基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術探討銀杏-蜜環(huán)抗腦缺血損傷的作用機制摘要：目的運用網(wǎng)絡藥理學研究蜜環(huán)-銀杏藥治療腦缺血再灌注損傷的作用機制。方法從TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取銀杏葉的成分與靶點，并以口服生物利用度（OB）不低于30%且類藥性（DL）不低于0.18作為篩選條件。通過查閱文獻獲得蜜環(huán)菌的主要化學成分并利用SwissTargetPrediction預測靶點；從DisGeNET、OMIM、Genecards數(shù)據(jù)庫收集疾病靶點；使用STRING數(shù)據(jù)庫繪制PPI網(wǎng)絡圖；采用Cytoscape3.9.0軟件構建“中藥-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡，并從中獲得核心靶點及化合物；利用R語言對交集基因進行GO分析和KEGG分析；最后利用AutodockVina軟件進行分子對接，預測核心靶點與核心成分的對接情況。結果篩選出蜜環(huán)-銀杏藥對26個有效成分和129個潛在作用靶點。GO分析顯示主要集中在對活性氧生物合成與代謝、對氧化應激和炎癥的反應以及對激酶活性調節(jié)等過程；KEGG分析顯示，AGE-RAGE、PI3K-Akt和cAMP等信號通路在腦缺血再灌注損傷中起到關鍵作用。由分子對接結果可發(fā)現(xiàn)，核心成分染料木素、槲皮素、山奈酚、蜜環(huán)菌己素和蜜環(huán)菌乙素與核心靶點SRC、TP53、JUN、MAPK3和EGRF可以穩(wěn)定對接。結論蜜環(huán)-銀杏藥對具有多成分、多靶點以及多通路的腦缺血再灌注損傷治療的原理。關鍵詞：腦缺血再灌注損傷；網(wǎng)絡藥理學；蜜環(huán)-銀杏；分子對接；通路；靶點Exploringthemechanismofactionofhalimasch-ginkgointhetreatmentofcerebralischemiainjurybasedonnetworkpharmacologyandmoleculardockingtechniquesXuKeweiAbstract：ObjectiveToinvestigatetherationaleofhalimasch-ginkgodruginperformingtreatmentofcerebralischemia-reperfusioninjuryusingnetworkpharmacology.MethodsThecompositionandtargetsofGinkgobilobawereobtainedfromtheTCMSPdatabase,andoralbioavailability(OB)ofnotlessthan30%anddrug-likeproperties(DL)ofnotlessthan0.18wereusedasscreeningconditions.ThemainchemicalcomponentsofhalimaschwereobtainedfromtheliteratureandthetargetswerepredictedusingSwissTargetPrediction;thediseasetargetswerecollectedfromDisGeNET,OMIM,andGenecardsdatabases;thePPInetworkdiagramwasdrawnusingSTRINGdatabase;Cytoscape3.9.0softwarewasusedtoconstruct"Thecoretargetsandcompoundswereobtainedfromthenetwork;GOanalysisandKEGGanalysisoftheintersectinggeneswereperformedusingRlanguage;finally,moleculardockingwasperformedusingAutodockVinasoftwaretopredictthedockingofthecoretargetswiththecorecomponents.ResultsThehalimasch-ginkgodrugpairswerescreenedfor26activeingredientsand129potentialactiontargets.GOanalysisshowedthatthemainfocuswasontheprocessesofbiosynthesisandmetabolismofreactiveoxygenspecies,responsetooxidativestressandinflammation,andregulationofkinaseactivity;KEGGanalysisshowedthatAGE-RAGE,PI3K-AktandcAMPsignalingpathwaysplayakeyroleincerebralischemia-reperfusioninjury.Fromthemoleculardockingresults,itcanbefoundthatthecorecomponentsgenistein,quercetin,kaempferol,armillariginandarmillaridincanbestablydockedwiththecoretargetsSRC,TP53,JUN,MAPK3andEGRF.ConclusionHalimasch-ginkgocantreatcerebralischemia-reperfusioninjurywithmultiplecomponents,multipletargetsandmultiplepathways.KeyWords：cerebralischemia-reperfusioninjury;networkpharmacology;halimasch-ginkgo;moleculardocking;pathway;target引言作為全球第二大致死因素與第三大致殘因素，腦卒中極大地威脅著公眾的生命健康[1]。相關數(shù)據(jù)表明，缺血性腦卒中在我國腦卒中發(fā)病中占比最大，接近七成。溶栓是現(xiàn)階段最為重要的缺血性腦卒中治療手段，然而部分病人通過再灌注治療后，反而加重了神經細胞的損傷[2]，臨床中稱為腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷的病癥表現(xiàn)復雜，具體表現(xiàn)為多環(huán)節(jié)與多要素相統(tǒng)一的級聯(lián)反應。而中藥治療具有多成分多靶點的優(yōu)勢，研究表明中藥在治療腦缺血再灌注損傷方面具有良好的優(yōu)勢。銀杏葉為銀杏科植物銀杏GinkgobilobaL.的干燥葉，可以活血化瘀、通絡止痛，被廣泛應用于中風偏癱的治療當中。蜜環(huán)菌為白蘑科假蜜環(huán)菌屬真菌假蜜環(huán)菌Armillariellamellea（Vahl.exFr.）Karst.的子實體，具有熄風平肝，祛風通絡的功效，常用于治療頭暈、頭痛和冠心病等。蜜環(huán)銀杏口服液可有效擴張冠狀動脈與腦血管，臨床主要用于醫(yī)治冠心病、心絞痛、缺血性腦血管疾病，可以改善心腦的供血[3]。然而迄今為止尚不了解蜜環(huán)銀杏在腦缺血再灌注損傷臨床治療中的作用機制，并且中藥復方往往是多成分多靶點，單分子單通路的研究難以全面解釋機制。因此本文利用網(wǎng)絡藥理學，對銀杏蜜環(huán)治療腦缺血再灌注損傷進行系統(tǒng)的分析，并用分子對接技術驗證靶點和活性成分的結合能力，為進一步實驗驗證奠定基礎。資料與方法蜜環(huán)菌和銀杏葉的活性成分和作用靶點篩選對于銀杏葉，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫（/），以“銀杏葉”為關鍵詞，將口服生物利用度（OB）不低于30%且類藥性（DL）不低于0.18設定為篩選條件，從中得出銀杏葉的活性成分與靶點，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫對靶點作出基因id轉化。對于蜜環(huán)菌，由于數(shù)據(jù)庫中相關的數(shù)據(jù)很少，因此通過查閱文獻收集蜜環(huán)菌中具有代表性的成分，并在SwissADME網(wǎng)站中以高腸胃道吸收和滿足Lipinski五倍率法則為篩選條件，篩選出符合條件的活性成分，最后在SwissTargetPrediction網(wǎng)站當中測算得出分數(shù)高于0的靶點，并將其認定為藥物靶點。