第三章基因工程

教學重點、難點、學時一、概述二、基因三、酶四、載體五、基因重組1、要點基因工程的分子生物學基礎、基因工程工具酶、基因工程載體、目的基因的獲得、目的基因?qū)胧荏w細胞、重組體的篩選、DNA序列分析、基因工程在環(huán)境污染治理中的應用2、重點基因工程的分子生物學、目的基因的獲得、基因工程工具酶、基因工程載體、目的基因?qū)胧荏w細胞、重組體的篩選3、學時5學時教學要點、重點、學時一、概述（一）基因組的相關(guān)名詞1、DNA：遺傳物質(zhì)脫氧核糖核酸的簡稱。每個DNA分子都包含螺旋結(jié)構(gòu)的雙股鏈。2、基因：DNA上有遺傳意義的片段叫基因，基因包含一定數(shù)量的堿基?；蚴腔A的遺傳單位，它們決定一個人眼睛的顏色、耳朵的大小、腦容量等所有人的生理特征和一些行為特征。更重要的是，基因與許多疾病有關(guān)。一、概述3、測序：確定DNA雙股鏈上每個獨立結(jié)構(gòu)單元或堿基的確切順序的過程。測序經(jīng)常被稱為“破譯”，因為其結(jié)果就像解碼一樣。解碼結(jié)果包含數(shù)百頁和成千上萬行4種字母的序列，這些字母表示4種不同的堿基，它們是腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，分別用它們的首字母A、T、C、G表示，其排列順序中蘊藏著各種各樣的遺傳信息和生命指令。4、基因診斷:也叫DNA診斷、分子診斷，是通過從患者體內(nèi)提取樣本用基因檢測方法來判斷患者是否有基因異?；驍y帶病原微生物。目前，基因診斷檢測的疾病主要有三大類：感染性疾病的病原診斷、各種腫瘤的生物學特性的判斷、遺傳病的基因異常分析。一、概述5、ＤＮＡ芯片，又稱基因芯片（ｇｅｎｅｃｈｉｐ），實質(zhì)上是一種高密度的寡聚核苷酸（ＤＮＡ探針）陣列。它采用在位組合合成化學和微電子芯片的光刻技術(shù)，或者利用其他方法將大量特定系列的ＤＮＡ片段（探針）有序地固化在玻璃或磋襯底上，從而構(gòu)成儲存有大量生命信息的ＤＮＡ芯片。6、所謂轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是把外源基因整合到動植物基因組中去。下面分別對轉(zhuǎn)基因動物和轉(zhuǎn)基因植物來進行描述。一、概述7、基因突變是指由于DNA堿基對的置換、增添或缺失而引起的基因結(jié)構(gòu)的變化，亦稱點突變。8、人類基因組（ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅ）：是建立人體所需的化學密碼或藍圖，而這幅藍圖的基本組成是ＤＮＡ。ＤＮＡ是一條由磷酸鹽和糖組成的分子鏈，呈雙螺旋形，即兩條互相纏繞的螺旋形分子帶，中間以稱為堿基的橫條緊扣。除了孿生子女外，每個人的ＤＮＡ都是獨一無二的。一、概述9、染色體（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）：人體每個細胞內(nèi)皆有２３對染色體，它們位于細胞的核心，當中染色體ＸＹ是決定性別的。一個人體內(nèi)所有細胞的染色體的長度加起來，足足有１６００億公里長。10、克隆是英文clone的音譯，簡單講就是一種人工誘導的無性繁殖方式。

一、概述（二）基因工程1、定義：將外源基因體外重組后導入受體細胞內(nèi)，使這個基因能在受體細胞內(nèi)復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達的操作。2、理論和技術(shù)支撐（1）理論：40年代發(fā)現(xiàn)了生物的遺傳物質(zhì)是DNA、50年代弄清了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)、60年代確定了遺傳信息的傳遞方式。一、概述（2）技術(shù)：工具酶、載體、逆轉(zhuǎn)錄酶2、基因工程實施至少四個必要條件：工具酶、基因、載體、受體細胞3、基因工程的內(nèi)容4、遺傳工程、基因工程、DNA重組技術(shù)的區(qū)別5、基因工程操作的基本技術(shù)一、概述二、基因（一）結(jié)構(gòu)與功能（二）DNA的變性、復性與雜交（三）中心法則（一）結(jié)構(gòu)與功能1、DNA的組成堿基、脫氧核糖、磷酸基二、基因（一）結(jié)構(gòu)與功能2、DNA的結(jié)構(gòu)核心是堿基配對（A＝T，G＝C）1）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型：

