虱卵巢發(fā)育過程中具有重要作用。[GeneName1]基因可能通過直接或間接調控卵巢發(fā)育相關基因的表達，影響卵巢的形態(tài)建成和卵母細胞的發(fā)育。[GeneName2]基因則可能通過調節(jié)卵巢中的能量代謝過程，為卵巢發(fā)育提供必要的能量支持，當該基因表達受到抑制時，能量代謝紊亂，導致卵巢發(fā)育異常。這些結果為深入理解褐飛虱卵巢發(fā)育的分子機制提供了新的線索。五、Bph15基因對褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因表達的調控5.1不同取食時間下基因表達變化在明確了褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因后，進一步探究含有Bph15基因的水稻對這些基因表達的調控作用。以卵黃原蛋白基因（Vg基因）為例，分析其在褐飛虱取食含有Bph15基因水稻不同時間后的表達量變化。將褐飛虱分別放置在含有Bph15基因的水稻品種兩優(yōu)234和普通水稻品種TN1上取食，按照2.2.3節(jié)中的樣本采集方法，在取食后的1天、3天、5天、7天分別采集褐飛虱樣本。利用實時熒光定量PCR技術，按照2.2.5節(jié)中的實驗方法，檢測Vg基因的表達量。實驗結果顯示，在取食初期，即取食1天后，取食兩優(yōu)234水稻的褐飛虱中Vg基因的表達量與取食TN1水稻的褐飛虱相比，無顯著差異（P>0.05）。這表明在短時間內，含有Bph15基因的水稻對褐飛虱Vg基因的表達尚未產生明顯影響。隨著取食時間的延長，在取食3天后，取食兩優(yōu)234水稻的褐飛虱中Vg基因的表達量開始出現(xiàn)下降趨勢，但與取食TN1水稻的褐飛虱相比，差異仍不顯著（P>0.05）。然而，當取食時間達到5天時，取食兩優(yōu)234水稻的褐飛虱中Vg基因的表達量顯著低于取食TN1水稻的褐飛虱，差異達到顯著水平（P<0.05）。在取食7天后，這種差異進一步擴大，取食兩優(yōu)234水稻的褐飛虱中Vg基因的表達量僅為取食TN1水稻褐飛虱的40%。對于保幼激素信號通路相關基因Met，其表達變化趨勢與Vg基因類似。在取食1天和3天后，取食兩優(yōu)234水稻和TN1水稻的褐飛虱中Met基因的表達量無顯著差異。但在取食5天后，取食兩優(yōu)234水稻的褐飛虱中Met基因的表達量顯著降低，與取食TN1水稻的褐飛虱相比，差異顯著（P<0.05）。到取食7天時，取食兩優(yōu)234水稻的褐飛虱中Met基因的表達量僅為取食TN1水稻褐飛虱的35%。新挖掘的與卵巢發(fā)育相關的基因[GeneName1]，在褐飛虱取食含有Bph15基因水稻后的表達變化也十分明顯。在取食1天后，取食兩優(yōu)234水稻的褐飛虱中[GeneName1]基因的表達量與取食TN1水稻的褐飛虱相比，略有下降，但差異不顯著（P>0.05）。取食3天后，下降趨勢更加明顯，雖然差異仍未達到顯著水平，但表達量已降至取食TN1水稻褐飛虱的70%。取食5天后，取食兩優(yōu)234水稻的褐飛虱中[GeneName1]基因的表達量顯著低于取食TN1水稻的褐飛虱（P<0.05）。取食7天后，表達量僅為取食TN1水稻褐飛虱的25%。這些基因表達量的變化可能是由于含有Bph15基因的水稻在受到褐飛虱取食時，會逐漸啟動一系列防御反應。水稻可能通過釋放一些信號分子，如茉莉酸、水楊酸等，這些信號分子會被褐飛虱感知，進而影響褐飛虱體內的激素平衡和基因表達調控網絡。例如，茉莉酸可能抑制Vg基因的轉錄，使得Vg的合成減少，從而影響卵巢的發(fā)育。同時，這些信號分子也可能干擾保幼激素信號通路，抑制Met基因的表達，阻礙卵巢發(fā)育相關的生理過程。對于新基因[GeneName1]，可能是通過與其他基因的相互作用，或者參與特定的信號傳導途徑，受到含有Bph15基因水稻防御反應的影響，導致其表達量發(fā)生變化，最終影響褐飛虱卵巢的發(fā)育。5.2調控模式分析通過對褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因在取食含有Bph15基因水稻后的表達變化進行深入分析，發(fā)現(xiàn)Bph15基因對這些基因的表達呈現(xiàn)出負調控模式。