腦缺血再灌注損傷相關疾病靶點篩選以“ischemicstroke”和“cerebralischemia-reperfusioninjury”為關鍵詞，分別在DisGeNET數(shù)據(jù)庫()、OMIM數(shù)據(jù)庫、Genecards數(shù)據(jù)庫中進行檢索，合并并刪除同時出現(xiàn)在兩個關鍵詞中的重復基因，將同時出現(xiàn)在兩個及以上數(shù)據(jù)庫中的基因作為相關疾病靶點基因。蜜環(huán)-銀杏治療腦缺血再灌注損傷的靶點篩選將疾病靶點與藥物靶點分別導進Venny2.1作圖工具當中，利用軟件畫出韋恩圖，交集部分即為蜜環(huán)-銀杏治療腦缺血再灌注損傷的潛在靶點。蛋白互作網(wǎng)絡構建與核心靶點篩選在STRING數(shù)據(jù)庫當中輸入交集靶點，并將蛋白質種類設定成“Homosapiens”，最低相互作用閾值為0.7，進行蛋白互作PPI網(wǎng)絡分析，將數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.9.0軟件并進行拓撲研究，從中挑選取得核心基因?！爸兴?成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡構建及分析使用Cytoscape3.9.0軟件構建“蜜環(huán)銀杏-成分-靶點-腦缺血再灌注”網(wǎng)絡，同時對其進行拓撲研究，并挑選出核心活性元素。靶點富集分析為了得到1.3篩選的潛在基因在功能和信號通路中的富集情況，使用R語言的Bioconductor軟件包，以P≤0.05作為條件進行GO和KEGG富集分析。分子對接驗證為了進一步預測關鍵活性成分和關鍵靶點直接的結合情況，分別取度值排名前五的核心靶點和成分進行分子對接。從PDB數(shù)據(jù)庫（http：///）中下載蛋白質結構，利用AutodockTools軟件對蛋白質進行去水加氫處理；通過Pubchem數(shù)據(jù)庫（https：///）下載取得格式為sdf的活性成分文件，針對數(shù)據(jù)庫當中不存在的活性成分，能夠通過Schr?dinger軟件將2D結構轉化成3D結構。利用分子對接軟件AutoDockVina進行分子對接，若對接結合能小于0，則配體與受體可自發(fā)結合。部分對接結果用PyMol2.3.0進行繪制。結果蜜環(huán)-銀杏中活性成分及作用靶點的篩選對TCMSP數(shù)據(jù)庫進行設置，即OB≥30%、DL≥0.18，并篩選獲得的銀杏葉所包含的有效成分，同時參考相關文獻，最終確定其活性成分，得到潛在活性成分27個，見表1。篩選相應作用靶點，共129個。通過搜集有關蜜環(huán)菌成分研究的文獻，選取蜜環(huán)菌中具有代表性且含量較多的成分12個，并在SwissADME網(wǎng)站中進行藥代動力學分析，見表2。在SwissTargetPrediction網(wǎng)站中取預測得分大于0的靶標作為蜜環(huán)菌的藥物靶點，共322個靶點。表SEQ表\*ARABIC1銀杏葉活性成分編號活性成分OB(%)DLYXY1Isogoycyrol40.360.83YXY2Syringetin36.820.37YXY3Mandenol42.000.19YXY4sesamin56.550.83YXY5Diosmetin31.140.27YXY6Chryseriol35.850.27YXY7isorhamnetin49.600.31YXY8beta-sitosterol36.910.75YXY9kaempferol41.880.24YXY10Stigmasterol43.830.76YXY11(+)-catechin54.830.24YXY12Genkwanin37.130.24YXY13luteolin36.160.25YXY14Linolenicacidethylester46.100.20YXY15Laricitrin35.380.34YXY16(-)-catechin49.680.24YXY17quercetin46.430.28YXY18Bilobalide84.420.36YXY19Flavoxanthin60.410.56YXY20ginkgolideB44.380.73YXY21ginkgolideC48.330.73YXY22ginkgolideJ44.840.74YXY23GinkgolideM49.090.75YXY24Luteolin-4′-glucoside41.970.79YXY25bis[(2S)-2-ethylhexyl]benzene-1,2-dicarboxylate43.590.35YXY26Ethyloleate(NF)32.400.19YXY27campest-5-en-3beta-ol37.580.71表SEQ表\*ARABIC2蜜環(huán)菌活性成分編號活性成分腸胃道吸收LipinskiMHJ1染料木素HighYesMHJ2大豆素HighYesMHJ35-羥甲基糠醛HighYesMHJ45-乙酸基甲基-2-糠醛HighYesMHJ5羥甲基呋喃基酮HighYesMHJ67-甲基-6-硝基苯并吡喃-2-酮HighYesMHJ7蜜環(huán)菌己素HighYesMHJ8蜜環(huán)菌乙素HighYesMHJ9蜜環(huán)菌丁素HighYesMHJ10脫氫樅酸HighYesMHJ115-甲基糠醛HighYesMHJ12蜜環(huán)菌戊素HighYes腦缺血再灌注損傷相關疾病靶點以“ischemicstroke”為關鍵詞，在DisGeNET數(shù)據(jù)庫（）中進行檢索，得到1160個基因，由于以“cerebralischemiareperfusioninjury”為關鍵詞直接在DisGeNET數(shù)據(jù)庫中搜索沒有結果，故分別以“cerebralischemia”和“reperfusioninjury”為關鍵詞搜索，分別得到120個和300個基因，合并并去除重復項，得到1368個基因。在genecard數(shù)據(jù)庫中，以“ischemicstroke”為關鍵詞，選擇打分值>5，得到487個基因，以“cerebralischemiareperfusioninjury”為關鍵詞檢索得到540個基因，合并并刪去重復基因，共755個基因。利用關鍵詞檢索的方式，在OMIM數(shù)據(jù)庫當中分別輸入“ischemicstroke”與“cerebralischemiareperfusioninjury”，依次搜索出20個、106個基因，合并且剔除重復基因，共取得114個基因。在Venny2.1平臺中做出三個數(shù)據(jù)庫的基因交集圖，并選取出現(xiàn)在至少兩個數(shù)據(jù)庫中的基因作為疾病靶點基因，共483個基因，見圖1。圖SEQ圖\*ARABIC1不同數(shù)據(jù)庫腦缺血再灌注損傷相關靶點韋恩圖蜜環(huán)-銀杏治療腦缺血再灌注損傷的靶點在Venny2.1平臺中輸入483個疾病靶點，129個銀杏作用靶點和322個蜜環(huán)菌作用靶點。取交集后，發(fā)現(xiàn)藥物-疾病共同靶點共計129個，如圖2所示。將取得的基因全部輸入至STRING數(shù)據(jù)庫，以最低相互作用閾值為0.7進行蛋白互作分析，將結果導出并在Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡，見圖3。每個節(jié)點的度值大小通過顏色深淺表示。通過NetworkAnalyzer工具開展拓撲分析，利用軟件把排名前30的靶點繪制成條形圖，如圖4所示。度值排名前五的基因為SRC、TP53、JUN、MAPK3和EGRF，查閱與腦缺血再灌注損傷的相關文獻研究，發(fā)現(xiàn)這些基因在其中起到關鍵作用，結果見表3。圖SEQ圖\*ARABIC2銀杏-蜜環(huán)與腦缺血再灌注損傷靶點韋恩圖圖SEQ圖\*ARABIC3銀杏-蜜環(huán)與腦缺血再灌注損傷交集基因PPI網(wǎng)絡圖SEQ圖\*ARABIC4基于PPI拓撲分析的銀杏-蜜環(huán)核心靶點排序表SEQ表\*ARABIC3腦缺血再灌注損傷相關基因文獻研究基因名稱相關研究SRCSrc激酶抑制劑PP2的工作機理是通過抑制NMDAR受體及Src磷酸化表達，實現(xiàn)防止因腦缺血再灌注而致使神經元受損情況的出現(xiàn)REF_Ref88336489\r\h[4]。SrcY418磷酸化的動態(tài)時間變化可能調節(jié)腦缺血和再灌注后血管通透性，Src可能是減少血管通透性增加引起的組織損傷的一個新的治療靶點REF_Ref88336493\r\h[5]。