傳染性造血器官壞死病毒糖蛋白原核表達(dá)與免疫學(xué)鑒定的深度探究一、引言1.1研究背景隨著全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，魚類疾病成為制約產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一。傳染性造血器官壞死病毒（InfectiousHematopoieticNecrosisVirus，IHNV）引發(fā)的傳染性造血器官壞死病（InfectiousHematopoieticNecrosis，IHN），是鮭鱒魚類最為嚴(yán)重的急性、傳染性病毒病，給世界鮭魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。據(jù)統(tǒng)計(jì)，IHN的爆發(fā)可導(dǎo)致魚體80%-100%的死亡率，對(duì)全球鮭鱒魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)沉重打擊。IHNV屬于彈狀病毒科諾拉彈狀病毒屬，粒子呈典型的彈狀，大小為（120-300）nm×（60-100）nm，有囊膜，不耐熱、不耐酸，對(duì)甘油、乙醚、游離碘及氯仿敏感。其基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA，編碼6個(gè)基因，從3′端至5′端依次為核衣殼蛋白（N）、與聚合酶相關(guān)的磷酸蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）、非結(jié)構(gòu)蛋白（NV）和聚合酶（L）。糖蛋白（G）在IHNV的感染和免疫過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。一方面，G蛋白是病毒的主要表面抗原，參與病毒與宿主細(xì)胞的吸附和融合過(guò)程，決定了病毒的宿主范圍和感染特異性。研究表明，G蛋白能夠特異性地識(shí)別宿主細(xì)胞表面的受體，介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞，從而啟動(dòng)感染過(guò)程。另一方面，G蛋白具有良好的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，在病毒感染的免疫預(yù)防和診斷中具有重要意義。當(dāng)機(jī)體感染IHNV后，免疫系統(tǒng)會(huì)識(shí)別G蛋白并產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，這些抗體可以中和病毒，阻止病毒進(jìn)一步感染細(xì)胞，從而保護(hù)機(jī)體免受病毒侵害。在病毒感染機(jī)制研究中，G蛋白的結(jié)構(gòu)和功能一直是研究的熱點(diǎn)。通過(guò)對(duì)G蛋白的結(jié)構(gòu)解析，發(fā)現(xiàn)其具有特定的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域與病毒的吸附、融合以及免疫原性密切相關(guān)。一些研究通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)G蛋白的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，研究其對(duì)病毒感染和免疫應(yīng)答的影響，為深入理解病毒感染機(jī)制提供了重要依據(jù)。在免疫診斷方面，以G蛋白為基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢測(cè)方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫熒光技術(shù)等，已被廣泛應(yīng)用于IHNV的檢測(cè)和診斷。這些方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，能夠快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出病毒感染，為疫病的防控提供了有力的技術(shù)支持。在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，G蛋白作為重要的免疫原，被用于開(kāi)發(fā)多種類型的疫苗，如亞單位疫苗、DNA疫苗等。這些疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的免疫保護(hù)效果，為IHN的防控提供了新的策略和手段。盡管目前對(duì)IHNV糖蛋白的研究取得了一定進(jìn)展，但仍存在許多問(wèn)題亟待解決。例如，G蛋白的免疫原性機(jī)制尚未完全明確，如何進(jìn)一步提高G蛋白的免疫原性，開(kāi)發(fā)更加高效的疫苗，仍然是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。此外，隨著病毒的進(jìn)化和變異，G蛋白的抗原性也可能發(fā)生改變，如何及時(shí)監(jiān)測(cè)和應(yīng)對(duì)這些變化，也是未來(lái)研究需要關(guān)注的問(wèn)題。本研究旨在通過(guò)原核表達(dá)技術(shù)獲得高純度的IHNV糖蛋白，并對(duì)其進(jìn)行免疫學(xué)鑒定，為IHNV的檢測(cè)方法建立、疫苗研制以及病毒感染機(jī)制研究提供基礎(chǔ)材料和理論依據(jù)。1.2研究目的與意義本研究旨在通過(guò)原核表達(dá)技術(shù)獲得高純度的IHNV糖蛋白，并對(duì)其進(jìn)行免疫學(xué)鑒定，為IHN的防控提供重要的技術(shù)支持和理論依據(jù)。在病毒檢測(cè)方面，目前針對(duì)IHNV的檢測(cè)方法雖然眾多，但仍存在一些不足之處。傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)法操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，且對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較高；血清學(xué)檢測(cè)方法雖然具有快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但存在特異性和靈敏度不夠高的問(wèn)題。而以IHNV糖蛋白為基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢測(cè)方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫熒光技術(shù)等，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，能夠快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出病毒感染，為疫病的早期診斷和防控提供有力支持。通過(guò)本研究獲得高純度的糖蛋白，可用于建立更加靈敏、準(zhǔn)確的免疫學(xué)檢測(cè)方法，提高IHNV的檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性，及時(shí)發(fā)現(xiàn)病毒感染，采取有效的防控措施，減少病毒的傳播和擴(kuò)散。在疫苗研制領(lǐng)域，糖蛋白作為IHNV的主要表面抗原，是開(kāi)發(fā)疫苗的關(guān)鍵靶點(diǎn)。傳統(tǒng)的疫苗，如滅活疫苗和減毒疫苗，雖然在一定程度上能夠預(yù)防IHN的發(fā)生，但存在潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)，如滅活不徹底導(dǎo)致病毒毒力返強(qiáng)，減毒疫苗可能引發(fā)免疫抑制等問(wèn)題。而以糖蛋白為基礎(chǔ)的亞單位疫苗、DNA疫苗等新型疫苗，具有安全性高、免疫原性強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠有效激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答，提供持久的免疫保護(hù)。本研究對(duì)糖蛋白進(jìn)行原核表達(dá)和免疫學(xué)鑒定，可為新型疫苗的研發(fā)提供優(yōu)質(zhì)的免疫原，深入研究糖蛋白的免疫原性機(jī)制，優(yōu)化疫苗的設(shè)計(jì)和制備工藝，提高疫苗的免疫效果，為IHN的有效防控提供新的策略和手段。在病毒感染機(jī)制研究方面，雖然目前對(duì)IHNV的感染過(guò)程有了一定的了解，但仍存在許多未知的環(huán)節(jié)。糖蛋白在病毒與宿主細(xì)胞的吸附、融合以及病毒的入侵過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，深入研究糖蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，有助于揭示IHNV的感染機(jī)制。通過(guò)本研究獲得的高純度糖蛋白，可用于研究糖蛋白與宿主細(xì)胞表面受體的相互作用機(jī)制，探索病毒感染的分子途徑，為開(kāi)發(fā)針對(duì)病毒感染關(guān)鍵環(huán)節(jié)的抗病毒藥物提供理論基礎(chǔ)，從根本上阻斷病毒的感染和傳播，保障鮭鱒魚類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。二、傳染性造血器官壞死病毒及糖蛋白概述2.1IHNV的生物學(xué)特性2.1.1形態(tài)結(jié)構(gòu)傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）粒子呈典型的彈狀形態(tài)，其大小范圍為（120-300）nm×（60-100）nm，擁有囊膜結(jié)構(gòu)。這種特殊的形態(tài)和結(jié)構(gòu)使其在病毒的感染和傳播過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。囊膜不僅能夠保護(hù)病毒的核心基因組，還參與了病毒與宿主細(xì)胞的相互作用，如識(shí)別宿主細(xì)胞表面的受體，介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞。IHNV的基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA，這種基因組結(jié)構(gòu)決定了病毒的遺傳信息傳遞方式和復(fù)制機(jī)制。其編碼6個(gè)基因，從3′端至5′端依次為核衣殼蛋白（N）、與聚合酶相關(guān)的磷酸蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）、非結(jié)構(gòu)蛋白（NV）和聚合酶（L）。