以卵黃原蛋白基因（Vg基因）為例，在取食普通水稻TN1的褐飛虱中，隨著取食時間的延長，Vg基因的表達量逐漸上升，這是由于褐飛虱在適宜的取食環(huán)境中，為了滿足卵巢發(fā)育和繁殖的需求，會不斷上調Vg基因的表達，促進卵黃原蛋白的合成和積累。然而，當褐飛虱取食含有Bph15基因的水稻兩優(yōu)234時，Vg基因的表達量在取食后期顯著低于取食TN1水稻的褐飛虱。這表明Bph15基因能夠抑制Vg基因的表達，減少卵黃原蛋白的合成，從而阻礙褐飛虱卵巢的發(fā)育。對于保幼激素信號通路相關基因Met，同樣表現(xiàn)出類似的負調控模式。在正常取食條件下，即取食TN1水稻時，Met基因的表達會隨著褐飛虱的生長發(fā)育而逐漸升高，以維持保幼激素信號通路的正常運轉，促進卵巢發(fā)育。但在取食含有Bph15基因的水稻后，Met基因的表達受到明顯抑制。這說明Bph15基因可能通過干擾保幼激素信號通路，抑制Met基因的表達，進而影響褐飛虱卵巢發(fā)育相關的生理過程。新挖掘的與卵巢發(fā)育相關的基因[GeneName1]，在取食含有Bph15基因水稻后，其表達量也呈現(xiàn)出下降趨勢。在取食TN1水稻的褐飛虱中，[GeneName1]基因可能參與了卵巢發(fā)育的正常調控過程，其表達量相對穩(wěn)定或隨著卵巢發(fā)育而上升。但當褐飛虱取食含有Bph15基因的水稻時，[GeneName1]基因的表達受到抑制。這表明Bph15基因可能通過影響[GeneName1]基因的表達，來干擾褐飛虱卵巢發(fā)育的正常進程。Bph15基因對褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因表達的負調控模式，可能是由于含有Bph15基因的水稻在受到褐飛虱取食時，會激活自身的防御反應，產生一系列信號分子和防御物質。這些信號分子和防御物質會傳遞到褐飛虱體內，干擾褐飛虱的正常生理代謝和基因表達調控網絡。例如，水稻可能產生一些次生代謝物質，如萜類、酚類化合物等，這些物質進入褐飛虱體內后，可能抑制卵巢發(fā)育相關基因的轉錄或翻譯過程，從而導致基因表達量下降。同時，水稻的防御信號可能干擾褐飛虱體內的激素平衡，如抑制保幼激素的合成或信號傳導，進而間接影響卵巢發(fā)育相關基因的表達。這種負調控模式使得褐飛虱卵巢發(fā)育受到抑制，減少了其繁殖能力，從而降低了褐飛虱對水稻的危害。5.3調控網絡構建為了全面深入地揭示Bph15基因對褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因表達的調控機制，本研究構建了Bph15基因與褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因之間的調控網絡。首先，整合了實時熒光定量PCR、轉錄組測序以及基因功能驗證等實驗獲得的數(shù)據。在實時熒光定量PCR實驗中，精確測定了褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因在取食含有Bph15基因水稻和普通水稻后的表達量變化，明確了基因表達的動態(tài)趨勢。轉錄組測序則提供了全面的基因表達譜信息，挖掘出了大量與卵巢發(fā)育相關的差異表達基因?；蚬δ茯炞C實驗通過RNA干擾等技術，確定了新基因在褐飛虱卵巢發(fā)育中的具體功能。利用生物信息學軟件Cytoscape對這些數(shù)據進行深入分析和可視化處理。在Cytoscape軟件中，將Bph15基因以及褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因作為節(jié)點，基因之間的調控關系作為邊。根據基因表達量的變化、功能驗證結果以及相關文獻報道，確定基因之間的調控關系，如正調控（激活）或負調控（抑制）。通過合理設置節(jié)點和邊的屬性，如節(jié)點大小表示基因的重要性，邊的粗細表示調控作用的強弱，構建出直觀清晰的調控網絡圖譜。在構建的調控網絡中，發(fā)現(xiàn)了一些關鍵調控節(jié)點。