第三章細胞生物學(xué)研究辦法

第一節(jié)細胞形態(tài)構(gòu)造的觀察辦法

顯微鏡及其分辨力分辨力：一架顯微鏡或人眼在２５cm的明視距離處，能分辨被檢物體細微構(gòu)造最小間隔的能力。顯微鏡的分辨力：R=0.61λ/N.A.(其中，N.A.=nsinθ)R為分辨力，N.A.為鏡口率（n為介質(zhì)的折射率，sinθ為透鏡視錐半頂角的正弦），λ為波長。人眼分辨力為100μm；光學(xué)顯微鏡最大分辨力約為０.2μm。顯微構(gòu)造（線粒體、中心體、核仁等）和亞顯微構(gòu)造（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體微管等）；電子顯微鏡：采用電子波替代光波，分辨力可達２?。1、普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)樣品經(jīng)固定劑解決，包埋切片，5um厚度，普通通過染色，不同燃料對某種細胞親和性或特異的吸附而形成反差。2.熒光顯微鏡技術(shù)對特異性蛋白質(zhì)等生物大分子定性定位的最有力的工具。分為免疫熒光技術(shù)和熒光素直接標記技術(shù)。將可產(chǎn)生熒光的綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）基因和某種蛋白質(zhì)基因融合，在體現(xiàn)這種融合蛋白質(zhì)的細胞中，便可直接觀察到該蛋白的動態(tài)變化。一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)3、激光共焦點掃描顯微鏡技術(shù)激光共焦點掃描顯微鏡（laserscanningconfocalmicroscopy）的分辨率比普通熒光顯微鏡提高了1.4-1.7倍。所謂共聚焦，指物鏡和聚光鏡同時聚焦到同一小點。能夠觀察到比較厚的樣品的內(nèi)部構(gòu)造。能夠重構(gòu)建樣品的三維構(gòu)造。。

在研究亞細胞構(gòu)造與組分等方面的應(yīng)用越來越廣顯微鏡光學(xué)顯微鏡，最小分辨率1um。電子顯微鏡的最小分辨率0.1nm。透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡不同顯微鏡下細胞激光共聚焦顯微鏡用激光共聚焦顯微鏡看到的多個細胞4、相差和微分干涉顯微鏡在相差顯微鏡（phase-contrastmicroscopy）中，將這種光程差或相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹?。能夠有不同程度的吸光作用，能夠“夸張”相位差，最后這兩光束又會聚，形成干涉現(xiàn)象，從而體現(xiàn)出肉眼可見的明暗區(qū)別。由于反差是以樣品中的密度差為基礎(chǔ)，故樣品不需染色。能夠觀察活細胞、細胞核、線粒體等細胞器的動態(tài)。二、電子顯微鏡技術(shù)

由于波長的限制，其分辨率只能達成一定的程度。研究細胞內(nèi)部的精細構(gòu)造，就必須借助于分辨率更高的電子顯微鏡(electronmicroscope)。(一)電子顯微鏡的普通知識1.電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別高分辨率。用電磁透鏡聚焦，電鏡鏡筒中規(guī)定高真空，圖象需要熒光屏來顯示或感光膠片作統(tǒng)計。2.分辨本領(lǐng)與有效放大倍數(shù)人眼分辨率0.2mm，光鏡分辨率0.2um，有效放大倍數(shù)0.2mm/0.2um，即1000倍，電鏡分辨率偽0.2nm，放大106倍。但電鏡的實際分辨率受到生物樣品本身的限制，分辨率約為5nm。3.電鏡的基本構(gòu)造電子束照明系統(tǒng)：電子槍、聚光鏡成像系統(tǒng)：物鏡、中間鏡和投影鏡真空系統(tǒng)：保持電子槍、鏡筒、統(tǒng)計系統(tǒng)的高真空統(tǒng)計系統(tǒng)：成像通過熒光屏或感光膠片統(tǒng)計

電鏡可分為兩大類:

