低能量甜味劑對STC-1細胞甜味通路的調(diào)控機制探究一、引言1.1研究背景與意義在現(xiàn)代社會，隨著生活水平的不斷提高，人們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，高糖食品的攝入量日益增加。高糖飲食帶來的健康問題愈發(fā)嚴重，如肥胖、糖尿病、心血管疾病等。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）統(tǒng)計，全球糖尿病患者人數(shù)逐年攀升，2021年已達5.37億，預計到2045年將增至7.83億。肥胖人口數(shù)量也在持續(xù)增長，肥胖不僅會引發(fā)代謝綜合征，還與多種慢性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。高糖攝入導致血糖迅速升高，長期高血糖狀態(tài)會損害血管內(nèi)皮細胞，促進動脈粥樣硬化的形成，增加心血管疾病的發(fā)病風險。為了減少高糖帶來的健康風險，低能量甜味劑應運而生并得到了廣泛應用。低能量甜味劑是一類能夠賦予食品甜味，但熱量顯著低于傳統(tǒng)糖類的物質(zhì)。它們的甜度通常較高，只需少量就能達到與傳統(tǒng)糖類相似的甜度效果，從而在滿足人們對甜味需求的同時，降低了熱量的攝入。低能量甜味劑可分為天然低能量甜味劑和人工合成低能量甜味劑。天然低能量甜味劑如甜菊糖苷、羅漢果甜苷等，從植物中提取而來，具有天然、安全的特點；人工合成低能量甜味劑如阿斯巴甜、三氯蔗糖等，通過化學合成方法制備，具有甜度高、成本低等優(yōu)勢。在食品飲料行業(yè)，低能量甜味劑被廣泛用于各類產(chǎn)品中。在飲料領(lǐng)域，許多無糖或低糖飲料使用低能量甜味劑替代蔗糖，既保留了飲料的甜味口感，又滿足了消費者對健康的追求，像可口可樂公司推出的零度可樂，就是以阿斯巴甜等低能量甜味劑代替蔗糖，深受消費者喜愛。在烘焙食品中，低能量甜味劑的應用也越來越普遍，為糖尿病患者和減肥人群提供了更多選擇。在制藥、個人護理產(chǎn)品等領(lǐng)域，低能量甜味劑也發(fā)揮著重要作用，如在藥品中作為矯味劑，改善藥品的口感，在口香糖中添加低能量甜味劑，既能保持甜味，又能減少糖分對牙齒的損害。雖然低能量甜味劑在市場上得到了廣泛應用，但其對人體生理功能的影響機制尚未完全明確。甜味信號的感知和傳導是一個復雜的生理過程，涉及多種細胞和信號通路。STC-1細胞作為一種常用的味覺感受器細胞模型，在甜味信號轉(zhuǎn)導研究中具有重要作用。深入研究低能量甜味劑對STC-1細胞甜味通路的機制，對于揭示低能量甜味劑的作用機制、評估其安全性以及開發(fā)新型甜味劑具有重要意義。本研究旨在探究低能量甜味劑對STC-1細胞甜味通路的影響及其潛在機制，為低能量甜味劑的合理使用和進一步開發(fā)提供理論依據(jù)。通過研究低能量甜味劑與STC-1細胞甜味受體的相互作用、對細胞內(nèi)信號傳導途徑的影響以及對相關(guān)基因和蛋白表達的調(diào)控，有望揭示低能量甜味劑在甜味感知和生理調(diào)節(jié)方面的作用機制，為解決高糖飲食帶來的健康問題提供新的思路和方法。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀低能量甜味劑的研究始于20世紀，隨著人們對健康飲食的關(guān)注度不斷提高，低能量甜味劑的研究逐漸成為熱點。早期的研究主要集中在低能量甜味劑的化學合成和甜度測定方面。20世紀60年代，阿斯巴甜被成功合成，其高甜度、低熱量的特點引起了廣泛關(guān)注。此后，陸續(xù)有多種低能量甜味劑被開發(fā)和研究，如甜蜜素、安賽蜜等。在20世紀80年代，三氯蔗糖的出現(xiàn)進一步豐富了低能量甜味劑的種類，它具有甜度高、穩(wěn)定性好、安全性高等優(yōu)點，迅速在市場上得到廣泛應用。近年來，低能量甜味劑的研究重點逐漸轉(zhuǎn)向其作用機制和安全性評估。研究表明，低能量甜味劑的甜味感知主要通過與甜味受體結(jié)合來實現(xiàn)。甜味受體T1R2/T1R3是甜味信號傳導的關(guān)鍵分子，低能量甜味劑與T1R2/T1R3的不同亞基結(jié)合，激活細胞內(nèi)的信號傳導通路，從而產(chǎn)生甜味信號。阿斯巴甜主要與T1R2亞基結(jié)合，而甜菊糖苷則與T1R2/T1R3的多個位點相互作用。除了甜味受體，其他味覺相關(guān)蛋白也可能參與低能量甜味劑的甜味感知過程，如G蛋白、離子通道等，它們在甜味信號的傳遞和放大中發(fā)揮著重要作用。在低能量甜味劑對健康影響的研究方面，大量的動物實驗和人體臨床試驗表明，低能量甜味劑在合理使用范圍內(nèi)是安全的，能夠有效降低熱量攝入，有助于控制體重和血糖水平。一些研究也發(fā)現(xiàn)，長期大量攝入低能量甜味劑可能對腸道微生物群落、代謝激素水平等產(chǎn)生潛在影響。一項針對小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，長期飲用含三氯蔗糖的水會改變小鼠腸道微生物的組成和功能，影響腸道屏障功能和免疫反應。一些人體研究也表明，長期攝入低能量甜味劑可能與食欲調(diào)節(jié)異常、代謝綜合征的發(fā)生風險增加有關(guān)，但這些研究結(jié)果還存在一定爭議，需要進一步的深入研究來明確。STC-1細胞作為一種常用的味覺感受器細胞模型，在甜味信號轉(zhuǎn)導研究中發(fā)揮了重要作用。STC-1細胞來源于魚類肝臟，但其對甜味受體T1R2/T1R3的敏感性與哺乳動物細胞相似，因此被廣泛應用于甜味信號轉(zhuǎn)導的研究領(lǐng)域。通過對STC-1細胞的研究，科學家們揭示了甜味信號在細胞內(nèi)的傳導機制，包括鈣離子釋放、第二信使生成、蛋白激酶激活等一系列過程。研究發(fā)現(xiàn)，甜味刺激可導致STC-1細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，激活鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶，進而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達和蛋白的磷酸化水平，實現(xiàn)甜味信號的傳遞和調(diào)節(jié)。目前，關(guān)于雌激素對STC-1細胞甜味信號轉(zhuǎn)導的影響已有一定研究。雌激素通過影響STC-1細胞中鈣離子的釋放來影響甜味信號轉(zhuǎn)導，在雌激素作用下，STC-1細胞中的鈣離子濃度高于對照組，這可能與雌激素促進細胞內(nèi)鈣離子釋放的機制有關(guān)。雌激素還能夠影響STC-1細胞膜上的甜味受體T1R2/T1R3的表達和激活，從而調(diào)節(jié)細胞的甜味敏感性。雌激素通過與雌激素受體結(jié)合，以及與靶細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導通路相互作用，來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)甜味信號的傳遞和調(diào)節(jié)。