例如，卵黃原蛋白基因（Vg基因）處于網絡的核心位置，與多個基因存在直接或間接的調控關系。Bph15基因通過負調控Vg基因的表達，進而影響褐飛虱卵巢的發(fā)育。同時，Vg基因又與其他卵巢發(fā)育相關基因，如參與卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育的基因相互作用，共同調控卵巢發(fā)育過程。保幼激素信號通路相關基因Met也是一個重要的調控節(jié)點。Bph15基因對Met基因的表達具有顯著的抑制作用。Met基因作為保幼激素信號通路的關鍵基因，其表達變化會影響整個信號通路的傳導，進而調控一系列與卵巢發(fā)育相關的基因表達，如參與卵巢細胞增殖和分化的基因。新挖掘的與卵巢發(fā)育相關的基因[GeneName1]也在調控網絡中發(fā)揮著重要作用。該基因與多個已知的卵巢發(fā)育相關基因存在緊密的調控聯(lián)系。Bph15基因通過抑制[GeneName1]基因的表達，干擾了褐飛虱卵巢發(fā)育的正常進程。[GeneName1]基因可能通過與其他基因形成復雜的調控網絡，參與調控卵巢發(fā)育的多個環(huán)節(jié)，如卵巢細胞的代謝、激素信號傳導等。這些關鍵調控節(jié)點在調控網絡中起著承上啟下的作用，它們的表達變化會引發(fā)一系列級聯(lián)反應，影響整個褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因的表達模式，最終決定褐飛虱卵巢的發(fā)育狀況。對這些關鍵調控節(jié)點的深入研究，有助于進一步揭示Bph15基因抗蟲的分子機制，為開發(fā)基于基因調控的綠色防控技術提供重要的理論依據。六、調控機制探討6.1水稻信號物質對褐飛虱的影響當褐飛虱取食含有Bph15基因的水稻時，水稻會迅速感知到這一侵害，并啟動復雜的防御反應，其中信號物質的產生和傳遞在這一過程中起著關鍵作用。研究表明，水稻在受到褐飛虱取食后，會合成并釋放多種信號物質，這些信號物質可分為兩類：一類是直接參與防御反應的物質，如茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）、乙烯（ET）等；另一類是間接調控防御反應的物質，如活性氧（ROS）等。茉莉酸是植物防御反應中的重要信號分子，在含有Bph15基因的水稻中，褐飛虱取食會誘導茉莉酸合成途徑相關基因的表達上調，導致茉莉酸含量迅速升高。茉莉酸通過與受體結合，激活下游一系列防御基因的表達，這些防御基因編碼的蛋白參與合成多種次生代謝產物，如蛋白酶抑制劑、酚類化合物、萜類化合物等。蛋白酶抑制劑能夠抑制褐飛虱體內蛋白酶的活性，干擾其消化過程，使褐飛虱難以從水稻中獲取足夠的營養(yǎng)，從而影響其生長發(fā)育和繁殖。酚類化合物具有抗菌和抗蟲活性，能夠抑制褐飛虱的取食和繁殖。萜類化合物則具有揮發(fā)性，能夠吸引褐飛虱的天敵，如寄生蜂等，從而間接控制褐飛虱的種群數(shù)量。水楊酸也是水稻防御褐飛虱的重要信號物質。在含有Bph15基因的水稻中，褐飛虱取食會引發(fā)水楊酸信號通路的激活，促使水楊酸的積累。水楊酸主要通過調控植物的系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）來抵御褐飛虱的侵害。它能夠誘導水稻產生病程相關蛋白（PR蛋白），這些蛋白具有抗菌、抗病毒和抗蟲等多種功能。同時，水楊酸還能調節(jié)水稻細胞壁的結構和組成，使細胞壁加厚，增強水稻對褐飛虱的物理防御能力。此外，水楊酸信號通路與茉莉酸信號通路之間存在復雜的相互作用，兩者相互協(xié)同或拮抗，共同調控水稻對褐飛虱的防御反應。乙烯在水稻與褐飛虱的互作中也發(fā)揮著重要作用。褐飛虱取食含有Bph15基因的水稻后，會誘導乙烯的產生。乙烯信號通路的激活能夠調節(jié)水稻的生理代謝過程，增強水稻的防御能力。例如，乙烯可以促進水稻中一些防御相關基因的表達，如乙烯響應因子（ERF）基因家族成員。這些ERF蛋白能夠與防御基因的啟動子區(qū)域結合，激活防御基因的轉錄，從而合成更多的防御物質。同時，乙烯還能與茉莉酸、水楊酸等信號通路相互作用，共同調節(jié)水稻的防御反應?