透射電子顯微鏡

掃描電子顯微鏡。光鏡與電子顯微鏡(透射電鏡)的構(gòu)造

（二）重要電鏡樣品制作技術(shù)樣品規(guī)定：

①樣品很薄100-200kv電壓，電子透射能力只有1um，只有使用超薄切片技術(shù)方可達成幾十nm；一種直徑為20um的細胞可切成幾百片。②規(guī)定更加好地保持樣品的精細構(gòu)造，樣品的制備過程復(fù)雜：固定、脫水、包埋、切片和染色。1.超薄切片技術(shù)規(guī)定樣品既要有一定的剛性又要有一定的柔性。生物樣品并不含有這樣的特性。規(guī)定包埋材料。（1）固定保持樣品的真實性，慣用鋨酸和戊二醛。（2）包埋使樣品中多個細微構(gòu)造在切片過程中得到均勻良好的支撐，因此包埋邁進行一系列的脫水。（3）切片切片厚度普通為40-50nm，再用載網(wǎng)支撐。（4）染色鋨酸易染脂肪，鉛鹽易染蛋白質(zhì)，醋酸鈾易染核酸。只能染出黑白圖象。電子顯微鏡樣品的制備過程

2.負染色技術(shù)線粒體基粒、核糖體、蛋白質(zhì)及其構(gòu)成的纖維和病毒等可通過負染色（negativestaining）技術(shù)，其分辨率可達1.5nm左右。使用磷鎢酸或醋酸雙氧鈾。負染色(negativestainning)某些生物大分子構(gòu)成的構(gòu)造，如病毒、線粒體基粒、核糖體和蛋白質(zhì)構(gòu)成的纖維等能夠通過負染色電鏡技術(shù)觀察其精細構(gòu)造，還能夠從不同角度觀察三維構(gòu)造。

煙草rattle病毒的負染色3.冷凍斷裂或冷凍蝕刻技術(shù)快速低溫冷凍，在低溫下進行斷裂。在疏水鍵處斷裂，使使膜脂中的蛋白顆粒露出。冷凍蝕刻（freeingetching）是專門觀察樣品外表面的投影復(fù)型術(shù)(圖3-4)。

冰凍斷裂與冰凍蝕刻技術(shù)間接成像技術(shù)光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡是運用質(zhì)子和電子使樣品直接成像的技術(shù)，尚有某些顯微辦法是間接成像。所謂間接成像，舉一種例子，假定你拿起一種物體，非?？拷愕难劬M行觀察，你或許覺得該物體有六個平面、十二條邊和八個角，然后將你感覺到的畫出來，可能是一種盒子，這就是間接成像。下面討論的是幾個間接成像的辦法，這些辦法都含有原子級分辨力，它們的分辨率比最佳的電子顯微鏡還高10倍。4.電子三維重構(gòu)技術(shù)電子顯微術(shù)、電子衍射與計算機圖象解決結(jié)合的新技術(shù)。對生物樣品的不同傾角進行一系列的拍照得到一系列的電鏡圖片，經(jīng)變換解決后，呈現(xiàn)出生物大分子及其復(fù)合三維構(gòu)造的電子密度圖。AB

根據(jù)低溫電鏡圖象和三維重構(gòu)技術(shù)所顯示的我國兔出血病毒的三維密度圖A：為沿三次軸觀察的密度圖B：為病毒顆粒垂直于三次軸的中心切片，顯示三維重構(gòu)的密度分布

5.掃描電鏡技術(shù)（scanningelectronmicroscope,SEM）其電子束會聚成探針，在樣品表面進行掃描?？杉ぐl(fā)樣品表面釋放出二次電子（其多少與電子表面的形貌有關(guān)），含有強烈的立體感。掃描電子顯微鏡使用與透射電子顯微鏡完全不同的方式成像，即用電視的方式成像。掃描電子顯微鏡重要由電子光學(xué)系統(tǒng)和顯示單元構(gòu)成。

掃描電子顯微鏡

AB四膜蟲的掃描電鏡圖象

A：全蟲；B：部分放大

透射電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope，TEM)透射電子顯微鏡重要是讓電子束穿透樣片而成像。三、掃描隧道顯微鏡（scanningtunnelingmicroscope,STM）直接觀察DNA、RNA和蛋白質(zhì)、生物膜、病毒的構(gòu)造。DNA雙螺旋構(gòu)造的建立是根據(jù)X射線衍射成果推導(dǎo)出來的，至今還沒有直接觀察DNA構(gòu)造的辦法，因此對其中的微細構(gòu)造還不夠理解。用STM觀察了DNA的雙螺旋構(gòu)造，見到DNA分子上的大溝(majorgroove)和小溝(minorgroove)，并且理解DNA的構(gòu)造隨染色體長度而異。掃描隧道顯微鏡觀察的DNA雙螺旋構(gòu)造

四、X-射線衍射技術(shù)

X-射線衍射(X-raydiffraction)第二節(jié)細胞組分的分析辦法

一、用超速離心技術(shù)分離細胞器和生物大分子及其復(fù)合物用低滲勻漿、超聲破碎等破壞細胞壁，后用差速離心（differentialcentrifugation）和密度梯度離心法分離。