這些結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的生命周期中各自承擔(dān)著獨(dú)特的功能。核衣殼蛋白（N）主要負(fù)責(zé)包裹和保護(hù)病毒的基因組RNA，使其免受外界環(huán)境的影響；磷酸蛋白（P）與聚合酶緊密相關(guān)，參與病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程；基質(zhì)蛋白（M）則在病毒粒子的組裝和形態(tài)維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它能夠連接病毒的囊膜和內(nèi)部的核衣殼結(jié)構(gòu)，確保病毒粒子的完整性；糖蛋白（G）作為病毒的主要表面抗原，在病毒與宿主細(xì)胞的吸附和融合過(guò)程中起著決定性作用，它能夠特異性地識(shí)別宿主細(xì)胞表面的受體，介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞，從而啟動(dòng)感染過(guò)程；非結(jié)構(gòu)蛋白（NV）雖然不參與病毒粒子的組成，但在病毒的復(fù)制和感染過(guò)程中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用；聚合酶（L）則負(fù)責(zé)催化病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，是病毒遺傳信息傳遞的關(guān)鍵酶。2.1.2病毒培養(yǎng)與增殖IHNV能夠在多種魚類傳代細(xì)胞系中有效增殖，如大鱗大馬哈魚胚胎細(xì)胞系（CHSE-214）、虹鱒性腺細(xì)胞系（RTG-2）、鯉魚上皮瘤細(xì)胞系（EPC）、胖頭鱥肌肉細(xì)胞系（FHM）、藍(lán)腮太陽(yáng)魚細(xì)胞系（BF-2）等。這些細(xì)胞系為IHNV的研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｔ谂囵B(yǎng)過(guò)程中，病毒的生長(zhǎng)溫度范圍為4-20℃，最適溫度為15℃。在這個(gè)溫度范圍內(nèi)，病毒能夠充分利用細(xì)胞的代謝系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)制和增殖。當(dāng)溫度達(dá)到23-25℃時(shí)，病毒的復(fù)制過(guò)程會(huì)受到抑制，無(wú)法正常進(jìn)行。研究人員McAllister等對(duì)IHNV的復(fù)制周期進(jìn)行了深入研究。將IHNV在CHSE-214細(xì)胞株中于18℃進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4h內(nèi)即可產(chǎn)生病毒，并且在隨后的16h內(nèi)進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)病毒滴度最高可達(dá)10^7pfu/mL。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞病變逐漸明顯。在感染10-15h后，細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)趨向邊緣，感染病毒的細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡，空泡邊緣處細(xì)胞聚集形成葡萄狀，最終細(xì)胞崩解。這種細(xì)胞病變特征不僅是IHNV感染的重要標(biāo)志，也為病毒的檢測(cè)和研究提供了重要的依據(jù)。通過(guò)觀察細(xì)胞病變的形態(tài)和發(fā)展過(guò)程，可以判斷病毒的感染程度和復(fù)制狀態(tài)，從而深入了解病毒的生物學(xué)特性和致病機(jī)制。2.1.3流行病學(xué)特點(diǎn)IHNV的地理分布廣泛，最早于20世紀(jì)40-50年代在美國(guó)西北部太平洋地區(qū)的養(yǎng)魚場(chǎng)被發(fā)現(xiàn)，隨后迅速傳播至整個(gè)北美地區(qū)。1968年，通過(guò)被感染的魚卵運(yùn)輸，IHNV傳入日本；1985年，由于進(jìn)口感染的魚卵，該病毒從日本傳至中國(guó)東北；1987年，又傳入意大利及法國(guó)。目前，IHNV在全球多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的鮭鱒魚養(yǎng)殖場(chǎng)均有報(bào)道，對(duì)當(dāng)?shù)氐孽q鱒魚養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重威脅。該病毒具有廣泛的易感魚類品種，主要危害鮭魚科魚類，包括虹鱒（Rainbowtrout）、硬頭鱒（Oncorhynchusmykiss）、大鱗大馬哈魚（O.tshawystcha）、紅大麻哈魚（O.nerka）、大麻哈魚（O.kete）、馬蘇大麻哈魚（O.masou），以及銀鱒（O.kisutch）和大西洋鮭（Salmosalar）等。不同種類的鮭鱒魚對(duì)IHNV的易感性存在顯著差異。在太平洋鮭魚品種中，紅大麻哈魚（Sockeyesalmon）和虹鱒魚（Rainbowtrout）對(duì)病毒最為敏感，感染后死亡率較高；其次是細(xì)鱗大麻哈魚（Pinksalmon）；大鱗大麻哈魚（Chinooksalmon）的易感性相對(duì)較低。此外，2023年劉葒等首次從自然牙鲆體內(nèi)分離出IHNV，盡管目前尚未見(jiàn)自然條件下IHNV導(dǎo)致牙鲆發(fā)生大規(guī)模死亡的報(bào)道，但這一發(fā)現(xiàn)提示了IHNV的宿主范圍可能進(jìn)一步擴(kuò)大，需要引起高度關(guān)注。IHNV的傳播途徑主要包括水平傳播和垂直傳播。水平傳播是病毒在稚魚和幼魚之間傳播的最主要方式，主要通過(guò)接觸被病毒污染的水、食物、帶毒魚排泄的尿、糞便等而感染。例如，在養(yǎng)殖場(chǎng)中，若水體被IHNV污染，健康魚接觸后極易感染病毒。1989年，ScottT.shors和Vernwinston從一種無(wú)脊椎動(dòng)物-蜉蝣（sp.）中分離到了IHN病毒，這表明蜉蝣可能是該病的傳播者之一，進(jìn)一步豐富了我們對(duì)IHNV傳播途徑的認(rèn)識(shí)。雖然在卵液中可以發(fā)現(xiàn)病毒，但垂直傳播仍未得到確鑿的確認(rèn)，這可能與病毒在魚卵中的感染機(jī)制和傳播效率有關(guān)，需要進(jìn)一步深入研究。水溫對(duì)IHNV的流行和發(fā)病具有顯著影響。該病在8-12℃時(shí)為流行高峰，此時(shí)病毒的傳播速度較快，感染魚群的發(fā)病率和死亡率也較高。當(dāng)水溫在10℃時(shí)，死亡率最高；水溫低于10℃時(shí)，潛伏期延長(zhǎng)，病情呈慢性發(fā)展；水溫高于10℃時(shí)，病情較急，但死亡率相對(duì)較低；當(dāng)水溫超過(guò)15℃后，一般不出現(xiàn)自然發(fā)病。這是因?yàn)樗疁貢?huì)影響病毒的復(fù)制速度、魚體的免疫力以及病毒在環(huán)境中的存活時(shí)間。在適宜的水溫條件下，病毒能夠快速?gòu)?fù)制，而魚體的免疫力可能會(huì)受到抑制，從而導(dǎo)致疾病的爆發(fā)。了解水溫對(duì)IHNV流行的影響，對(duì)于制定科學(xué)合理的防控措施具有重要指導(dǎo)意義，如在高發(fā)季節(jié)通過(guò)調(diào)節(jié)水溫等方式來(lái)降低病毒的傳播風(fēng)險(xiǎn)。2.2IHNV糖蛋白的結(jié)構(gòu)與功能2.2.1糖蛋白的結(jié)構(gòu)特征IHNV糖蛋白（G）是由病毒基因組中的G基因編碼產(chǎn)生，其氨基酸序列具有獨(dú)特的特征。研究顯示，G蛋白的氨基酸數(shù)量大約在500-600個(gè)之間，這些氨基酸通過(guò)特定的順序排列，形成了G蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)。在G蛋白的氨基酸序列中，包含了一些保守區(qū)域和可變區(qū)域。保守區(qū)域在不同毒株的G蛋白中相對(duì)穩(wěn)定，它們對(duì)于維持G蛋白的基本結(jié)構(gòu)和功能起著關(guān)鍵作用。例如，一些保守的氨基酸殘基參與了G蛋白與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合過(guò)程，確保病毒能夠特異性地識(shí)別并感染宿主細(xì)胞。而可變區(qū)域則在不同毒株之間存在一定的差異，這些差異可能導(dǎo)致G蛋白的抗原性發(fā)生變化，從而影響病毒的免疫逃逸能力和宿主范圍。G蛋白具有明顯的跨膜區(qū)，這一結(jié)構(gòu)特征使其能夠錨定在病毒的囊膜上?？缒^(qū)由一段富含疏水氨基酸的序列組成，這些疏水氨基酸通過(guò)疏水相互作用與病毒囊膜的脂質(zhì)雙分子層緊密結(jié)合，將G蛋白固定在病毒表面?？缒^(qū)的長(zhǎng)度和氨基酸組成對(duì)于G蛋白在囊膜上的定位和穩(wěn)定性至關(guān)重要。如果跨膜區(qū)的氨基酸序列發(fā)生突變，可能會(huì)導(dǎo)致G蛋白無(wú)法正確錨定在囊膜上，進(jìn)而影響病毒的感染能力。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)跨膜區(qū)氨基酸的定點(diǎn)突變，能夠改變G蛋白在囊膜上的分布和功能，這為深入研究G蛋白的作用機(jī)制提供了重要線索。在G蛋白的氨基酸序列中，還存在多個(gè)糖基化位點(diǎn)。糖基化是指在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將寡糖鏈連接到蛋白質(zhì)特定氨基酸殘基上的過(guò)程。G蛋白的糖基化主要發(fā)生在Asn（天冬酰胺）殘基上，形成N-糖基化修飾。這些糖基化位點(diǎn)對(duì)于G蛋白的功能具有重要影響。糖基化修飾可以增加G蛋白的穩(wěn)定性，保護(hù)其免受蛋白酶的降解。糖基化還可以影響G蛋白的抗原性和免疫原性。糖基化修飾可以掩蓋G蛋白表面的一些抗原表位，降低機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)其的識(shí)別和攻擊，從而有利于病毒的免疫逃逸。另一方面，糖基化也可以增強(qiáng)G蛋白的免疫原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。研究表明，去除G蛋白上的糖基化修飾，會(huì)導(dǎo)致其免疫原性下降，機(jī)體產(chǎn)生的抗體水平也會(huì)明顯降低。