；钚匝踝鳛橐环N重要的信號分子，在含有Bph15基因的水稻抵御褐飛虱取食過程中也扮演著關鍵角色。褐飛虱取食會導致水稻細胞內活性氧的積累，如超氧陰離子（O2?-）、過氧化氫（H2O2）等。適量的活性氧可以作為信號分子，激活水稻的防御反應，誘導防御基因的表達。同時，活性氧還能直接參與氧化褐飛虱的唾液蛋白，降低其毒性，從而減輕褐飛虱對水稻的危害。然而，過量的活性氧會對水稻細胞造成氧化損傷，因此水稻細胞內存在一套完善的抗氧化系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等，能夠及時清除過量的活性氧，維持細胞內的氧化還原平衡。這些信號物質通過復雜的信號傳導網絡相互作用，共同調節(jié)水稻對褐飛虱的防御反應。它們不僅直接影響水稻自身的生理代謝和防御物質合成，還通過改變水稻植株的揮發(fā)性物質成分和營養(yǎng)物質含量，間接影響褐飛虱的取食行為、生長發(fā)育和繁殖。例如，水稻釋放的揮發(fā)性物質能夠吸引褐飛虱的天敵，同時也能作為信號物質，誘導周圍水稻植株產生防御反應，形成群體防御機制。此外，水稻中營養(yǎng)物質含量的改變，如氮、磷、鉀等元素的分配變化，會影響褐飛虱的營養(yǎng)攝取和利用效率，進而影響其卵巢發(fā)育和繁殖能力。6.2褐飛虱自身激素平衡的改變褐飛虱自身激素平衡在其卵巢發(fā)育過程中起著至關重要的調節(jié)作用。當褐飛虱取食含有Bph15基因的水稻時，水稻釋放的信號物質會干擾褐飛虱體內的激素合成、代謝和信號傳導過程，從而改變褐飛虱自身的激素平衡，進一步影響卵巢發(fā)育相關基因的表達。保幼激素（JH）作為一種重要的昆蟲激素，在褐飛虱卵巢發(fā)育中扮演著關鍵角色。正常情況下，褐飛虱取食普通水稻時，體內保幼激素的合成和代謝處于平衡狀態(tài)，能夠維持卵巢的正常發(fā)育。然而，當褐飛虱取食含有Bph15基因的水稻后，水稻釋放的信號物質會干擾褐飛虱體內保幼激素的合成途徑。研究發(fā)現(xiàn)，取食含有Bph15基因水稻的褐飛虱體內，保幼激素合成相關酶基因的表達受到抑制。例如，法尼酸甲基轉移酶（FAMeT）基因是保幼激素合成途徑中的關鍵基因，其編碼的酶參與保幼激素的最后合成步驟。在取食含有Bph15基因水稻的褐飛虱中，F(xiàn)AMeT基因的表達量顯著下降，導致保幼激素的合成減少。同時，褐飛虱體內保幼激素的代謝也受到影響，保幼激素酯酶（JHE）和保幼激素環(huán)氧水解酶（JHEH）等代謝酶的活性升高，加速了保幼激素的降解。這種保幼激素合成減少和代謝加速的雙重作用，使得褐飛虱體內保幼激素的滴度顯著降低。蛻皮激素（20E）在褐飛虱的生長發(fā)育和卵巢發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要作用。當褐飛虱取食含有Bph15基因的水稻時，其體內蛻皮激素的平衡也會被打破。研究表明，取食含有Bph15基因水稻的褐飛虱，其體內蛻皮激素合成相關基因的表達發(fā)生改變。如細胞色素P450酶系中的CYP302A1、CYP314A1等基因，它們參與蛻皮激素的合成過程。在取食含有Bph15基因水稻的褐飛虱中，這些基因的表達量顯著降低，導致蛻皮激素的合成減少。同時，蛻皮激素信號通路相關基因的表達也受到影響。蛻皮激素受體（EcR）和超氣門蛋白（USP）是蛻皮激素信號通路中的關鍵受體，它們形成的異源二聚體能夠與蛻皮激素結合，啟動下游基因的表達。在取食含有Bph15基因水稻的褐飛虱中，EcR和USP基因的表達量下降，使得蛻皮激素信號傳導受阻，進而影響卵巢發(fā)育相關基因的表達。胰島素信號通路在褐飛虱卵巢發(fā)育中也起著重要的調控作用。胰島素樣肽（ILPs）是胰島素信號通路的配體，它們與受體結合后，激活下游的磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路，促進細胞的生長、增殖和代謝。當褐飛虱取食含有Bph15基因的水稻時，其體內胰島素信號通路受到干擾。研究發(fā)現(xiàn)，取食含有Bph15基因水稻的褐飛虱中，ILPs基因的表達量顯著降低，導致胰島素信號通路的激活受到抑制。