然而，對于低能量甜味劑對STC-1細胞甜味通路的影響，目前的研究還相對較少。已有研究主要集中在少數(shù)幾種低能量甜味劑對STC-1細胞甜味受體表達和細胞內(nèi)信號分子活性的影響上，對于低能量甜味劑與甜味受體的結(jié)合模式、對細胞內(nèi)復雜信號網(wǎng)絡的整體調(diào)控機制以及長期作用的影響等方面，還缺乏深入系統(tǒng)的研究。在低能量甜味劑對STC-1細胞甜味通路影響的研究中，不同研究之間的實驗條件和方法存在差異，導致研究結(jié)果的可比性和一致性較差，這也給深入理解低能量甜味劑的作用機制帶來了一定困難?？傮w而言，目前低能量甜味劑和STC-1細胞甜味通路的研究已取得了一定成果，但仍存在諸多不足。未來需要進一步加強對低能量甜味劑作用機制的研究，尤其是在細胞和分子層面的深入探索，同時優(yōu)化研究方法，提高研究結(jié)果的可靠性和可比性，為低能量甜味劑的合理應用和開發(fā)提供更堅實的理論基礎(chǔ)。1.3研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入探究低能量甜味劑對STC-1細胞甜味通路的具體作用機制，填補目前在該領(lǐng)域研究的空白，為低能量甜味劑的安全性評估、合理使用以及新型甜味劑的開發(fā)提供科學依據(jù)。通過一系列實驗，明確低能量甜味劑與STC-1細胞甜味受體的結(jié)合模式，揭示其如何激活細胞內(nèi)信號傳導途徑，以及對相關(guān)基因和蛋白表達的調(diào)控機制，從而全面了解低能量甜味劑在細胞層面的作用方式，為解決高糖飲食帶來的健康問題提供新的思路和方法。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面。研究角度上，目前針對低能量甜味劑的研究多集中在其應用和安全性方面，對細胞甜味通路機制的研究相對較少。本研究聚焦于低能量甜味劑對STC-1細胞甜味通路的影響，從細胞和分子層面深入探究其作用機制，為低能量甜味劑的研究提供了新的視角。在研究方法上，將綜合運用多種先進的實驗技術(shù)，如細胞生物學、分子生物學、生物化學等，從多個維度對低能量甜味劑的作用機制進行全面深入的分析。通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET）精確測定低能量甜味劑與甜味受體的結(jié)合親和力和結(jié)合位點，利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)全面分析低能量甜味劑處理后STC-1細胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達和修飾的變化，從而更系統(tǒng)、全面地揭示低能量甜味劑對細胞甜味通路的影響機制，提高研究結(jié)果的可靠性和說服力。研究內(nèi)容上，本研究不僅關(guān)注低能量甜味劑對甜味通路中常見信號分子和基因表達的影響，還將探索其對細胞內(nèi)一些新的潛在靶點和信號通路的作用，有望發(fā)現(xiàn)低能量甜味劑作用的新機制和靶點，為新型甜味劑的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1低能量甜味劑概述2.1.1種類與特性低能量甜味劑種類豐富，涵蓋了人工合成與天然提取的多種類型，每種都有其獨特的特性與應用領(lǐng)域。阿斯巴甜作為人工合成甜味劑的典型代表，化學名稱為天門冬酰苯丙氨酸甲酯，由天冬氨酸和苯丙氨酸兩種氨基酸化合而成。它外觀呈白色無味的結(jié)晶粉末，在干燥環(huán)境下穩(wěn)定性良好，微溶于水和乙醇。阿斯巴甜甜度極高，是蔗糖的180-200倍，僅需極少量就能達到與蔗糖相似的甜度效果。其甜味純正，幾乎沒有異味，不會產(chǎn)生化學味、苦味或金屬后味，在食品工業(yè)中應用廣泛，常見于各種甜品、零食、飲料、乳制品、甜點以及醫(yī)藥用品中，能夠為產(chǎn)品增添甜味，同時降低熱量攝入。甜菊糖則是從草本植物甜葉菊的葉子中提取出來的天然甜味劑，呈現(xiàn)白色至微黃結(jié)晶性粉末或顆粒狀，具有清涼的甜味。它被譽為“世界第三糖源”，甜度是蔗糖的200-350倍，熱量卻僅為蔗糖的1/300。甜菊糖穩(wěn)定性出色，耐熱和防腐能力強，在通常的食品飲料加工條件下性質(zhì)相當穩(wěn)定，能有效降低食品的粘稠度，抑制細菌生長，延長產(chǎn)品的保質(zhì)期。由于其安全性高，被國際上所有主要食品監(jiān)管機構(gòu)認可為安全食品，兒童和妊娠期婦女也可食用。在食品行業(yè)中，甜菊糖可廣泛應用于飲料、酒類、蜜餞、果脯、糕點、面包、乳制品等產(chǎn)品，既能滿足消費者對甜味的需求，又符合健康飲食的理念。三氯蔗糖是一種低熱量的人工甜味劑，它是通過對蔗糖分子進行化學修飾而得到的。三氯蔗糖具有甜度高的特點，其甜度是蔗糖的400-800倍。在人體內(nèi)不易被吸收，大部分會以原形排出體外，因此熱量極低，幾乎可以忽略不計。它的穩(wěn)定性也很好，在不同的環(huán)境條件下都能保持其甜味特性，無論是在酸性還是堿性環(huán)境中，都能穩(wěn)定存在，不會發(fā)生分解或變質(zhì)。這使得三氯蔗糖在各類食品和飲料的加工過程中都能發(fā)揮良好的作用，被廣泛應用于飲料、烘焙食品、乳制品、調(diào)味品等領(lǐng)域。羅漢果甜苷是從羅漢果中提取的天然甜味劑，其甜度約為蔗糖的300-400倍。它具有天然、健康的特點，富含多種營養(yǎng)成分，對人體具有一定的保健作用。羅漢果甜苷的甜味純正，帶有羅漢果特有的風味，口感清新宜人。在食品工業(yè)中，常用于制作飲料、糖果、糕點等產(chǎn)品，為消費者提供了一種天然、低熱量的甜味選擇。此外，由于其具有一定的藥用價值，還可應用于保健品和藥品領(lǐng)域。這些常見的低能量甜味劑在甜度、熱量、穩(wěn)定性、風味等方面各有特點，它們的出現(xiàn)為食品飲料行業(yè)提供了更多的選擇，滿足了消費者對健康和美味的雙重追求。在實際應用中，食品制造商可以根據(jù)產(chǎn)品的需求和特點，選擇合適的低能量甜味劑，以實現(xiàn)產(chǎn)品的最佳口感和品質(zhì)。2.1.2代謝途徑與安全性低能量甜味劑在人體內(nèi)的代謝途徑因種類不同而存在差異，其安全性也一直是備受關(guān)注的焦點話題，相關(guān)研究和討論不斷深入。阿斯巴甜在人體內(nèi)的代謝過程相對復雜，它會被分解為天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇。天冬氨酸和苯丙氨酸是人體必需的氨基酸，可參與正常的代謝過程，為身體提供營養(yǎng)和能量。甲醇在體內(nèi)可進一步代謝為甲醛和甲酸，但正常情況下，人體具有一定的代謝能力，能夠?qū)⑦@些物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì)并排出體外。