從空間結(jié)構(gòu)來(lái)看，G蛋白呈現(xiàn)出復(fù)雜的三維構(gòu)象，包括多個(gè)結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域各自具有獨(dú)特的功能，它們之間通過(guò)相互作用協(xié)同完成G蛋白的生物學(xué)功能。其中，受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞表面的受體進(jìn)行特異性識(shí)別和結(jié)合，決定了病毒的宿主范圍和感染特異性。當(dāng)G蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與宿主細(xì)胞受體相互作用時(shí)，會(huì)引發(fā)一系列的分子事件，如構(gòu)象變化、信號(hào)傳導(dǎo)等，最終導(dǎo)致病毒進(jìn)入細(xì)胞。免疫原性結(jié)構(gòu)域則是刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的關(guān)鍵部位，它包含了多個(gè)抗原表位，能夠被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別并引發(fā)免疫反應(yīng)。不同結(jié)構(gòu)域之間的相互作用對(duì)于維持G蛋白的整體結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。如果結(jié)構(gòu)域之間的相互作用發(fā)生改變，可能會(huì)影響G蛋白的功能，進(jìn)而影響病毒的感染和免疫過(guò)程。2.2.2糖蛋白在病毒感染中的作用在病毒感染過(guò)程中，IHNV糖蛋白（G）在病毒與細(xì)胞受體識(shí)別、結(jié)合以及病毒入侵過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的關(guān)鍵作用。G蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有高度的特異性，能夠精準(zhǔn)地識(shí)別宿主細(xì)胞表面的特定受體。研究表明，不同宿主細(xì)胞表面的受體存在差異，而G蛋白能夠通過(guò)其受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與相應(yīng)的受體進(jìn)行特異性結(jié)合，從而決定了病毒的宿主范圍。對(duì)于鮭鱒魚類細(xì)胞，G蛋白能夠特異性地識(shí)別細(xì)胞表面的某些糖蛋白或糖脂類受體，這種識(shí)別作用是病毒感染的第一步。通過(guò)這種特異性結(jié)合，病毒能夠緊密附著在宿主細(xì)胞表面，為后續(xù)的入侵過(guò)程奠定基礎(chǔ)。當(dāng)G蛋白與宿主細(xì)胞受體結(jié)合后，會(huì)引發(fā)G蛋白的構(gòu)象變化。這種構(gòu)象變化是病毒入侵細(xì)胞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它能夠激活G蛋白的融合活性。G蛋白的融合活性使其能夠介導(dǎo)病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜的融合，從而使病毒的基因組能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)部。在融合過(guò)程中，G蛋白的一些結(jié)構(gòu)域會(huì)發(fā)生重排，形成特殊的融合中間體，促進(jìn)病毒囊膜與細(xì)胞膜的融合。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)G蛋白的融合活性進(jìn)行抑制，可以有效阻止病毒的入侵，這進(jìn)一步證明了G蛋白在病毒入侵過(guò)程中的關(guān)鍵作用。此外，G蛋白在病毒感染過(guò)程中的作用還受到多種因素的影響。例如，病毒的株系差異會(huì)導(dǎo)致G蛋白的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響其與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合能力和融合活性。不同毒株的G蛋白在受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸組成上可能存在差異，這會(huì)導(dǎo)致它們對(duì)宿主細(xì)胞受體的親和力不同，進(jìn)而影響病毒的感染效率。宿主細(xì)胞的生理狀態(tài)也會(huì)對(duì)G蛋白的功能產(chǎn)生影響。當(dāng)宿主細(xì)胞受到應(yīng)激或其他因素的影響時(shí)，其表面受體的表達(dá)和功能可能會(huì)發(fā)生改變，從而影響G蛋白與受體的結(jié)合和病毒的入侵。2.2.3糖蛋白的免疫原性IHNV糖蛋白（G）作為病毒的主要抗原，在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。當(dāng)機(jī)體感染IHNV后，免疫系統(tǒng)會(huì)迅速識(shí)別G蛋白上的抗原表位。這些抗原表位是G蛋白表面能夠被免疫系統(tǒng)識(shí)別的特定區(qū)域，它們具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)。免疫系統(tǒng)中的抗原呈遞細(xì)胞（APC），如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等，會(huì)攝取并處理含有G蛋白的病毒顆粒，將G蛋白的抗原表位呈遞給T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞在識(shí)別抗原表位后，會(huì)被激活并分化為不同的亞型，如輔助性T細(xì)胞（Th）和細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）。輔助性T細(xì)胞能夠分泌細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等，這些細(xì)胞因子可以促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。細(xì)胞毒性T細(xì)胞則能夠直接殺傷被病毒感染的細(xì)胞，通過(guò)釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，破壞感染細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞器，從而清除病毒感染。B淋巴細(xì)胞在識(shí)別抗原表位后，會(huì)活化、增殖并分化為漿細(xì)胞。漿細(xì)胞能夠產(chǎn)生特異性抗體，這些抗體能夠與G蛋白結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物?？贵w與G蛋白的結(jié)合具有高度的特異性，能夠精準(zhǔn)地識(shí)別并結(jié)合G蛋白上的抗原表位。這種結(jié)合可以中和病毒的活性，阻止病毒與宿主細(xì)胞的進(jìn)一步結(jié)合和入侵?？贵w還可以通過(guò)調(diào)理作用，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞對(duì)病毒的吞噬和清除能力。當(dāng)抗體與病毒結(jié)合后，吞噬細(xì)胞表面的Fc受體能夠識(shí)別并結(jié)合抗體的Fc段，從而促進(jìn)吞噬細(xì)胞對(duì)病毒的吞噬作用，提高機(jī)體對(duì)病毒的清除效率。G蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答具有重要的意義。它可以幫助機(jī)體抵御病毒的感染，降低病毒在體內(nèi)的復(fù)制和傳播，減輕疾病的癥狀和嚴(yán)重程度。在疫苗研發(fā)中，利用G蛋白的免疫原性，將其作為主要的免疫原成分，可以開(kāi)發(fā)出有效的疫苗，用于預(yù)防IHNV的感染。通過(guò)接種疫苗，機(jī)體可以預(yù)先產(chǎn)生針對(duì)G蛋白的免疫記憶細(xì)胞，當(dāng)再次接觸到病毒時(shí)，免疫系統(tǒng)能夠迅速啟動(dòng)免疫應(yīng)答，有效地清除病毒，保護(hù)機(jī)體免受感染。三、原核表達(dá)系統(tǒng)3.1原核表達(dá)系統(tǒng)的原理與優(yōu)勢(shì)3.1.1基本原理原核表達(dá)系統(tǒng)是利用原核生物來(lái)表達(dá)外源蛋白質(zhì)的工具，在生物技術(shù)和基因工程領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。其基本構(gòu)成包括表達(dá)載體和宿主細(xì)胞兩部分。表達(dá)載體是一種重組DNA分子，通常包含起始位點(diǎn)（在大腸桿菌中通常為AUG）、表達(dá)基因（包括編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA序列和轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子等序列）、選擇標(biāo)記（如抗生素抵抗基因和熒光標(biāo)記基因等，用于篩選出帶有目標(biāo)基因的細(xì)胞并提高表達(dá)效率）以及復(fù)制起點(diǎn)（使表達(dá)載體在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制，提高表達(dá)效率）。宿主細(xì)胞則是能夠?qū)崿F(xiàn)表達(dá)載體遺傳信號(hào)轉(zhuǎn)錄、翻譯和合成目標(biāo)蛋白質(zhì)的生命體，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等。在原核表達(dá)系統(tǒng)中，外源基因的表達(dá)主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)過(guò)程實(shí)現(xiàn)。當(dāng)攜帶外源基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞后，轉(zhuǎn)錄因子會(huì)識(shí)別插入表達(dá)載體的啟動(dòng)子序列，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，以DNA為模板合成mRNA。啟動(dòng)子是一段位于基因上游的特定DNA序列，能被RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合，它在轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。