由以上可知，通過抑制SRC的表達能夠有效防止神經元因腦缺血再灌注而受損，該作用機制在一定程度上與抑制NMDAR受體及暢通血管緊密相關。TP53在腦缺血再灌注中，p53基因大量表達并且誘導細胞凋亡REF_Ref88336499\r\h[6]；發(fā)現(xiàn)抑制p53可上調mTOR活性，減少腦缺血再灌注損傷REF_Ref88336503\r\h[7]；SIRT1通過靶向p53/microRNA-22軸來減輕腦缺血再灌注損傷REF_Ref88336508\r\h[8]。綜上，在腦缺血再灌注中，p53基因會大量表達并且誘導細胞凋亡，抑制p53表達可以減弱腦缺血再灌注的損傷。JUN5%異氟醚可顯著減輕腦缺血再灌注損傷，其機制可能與上調TGF-β1的表達和下調c-JunN-末端激酶（JNK）的表達有關REF_Ref88336512\r\h[9]。因此JUN在腦缺血再灌注損傷中有重要的作用。MAPK3ERK1/2信號通路參與了腦缺血后新生血管的生成REF_Ref88336517\r\h[10]；吳茱萸次堿可能通過調節(jié)ERK1/2的表達來減輕腦缺血再灌注誘導的腦損傷REF_Ref88336524\r\h[11]。綜上，MAPK3（ERK1）的表達與減輕腦缺血再灌注損傷有重要關系。EGFREGFR在腦缺血和再灌注過程中均被磷酸化和反式激活REF_Ref88336532\r\h[12]；金屬蛋白酶（MMP）介導的EGFR反式激活對于δOR激動劑誘導的MCAO/再灌注損傷緩解至關重要REF_Ref88336536\r\h[13]。綜上，反式激活EGFR可起到緩解腦缺血再灌注損傷的作用。“中藥-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡的構建將銀杏-蜜環(huán)的39個潛在活性成分和139個藥物-疾病共同靶點輸入Cytoscape中，繪制出“蜜環(huán)銀杏-成分-靶點-腦缺血再灌注損傷”網(wǎng)絡，見圖5。度值排名前五的成分分別為染料木素、蜜環(huán)菌己素、蜜環(huán)菌乙素、山奈酚和槲皮素，將其作為核心成分，并查閱這些成分與腦缺血再灌注損傷的相關文獻研究，發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注模型大鼠在攝入染料木素、山奈酚與槲皮素等藥物之后，恢復狀況良好，而蜜環(huán)菌乙素和蜜環(huán)菌己素的作用則需進一步的研究，結果見表4。圖SEQ圖\*ARABIC5“蜜環(huán)銀杏-成分-靶點-腦缺血再灌注損傷”網(wǎng)絡表SEQ表\*ARABIC4腦缺血再灌注損傷相關化合物文獻研究名稱相關研究染料木素染料木素可以降低腦缺血再灌注后的炎性細胞因子IL-6,IL-1β與TNF-α的合成速度，從而更好地保護神經細胞REF_Ref88336545\r\h[14]；染料木素可通過促進PI3K-Akt-mTOR信號通路的活性，減輕去卵巢大鼠腦缺血誘導的神經元凋亡REF_Ref88336550\r\h[15]；染料木素具有抗鏈脲霉素誘導的糖尿病小鼠全腦缺血再灌注的神經元損傷，具有有效的神經保護作用REF_Ref88336554\r\h[16]。綜上，染料木素能夠有效避免腦缺血再灌注受損，其工作原理多為抗炎、抗細胞衰亡。蜜環(huán)菌己素研究發(fā)現(xiàn)蜜環(huán)菌己素不具有抑制缺糖缺氧致大鼠大腦皮層原代神經細胞損傷的活性REF_Ref88336558\r\h[17]，因此蜜環(huán)菌己素抗腦缺血再灌注損傷的作用需要進一步研究。蜜環(huán)菌乙素同蜜環(huán)菌己素。山奈酚山奈酚可能是通過調節(jié)TLR4/MyD88/NF-κB通路的表達，對局灶性腦缺血再灌注損傷起到神經保護作用REF_Ref88336561\r\h[18]；山奈酚可以增加SOD和GSH的活性，減少血清和腦組織中MDA的含量，以及恢復體內TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平，對腦缺血再灌注損傷起到保護作用REF_Ref88336565\r\h[19]。綜上，山奈酚可以通過抗氧化和抗炎作用減輕腦缺血再灌注損傷。