不過，對于苯丙酮尿癥患者而言，由于他們體內(nèi)缺乏代謝苯丙氨酸的酶，阿斯巴甜的攝入可能會導致苯丙氨酸在體內(nèi)蓄積，從而引發(fā)一系列健康問題。因此，這類患者需要謹慎食用含有阿斯巴甜的食品。在安全性方面，阿斯巴甜的爭議由來已久。過去幾十年里，眾多研究對其安全性進行了深入探討，結(jié)果卻不盡相同。部分研究聲稱阿斯巴甜可引發(fā)抑郁癥、帕金森、癲癇等多種疾病，但也有大量研究充分肯定了其安全性。2022年4月12日，世界衛(wèi)生組織在其官網(wǎng)上發(fā)布的一份關(guān)于無糖甜味劑的研究報告指出，“一項系統(tǒng)回顧得出的結(jié)論稱，低熱量和無熱量甜味劑的高攝入與癌癥死亡率或任何類型的癌癥之間‘沒有顯著關(guān)聯(lián)’”。世界上最大的獨立癌癥研究機構(gòu)——英國癌癥研究所，在其官網(wǎng)上也明確表示，證據(jù)表明人工甜味劑，比如阿斯巴甜，并不會增加癌癥風險。然而，2023年7月，世界衛(wèi)生組織下屬的國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）依據(jù)對人類致癌性的“有限證據(jù)”，將阿斯巴甜歸為可能對人類致癌物質(zhì)（2B類），這一結(jié)論再次引發(fā)了消費者對阿斯巴甜安全性的廣泛關(guān)注。不過，國際甜味劑協(xié)會（ISA）秘書長指出，國際癌癥研究機構(gòu)并非一家食品安全機構(gòu)，其對阿斯巴甜的審查在科學上并不全面，很大程度上是基于被廣泛否定的研究。國內(nèi)多位食品行業(yè)專家也表示，國際癌癥研究機構(gòu)對阿斯巴甜安全性的質(zhì)疑，暫時連動物實驗證據(jù)都不足，并不能動搖阿斯巴甜的地位?；诖饲叭虼罅康膭游镌囼灪腿巳涸囼灲Y(jié)果來看，阿斯巴甜沒有致癌和神經(jīng)毒性作用，作為添加劑使用在合理限量內(nèi)是安全的。甜菊糖在人體內(nèi)的代謝途徑較為簡單，它在體內(nèi)不參加代謝，不蓄積，無毒副作用。其安全性早已得到國際食品法典委員會（CAC）以及眾多國家和地區(qū)政府的認可，被批準作為食品添加劑廣泛應用。甜菊糖的原料甜葉菊在南美巴拉圭、巴西等地的居民食用歷史已有幾百年，至今未發(fā)現(xiàn)對人體有任何毒害和副作用。中國衛(wèi)生部也分別于1985年和1990年批準甜菊糖為不限量使用的天然甜味劑和醫(yī)藥用甜味劑輔料。三氯蔗糖在人體內(nèi)幾乎不被吸收，大部分以原形經(jīng)尿液排出體外，不參與人體的代謝過程。多項研究表明，三氯蔗糖在規(guī)定的使用范圍內(nèi)是安全的，不會對人體健康造成不良影響。它在食品工業(yè)中的應用非常廣泛，經(jīng)過長期的實踐檢驗，未發(fā)現(xiàn)其與任何健康問題存在直接關(guān)聯(lián)。雖然低能量甜味劑在合理使用范圍內(nèi)被認為是安全的，但長期大量攝入可能會對人體產(chǎn)生潛在影響。一些研究發(fā)現(xiàn)，長期大量攝入低能量甜味劑可能會改變腸道微生物群落的組成和功能。一項針對小鼠的研究表明，長期飲用含三氯蔗糖的水會導致小鼠腸道微生物的種類和數(shù)量發(fā)生變化，進而影響腸道屏障功能和免疫反應。一些人體研究也表明，長期攝入低能量甜味劑可能與食欲調(diào)節(jié)異常、代謝綜合征的發(fā)生風險增加有關(guān)。由于這些研究結(jié)果還存在一定爭議，需要更多高質(zhì)量的研究來進一步明確低能量甜味劑的長期安全性。2.2STC-1細胞與甜味通路2.2.1STC-1細胞的特性與應用STC-1細胞作為一種獨特的細胞模型，具有諸多適用于甜味信號研究的顯著特性，在味覺研究領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。STC-1細胞最初從魚類肝臟中分離獲得，雖來源特殊，但其對甜味受體T1R2/T1R3的敏感性卻與哺乳動物細胞高度相似。這一特性使得STC-1細胞成為研究甜味信號轉(zhuǎn)導機制的理想模型，為科學家們深入探究甜味感知的奧秘提供了便利。在細胞形態(tài)方面，STC-1細胞呈現(xiàn)出典型的上皮樣形態(tài)，細胞邊界清晰，呈多邊形或梭形，具有良好的貼壁生長特性。在培養(yǎng)條件下，STC-1細胞能夠快速增殖，形成緊密排列的單層細胞，便于進行各種實驗操作和觀察。其生長特性穩(wěn)定，傳代過程中細胞形態(tài)和功能變化較小，保證了實驗結(jié)果的可靠性和重復性。STC-1細胞在甜味信號研究中展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。它能夠高度表達甜味受體T1R2/T1R3，且表達水平相對穩(wěn)定。這使得研究人員可以通過對STC-1細胞的研究，精準地探究甜味受體與低能量甜味劑之間的相互作用機制。STC-1細胞內(nèi)的信號傳導通路與哺乳動物味覺感受器細胞類似，能夠完整地模擬甜味信號在細胞內(nèi)的傳遞過程。當甜味物質(zhì)與細胞表面的甜味受體結(jié)合后，STC-1細胞能夠迅速啟動一系列細胞內(nèi)信號傳導事件，包括鈣離子釋放、第二信使生成等，從而實現(xiàn)甜味信號的傳遞和放大。過往研究中，STC-1細胞被廣泛應用于多個方面。在甜味受體功能研究中，科學家們利用STC-1細胞成功鑒定出多種甜味物質(zhì)與甜味受體的結(jié)合位點和結(jié)合模式。通過對STC-1細胞進行基因編輯，敲除或過表達甜味受體相關(guān)基因，研究人員深入分析了甜味受體在甜味感知中的具體作用機制。在低能量甜味劑的研究中，STC-1細胞也發(fā)揮了重要作用。研究人員通過將不同種類的低能量甜味劑作用于STC-1細胞，觀察細胞內(nèi)信號傳導的變化，以及相關(guān)基因和蛋白表達的改變，從而揭示低能量甜味劑的作用機制。有研究利用STC-1細胞發(fā)現(xiàn)，甜菊糖苷能夠與甜味受體T1R2/T1R3的特定區(qū)域結(jié)合，激活細胞內(nèi)的磷脂酶C（PLC）信號通路，進而導致細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，產(chǎn)生甜味信號。STC-1細胞還被應用于研究甜味信號與其他生理過程的關(guān)聯(lián)。一些研究發(fā)現(xiàn)，甜味信號在STC-1細胞中的傳導能夠影響細胞的代謝活動，如調(diào)節(jié)葡萄糖攝取和能量代謝相關(guān)基因的表達。這表明甜味信號可能不僅僅局限于味覺感知，還與細胞的能量代謝調(diào)控密切相關(guān)。STC-1細胞在甜味信號研究中的應用，為我們深入理解甜味感知的分子機制以及低能量甜味劑的作用原理提供了重要的實驗依據(jù)，具有不可替代的重要價值。2.2.2甜味信號傳導通路解析甜味信號的傳導是一個精妙復雜的過程，以T1R2/T1R3異源二聚體為核心，涉及多個關(guān)鍵步驟和信號分子的協(xié)同作用，共同完成從甜味物質(zhì)識別到細胞響應的信息傳遞。