不同的啟動(dòng)子具有不同的轉(zhuǎn)錄效率，如T7噬菌體啟動(dòng)子具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，能夠驅(qū)動(dòng)外源基因高效表達(dá)。轉(zhuǎn)錄后的mRNA從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，與核糖體結(jié)合，開(kāi)始翻譯過(guò)程。核糖體沿著mRNA移動(dòng)，根據(jù)mRNA上的密碼子序列，將氨基酸依次連接起來(lái)，合成蛋白質(zhì)。在翻譯過(guò)程中，還需要多種翻譯因子的參與，它們協(xié)助核糖體準(zhǔn)確地識(shí)別密碼子，保證蛋白質(zhì)合成的準(zhǔn)確性和高效性。3.1.2優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)在生物技術(shù)領(lǐng)域具有顯著優(yōu)勢(shì)，使其成為蛋白質(zhì)表達(dá)的常用工具。從成本角度來(lái)看，原核表達(dá)系統(tǒng)所需的培養(yǎng)基價(jià)格低廉，培養(yǎng)過(guò)程簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的設(shè)備和高昂的試劑費(fèi)用。以大腸桿菌為例，其常用的LB培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單，主要包括酵母膏、蛋白胨、NaCl等，這些成分價(jià)格親民，來(lái)源廣泛，大大降低了生產(chǎn)成本。相比之下，真核表達(dá)系統(tǒng)，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，需要使用含有多種生長(zhǎng)因子和血清的培養(yǎng)基，成本高昂。這使得原核表達(dá)系統(tǒng)在大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)時(shí)具有明顯的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)，能夠降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。在表達(dá)效率方面，原核生物具有較短的生長(zhǎng)周期和快速的代謝速度，能夠在短時(shí)間內(nèi)大量表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)。大腸桿菌在適宜的條件下，其倍增時(shí)間僅為20分鐘左右，這意味著在短時(shí)間內(nèi)可以獲得大量的菌體，從而提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。研究表明，在優(yōu)化的表達(dá)條件下，某些外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)量可以達(dá)到細(xì)胞總蛋白的50%以上。原核生物的基因表達(dá)調(diào)控相對(duì)簡(jiǎn)單，通過(guò)合理設(shè)計(jì)表達(dá)載體和選擇合適的誘導(dǎo)條件，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)外源基因表達(dá)的有效控制，進(jìn)一步提高表達(dá)效率。原核表達(dá)系統(tǒng)的操作便利性也是其重要優(yōu)勢(shì)之一。原核生物的遺傳背景相對(duì)清晰，基因操作技術(shù)成熟，如質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、基因克隆等技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，易于掌握。將外源基因克隆到表達(dá)載體上，再通過(guò)熱激或電擊等方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞，整個(gè)過(guò)程在實(shí)驗(yàn)室中易于實(shí)現(xiàn)。而且原核表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)周期較短，從構(gòu)建表達(dá)載體到獲得表達(dá)產(chǎn)物，通常只需要幾天到幾周的時(shí)間，能夠快速滿足研究和生產(chǎn)的需求?；谶@些優(yōu)勢(shì)，原核表達(dá)系統(tǒng)在生物領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。在基礎(chǔ)研究中，它被用于表達(dá)各種蛋白質(zhì)，以便研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。通過(guò)原核表達(dá)獲得大量的目標(biāo)蛋白質(zhì)，利用X射線晶體學(xué)、核磁共振等技術(shù)解析蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，深入了解蛋白質(zhì)的功能機(jī)制。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，原核表達(dá)系統(tǒng)可用于生產(chǎn)重組蛋白藥物，如胰島素、干擾素等。這些藥物在治療糖尿病、癌癥等疾病中發(fā)揮著重要作用。在疫苗研制方面，原核表達(dá)的蛋白可以作為疫苗的抗原成分，如一些細(xì)菌和病毒的亞單位疫苗，通過(guò)表達(dá)病原體的關(guān)鍵抗原蛋白，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，預(yù)防疾病的發(fā)生。原核表達(dá)系統(tǒng)還在工業(yè)酶生產(chǎn)、生物傳感器開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，為生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用提供了有力支持。3.2原核表達(dá)常用載體與宿主菌3.2.1表達(dá)載體在原核表達(dá)中，表達(dá)載體起著至關(guān)重要的作用，它是攜帶外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的關(guān)鍵工具。常見(jiàn)的原核表達(dá)載體有多種類型，其中pET系列載體在科研和工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛。pET系列載體是利用T7噬菌體啟動(dòng)子的高效表達(dá)載體，其表達(dá)能力強(qiáng)且可控性良好。該載體的啟動(dòng)子只受T7噬菌體RNA聚合酶識(shí)別，而不受大腸桿菌RNA聚合酶識(shí)別，這一特性使得其表達(dá)具有高度的特異性。當(dāng)宿主細(xì)胞提供T7RNA聚合酶時(shí)，在IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）的誘導(dǎo)下，pET載體能夠高效表達(dá)克隆于其中的外源基因。在充分誘導(dǎo)的情況下，幾乎所有的細(xì)胞資源都會(huì)被用于表達(dá)目的蛋白，誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾個(gè)小時(shí)，目的蛋白通常可以占到細(xì)胞總蛋白的50%以上。這種高效的表達(dá)能力為獲得大量的目標(biāo)蛋白提供了有力保障。pET系列載體的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合理，包含了多個(gè)重要元件。它擁有強(qiáng)啟動(dòng)子，如T7噬菌體啟動(dòng)子，能夠啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程；具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS），即Shine-Dalgarno(SD)序列，該序列與核糖體的結(jié)合能力影響著翻譯的起始效率，ATG（起始密碼子）與RBS之間的距離一般在3-11bp，合適的距離對(duì)于保證翻譯的準(zhǔn)確性和高效性至關(guān)重要；還含有轉(zhuǎn)錄終止子，依賴于ρ因子或不依賴于ρ因子（遇莖環(huán)結(jié)構(gòu)而終止），能夠準(zhǔn)確地終止轉(zhuǎn)錄過(guò)程，防止轉(zhuǎn)錄的過(guò)度延伸。除了pET系列載體，還有其他一些常用的表達(dá)載體。pGEX系列載體是一種表達(dá)融合蛋白的載體，其GST（谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶）標(biāo)簽來(lái)自于血吸蟲(chóng)。融合蛋白保持著GST的酶學(xué)活性，對(duì)谷胱甘肽有很強(qiáng)的結(jié)合能力，這使得融合蛋白的純化變得相對(duì)容易。通過(guò)凝血蛋白酶切割，可以從融合蛋白中得到純的目的蛋白。pGEX系列載體在構(gòu)建時(shí)，將目標(biāo)基因與GST基因進(jìn)行融合，使表達(dá)的融合蛋白兼具GST的特性和目標(biāo)蛋白的功能。在蛋白純化過(guò)程中，可以利用GST與谷胱甘肽的特異性結(jié)合，通過(guò)親和層析的方法將融合蛋白從細(xì)胞裂解液中分離出來(lái)，然后再用凝血蛋白酶切割，去除GST標(biāo)簽，獲得純凈的目的蛋白。pET-30a(+)載體也是一種常見(jiàn)的原核表達(dá)載體，它具有多克隆位點(diǎn)，方便外源基因的插入。在構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，研究人員可以根據(jù)外源基因的特點(diǎn)，選擇合適的限制性內(nèi)切酶切割pET-30a(+)載體和外源基因，然后通過(guò)DNA連接酶將兩者連接起來(lái)，構(gòu)建成重組表達(dá)載體。該載體還帶有His標(biāo)簽，His標(biāo)簽?zāi)芘c鎳等二價(jià)金屬離子結(jié)合，利用這一特性，可以通過(guò)鎳柱親和層析的方法對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化。在實(shí)際應(yīng)用中，將含有重組pET-30a(+)載體的宿主細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，收集細(xì)胞裂解液，將其通過(guò)鎳柱，His標(biāo)簽與鎳離子結(jié)合，而其他雜質(zhì)則被洗脫，最后通過(guò)咪唑等洗脫劑將結(jié)合在鎳柱上的目的蛋白洗脫下來(lái)，實(shí)現(xiàn)蛋白的純化。