分離技術(shù)是一大類技術(shù)的總稱，涉及細胞組分的分離和生物大分子的分離。

（一）離心分離技術(shù)離心分離細胞組分和生物分子是最慣用的分離辦法，由于不同的細胞器和分子有不同的體積和密度(圖3-26)，可在不同離心力的作用下沉降分離。慣用的兩類離心分離辦法是速度離心(velocitycentrifugation)和等密度離心(isodensitycentrifugation)。圖3-26不同的細胞器、大分子和病毒的密度及對應(yīng)的沉降系數(shù)1.速度離心分離細胞器和大分子在速度離心分離中有兩種不同的辦法:(1)差速離心(differentialcentrifugation)(圖3-27)。(2)移動區(qū)帶離心(moving-zonecentrifugation)(圖3-28)圖3-27差速離心的原理慣用的是蔗糖密度梯度離心(sucrosedensitygradientcentrifugation)。移動區(qū)帶離心圖3-28移動區(qū)帶離心分離2.等密度離心(isodensitycentrifugation)(圖3-29)

圖3-29密度梯度離心分離溶酶體、線粒體和微體離心分離密度不不大于1.3g/cm3的樣品，如DNA、RNA，需要使用密度比蔗糖和甘油大的介質(zhì)。重金屬鹽氯化銫(CsCl)是現(xiàn)在使用的最佳的離心介質(zhì)，它在離心場中可自行調(diào)節(jié)形成濃度梯度，并能保持穩(wěn)定(圖3-30)。圖3-30CsCl密度梯度離心分離DNA(二)層析分離技術(shù)(chromatography)層析是廣泛使用的分離蛋白質(zhì)的辦法，它是根據(jù)蛋白質(zhì)的形態(tài)、大小和電荷的不同而設(shè)計的物理分離辦法。凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等是現(xiàn)在最慣用的層析辦法。根據(jù)蛋白質(zhì)的形態(tài)、大小和電荷的不同而設(shè)計的物理分離辦法。多個不同的層析辦法都涉及共同的基本特點:有一種固定相和流動相，當?shù)鞍踪|(zhì)混合溶液(流動相)通過裝有珠狀或基質(zhì)材料的管或柱(固定相)時，由于混合物中各組份在物理化學(xué)性質(zhì)(如吸引力、溶解度、分子的形狀與大小、分子的電荷性與親和力)等方面的差別使各組分在兩相間進行重復(fù)多次的分派而得以分開。1.凝膠過濾層析(gelfiltrationchromatography)凝膠過濾層析法又稱排阻層析或分子篩辦法，重要是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進行分離和純化(圖3-31)。圖3-31凝膠層析法2.親和層析(affinitychromatography)在生物分子中有些分子的特定構(gòu)造部位能夠同其它分子互相識別并結(jié)合，如酶與底物的識別結(jié)合、受體與配體的識別結(jié)合、抗體與抗原的識別結(jié)合，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的，變化條件能夠使這種結(jié)合解除。生物分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力。親和層析就是根據(jù)這樣的原理設(shè)計的蛋白質(zhì)分離純化辦法(圖3-32)。圖3-32親和層析

3.離子交換層析(ion-exchangechromatography)離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的差別進行分離純化的一種辦法(圖3-33)。圖3-33離子交換層析二、細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類與脂質(zhì)等的顯示辦法顯色劑與特殊基團相結(jié)合，通過顯色劑在細胞中的定位和顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細胞中的分布和含量。福爾根（Feulgen）反映可特異顯示DNA的分布;酸水解后僅保存DNA，并脫嘌呤，暴露脫氧核糖的醛基，與Schiff試劑結(jié)合呈紫紅色。PAS反映則檢測多糖的存在。四氧化鋨與不飽和脂肪酸反映呈黑色。蛋白質(zhì)Millon反映中氮汞試劑與酪氨酸反映，形成紅色沉淀等。檢測酶時，采用冷凍技術(shù)或冷丙酮、甲醛進行短期固定，然后將樣品與適宜的底物共溫育，如Gomori辦法。形成有色沉淀。

蘇丹III（深紅）使脂滴著色，蘇丹黑也溶于磷脂和膽固醇中。

三、特異蛋白抗原的定位與定性

體內(nèi)：免疫熒光(immunofluorescencetechnique)與免疫電鏡技術(shù)