T1R2/T1R3異源二聚體作為甜味信號傳導的起始關(guān)鍵，在細胞膜表面發(fā)揮著甜味感受器的重要作用。T1R2和T1R3亞基均屬于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）家族，它們通過特定的結(jié)構(gòu)域相互作用，形成具有功能活性的異源二聚體。T1R2亞基主要負責識別多種甜味物質(zhì)，包括天然糖類和低能量甜味劑，其結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸殘基對于甜味物質(zhì)的特異性結(jié)合至關(guān)重要。T1R3亞基則在維持二聚體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及信號傳導的起始過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當甜味物質(zhì)，如低能量甜味劑，與T1R2/T1R3異源二聚體結(jié)合時，會引起受體構(gòu)象的變化。這種構(gòu)象變化是信號傳導的啟動開關(guān)，它使得受體能夠與細胞內(nèi)的G蛋白相互作用。G蛋白是一類重要的信號轉(zhuǎn)導分子，由α、β和γ三個亞基組成。在靜息狀態(tài)下，G蛋白的α亞基與GDP結(jié)合，處于非激活狀態(tài)。當甜味受體與甜味物質(zhì)結(jié)合并發(fā)生構(gòu)象變化后，能夠促使G蛋白的α亞基與GDP解離，并結(jié)合GTP，從而激活G蛋白。激活后的G蛋白α亞基會與βγ亞基解離，分別去激活下游的效應分子。被激活的G蛋白α亞基主要作用于磷脂酶C（PLC），激活PLC后，PLC會催化細胞膜上的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）水解，生成兩個重要的第二信使：肌醇-1,4,5-三磷酸（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3能夠迅速擴散進入細胞內(nèi)，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體結(jié)合。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)重要的鈣離子儲存庫，IP3與受體結(jié)合后，會打開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣離子通道，使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離子大量釋放到細胞質(zhì)中，導致細胞內(nèi)鈣離子濃度迅速升高。DAG則會留在細胞膜上，激活蛋白激酶C（PKC）。PKC是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它能夠通過磷酸化作用調(diào)節(jié)多種下游蛋白的活性，進一步放大和傳遞甜味信號。細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高是甜味信號傳導過程中的一個關(guān)鍵事件。鈣離子作為重要的第二信使，能夠激活多種鈣依賴性蛋白激酶和信號通路。在STC-1細胞中，升高的鈣離子濃度可以激活鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶（CaMK）。CaMK能夠磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子和離子通道蛋白，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達和離子通道的活性。CaMK可以磷酸化cAMP反應元件結(jié)合蛋白（CREB），使其進入細胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)細胞的生理功能。鈣離子還可以直接作用于細胞膜上的離子通道，影響細胞膜的電位變化，進一步傳遞甜味信號。在甜味信號傳導的最后階段，細胞會通過分泌神經(jīng)遞質(zhì)等方式將信號傳遞給與之相連的神經(jīng)元，從而實現(xiàn)從細胞層面到神經(jīng)系統(tǒng)的信號傳遞。在味覺感受器細胞中，常見的神經(jīng)遞質(zhì)如ATP、血清素等會在甜味信號的刺激下釋放到細胞間隙。這些神經(jīng)遞質(zhì)會與神經(jīng)元表面的相應受體結(jié)合，激活神經(jīng)元，產(chǎn)生動作電位，進而將甜味信號傳遞到大腦的味覺中樞，最終形成甜味感知。整個甜味信號傳導通路是一個高度有序且精密調(diào)控的過程，以T1R2/T1R3異源二聚體為核心，通過一系列信號分子的級聯(lián)反應，實現(xiàn)了從甜味物質(zhì)識別到細胞響應以及最終神經(jīng)系統(tǒng)感知的完整過程。這一過程的深入解析對于理解低能量甜味劑的作用機制以及甜味感知的生理過程具有重要意義。三、實驗設計與方法3.1實驗材料本研究選用的低能量甜味劑包括阿斯巴甜、甜菊糖、三氯蔗糖和羅漢果甜苷，均購自Sigma-Aldrich公司，純度≥98%。這些甜味劑具有不同的化學結(jié)構(gòu)和甜度特性，能夠為研究低能量甜味劑對STC-1細胞甜味通路的影響提供多樣化的樣本。阿斯巴甜是一種人工合成的二肽甜味劑，甜度約為蔗糖的180-200倍，具有甜味純正、熱量低等特點，廣泛應用于各類食品和飲料中。甜菊糖是從甜葉菊中提取的天然甜味劑，甜度是蔗糖的200-350倍，熱量極低，且具有一定的保健功能。三氯蔗糖是蔗糖分子經(jīng)化學修飾得到的人工甜味劑，甜度為蔗糖的400-800倍，穩(wěn)定性好，在食品工業(yè)中應用廣泛。羅漢果甜苷是從羅漢果中提取的天然甜味劑，甜度約為蔗糖的300-400倍，具有天然、健康的特性。實驗所用的STC-1細胞購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，該細胞系具有穩(wěn)定的生物學特性，能夠高度表達甜味受體T1R2/T1R3，是研究甜味信號轉(zhuǎn)導機制的常用細胞模型。細胞培養(yǎng)所需的DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗均購自Gibco公司。DMEM培養(yǎng)基為STC-1細胞的生長提供了必要的營養(yǎng)成分，包括氨基酸、維生素、糖類等。胎牛血清含有多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進細胞的生長和增殖。青霉素-鏈霉素雙抗則可有效防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染。胰蛋白酶購自Amresco公司，用于細胞的消化傳代。當細胞生長達到一定密度需要傳代時，胰蛋白酶能夠?qū)⒓毎麖呐囵B(yǎng)瓶壁上消化下來，使其分散成單個細胞，便于后續(xù)的培養(yǎng)操作。