不同的表達(dá)載體具有各自的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，在選擇表達(dá)載體時(shí)，需要綜合考慮多種因素。要考慮目的蛋白的應(yīng)用，是用于結(jié)構(gòu)研究、活性分析還是制備抗體等。不同的應(yīng)用對(duì)蛋白的純度、活性等要求不同，因此需要選擇合適的載體以滿足相應(yīng)的需求。還要考慮目的蛋白已知的特定信息，如蛋白的氨基酸序列、是否需要進(jìn)行融合表達(dá)、是否對(duì)蛋白的修飾有要求等。如果蛋白需要正確折疊和修飾才能發(fā)揮活性，那么就需要選擇能夠提供相應(yīng)條件的表達(dá)載體。還需要考慮克隆策略，包括目的基因的克隆方法、對(duì)限制性酶切位點(diǎn)及閱讀框的要求等。選擇合適的表達(dá)載體能夠提高外源基因的表達(dá)效率和蛋白的質(zhì)量，為后續(xù)的研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。3.2.2宿主菌宿主菌是原核表達(dá)系統(tǒng)中的重要組成部分，不同的宿主菌具有各自獨(dú)特的特性，適用于不同的表達(dá)需求。大腸桿菌BL21系列是原核表達(dá)中常用的宿主菌之一。大腸桿菌BL21由于lon和ompT基因突變，使得其具有減少重組蛋白降解的優(yōu)勢(shì)，從而提高了蛋白的產(chǎn)量。lon基因編碼的ATP依賴性蛋白酶Lon參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解過(guò)程，ompT基因編碼的外膜蛋白酶VII也會(huì)降解細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。BL21中這兩個(gè)基因的突變，有效降低了蛋白酶對(duì)重組蛋白的降解作用，使得重組蛋白能夠在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在并積累。BL21不適合與基于T7啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體共同使用，這是因?yàn)樗旧聿痪邆銽7RNA聚合酶基因，無(wú)法啟動(dòng)T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的外源基因表達(dá)。為了解決這一問(wèn)題，研究人員開(kāi)發(fā)了BL21(DE3)菌株。BL21(DE3)整合了λ噬菌體DE3基因組，包含lacUV5啟動(dòng)子控制下的T7RNA聚合酶基因。這使得它適用于高效表達(dá)克隆于含有T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體的基因。在IPTG誘導(dǎo)下，lacUV5啟動(dòng)子啟動(dòng)T7RNA聚合酶基因的表達(dá)，T7RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合到T7啟動(dòng)子上，從而啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。在利用pET系列載體進(jìn)行外源基因表達(dá)時(shí)，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)宿主菌中，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)，能夠獲得大量的目的蛋白。BL21Star(DE3)在BL21(DE3)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步引入rne131突變，這一突變?cè)鰪?qiáng)了mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而提升了外源蛋白的表達(dá)量。rne131突變使得細(xì)胞內(nèi)的核糖核酸酶E（RNaseE）活性降低，RNaseE是一種參與mRNA降解的酶，其活性降低使得mRNA在細(xì)胞內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)，從而有更多的時(shí)間進(jìn)行翻譯，提高了外源蛋白的表達(dá)水平。除了BL21系列，K12系列中的DH5α也是常用的宿主菌，它常用于質(zhì)?？寺?。DH5α與pUC系列質(zhì)粒載體編碼的β-半乳糖苷酶氨基端α-互補(bǔ)，可用于藍(lán)白斑篩選。在藍(lán)白斑篩選過(guò)程中，當(dāng)外源基因插入到pUC系列質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)時(shí)，會(huì)破壞β-半乳糖苷酶基因的讀碼框，導(dǎo)致β-半乳糖苷酶無(wú)法正常表達(dá)。此時(shí)，含有重組質(zhì)粒的DH5α在含有X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，不能將X-Gal分解成藍(lán)色產(chǎn)物，菌落呈現(xiàn)白色；而含有未重組質(zhì)粒的DH5α則能夠表達(dá)β-半乳糖苷酶，將X-Gal分解成藍(lán)色產(chǎn)物，菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。通過(guò)這種方式，可以快速篩選出含有重組質(zhì)粒的克隆。JM109同樣屬于K12系列，也適用于質(zhì)?？寺『突蚬こ滩僮鳎忙?互補(bǔ)機(jī)制顯示β-半乳糖苷酶活性，便于鑒別重組體。TOP10適合高效的DNA克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增，能夠確保高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳。在進(jìn)行DNA克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)時(shí)，TOP10能夠快速?gòu)?fù)制質(zhì)粒，提高實(shí)驗(yàn)效率，并且保證質(zhì)粒在傳代過(guò)程中的穩(wěn)定性，減少質(zhì)粒丟失和突變的發(fā)生。Rosetta(DE3)是BL21(DE3)的衍生物，它補(bǔ)充了大腸桿菌稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA，解決了密碼子偏好性問(wèn)題，特別適合表達(dá)含有稀有密碼子的蛋白質(zhì)。在不同物種中，密碼子的使用頻率存在差異，當(dāng)外源基因中含有較多大腸桿菌稀有密碼子時(shí)，在普通宿主菌中表達(dá)可能會(huì)因?yàn)槿狈ο鄳?yīng)的tRNA而導(dǎo)致翻譯受阻。Rosetta(DE3)通過(guò)提供這些稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA，保證了含有稀有密碼子的蛋白質(zhì)能夠順利表達(dá)。Rosetta-gami系列則結(jié)合了Origami菌株特性，不僅補(bǔ)充了稀有密碼子，還促進(jìn)了正確二硫鍵的形成。在蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中，二硫鍵的正確形成對(duì)于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。Rosetta-gami系列宿主菌能夠?yàn)榈鞍踪|(zhì)的折疊提供更有利的環(huán)境，有助于表達(dá)需要正確折疊和穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)。Origami(DE3)經(jīng)過(guò)特殊改造，有助于在細(xì)胞質(zhì)中形成正確的二硫鍵，特別適用于表達(dá)那些需要正確折疊和穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)。在原核表達(dá)中，由于大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)的還原環(huán)境，一些含有二硫鍵的蛋白質(zhì)難以正確折疊。Origami(DE3)通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原環(huán)境進(jìn)行調(diào)控，使得蛋白質(zhì)能夠在細(xì)胞質(zhì)中形成正確的二硫鍵，從而獲得具有天然結(jié)構(gòu)和活性的蛋白質(zhì)。不同的宿主菌在原核表達(dá)中具有各自的適用場(chǎng)景。在選擇宿主菌時(shí)，需要根據(jù)外源基因的特點(diǎn)、表達(dá)載體的類型以及目的蛋白的要求等因素進(jìn)行綜合考慮，以實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)和目的蛋白的高質(zhì)量生產(chǎn)。四、傳染性造血器官壞死病毒糖蛋白的原核表達(dá)4.1材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)使用的傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）毒株為[具體毒株名稱]，由[病毒來(lái)源機(jī)構(gòu)]提供，保存于-80℃冰箱中備用。該毒株經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的鑒定和保存，確保其生物學(xué)特性的穩(wěn)定性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可靠的病毒材料。表達(dá)載體選用pET-30a(+)，購(gòu)自[供應(yīng)商名稱]。pET-30a(+)具有多克隆位點(diǎn)，便于外源基因的插入，且?guī)в蠬is標(biāo)簽，利用His標(biāo)簽?zāi)芘c鎳等二價(jià)金屬離子結(jié)合的特性，可通過(guò)鎳柱親和層析的方法對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化，為后續(xù)的蛋白純化工作提供便利。宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)，同樣購(gòu)自[供應(yīng)商名稱]。BL21(DE3)整合了λ噬菌體DE3基因組，包含lacUV5啟動(dòng)子控制下的T7RNA聚合酶基因，適用于高效表達(dá)克隆于含有T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體的基因，在IPTG誘導(dǎo)下能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因的高效表達(dá)。