槲皮素槲皮素可以使蛋白酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸磷酸酶的活性降低，同時減少了ERK和Akt磷酸化，這可能在腦缺血再灌注損傷的擴大中起關鍵作用REF_Ref88336569\r\h[20]；槲皮素通過Sirt1信號通路保護MCAO大鼠的血腦屏障，從而對腦缺血再灌注損傷具有神經保護作用REF_Ref88336577\r\h[21]。綜上，槲皮素具有抗腦缺血再灌注損傷的作用。關鍵靶點GO和KEGG富集分析利用R軟件的Bioconductor軟件包，以P≤0.05進行關鍵基因GO與KEGG分析，將結果以條形圖和氣泡圖形式展現(xiàn)，見圖6和圖7。GO功能注釋包括生物過程、細胞組分和分子功能三個方面。整個生物過程包含脂多糖、氧化應激、炎癥、活性氧代謝過程和活性氧生物合成過程；細胞組分主要涉及到膜微區(qū)、膜筏、核被膜、囊腔；分子功能大體包含激酶調節(jié)、內切酶、水解酶以及磷酸酶相互聯(lián)系等等；圖SEQ圖\*ARABIC6蜜環(huán)銀杏GO富集分析KEGG富集分析得到166個目錄，主要涉及到脂質和動脈粥樣硬化（Lipidandatherosclerosis）、AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、cAMP信號通路和TNF信號通路等。其中富集最顯著的是AGE-RAGE信號通路，RAGE與配體結合可以激活PI3K-Akt通路，而PI3K激活的AKT可以通過磷酸化Bad、Caspase-9、Forkhead、NF-κB等抑制細胞凋亡，許多研究表明，激活PI3K-Akt信號通路可以減輕腦缺血再灌注損傷REF_Ref88337225\r\h[22]。圖SEQ圖\*ARABIC7蜜環(huán)銀杏KEGG富集分析選取富集基因數(shù)目前五的通路，查閱相關研究，得到結果見表5。表SEQ表\*ARABIC5腦缺血再灌注損傷相關通路文獻研究通路名稱相關研究AGE-RAGE抑制AGEs-RAGE通路，可以改善糖尿病腦缺血再灌注模型腎臟的損傷REF_Ref88337427\r\h[23]；腦缺血之后再次進行灌注，進而會導致缺血腦組織內部的AGEs與血清內部的AGEs提高REF_Ref88336592\r\h[24]。總體而言，AGE-RAGE在期間發(fā)揮關鍵作用，抑制其激活可減輕腦缺血再灌注損傷。PI3K-Akt腦缺血再灌注后，6′-O-沒食子酸芍藥苷可以激活PI3K/Akt/Nrf2通路，降低氧化應激、炎癥、細胞損傷以及凋亡情況的出現(xiàn)，起到神經保護作用REF_Ref88336606\r\h[25]；曲美蝶烯酸B（TAB）通過抑制miR-10a表達，激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，從而減少線粒體介導的凋亡，從而對腦缺血再灌注損傷具有神經保護作用REF_Ref88336611\r\h[26]。綜上，激起PI3K-Akt發(fā)揮作用能夠起到保護神經細胞的效果，降低細胞凋亡的問題，進一步抵抗腦缺血再灌注損傷問題。cAMPFCPR16通過cAMP/CREB途徑抑制炎癥與細胞凋亡，能夠充分發(fā)揮保護腦缺血再灌注損傷的功效REF_Ref88336614\r\h[27]；脂聯(lián)素（APN）治療可減少I/R損傷后的梗死體積、神經功能缺損和腦含水量。同時，APN可增加cAMP、PKA、CREB和BDNF的表達REF_Ref88336621\r\h[28]。綜上，提高cAMP表達可增強抗炎作用，從而減弱腦缺血再灌注損傷。TNF腦缺血損傷中，TNF-α大量增加，加劇了缺血性腦損傷REF_Ref88336625\r\h[29]；經芪參益氣預處理的小鼠在腦缺血再灌注后可顯著降低IFNG-γ、IL-6、TNF-α、NF-κBp65和TLR-4mRNA水平，并增加腦內TGF-β1mRNA水平，能夠對于腦缺血再灌注損傷發(fā)揮巨大的保護功效REF_Ref88336630\r\h[30]。綜上，TNF通路表達勢必會導致上述損傷問題變重，而拮抗TNF-α卻能夠對其發(fā)揮保護功效。IL-17IL-17是形成腦梗死和腦神經功能損傷的重要原因REF_Ref88336633\r\h[31]；NLRP3炎性體促進了IL-23/IL-17軸的損傷效應，加重了腦缺血再灌注損傷REF_Ref88336638\r\h[32]。