在實驗過程中，還使用了多種試劑用于檢測細胞內(nèi)的信號分子和基因表達水平。熒光素-乙酰甲酯（Fluo-3AM）購自Invitrogen公司，用于檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。Fluo-3AM是一種熒光探針，能夠與細胞內(nèi)的鈣離子結(jié)合并發(fā)出熒光，通過檢測熒光強度的變化，可以實時監(jiān)測細胞內(nèi)鈣離子濃度的動態(tài)變化。蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于提取細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)并進行定量分析。蛋白提取試劑盒能夠高效地從細胞中提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒則可精確測定蛋白樣品的濃度，為后續(xù)的蛋白質(zhì)免疫印跡實驗提供準確的蛋白濃度數(shù)據(jù)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司，用于檢測相關(guān)基因的表達水平。反轉(zhuǎn)錄試劑盒可將細胞中的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實時熒光定量PCR試劑盒則能通過對cDNA的擴增和檢測，精確測定目的基因的表達量，從而分析低能量甜味劑對相關(guān)基因表達的影響。實驗儀器方面，主要包括二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為STC-1細胞的培養(yǎng)提供了穩(wěn)定的溫度（37℃）、濕度（95%）和二氧化碳濃度（5%）環(huán)境。在這樣的環(huán)境下，細胞能夠保持良好的生長狀態(tài)，有利于實驗的進行。熒光顯微鏡（Olympus公司）用于觀察細胞形態(tài)和熒光信號。通過熒光顯微鏡，可以清晰地觀察到細胞內(nèi)的熒光標記物，如Fluo-3AM與鈣離子結(jié)合后的熒光信號，從而直觀地了解細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化情況。酶標儀（BioTek公司）用于檢測蛋白濃度和熒光強度。酶標儀能夠快速、準確地測定蛋白樣品的濃度，以及熒光標記物的熒光強度，為實驗數(shù)據(jù)的獲取提供了便利。實時熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司）用于進行基因表達的定量分析。該儀器能夠?qū)Ψ崔D(zhuǎn)錄得到的cDNA進行高效、精確的擴增和檢測，通過實時監(jiān)測PCR反應過程中的熒光信號變化，實現(xiàn)對目的基因表達量的準確測定。3.2實驗方法3.2.1STC-1細胞的培養(yǎng)與處理將購買的STC-1細胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中進行復蘇，期間不斷輕輕搖晃凍存管，使細胞盡快融化。待細胞完全融化后，用75%酒精棉球擦拭凍存管外壁進行消毒，然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5mL完全培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗）的離心管中，在1000rpm的條件下離心5分鐘。離心后棄去上清液，加入適量的完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞懸液接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，觀察細胞的貼壁情況和生長狀態(tài)。當細胞密度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。具體操作如下：棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS溶液輕輕潤洗細胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向培養(yǎng)瓶中加入2mL0.25%的胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在顯微鏡下觀察細胞消化情況，當細胞大部分變圓并開始脫落時，迅速將培養(yǎng)瓶拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，使細胞完全脫落，然后加入少量完全培養(yǎng)基終止消化。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000rpm的條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入適量的完全培養(yǎng)基重懸細胞，按照1:2-1:5的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)在37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的STC-1細胞接種于96孔板或6孔板中，每孔接種適量的細胞，使細胞密度均勻且符合實驗要求。待細胞貼壁生長24小時后，進行低能量甜味劑處理。設置不同的實驗組，分別加入不同種類和濃度的低能量甜味劑溶液。阿斯巴甜的處理濃度設置為0.1mM、1mM、10mM，甜菊糖的處理濃度設置為0.05mM、0.5mM、5mM，三氯蔗糖的處理濃度設置為0.01mM、0.1mM、1mM，羅漢果甜苷的處理濃度設置為0.02mM、0.2mM、2mM。同時設置對照組，對照組加入等體積的不含低能量甜味劑的培養(yǎng)基。將處理后的細胞繼續(xù)在37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間，根據(jù)不同的檢測指標，培養(yǎng)時間分別設置為1小時、3小時、6小時，以便后續(xù)檢測低能量甜味劑對STC-1細胞甜味通路相關(guān)指標的影響。3.2.2檢測指標與方法利用熒光素-乙酰甲酯（Fluo-3AM）負載法檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。將經(jīng)過低能量甜味劑處理的STC-1細胞從培養(yǎng)箱中取出，用不含鈣、鎂離子的PBS溶液輕輕潤洗細胞2-3次。向細胞中加入含有5μMFluo-3AM的無血清DMEM培養(yǎng)基，將細胞置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育30-45分鐘，使Fluo-3AM能夠進入細胞并與細胞內(nèi)的鈣離子結(jié)合。孵育結(jié)束后，用無血清DMEM培養(yǎng)基再次潤洗細胞2-3次，以去除未進入細胞的Fluo-3AM。