工具酶包括限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII，購(gòu)自[酶供應(yīng)商名稱]。這些限制性內(nèi)切酶具有高度的特異性，能夠識(shí)別并切割特定的DNA序列，用于表達(dá)載體和目的基因的酶切，以便后續(xù)的連接反應(yīng)。T4DNA連接酶也購(gòu)自[酶供應(yīng)商名稱]，其作用是將酶切后的表達(dá)載體和目的基因連接起來(lái)，形成重組表達(dá)載體。試劑方面，DNAMarker購(gòu)自[試劑供應(yīng)商名稱]，用于在核酸電泳中作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，幫助判斷目的基因的大小和純度。蛋白質(zhì)Marker同樣購(gòu)自[試劑供應(yīng)商名稱]，在蛋白質(zhì)電泳中用于確定蛋白的分子量。IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）購(gòu)自[試劑供應(yīng)商名稱]，是一種常用的誘導(dǎo)劑，能夠誘導(dǎo)含有l(wèi)ac操縱子的表達(dá)載體啟動(dòng)外源基因的表達(dá)。其他常規(guī)試劑，如dNTPs、PCR緩沖液、Tris-HCl、NaCl、SDS、甘油等，均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自[試劑供應(yīng)商名稱]，這些試劑在實(shí)驗(yàn)中用于各種溶液的配制和反應(yīng)體系的構(gòu)建，確保實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。4.1.2實(shí)驗(yàn)方法從保存的IHNV毒株中提取總RNA，使用TRIzol試劑按照其說(shuō)明書進(jìn)行操作。將病毒液與TRIzol試劑充分混合，經(jīng)過(guò)氯仿抽提、異丙醇沉淀等步驟，獲得純凈的總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)自[試劑盒供應(yīng)商名稱]）將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行設(shè)置。在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，以O(shè)ligo(dT)為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增提供模板。根據(jù)GenBank中公布的IHNV糖蛋白（G）基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物為5′-CGCGGATCCATGAAACTCAGTGTAGAC-3′，下游引物為5′-CCCAAGCTTTCACACGCTGACCTCTTC-3′，引物兩端分別引入BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)（下劃線部分）。引物由[引物合成公司名稱]合成，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，確保引物的準(zhǔn)確性和特異性。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括：cDNA模板2μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，10×PCR緩沖液5μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，加ddH?O補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。通過(guò)PCR擴(kuò)增，獲得目的基因片段，利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，觀察是否得到預(yù)期大小的條帶。用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII對(duì)PCR擴(kuò)增得到的目的基因片段和pET-30a(+)表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切。酶切體系為：目的基因片段或表達(dá)載體1μg，10×Buffer5μL，BamHI和HindIII各1μL，加ddH?O補(bǔ)足至50μL。37℃水浴酶切3h，使目的基因和表達(dá)載體產(chǎn)生粘性末端。酶切產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，利用凝膠回收試劑盒（購(gòu)自[試劑盒供應(yīng)商名稱]）回收目的基因片段和線性化的表達(dá)載體。按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，確?；厥盏钠渭兌雀摺⑼暾院?。將回收的目的基因片段和線性化的pET-30a(+)表達(dá)載體用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。連接體系為：目的基因片段3μL，線性化表達(dá)載體1μL，T4DNA連接酶1μL，10×T4DNA連接酶緩沖液1μL，加ddH?O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過(guò)夜，使目的基因與表達(dá)載體成功連接，形成重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-G。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將連接產(chǎn)物加入到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，42℃熱激90s，迅速冰浴2min，加入900μL無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)胞復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，PCR鑒定反應(yīng)體系和條件與目的基因擴(kuò)增時(shí)相同，雙酶切鑒定體系和條件與構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒時(shí)相同。通過(guò)鑒定，篩選出陽(yáng)性克隆，提取重組質(zhì)粒送[測(cè)序公司名稱]進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保重組表達(dá)質(zhì)粒的正確性。將測(cè)序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-G轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化方法與轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞相同。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落接種于5mL含有卡那霉素（50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???值約為0.6-0.8，此時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，適合進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。向培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h，在IPTG的誘導(dǎo)下，T7RNA聚合酶啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，實(shí)現(xiàn)目的蛋白的表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，收集菌體，用PBS緩沖液洗滌3次，以去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。將洗滌后的菌體重懸于適量的PBS緩沖液中，進(jìn)行超聲破碎，超聲條件為：功率300W，工作3s，間隔5s，共超聲30min，使細(xì)胞破碎，釋放出目的蛋白。將破碎后的菌液于4℃、12000r/min離心30min，收集上清和沉淀，分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，確定目的蛋白的表達(dá)形式（可溶性表達(dá)或包涵體表達(dá)）。若目的蛋白以包涵體形式表達(dá)，將沉淀用含有8mol/L尿素的PBS緩沖液溶解，4℃攪拌過(guò)夜，使包涵體充分溶解。將溶解后的包涵體溶液通過(guò)0.45μm濾膜過(guò)濾，去除不溶性雜質(zhì)。采用鎳柱親和層析的方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，將過(guò)濾后的溶液上樣到鎳柱中，目的蛋白上的His標(biāo)簽與鎳柱上的鎳離子結(jié)合，其他雜質(zhì)被洗脫。用含有不同濃度咪唑的PBS緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫峰，通過(guò)SDS-PAGE電泳分析洗脫產(chǎn)物，確定純化后的目的蛋白。將純化后的目的蛋白進(jìn)行透析復(fù)性，將蛋白溶液裝入透析袋中，放入含有復(fù)性緩沖液（如Tris-HCl緩沖液，pH8.0，含有一定濃度的氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽）的透析液中，4℃透析過(guò)夜，使蛋白逐漸復(fù)性，恢復(fù)其天然結(jié)構(gòu)和活性。若目的蛋白以可溶性形式表達(dá)，將離心后的上清直接進(jìn)行鎳柱親和層析純化，操作步驟與包涵體純化類似。將純化后的蛋白溶液用超濾濃縮管進(jìn)行濃縮，按照超濾濃縮管的說(shuō)明書進(jìn)行操作，將蛋白溶液濃縮至所需濃度，用于后續(xù)的免疫學(xué)鑒定和研究。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.2.1重組表達(dá)載體的鑒定對(duì)構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-G進(jìn)行雙酶切鑒定，使用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII進(jìn)行酶切反應(yīng)。