體外：免疫印跡（westernblotting）和免疫放射沉淀（radioimmuno-precipitation）1.免疫熒光技術(shù)(immunofluorescencetechnique)

將免疫學(xué)辦法與熒光標記技術(shù)相結(jié)合用來研究特異抗原蛋白在細胞內(nèi)的分布的辦法。重要涉及：熒光抗體的制備、標本的解決、免疫染色和觀察統(tǒng)計等過程。特點：快速、敏捷、有特異性，但分辨率有限。2.免疫電鏡技術(shù)

免疫鐵蛋白技術(shù)、免疫酶技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)。

四、細胞內(nèi)特異核酸序列的定位與定性

采用原位雜交技術(shù)（insituhybridization）

放射性標記技術(shù)、熒光素標記、膠體金標記、生物素標記等。在顯微與亞顯微構(gòu)造上的基因定位、特異mRNA體現(xiàn)等研究中有用。五、運用放射性標記技術(shù)碩士物大分子在細胞內(nèi)的合成動態(tài)放射性自顯影技術(shù)是運用放射性同位素的電離輻射對乳膠（含AgBr或AgCl）的感光作用，對細胞內(nèi)生物大分子進行定性、定位與半定量研究的一種細胞化學(xué)技術(shù)。對細胞內(nèi)生物大分子進行動態(tài)研究和追蹤（pulse-chase）是這一技術(shù)的獨具特性。

涉及兩個重要環(huán)節(jié)：同位素標記的生物大分子的摻入和細胞內(nèi)同位素所在位置的顯示。研究DNA合成時慣用氚（3H）標記的胸腺嘧啶脫氧核苷（3H-TdR）；研究RNA合成時慣用氚標記的尿嘧啶核苷（3H-U）；研究含硫氨基酸代謝時，可用35S標記的蛋氨酸和半光氨酸，也可用3H和14C標記的蛋氨酸、亮氨酸等。

同位素標記的前體物摻入細胞即標記。六、定量細胞化學(xué)分析技術(shù)蛋白質(zhì)和核酸在某個細胞或細胞群中的含量分析對該物質(zhì)的生物學(xué)功效十分重要。下面介紹兩種細胞化學(xué)的定量分析辦法。1.顯微分光光度測定技術(shù)細胞顯微分光光度術(shù)(microspectrophotometry）是運用細胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜吸取的原理，用來測定這些物質(zhì)(如蛋白質(zhì)與核酸等)在每一種細胞內(nèi)的含量的一種實驗技術(shù)，如DNA對紫外線的最高吸取波長位260nm，也可通過特異的染色反映，如DNA通過特異Feulgen反映后就可吸取波長為546nm的可見光波段。

分為紫外光顯微分光光度測定法和可見光顯微分光光度法。

顯微分光光度測定技術(shù):將顯微鏡技術(shù)與分光光度計結(jié)合起來的技術(shù)。它以物質(zhì)分子的光吸取、熒光發(fā)射和光反射特性作為測定基礎(chǔ)，可用來分析生物樣品細微構(gòu)造中的化學(xué)成分，同時進行定位、定性和定量。顯微熒光光度術(shù)(microfluorometry)

運用顯微分光光度計對細胞內(nèi)原有能發(fā)光的物質(zhì)或?qū)毎麅?nèi)多個化學(xué)成分用不同的熒光經(jīng)熒光探針標記后進行定位、定性和定量地測定，稱為顯微熒光光度術(shù)，也稱細胞熒光光度術(shù)(cytofluorometry)。它是一種微觀而敏捷的辦法，對于研究細胞的構(gòu)造、功效及其變化含有重要意義。核磁共振技術(shù)(nuclearmagneticresonance，NMR)核磁共振技術(shù)能夠直接研究溶液和活細胞中小分子量(20，000道爾頓下列)蛋白質(zhì)、核酸以及其它分子的構(gòu)造，而不損傷細胞。核磁共振的基本原理是:原子核有自旋運動，在恒定的磁場中，自旋的原子核將繞外加磁場作回旋轉(zhuǎn)動，叫進動(precession)。進動有一定的頻率，它與所加磁場的強度成正比。如在此基礎(chǔ)上再加一種固定頻率的電磁波，并調(diào)節(jié)外加磁場的強度，使進動頻率與電磁波頻率相似。這時原子核進動與電磁波產(chǎn)生共振，叫核磁共振。核磁共振時，原子核吸取電磁波的能量，統(tǒng)計下的吸取曲線就是核磁共振譜(NMR-spectrum)。由于不同分子中原子核