綜上，IL-17通路為此損傷的關鍵通路，減少IL-17能夠降低損傷。分子對接選取degree值前五的基因與degree值前五的化合物開展分子對接檢驗，具體結果如表6。對接結果顯示，結合能均≤?5kcal/mol，表明蜜環(huán)-銀杏的活性成分與預測的作用靶點有較強的結合活性。利用pymol繪制出核心靶點與小分子配體的對接結合模式，細節(jié)圖中顯示對接形成的氫鍵作用，并且標出相應的氨基酸殘基。表6蜜環(huán)銀杏主要活性成分與關鍵靶點的分子對接Bindingenergy(kcal/mol)MHJ1MHJ7MHJ8YXY17YXY25SRC-6.4-5.9-5.4-6.8-7.2TP53-6.8-6.5-6.9-6.9-7JUN-5.7-5.5-5.7-5.2-5.5MAPK3-8.3-7.5-7.8-8.5-8.9EGFR-7.5-7.3-6.9-7.5-7.8圖SEQ圖\*ARABIC8分子對接結合模式（一）

圖SEQ圖\*ARABIC9分子對接結合模式（二）討論缺血性腦卒中屬于發(fā)病率和致死率均極高的疾病，現(xiàn)階段的治療方式中，溶栓治療可以說是最有效的治療措施，但溶栓后腦再灌注可引起出血轉化、腦細胞水腫、腦細胞功能障礙加重等并發(fā)癥。血流再通后造成的組織或器官的再灌注損傷又給缺血性腦卒中的治療帶來新的難題REF_Ref88336642\r\h[33]。近年來，網(wǎng)絡藥理學在分析闡明中藥配方治療疾病的多成分多靶點協(xié)同作用和機制中發(fā)揮了重要作用。蜜環(huán)銀杏口服液在治療缺血性腦血管疾病有很好的作用，研究表明蜜環(huán)銀杏口服液具有抗腦缺血再灌注損傷的作用REF_Ref88336741\r\h[34]，但其機制尚不明確。為了研究蜜環(huán)-銀杏治療腦缺血再灌注損傷的藥效基礎及潛在機制，本文借助網(wǎng)絡藥理學對蜜環(huán)-銀杏成分與靶點展開分析。由于數(shù)據(jù)庫中缺少蜜環(huán)菌的成分數(shù)據(jù)，本文通過查閱蜜環(huán)菌成分研究的文獻，選取具有代表性的12個成分進行研究。發(fā)現(xiàn)可以作用于治療腦缺血再灌注損傷的26個成分和129個作用靶點。其中染料木素、槲皮素、山奈酚、蜜環(huán)菌己素和蜜環(huán)菌乙素是對應靶點較多的成分。已有研究發(fā)現(xiàn)，染料木素可以直接和β-淀粉樣蛋白（Aβ）結合，減少Aβ導致的神經毒性REF_Ref88336746\r\h[35]；染料木素可以通過調節(jié)PI3K活性，激活Nrf2信號通路來抑制Aβ25-35產生的氧化應激損傷，以此起到保護腦血管內皮細胞的作用REF_Ref88336752\r\h[36]，而氧化應激是CIRI的重要病理性變化指標之一；染料木素還可以降低Ca2+超載和炎癥反應，能夠對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮較好的保護功效。槲皮素具有抗氧化作用，可直接清除活性自由基，螯合金屬離子，還可以抑制LDL氧化損傷[37-39]；具有抗炎作用，能夠借助降低促炎細胞因子（IL-1β、IL-6）、提高抗炎細胞因子（IL-4、IL-10）的方式來發(fā)揮對抗炎癥的作用。山奈酚能夠通過調整TLR4/MyD88/NF-κB通路的表達REF_Ref88336561\r\h[18]，進而發(fā)揮保護腦缺血再灌注損傷的功效。而蜜環(huán)菌己素和蜜環(huán)菌乙素則并不能抑制缺糖缺氧導致的神經細胞損傷REF_Ref88336558\r\h[17]，其具體作用還有待研究。SRC、TP53、JUN、MAPK3和EGRF是本研究中發(fā)現(xiàn)的關鍵基因。SRC基因編碼的蛋白屬于SRC家族激酶（SFKs），SRC蛋白是非受體酪氨酸激酶，激活后的SRC激酶可以活化PI3K-AKT、EGFR和MAPK等通路，從而介導大腦損傷。p53基因是人類抑癌基因，超過半數(shù)以上的惡性腫瘤中出現(xiàn)該基因的突變?，F(xiàn)有研究表明p53與腦缺血之間也有著密切的關系，缺血再灌注后可以誘導p53基因表達和細胞凋亡REF_Ref88336499\r\h[6]；抑制p53能夠對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮良好的保護功效，其機制可能與激活Wnt信號通路有關REF_Ref88336780\r\h[42]。