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示。在電泳圖中，可見(jiàn)兩條清晰的條帶，一條約為5369bp，與線性化的pET-30a(+)表達(dá)載體大小相符；另一條約為1500bp，與預(yù)期的IHNV糖蛋白（G）基因片段大小一致。這表明目的基因已成功插入到pET-30a(+)表達(dá)載體中，初步驗(yàn)證了重組表達(dá)載體構(gòu)建的正確性。為進(jìn)一步確認(rèn)重組表達(dá)載體的序列準(zhǔn)確性，將陽(yáng)性克隆提取的重組質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank中公布的IHNV糖蛋白基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，測(cè)序得到的基因序列與目標(biāo)序列完全一致，無(wú)堿基突變和缺失。這充分證明了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-G構(gòu)建成功，為后續(xù)的蛋白表達(dá)和研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。[此處插入重組表達(dá)載體雙酶切鑒定電泳圖，圖注：M：DNAMarker；1：pET-30a(+)-G雙酶切產(chǎn)物]4.2.2糖蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將測(cè)序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-G轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，在IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，收集菌體進(jìn)行超聲破碎，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖2所示。在未誘導(dǎo)的對(duì)照組中，未見(jiàn)明顯的特異性條帶；在誘導(dǎo)后的實(shí)驗(yàn)組中，可見(jiàn)在相對(duì)分子質(zhì)量約57kDa處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，與預(yù)期的融合蛋白（帶有His標(biāo)簽）大小相符。這表明IHNV糖蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)。對(duì)上清和沉淀的電泳結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)沉淀中目的蛋白條帶明顯，而上清中目的蛋白條帶較弱。這說(shuō)明IHNV糖蛋白在大腸桿菌中主要以包涵體形式表達(dá)。包涵體的形成可能與蛋白的表達(dá)量過(guò)高、表達(dá)速度過(guò)快以及蛋白的折疊方式等因素有關(guān)。在原核表達(dá)系統(tǒng)中，由于缺乏真核細(xì)胞中的一些蛋白折疊輔助因子，當(dāng)外源蛋白表達(dá)量過(guò)高時(shí)，容易形成包涵體。后續(xù)需要對(duì)包涵體進(jìn)行變性復(fù)性處理，以獲得具有活性的蛋白。[此處插入SDS-PAGE電泳圖，圖注：M：蛋白質(zhì)Marker；1：未誘導(dǎo)的重組菌裂解液上清；2：未誘導(dǎo)的重組菌裂解液沉淀；3：誘導(dǎo)后的重組菌裂解液上清；4：誘導(dǎo)后的重組菌裂解液沉淀]4.2.3蛋白純化結(jié)果由于IHNV糖蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，對(duì)包涵體進(jìn)行了變性復(fù)性和鎳柱親和層析純化處理。將純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖3所示。在電泳圖中，可見(jiàn)在相對(duì)分子質(zhì)量約57kDa處出現(xiàn)一條單一且清晰的蛋白條帶，表明經(jīng)過(guò)純化后獲得了高純度的IHNV糖蛋白。為進(jìn)一步確定蛋白的純度，采用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)SDS-PAGE電泳結(jié)果進(jìn)行分析，通過(guò)軟件計(jì)算目的蛋白條帶的灰度值，并與總蛋白的灰度值進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，純化后的蛋白純度達(dá)到了90%以上，滿足后續(xù)免疫學(xué)鑒定和研究的要求。高純度的糖蛋白為深入研究其免疫學(xué)特性以及開(kāi)發(fā)相關(guān)的檢測(cè)方法和疫苗提供了優(yōu)質(zhì)的材料。[此處插入純化后蛋白的SDS-PAGE電泳圖，圖注：M：蛋白質(zhì)Marker；1：純化后的IHNV糖蛋白]五、傳染性造血器官壞死病毒糖蛋白的免疫學(xué)鑒定5.1免疫學(xué)鑒定方法概述免疫熒光技術(shù)是利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，使其與相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)特異性熒光反應(yīng)，從而對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定性、定位和定量檢測(cè)。根據(jù)標(biāo)記物的不同，免疫熒光技術(shù)可分為直接法和間接法。直接法是將熒光素直接標(biāo)記在抗體上，與標(biāo)本中的抗原直接結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)，操作相對(duì)簡(jiǎn)單、特異性高，但敏感性較低，且一種熒光抗體只能檢測(cè)一種抗原。間接法是先將特異性抗體與標(biāo)本中的抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的抗抗體（二抗）與特異性抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-抗抗體復(fù)合物，通過(guò)檢測(cè)復(fù)合物上的熒光來(lái)確定抗原的存在。間接法的敏感性較高，且只需標(biāo)記一種抗抗體即可檢測(cè)多種抗原，但操作相對(duì)復(fù)雜，容易出現(xiàn)非特異性熒光。免疫熒光技術(shù)在病毒檢測(cè)中具有重要應(yīng)用。在IHNV檢測(cè)方面，可將抗IHNV糖蛋白的抗體用熒光素標(biāo)記，與感染IHNV的細(xì)胞或組織切片進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)觀察熒光的分布和強(qiáng)度，判斷病毒的感染情況和糖蛋白的表達(dá)位置。在細(xì)胞生物學(xué)研究中，免疫熒光技術(shù)可用于觀察病毒感染細(xì)胞后糖蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和分布變化，深入了解病毒的感染機(jī)制。在疾病診斷中，免疫熒光技術(shù)能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出病毒抗原，為臨床診斷提供重要依據(jù)，有助于早期發(fā)現(xiàn)和治療疾病。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是一種基于抗原抗體特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物高效催化作用的免疫檢測(cè)技術(shù)。其基本原理是將抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，可極大地放大反應(yīng)效果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。ELISA技術(shù)具有多種類型，常見(jiàn)的有直接法、間接法、雙抗體夾心法以及間接夾心法等。直接法是將抗原直接包被在固相載體上，加入酶標(biāo)抗體進(jìn)行反應(yīng)，適用于檢測(cè)抗原。間接法是將抗原包被在固相載體上，加入待檢抗體，再加入酶標(biāo)二抗進(jìn)行反應(yīng)，主要用于檢測(cè)抗體。雙抗體夾心法是用特異性抗體包被固相載體，加入待檢抗原，再加入酶標(biāo)抗體進(jìn)行反應(yīng)，常用于檢測(cè)抗原。間接夾心法是將抗原包被在固相載體上，加入待檢抗體，再加入酶標(biāo)抗抗體進(jìn)行反應(yīng)，可用于檢測(cè)抗體。在IHNV糖蛋白的免疫學(xué)鑒定中，ELISA技術(shù)可用于檢測(cè)糖蛋白的含量和活性，以及機(jī)體對(duì)糖蛋白產(chǎn)生的抗體水平。通過(guò)將糖蛋白包被在酶標(biāo)板上，加入待檢血清，若血清中含有抗糖蛋白的抗體，則會(huì)與糖蛋白結(jié)合，再加入酶標(biāo)二抗，形成抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，加入底物后，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺可判斷抗體的含量，從而評(píng)估機(jī)體的免疫狀態(tài)。ELISA技術(shù)還可用于篩選和鑒定針對(duì)IHNV糖蛋白的單克隆抗體，為病毒的診斷和治療提供有力工具。免疫印跡（WesternBlot）是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的實(shí)驗(yàn)方法，可對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。其基本原理是通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳分離的細(xì)胞或生物組織樣品中的蛋白條帶進(jìn)行著色，通過(guò)分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況。該技術(shù)先進(jìn)行SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳），將蛋白質(zhì)樣品根據(jù)分子量大小進(jìn)行分離，然后將分離開(kāi)的蛋白質(zhì)樣品用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。免疫印跡技術(shù)在IHNV糖蛋白的鑒定中發(fā)揮著重要作用。通過(guò)免疫印跡，可以確定原核表達(dá)的糖蛋白是否具有正確的分子量和免疫活性，驗(yàn)證表達(dá)產(chǎn)物的正確性。