a.兩鏈平行反向且右旋，也發(fā)現(xiàn)了三股DNA和左旋Z－DNAb.以堿基配對c.每周含10個堿基對，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)堿基對也可變，A－DNAd.磷酸－核糖主鏈在外側(cè)，堿基以平面在內(nèi)側(cè)且與主鏈垂直e.超螺旋結(jié)構(gòu)普遍存在二、基因NucleotideGenes2）理論意義a.細胞減數(shù)分裂和有性生殖b.個體發(fā)育c.遺傳與變異d.性狀控制二、基因（一）結(jié)構(gòu)與功能3.DNA的復制1）在復制起始點形成復制起始叉；2）半保留復制；3）具有高度忠實性；4）需要多種酶4、DNA作為遺傳物質(zhì)的優(yōu)點1）信息量大，可以微縮；2）表面互補，電荷互補；3）在水溶液中穩(wěn)定性好4）可突變，能求進化5）有T無U，基因組得以增大，不會帶來潛在危險注：RNA擬酶?RNA蛋白質(zhì)?DNA世界二、基因（一）結(jié)構(gòu)與功能DNAReplication

變性（熔解）－在加熱或某些試劑的作用下，DNA配對堿基之間的氫鍵結(jié)構(gòu)受到破壞，雙鏈DNA多核苷酸鏈能完全分離，此分離過程稱為變性。

復性－變性DNA在一定條件下能恢復其雙是螺旋結(jié)構(gòu)的過程。二、基因（二）DNA的變性、復性與雜交1、變性1）變性表象ａ粘度降低ｂ沉速加快ｃ紫外吸收值增大2）影響因素ａDNA本身穩(wěn)定性ｂ外部條件3）變性研究

Tｍ二、基因（二）DNA的變性、復性與雜交2、復性1）影響因素ａDNA分子的大小和順序復雜性ｂ樣品的濃度ｃ溶液的離子強度

ｄ溫度2）復性條件ａ鹽濃度要高ｂ溫度要高得適當3）復性動力學滿足二級動力學

注:復雜度－DNA中最長的沒有重復序列的核苷酸對的個數(shù)值。二、基因（二）DNA的變性、復性與雜交3、雜交當復性的DNA分子由不同的兩單鏈分子形成時，稱為雜交。復性是分子雜交的理論基礎。二、基因（二）DNA的變性、復性與雜交轉(zhuǎn)錄－利用DNA為模板合成RNA的過程。翻譯－以RNA為模板合成蛋白質(zhì)的過程。1、RNA的轉(zhuǎn)錄

1）RNA聚合酶結(jié)合于DNA分子上的特定位置；

2）使DNA雙鏈解旋，起始RNA合成；

3）RNA鏈的延伸；

4）RNA合成的終止和釋放。二、基因（三）中心法則2、逆轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄－以RNA為模板在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成DNA的過程。

逆轉(zhuǎn)錄酶－是一種依賴于RNA的DNA聚合酶。

意義：逆轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)使我們可以用真核ｍRNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄而獲得為特定蛋白質(zhì)編碼的基因。3、翻譯－蛋白質(zhì)的生物合成二、基因（三）中心法則RNARibonucleicAcidRNARibonucleicAcid-AMoreDetailedDescriptionmRNA依照DNA上面的核甘酸序列，可翻譯成蛋白質(zhì)的氨基酸序列，這是如何做到的？

