DB42DB42/T1779—2021仔豬腸毒素性大腸桿菌反向間接血凝試驗操作規(guī)程Protocolofreverseindirecthemoagglutinationassayforpigletenterotoxigenicescherichiacoli2021-12-23發(fā)布2022-02-23實施湖北省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I 2 2 2 2 3 4 5本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件實施應(yīng)用中的疑問，可咨詢湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，聯(lián)系電話郵箱：hbsnab@126.com；對本規(guī)程的有關(guān)修改意見建議請反饋至湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，聯(lián)系電話郵箱：397321935@qq.escherichiacoli，ETEC）引起。該病常發(fā)生于1周齡內(nèi)的仔豬，以1日～3日齡最1仔豬腸毒素性大腸桿菌反向間接血凝試驗操作規(guī)程NY/T2839致仔豬黃痢大腸桿菌分離鑒定技術(shù)大多數(shù)革蘭氏陰性菌和少數(shù)革蘭氏陽性菌的菌體表面遍布的細(xì)而短的絲狀物，其化學(xué)成分為蛋白4儀器與材料4.2.1陽性對照：腸毒素性大腸桿菌纖毛抗原，制備方法見附錄A。4.2.2陰性對照：樣品稀釋液，配制方法見附錄B。24.2.4大腸桿菌纖毛抗體致敏綿羊紅細(xì)胞：制備方法見5樣品的采集和處理a)“++++”：100%凝集，致敏綿羊紅細(xì)胞呈細(xì)沙粒樣均勻鋪于孔底；b)“+++”：75%凝集，致敏綿羊紅細(xì)胞均勻鋪于孔底，但邊緣不整且稍向孔底集中；c)“++”：50％凝集，致敏綿羊紅細(xì)胞于孔底形成一個環(huán)狀，四周有小凝集塊；d)“+”：25%凝集，致敏綿羊紅細(xì)胞于孔底形成圓團，但邊緣不夠光滑，四周稍有凝集；待檢樣品出現(xiàn)“++”或“++”以上，判定為陽性；待檢樣品呈現(xiàn)“-”時，判定為陰性；介于兩者8.1實驗操作人員進(jìn)行實驗前應(yīng)穿戴好個人防護(hù)用品。8.3實驗過程中使用的器材、實驗廢棄物如病料、活菌及與活菌接觸的器皿、槍頭、防護(hù)手套等，均3A.2將收集的菌液，經(jīng)5000r/min離心10min，沉淀物用適量PBS（0.0A.410000r/min2℃~8℃離心30min，取上清。加入固體硫酸銨至30%飽和度，2℃~8℃放置過A.510000r/min2℃~8℃離心30min，收集沉淀，用少量PBS（0.01mol/L，pH值7.2）懸浮。4氯化鈉（NaCl）硫柳汞（C9H9HgNaO2S）0.2g加蒸餾水定容至1000mL即可，置2℃~8℃保存?zhèn)溆谩?C.1.1陽性血清的制備：用PBS（0.01mol/L，pH值7.2）將純化的纖毛抗原稀釋為蛋白質(zhì)濃度0.佐劑混合制成乳劑，作為二免抗原，注射方法與劑量同首免。再過2周進(jìn)行三免，免疫抗原和免疫方法同二免。三免2周后用瓊脂擴散試驗檢測血清效價，待血清瓊擴抗體效價達(dá)1:32以上時，心臟采血，分離血清，加0.01%硫柳汞，經(jīng)56℃水浴滅活30min，置-40℃保存。下逐滴加入正辛酸25μL/mL；室溫混合30min，2℃~8℃靜置2h以上；然后2℃~8℃,10000r/min離心30min，棄沉淀；計上清體積，加入1/10體積的PBS（0.01mol/L，pH值7.2用2mol/LNaOH調(diào)pH值至7.4；冰浴下于30min內(nèi)加入0.277g/mL心30min，棄上清；沉淀用適量PBS（0.01mol/L，pH值7.2）溶解，于50～100倍體積的PBS（0.01mol/L，pH值7.2）中置2℃~8℃透析過夜，期間以相同體積的PBS（0.01mol/L，pH值7.2）換液3～4次；收C.2大腸桿菌纖毛抗體致敏綿羊紅細(xì)胞的制備定3～5d。5000r/min離心10min后入1份3%戊二醛溶液，加完后繼續(xù)攪拌數(shù)小時至紅細(xì)胞呈紅褐色，5000r/min離心10min后去上清，細(xì)洗滌4～5次，用PBS（0.01mol/L，pH值7.2）配成10%醛化紅細(xì)胞。加0.01%硫柳汞，2℃~8℃保存，不充分混勻后，立即加入1份1:20000鞣酸溶液，混勻，37℃水浴30min。用含0.L