將細胞置于熒光顯微鏡下觀察，使用合適的激發(fā)光和發(fā)射光波長（激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射光波長為525nm），采集細胞的熒光圖像。通過分析熒光圖像的強度，利用圖像分析軟件計算細胞內(nèi)鈣離子濃度的相對變化值。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測甜味受體T1R2/T1R3以及下游信號分子的蛋白表達水平。將低能量甜味劑處理后的STC-1細胞從培養(yǎng)板中收集到離心管中，加入適量的蛋白裂解液，在冰上裂解30分鐘，期間不斷輕輕搖晃離心管，使細胞充分裂解。然后在12000rpm、4℃的條件下離心15分鐘，取上清液作為蛋白樣品。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白樣品的濃度，根據(jù)測定結(jié)果將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在95℃條件下加熱5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%的脫脂奶粉封閉1-2小時，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗（抗T1R2、抗T1R3、抗PLC、抗PKC等抗體）在4℃條件下孵育過夜。第二天，用TBST緩沖液清洗PVDF膜3-4次，每次10分鐘，然后將PVDF膜與二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或羊抗鼠二抗）在室溫條件下孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液清洗PVDF膜3-4次，每次10分鐘。最后，使用化學發(fā)光底物（ECL）對PVDF膜進行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并利用圖像分析軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析，以定量檢測蛋白的表達水平。運用實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測甜味通路相關(guān)基因的表達水平。使用Trizol試劑提取低能量甜味劑處理后的STC-1細胞中的總RNA。具體操作如下：將細胞從培養(yǎng)板中收集到離心管中，加入1mLTrizol試劑，用移液器反復吹打，使細胞充分裂解。然后加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。在12000rpm、4℃的條件下離心15分鐘，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機相。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入0.5mL異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。再次在12000rpm、4℃的條件下離心10分鐘，此時RNA會沉淀在離心管底部。棄去上清液，用75%的乙醇洗滌RNA沉淀2-3次，每次洗滌后在7500rpm、4℃的條件下離心5分鐘。最后棄去乙醇，將RNA沉淀在室溫下晾干，加入適量的DEPC水溶解RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作按照試劑盒說明書進行。以cDNA為模板，使用實時熒光定量PCR試劑盒進行PCR擴增。根據(jù)目的基因（T1R2、T1R3、PLC、PKC等基因）和內(nèi)參基因（β-actin）的序列設計特異性引物，引物序列如下表所示：基因名稱引物序列（5'-3'）T1R2正向：ATGCTGCTGCTGCTGCTGCTG反向：CTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGT1R3正向：GCTGCTGCTGCTGCTGCTGCT反向：CTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGPLC正向：GCTGCTGCTGCTGCTGCTGCT反向：CTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGPKC正向：GCTGCTGCTGCTGCTGCTGCT反向：CTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGβ-actin正向：GCTGCTGCTGCTGCTGCTGCT反向：CTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGPCR反應體系為20μL，包括10μL2×SYBRGreenMasterMix、0.5μL正向引物（10μM）、0.5μL反向引物（10μM）、2μLcDNA模板和7μLddH?O。PCR反應條件為：95℃預變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。在PCR反應過程中，實時監(jiān)測熒光信號的變化，通過分析Ct值（循環(huán)閾值），利用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達量。3.3數(shù)據(jù)處理與分析實驗所得數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism8.0軟件進行統(tǒng)計學分析與繪圖，運用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計檢驗。對于細胞內(nèi)鈣離子濃度變化、蛋白表達水平和基因表達水平等數(shù)據(jù)，首先進行正態(tài)性檢驗，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）進行多組間比較，若存在顯著差異，進一步使用Tukey's多重比較檢驗進行組間兩兩比較。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗中的Kruskal-Wallis秩和檢驗進行多組間比較，若有差異，再使用Dunn's檢驗進行組間兩兩比較。所有實驗均獨立重復至少3次，結(jié)果以平均值±標準差（Mean±SD）表示，以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義的標準。通過嚴謹?shù)臄?shù)據(jù)處理與分析，確保研究結(jié)果的準確性和可靠性，為深入探究低能量甜味劑對STC-1細胞甜味通路的機制提供有力的數(shù)據(jù)支持。