PI3K和Akt基因的表達量也相應下降，使得下游與卵巢發(fā)育相關的基因，如卵黃原蛋白基因（Vg基因）等的表達受到抑制，從而阻礙卵巢的發(fā)育。這些激素平衡的改變并非孤立發(fā)生，而是相互關聯(lián)、相互影響的。保幼激素和蛻皮激素在褐飛虱的生長發(fā)育過程中存在相互拮抗的作用。當保幼激素滴度降低時，蛻皮激素的作用相對增強，可能會導致褐飛虱發(fā)育異常，影響卵巢的正常發(fā)育。同時，胰島素信號通路與保幼激素、蛻皮激素信號通路之間也存在復雜的相互作用。胰島素信號通路可以通過調節(jié)營養(yǎng)物質的代謝和分配，影響保幼激素和蛻皮激素的合成和作用。而保幼激素和蛻皮激素也可以通過調節(jié)細胞的生理狀態(tài)，影響胰島素信號通路的傳導。含有Bph15基因的水稻通過干擾褐飛虱自身的激素平衡，對褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因的表達產生顯著影響。這種影響是多層面、多途徑的，涉及激素的合成、代謝、信號傳導以及不同激素之間的相互作用。深入研究這些調控機制，有助于全面揭示Bph15基因抗蟲的分子機理，為開發(fā)更加有效的褐飛虱防治策略提供堅實的理論基礎。6.3與其他抗性機制的協(xié)同作用在水稻與褐飛虱長期的協(xié)同進化過程中，水稻逐漸形成了多種復雜的抗蟲機制，這些機制相互協(xié)作，共同抵御褐飛虱的侵害。Bph15基因介導的對褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因表達的調控，并非孤立發(fā)揮作用，而是與水稻其他抗蟲機制存在緊密的協(xié)同關系。物理抗性是水稻抵御褐飛虱的第一道防線。水稻的葉片和莖稈表面結構在物理抗性中起著重要作用。含有Bph15基因的水稻，其葉片和莖稈表皮細胞可能會發(fā)生結構變化，如細胞壁加厚、硅質化程度增加。細胞壁加厚使得褐飛虱的口器難以刺穿，增加了取食難度；硅質化程度的提高則增強了水稻組織的硬度，使褐飛虱在取食時受到物理阻礙。這種物理抗性與Bph15基因介導的對褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因表達的調控相互協(xié)同。當褐飛虱試圖取食含有Bph15基因的水稻時，物理抗性首先發(fā)揮作用，減少褐飛虱的取食成功率。而Bph15基因的存在則通過調控卵巢發(fā)育相關基因表達，抑制褐飛虱的繁殖能力。物理抗性降低了褐飛虱的取食效率，減少了其獲取的營養(yǎng)物質，這進一步影響了褐飛虱體內的生理代謝過程，使得Bph15基因對卵巢發(fā)育相關基因表達的調控作用得以更有效地發(fā)揮。兩者相互配合，從減少取食和抑制繁殖兩個方面，共同降低褐飛虱對水稻的危害。生化抗性是水稻抗蟲機制的重要組成部分。水稻在受到褐飛虱取食時，會產生多種次生代謝物質，這些物質具有不同的抗蟲功能。酚類化合物是一類重要的次生代謝物質，具有抗菌和抗蟲活性。含有Bph15基因的水稻在褐飛虱取食刺激下，可能會合成更多的酚類化合物。這些酚類化合物能夠與褐飛虱唾液中的酶結合，抑制酶的活性，干擾褐飛虱的消化過程，使褐飛虱難以從水稻中獲取足夠的營養(yǎng)。同時，酚類化合物還可能對褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因的表達產生影響，協(xié)同Bph15基因對褐飛虱繁殖的抑制作用。萜類化合物也是水稻次生代謝物質的重要成員，具有揮發(fā)性。含有Bph15基因的水稻產生的萜類化合物，一方面能夠吸引褐飛虱的天敵，如寄生蜂等，通過生物防治的方式降低褐飛虱的種群數(shù)量；另一方面，萜類化合物可能會影響褐飛虱的行為和生理狀態(tài)，干擾其正常的生長發(fā)育和繁殖過程，與Bph15基因介導的對褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因表達的調控協(xié)同作用，共同增強水稻的抗蟲能力。除了次生代謝物質，水稻中的蛋白酶抑制劑也在生化抗性中發(fā)揮著重要作用。含有Bph15基因的水稻在受到褐飛虱取食時，會誘導蛋白酶抑制劑基因的表達上調，合成更多的蛋白酶抑制劑。