在研究糖蛋白的免疫原性時(shí)，免疫印跡可用于檢測(cè)機(jī)體免疫后產(chǎn)生的特異性抗體與糖蛋白的結(jié)合情況，分析抗體的特異性和親和力，為疫苗的研發(fā)和評(píng)估提供重要依據(jù)。免疫印跡還可用于比較不同毒株糖蛋白的差異，研究病毒的變異情況，為病毒的監(jiān)測(cè)和防控提供參考。5.2糖蛋白免疫原性檢測(cè)5.2.1抗血清制備將純化后的IHNV糖蛋白作為免疫原，用于免疫新西蘭大白兔以制備抗血清。選取健康、體重約2.0-2.5kg的新西蘭大白兔3只，在免疫前采集少量血液作為陰性對(duì)照血清。免疫時(shí)，將糖蛋白與弗氏完全佐劑按照1:1的體積比充分乳化，通過(guò)背部多點(diǎn)皮下注射的方式進(jìn)行初次免疫，每只兔子的免疫劑量為1mg糖蛋白。初次免疫后，間隔14天進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫。將糖蛋白與弗氏不完全佐劑按1:1乳化后，以相同的免疫劑量和注射方式進(jìn)行加強(qiáng)免疫。此后，每隔7天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共進(jìn)行3次加強(qiáng)免疫。在最后一次加強(qiáng)免疫后的第7天，通過(guò)耳緣靜脈采血的方式采集血液，將采集的血液在室溫下靜置1-2h，待血液凝固后，于4℃、3000r/min離心15min，分離血清，獲得抗血清。將抗血清分裝后，保存于-80℃冰箱中備用，以防止抗體活性下降和污染。5.2.2間接ELISA檢測(cè)采用間接ELISA方法檢測(cè)抗血清的效價(jià)。首先，將純化的重組IHNV糖蛋白用包被液（0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液）稀釋至1μg/mL，以100μL/孔的量加入到96孔酶標(biāo)板中，4℃包被過(guò)夜。次日，棄去包被液，用洗滌液（0.05%Tween-PBS，即PBST）洗滌3次，每次3min，以去除未結(jié)合的蛋白。隨后，每孔加入200μL封閉液（5%脫脂奶粉），37℃封閉2h，封閉酶標(biāo)板上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，再次用PBST洗滌3次。將制備的抗血清用PBST進(jìn)行倍比稀釋，從1:100開(kāi)始，依次稀釋為1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600等不同濃度，以100μL/孔的量加入到酶標(biāo)板中，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（未免疫兔血清）和陽(yáng)性對(duì)照（已知陽(yáng)性抗血清），37℃孵育1h。孵育結(jié)束后，用PBST洗滌5次，以確保未結(jié)合的抗體被徹底清除。加入用PBST稀釋的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:5000），100μL/孔，37℃孵育1h。再次用PBST洗滌5次，然后每孔加入顯色液A、B各50μL，37℃避光顯色15min。最后，加入50μL終止液（2MH?SO?）終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光值（OD???）。以O(shè)D???值大于陰性對(duì)照OD???值的2.1倍作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定抗血清的效價(jià)。結(jié)果顯示，制備的抗血清效價(jià)可達(dá)1:12800，表明抗血清具有較高的滴度，能夠與重組糖蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，具有良好的免疫反應(yīng)性。這為后續(xù)利用抗血清進(jìn)行病毒檢測(cè)和免疫相關(guān)研究提供了有力的工具。為進(jìn)一步驗(yàn)證抗血清與天然病毒株表面糖蛋白的反應(yīng)性，以感染IHNV的CHSE-214細(xì)胞裂解液作為抗原，按照上述間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，抗血清同樣能夠與病毒株表面糖蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，OD???值顯著高于陰性對(duì)照，說(shuō)明抗血清不僅對(duì)重組糖蛋白有反應(yīng)，對(duì)天然病毒株表面的糖蛋白也具有良好的識(shí)別能力，為IHNV的檢測(cè)和診斷提供了潛在的應(yīng)用價(jià)值。5.2.3間接免疫熒光檢測(cè)采用間接免疫熒光法檢測(cè)抗血清與IHNV的特異性結(jié)合情況。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CHSE-214細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入1×10?個(gè)細(xì)胞，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μL含IHNV的培養(yǎng)液（病毒滴度為10?TCID??/mL），37℃吸附1h。然后棄去病毒液，用PBS洗滌3次，加入含有2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，使病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，每次5min。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，再用PBS洗滌3次。隨后，用0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10min，以增加細(xì)胞膜的通透性，便于抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合。通透后，用PBS洗滌3次，加入5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，37℃封閉1h，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，將制備的抗血清用PBS稀釋至1:200，每孔加入100μL，37℃孵育1h。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌3次，加入用PBS稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:200），100μL/孔，37℃避光孵育1h。再次用PBS洗滌3次，每次5min，最后加入適量的抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，可見(jiàn)感染IHNV的細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的黃綠色熒光，而未感染病毒的細(xì)胞則無(wú)熒光信號(hào)。這表明制備的抗血清能夠與感染細(xì)胞內(nèi)的IHNV糖蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，產(chǎn)生特異性熒光，進(jìn)一步證實(shí)了抗血清的特異性和有效性。通過(guò)間接免疫熒光檢測(cè)，直觀地展示了抗血清與病毒之間的相互作用，為研究IHNV的感染機(jī)制和免疫診斷提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。5.3糖蛋白反應(yīng)原性檢測(cè)5.3.1Westernblot檢測(cè)將純化后的IHNV糖蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后通過(guò)電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，37℃封閉1h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉完成后，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次5min。將制備的兔抗IHNV糖蛋白抗血清用TBST緩沖液稀釋至1:1000，加入到膜上，37℃孵育1h，使抗血清中的抗體與膜上的糖蛋白特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次5min。加入用TBST緩沖液稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:5000），37℃孵育1h。孵育完成后，用TBST緩沖液洗滌膜5次，每次5min。最后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影。在Westernblot結(jié)果中，可見(jiàn)在相對(duì)分子質(zhì)量約57kDa處出現(xiàn)一條清晰的特異性條帶，與預(yù)期的糖蛋白大小相符。這表明純化后的IHNV糖蛋白能夠與制備的抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性，能夠被抗血清中的抗體識(shí)別并結(jié)合。[此處插入Westernblot檢測(cè)結(jié)果圖，圖注：M：蛋白質(zhì)Marker；1：純化后的IHNV糖蛋白與抗血清反應(yīng)條帶]5.3.2結(jié)果分析與討論通過(guò)間接ELISA檢測(cè)，制備的抗血清效價(jià)可達(dá)1:12800，這表明抗血清中含有較高濃度的特異性抗體，能夠與重組糖蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，說(shuō)明重組糖蛋白具有良好的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，抗血清能夠與感染IHNV的細(xì)胞內(nèi)的糖蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)明顯的黃綠色熒光，進(jìn)一步證實(shí)了抗血清的特異性和有效性，也表明重組糖蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠保持其免疫原性，與天然病毒株表面糖蛋白具有相似的免疫反應(yīng)特性。Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明，純化后的IHNV糖蛋白能夠與抗血清中的抗體特異性結(jié)合，在相對(duì)分子質(zhì)量約57kDa處出現(xiàn)清