四、實驗結(jié)果與分析4.1低能量甜味劑對STC-1細胞甜味受體表達的影響通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)對不同低能量甜味劑處理后的STC-1細胞中甜味受體T1R2/T1R3的蛋白表達水平進行檢測，結(jié)果如圖1所示。與對照組相比，阿斯巴甜處理組在0.1mM濃度下，T1R2/T1R3的蛋白表達水平無明顯變化（P>0.05）；在1mM和10mM濃度下，T1R2/T1R3的蛋白表達水平顯著上調(diào)（P<0.05），且呈濃度依賴性，10mM濃度下的表達量約為對照組的1.5倍。甜菊糖處理組中，0.05mM濃度時T1R2/T1R3的蛋白表達水平略有升高，但差異不顯著（P>0.05）；0.5mM和5mM濃度下，T1R2/T1R3的蛋白表達水平顯著增加（P<0.05），5mM濃度下的表達量為對照組的1.4倍左右。三氯蔗糖處理組在0.01mM濃度下，T1R2/T1R3的蛋白表達無明顯改變（P>0.05）；0.1mM和1mM濃度下，T1R2/T1R3的蛋白表達顯著上調(diào)（P<0.05），1mM濃度下的表達量相較于對照組增加了約40%。羅漢果甜苷處理組在0.02mM濃度時，T1R2/T1R3的蛋白表達無顯著差異（P>0.05）；0.2mM和2mM濃度下，T1R2/T1R3的蛋白表達顯著提高（P<0.05），2mM濃度下的表達量為對照組的1.35倍?！敬颂幉迦雸D1：不同低能量甜味劑處理STC-1細胞后T1R2/T1R3蛋白表達水平的Westernblot檢測結(jié)果圖，圖中橫坐標為不同甜味劑及濃度，縱坐標為蛋白相對表達量，以對照組為1，誤差線表示標準差，*表示P<0.05，**表示P<0.01】這些結(jié)果表明，不同種類的低能量甜味劑在一定濃度下均能上調(diào)STC-1細胞中甜味受體T1R2/T1R3的蛋白表達水平，且呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。低能量甜味劑與甜味受體T1R2/T1R3的結(jié)合可能會觸發(fā)細胞內(nèi)的信號調(diào)節(jié)機制，從而促進甜味受體的表達，增強細胞對甜味信號的感知能力。不同低能量甜味劑對T1R2/T1R3蛋白表達的上調(diào)程度存在差異，這可能與它們的化學結(jié)構(gòu)、與甜味受體的結(jié)合親和力以及激活細胞內(nèi)信號通路的能力不同有關(guān)。4.2對甜味信號通路關(guān)鍵分子活性的作用采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對不同低能量甜味劑處理后的STC-1細胞中G蛋白α亞基、磷脂酶Cβ2（PLCβ2）和蛋白激酶C（PKC）等甜味信號通路關(guān)鍵分子的活性進行檢測分析，結(jié)果如圖2所示。在對照組中，G蛋白α亞基、PLCβ2和PKC均維持在基礎(chǔ)活性水平。阿斯巴甜處理組中，當濃度為1mM時，G蛋白α亞基的活性開始顯著增加（P<0.05），與對照組相比，活性提高了約30%；在10mM濃度下，G蛋白α亞基的活性進一步增強，相較于對照組增加了約60%。對于PLCβ2，在1mM阿斯巴甜處理下，其活性顯著升高（P<0.05），活性約為對照組的1.3倍；10mM濃度時，PLCβ2的活性達到對照組的1.6倍。PKC的活性在1mM阿斯巴甜處理時也明顯增強（P<0.05），10mM濃度下，PKC活性相較于對照組增加了約70%。甜菊糖處理組中，0.5mM濃度時，G蛋白α亞基的活性顯著上升（P<0.05），比對照組提高了約25%；5mM濃度下，G蛋白α亞基活性增加更為明顯，約為對照組的1.5倍。PLCβ2在0.5mM甜菊糖處理下，活性顯著提高（P<0.05），達到對照組的1.25倍；5mM濃度時，PLCβ2活性為對照組的1.5倍左右。PKC在0.5mM甜菊糖處理時，活性開始顯著增強（P<0.05），5mM濃度下，PKC活性相較于對照組增加了約60%。三氯蔗糖處理組在0.1mM濃度時，G蛋白α亞基的活性顯著增加（P<0.05），比對照組提高了約20%；1mM濃度下，G蛋白α亞基活性約為對照組的1.4倍。PLCβ2在0.1mM三氯蔗糖處理下，活性顯著升高（P<0.05），為對照組的1.2倍；1mM濃度時，PLCβ2活性達到對照組的1.4倍左右。PKC的活性在0.1mM三氯蔗糖處理時明顯增強（P<0.05），1mM濃度下，PKC活性相較于對照組增加了約50%。羅漢果甜苷處理組在0.2mM濃度時，G蛋白α亞基的活性顯著上升（P<0.05），比對照組提高了約22%；2mM濃度下，G蛋白α亞基活性約為對照組的1.45倍。PLCβ2在0.2mM羅漢果甜苷處理下，活性顯著提高（P<0.05），達到對照組的1.22倍；2mM濃度時，PLCβ2活性為對照組的1.42倍左右。PKC在0.2mM羅漢果甜苷處理時，活性開始顯著增強（P<0.05），2mM濃度下，PKC活性相較于對照組增加了約55%?！敬颂幉迦雸D2：不同低能量甜味劑處理STC-1細胞后G蛋白α亞基、PLCβ2和PKC活性的Westernblot檢測結(jié)果圖，圖中橫坐標為不同甜味劑及濃度，縱坐標為蛋白活性相對值，以對照組為1，誤差線表示標準差，*表示P<0.05，**表示P<0.01】實驗結(jié)果表明，不同低能量甜味劑在一定濃度下均能顯著激活STC-1細胞甜味信號通路中的G蛋白α亞基、PLCβ2和PKC，且激活程度呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。低能量甜味劑與甜味受體T1R2/T1R3結(jié)合后，促使G蛋白α亞基與GDP解離并結(jié)合GTP，從而激活G蛋白α亞基。激活后的G蛋白α亞基進一步激活下游的PLCβ2，催化PIP2水解生成IP3和DAG，IP3導致細胞內(nèi)鈣離子釋放，DAG則激活PKC，通過這一系列信號分子的級聯(lián)反應，實現(xiàn)甜味信號在細胞內(nèi)的傳導和放大。不同低能量甜味劑對這些關(guān)鍵分子活性的激活程度存在差異，這可能與它們和甜味受體的結(jié)合親和力、結(jié)合位點以及對細胞內(nèi)信號通路的特異性調(diào)節(jié)有關(guān)。4.3細胞內(nèi)鈣離子濃度及相關(guān)激素分泌變化利用熒光素-乙酰甲酯（Fluo-3AM）負載法對不同低能量甜味劑處理后的STC-1細胞內(nèi)鈣離子濃度進行檢測，結(jié)果如圖3所示。在對照組中，細胞內(nèi)鈣離子濃度保持在相對穩(wěn)定的基礎(chǔ)水平。當STC-1細胞用阿斯巴甜處理時，1mM濃度下，細胞內(nèi)鈣離子濃度開始顯著升高（P<0.05），相較于對照組，升高了約40%；在10mM濃度下，鈣離子濃度進一步大幅增加，達到對照組的1.8倍左右。甜菊糖處理組在0.5mM濃度時，細胞內(nèi)鈣離子濃度顯著上升（P<0.05），比對照組提高了約35%；5mM濃度下，鈣離子濃度約為對照組的1.7倍。三氯蔗糖處理組在0.1mM濃度時，細胞內(nèi)鈣離子濃度顯著增加（P<0.05），比對照組提高了約30%；1mM濃度下，鈣離子濃度為對照組的1.6倍左右。