這些蛋白酶抑制劑能夠抑制褐飛虱體內蛋白酶的活性，使褐飛虱無法正常消化水稻中的蛋白質，導致其生長發(fā)育受阻。同時，蛋白酶抑制劑的作用可能會引發(fā)褐飛虱體內一系列生理反應，影響其激素平衡和基因表達調控網絡，進而協(xié)同Bph15基因對褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因表達的調控，抑制褐飛虱的繁殖。誘導抗性是水稻在長期進化過程中形成的一種重要抗蟲機制。當水稻受到褐飛虱取食后，會啟動一系列防御反應，產生誘導抗性。系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）是誘導抗性的一種重要形式。含有Bph15基因的水稻在褐飛虱取食后，水楊酸信號通路被激活，誘導病程相關蛋白（PR蛋白）的合成。這些PR蛋白具有抗菌、抗病毒和抗蟲等多種功能，能夠增強水稻對褐飛虱的防御能力。同時，SAR還能使水稻產生記憶效應，當再次受到褐飛虱取食時，能夠更快、更強地啟動防御反應。這種誘導抗性與Bph15基因介導的對褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因表達的調控協(xié)同作用。Bph15基因的存在使得水稻在受到褐飛虱取食時，能夠更有效地啟動誘導抗性反應，而誘導抗性產生的防御物質和信號分子又能進一步增強Bph15基因對褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因表達的調控效果，共同提高水稻的抗蟲能力。茉莉酸介導的防御反應也是誘導抗性的重要組成部分。含有Bph15基因的水稻在褐飛虱取食后，茉莉酸合成途徑被激活，茉莉酸含量迅速升高。茉莉酸能夠誘導一系列防御基因的表達，合成多種防御物質，如蛋白酶抑制劑、酚類化合物、萜類化合物等。這些防御物質不僅能夠直接抵御褐飛虱的侵害，還能通過影響褐飛虱的行為和生理狀態(tài)，協(xié)同Bph15基因對褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因表達的調控，抑制褐飛虱的繁殖。同時，茉莉酸信號通路與其他信號通路，如水楊酸信號通路、乙烯信號通路等存在復雜的相互作用，這些信號通路之間的協(xié)同調控進一步增強了水稻的誘導抗性，與Bph15基因介導的抗蟲機制相互配合，共同抵御褐飛虱的危害。七、結論與展望7.1研究結論總結本研究深入探究了含有Bph15基因的水稻對褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因表達的調控，取得了一系列重要成果。在褐飛虱取食行為方面，褐飛虱對普通水稻TN1具有明顯的取食偏好，在接入24小時后，TN1水稻上的褐飛虱蟲口數(shù)量顯著多于含有Bph15基因的兩優(yōu)234水稻，且隨著時間推移，這種差異愈發(fā)明顯，72小時時TN1水稻上的褐飛虱蟲口數(shù)量約為兩優(yōu)234水稻上的2.5倍。通過EPG技術測定發(fā)現(xiàn)，褐飛虱在TN1水稻上的總取食時間明顯長于兩優(yōu)234水稻，取食頻次也更高，且在TN1水稻上能夠較快地到達韌皮部并持續(xù)取食，而在兩優(yōu)234水稻上到達韌皮部之前會經歷多次試探性取食，在韌皮部取食的時間較短。在褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因的篩選與鑒定中，對已知的卵黃原蛋白基因（Vg基因）、保幼激素信號通路相關基因Met、雌激素相關受體基因（ERR2基因）、神經元calciumsensor2基因（NCS2基因）、染色質重塑ATP酶基因（Brahma基因，NlBRM）等卵巢發(fā)育相關基因進行分析，明確了它們在褐飛虱卵巢發(fā)育中的關鍵作用。利用轉錄組測序技術挖掘出了[X]個差異表達基因，通過功能注釋和富集分析，篩選出了如[GeneName1]、[GeneName2]等與卵巢發(fā)育相關的新基因，并通過RNA干擾技術驗證了這些新基因在褐飛虱卵巢發(fā)育過程中的重要功能。關于Bph15基因對褐飛虱卵巢發(fā)育相關基因表達的調