(1)DNA的序列可以A=U及C=G的互補關(guān)系，轉(zhuǎn)成messengerRNA。

(2)mRNA與核糖體結(jié)合，準備開始進行轉(zhuǎn)譯蛋白質(zhì)。

(3)mRNA序列以三個為一組，稱為“遺傳密碼”，每組密碼可對應一種氨基酸。

(4)由RNA譯成胺基酸序列時，需要有“翻譯者”，此翻譯者即為

tRNA。

(5)每個

tRNA可說是一種介面，一邊認得特定的

RNA密碼，一邊攜帶對應的氨基酸。

(6)當

tRNA

一邊認出其特定密碼，一邊可把所攜帶的氨基酸接上連成蛋白質(zhì)。三、酶（一）限制性內(nèi)切酶（二）連接酶（三）修飾酶四、載體

（一）定義、分類、要求

（二）載體因宿主而不同1、原核2、真核3、植物4、動物（一）定義、分類、要求1、定義

能承載外源DNA片段（基因）并帶入受體細胞的傳遞者。2、分類克隆載體、穿梭載體、表達載體3、要求（1）自主復制能力（2）可利用的限制酶切點（二）載體因宿主而不同1、原核（1）質(zhì)粒載體：能裝載10kb左右的DNA片段質(zhì)粒：是能自主復制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，它們在細菌中以獨立于染色體之外的方式存在，一個質(zhì)粒就是一個DNA分子，1kb--200kb。a、pBR322(p100)b、pUC18/19(p101)顏色反應：帶有沒有插入DNA片段的Puc18/19質(zhì)柆的菌落呈藍色；插入有目的DNA片段，那么就會破壞lacZ’的結(jié)構(gòu)，導致細菌無法產(chǎn)生功能性的lacZ蛋白，也就無法形成雜合β－半乳糖苷酶，因而菌落是白色的。（2）噬菌體載體：能裝載24kb左右的外源DNA（p102)

噬菌體內(nèi)含雙鏈環(huán)形、單鏈環(huán)形、雙鏈線形、單鏈線形等多種形式、大小不一的DNA，且感染率高。（二）載體因宿主而不同（3）人工載體：大多具有大腸桿菌質(zhì)粒的抗藥性和噬菌體強感染力，同時滿足攜帶真核生物的目的基因大片段DNA。

柯斯質(zhì)粒：又稱質(zhì)粒載體，是將質(zhì)粒與λ

噬菌體DNA包裝有關(guān)的區(qū)段（cos序列）相結(jié)合構(gòu)建而成的克隆載體。能裝載35kb—45kb的外源DNA。（p103)（二）載體因宿主而不同2、真核穿梭載體：既可在原核中復制擴增，也可在真核中擴增、表達。具備p104的五個條件。（1）酵母質(zhì)粒（2）人工染色體載體：整合質(zhì)粒（YIP）、復制型載體（穿梭載體）YRP、附加體型載體（YEP）a、YACb、BACC、PACsd、MAC（二）載體因宿主而不同3、植物（1）Ti質(zhì)粒（2）植物DNA病毒（很少應用）（3）植物轉(zhuǎn)座子（很有前景）4、動物（1）取代型（2）病毒－質(zhì)粒重組型（二）載體因宿主而不同InsertingaDNASampleintoaPlasmidCloningintoaPlasmidTransferandCloningoftheInsulinGeneCloningintoaYeastArtificialChromosome(YAC)五、基因重組（一）目的基因的獲得1、基因的組成：結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、操縱基因2、目的基因的獲得（1）原核：基因文庫（2）真核：cDNA、DNA的化學合成、PCR

（二）目的基因?qū)胧荏w細胞1、受體細胞及分類（1）定義：也稱宿主細胸或表達系統(tǒng)，主目的基因的表達，名手為復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、后加工、分泌等提供條件。五、基因重組（2）受體細胞選擇的原則（p118)(3)分類：微生物表達系統(tǒng)、植物細胞表達系統(tǒng)、動物細胞表達系統(tǒng)（4）注意區(qū)分幾個概念a融合系統(tǒng)與融合蛋白b瞬時表達系統(tǒng)與穩(wěn)定表達系統(tǒng)c導入方法：高等動植物－－－顯微注射、電穿孔原核細胞－－－轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：是指某一基因型的細胞從周圍介質(zhì)中吸收來自另一基因型細胞的DNA而使它的基因型和表型發(fā)生相應變化的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)導：是由病毒介導的細胞間進行遺傳交換的一種方式，即一個細胞的DNA或RNA通過病毒載體的感染轉(zhuǎn)移到另一個細胞中。

2、導入過程（1）目的基因?qū)肟寺≥d體：強啟動子、便于連接、因細胞不同選用合適的載體五、基因重組（2）重組DNA分子導入受體細胞：共有9種方法轉(zhuǎn)化、高壓電穿孔法、多聚物介導法、磷酸鈣或DEAE－葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染法、原生質(zhì)體融合法、脂質(zhì)體介導法、顯微注射法、粒子轟擊法、激光微束穿孔法(三）重組體的篩選1、物理方法：如電泳2、生物學方法（1）遺傳學方法：利用抗生素抗性基因、營養(yǎng)缺陷互補法（2）免疫學方法（western、eastern）（3）利用噬菌斑篩選3、核酸雜交基本原理：(探針－prob)(1)原位雜交（2）southern(3)northern(四）DNA序列分析1、Maxam－Gilbert