C-jun為原癌基因，正常情況下c-jun表達水平極低，而局灶性腦缺血再灌注后，c-jun表達水平明顯升高REF_Ref88336783\r\h[43]；c-jun表達產物Jun可經過亮氨酸拉鏈，聯(lián)合成為AP-1，從而促進凋亡REF_Ref88336789\r\h[44]；許多研究表明，腦保護藥物可通過下調c-jun表達來壓抑腦缺血再灌注損傷神經細胞的凋亡功效。MAPK3是絲裂原活化蛋白激酶，別名為ERK1。ERK1/2屬于其中發(fā)揮作用的關鍵激酶。EGFR是表皮生長因子受體。研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注損傷中，激活EGFR后可激活Akt和ERK1/2，而Akt和ERK1/2作為促生長因子，對于促進腦細胞存活有重要意義REF_Ref88336793\r\h[45]。根據(jù)蜜環(huán)-銀杏治療腦缺血再灌注損傷的靶點GO分析結果顯示，主要涉及到活性氧的生物合成和代謝過程、對氧化應激和炎癥的反應以及對激酶活性調節(jié)等過程。KEGG分析得出，蜜環(huán)-銀杏治療腦缺血再灌注損傷的靶點主要涉及到脂質和動脈粥樣硬化（Lipidandatherosclerosis）、AGE-RAGE、PI3K-Akt、cAMP以及TNF幾種信號通路等等。腦缺血患者常出現(xiàn)高血糖，而出血性轉化（Hemorrhagictransformation,HT）屬于缺血性腦卒中普遍的并發(fā)癥，卒中后高血糖與HT的發(fā)生有關，嚴重影響卒中的臨床治療。實驗表明，高血糖激活了AGE-RAGE信號通路，增加了HMGB1、TLR4和p-p65的表達，并誘導炎癥因子釋放和中性粒細胞浸潤，導致了HT的產生REF_Ref88336797\r\h[46]，可能因此加重了腦缺血再灌注的損傷。很多研究結果顯示，激活PI3K/Akt信號通路，能夠降低輕腦缺血再灌注損傷水平。PI3K/Akt信號通路著重借助以下四方面發(fā)揮作用：抑制細胞凋亡、推動腦血管新生、促進神經生長因子釋放和抑制自噬REF_Ref88336801\r\h[47]。CAMP-PKA/pCREB信號通路在神經再生過程中起到重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)，激活cAMP-PKA/pCREB信號通路可以促進損傷軸突再生，從而促進腦缺血后的神經功能的自然恢復REF_Ref88336805\r\h[48]。TNF-α在腦缺血卒中的前期和晚期發(fā)揮著不一樣的作用，早期TNF-α的分泌增加會影響凝血過程和引發(fā)血管收縮，表現(xiàn)為神經毒性，而恢復期時TNF-α的分泌增加可能是神經修復作用REF_Ref88336808\r\h[49]。綜上，蜜環(huán)-銀杏藥對主要通過作用于AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路以及其他與缺血性腦卒中相關的通路來腦缺血再灌注損傷起到保護作用。分子對接結果顯示，蜜環(huán)-銀杏藥對的核心成分染料木素、槲皮素、山奈酚、蜜環(huán)菌己素和蜜環(huán)菌乙素與核心靶點SRC、TP53、JUN、MAPK3和EGRF的分子對接分數(shù)均小于-5kcal/mol，表明核心成分與核心靶點的對接效果良好，從而進一步驗證了通過網(wǎng)絡藥理學得到的結果。而蜜環(huán)菌己素和蜜環(huán)菌乙素的抗腦缺血再灌注損傷尚未有實驗證實，它們所能夠發(fā)揮的實際作用依然亟待探究。綜上所述，本文基于網(wǎng)絡藥理學對蜜環(huán)-銀杏治療腦缺血再灌注損傷的機制進行了分析討論，并對篩選出的核心成分與核心靶點進行了分子對接驗證。結果顯示，蜜環(huán)-銀杏藥對中的染料木素、槲皮素和山奈酚等成分可能通過AGE-RAGE和PI3K-Akt等信號通路作用于SRC、TP53、JUN、MAPK3和EGRF等靶點，起到保護神經細胞、抗氧化應激、抗炎抗細胞凋亡、減小腦缺血再灌注損傷的作用。本研究進一步佐證了中藥多成分多靶點的治療作用，為以后的實驗驗證提供了依據(jù)。

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