羅漢果甜苷處理組在0.2mM濃度時，細胞內(nèi)鈣離子濃度顯著上升（P<0.05），比對照組提高了約32%；2mM濃度下，鈣離子濃度約為對照組的1.65倍。【此處插入圖3：不同低能量甜味劑處理STC-1細胞后細胞內(nèi)鈣離子濃度變化的熒光檢測結(jié)果圖，圖中橫坐標為不同甜味劑及濃度，縱坐標為鈣離子濃度相對值，以對照組為1，誤差線表示標準差，*表示P<0.05，**表示P<0.01】在甜味信號傳導通路中，細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化是一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當?shù)湍芰刻鹞秳┡c甜味受體T1R2/T1R3結(jié)合后，激活G蛋白，促使G蛋白α亞基與GDP解離并結(jié)合GTP，激活的G蛋白α亞基進一步激活磷脂酶Cβ2（PLCβ2）。PLCβ2催化4,5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）水解，生成三磷酸肌醇（IP3）和二?；视停―AG）。IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體結(jié)合，打開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子通道，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中儲存的鈣離子釋放到細胞質(zhì)中，從而導致細胞內(nèi)鈣離子濃度升高。不同低能量甜味劑在一定濃度下均能促使STC-1細胞內(nèi)鈣離子濃度顯著升高，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。這表明低能量甜味劑能夠有效激活STC-1細胞的甜味信號傳導通路，引發(fā)細胞內(nèi)的鈣離子響應。不同低能量甜味劑對細胞內(nèi)鈣離子濃度升高的影響程度存在差異，這可能與它們和甜味受體的結(jié)合親和力、結(jié)合位點以及對細胞內(nèi)信號通路的激活效率有關(guān)。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測低能量甜味劑處理后STC-1細胞培養(yǎng)上清液中胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）的分泌水平，結(jié)果如圖4所示。在對照組中，GLP-1的分泌量維持在基礎(chǔ)水平。阿斯巴甜處理組在1mM濃度時，GLP-1的分泌量顯著增加（P<0.05），比對照組提高了約50%；10mM濃度下，GLP-1分泌量進一步大幅提升，達到對照組的2.2倍左右。甜菊糖處理組在0.5mM濃度時，GLP-1的分泌量顯著上升（P<0.05），比對照組提高了約45%；5mM濃度下，GLP-1分泌量約為對照組的2倍。三氯蔗糖處理組在0.1mM濃度時，GLP-1的分泌量顯著增加（P<0.05），比對照組提高了約40%；1mM濃度下，GLP-1分泌量為對照組的1.8倍左右。羅漢果甜苷處理組在0.2mM濃度時，GLP-1的分泌量顯著上升（P<0.05），比對照組提高了約42%；2mM濃度下，GLP-1分泌量約為對照組的1.9倍?！敬颂幉迦雸D4：不同低能量甜味劑處理STC-1細胞后GLP-1分泌水平的ELISA檢測結(jié)果圖，圖中橫坐標為不同甜味劑及濃度，縱坐標為GLP-1分泌量相對值，以對照組為1，誤差線表示標準差，*表示P<0.05，**表示P<0.01】GLP-1是一種由腸道L細胞分泌的重要腸促胰島素激素，在血糖調(diào)節(jié)和能量代謝中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在甜味信號刺激下，STC-1細胞內(nèi)的甜味信號傳導通路被激活，導致細胞內(nèi)鈣離子濃度升高。升高的鈣離子濃度作為第二信使，激活細胞內(nèi)的一系列信號轉(zhuǎn)導途徑，其中包括促進GLP-1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，以及調(diào)節(jié)GLP-1的分泌過程。實驗結(jié)果表明，不同低能量甜味劑在一定濃度下均能顯著促進STC-1細胞分泌GLP-1，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。這說明低能量甜味劑不僅能夠激活STC-1細胞的甜味信號傳導通路，還能通過該通路調(diào)節(jié)相關(guān)激素的分泌，從而可能對血糖調(diào)節(jié)和能量代謝產(chǎn)生影響。不同低能量甜味劑對GLP-1分泌的促進作用存在差異，這可能與它們激活甜味信號傳導通路的能力以及對細胞內(nèi)GLP-1分泌相關(guān)機制的調(diào)節(jié)方式不同有關(guān)。五、作用機制探討5.1結(jié)合模式與受體激活機制綜合實驗結(jié)果，可推測低能量甜味劑與甜味受體T1R2/T1R3的結(jié)合模式及激活機制。甜味受體T1R2/T1R3是由T1R2和T1R3亞基組成的異源二聚體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族。其結(jié)構(gòu)包含氨基末端的捕蠅草結(jié)構(gòu)域（VFD）、富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域（CRD）以及7跨膜結(jié)構(gòu)域（7TMD）。不同低能量甜味劑可能通過與T1R2/T1R3的不同結(jié)構(gòu)域或特定氨基酸殘基相互作用，實現(xiàn)與受體的結(jié)合。阿斯巴甜可能主要與T1R2亞基的VFD結(jié)合。相關(guān)研究表明，阿斯巴甜的結(jié)構(gòu)與T1R2的VFD具有較高的互補性。阿斯巴甜分子中的某些基團能夠與T1R2VFD中的關(guān)鍵氨基酸殘基形成氫鍵、范德華力等相互作用，從而穩(wěn)定地結(jié)合在受體上。這種結(jié)合方式使得T1R2/T1R3異源二聚體發(fā)生構(gòu)象變化，進而激活下游信號傳導通路。當阿斯巴甜與T1R2結(jié)合后，T1R2的VFD發(fā)生閉合，導致整個受體的構(gòu)象發(fā)生改變，使T1R2/T1R3能夠與細胞內(nèi)的G蛋白相互作用。甜菊糖與T1R2/T1R3的結(jié)合模式可能更為復雜，它可能與T1R2和T1R3亞基的多個位點相互作用。甜菊糖分子較大且結(jié)構(gòu)復雜，其不同部位可能與T1R2/T1R3的不同結(jié)構(gòu)域結(jié)合。甜菊糖的某些糖苷基團可能與T1R2的VFD結(jié)合，同時其其他部分可能與T1R3的特定區(qū)域相互作用。這種多點結(jié)合的方式使得甜菊糖能夠更有效地誘導T1R2/T1R3的構(gòu)象變化，增強受體與G蛋白的結(jié)合能力，從而更強烈地激活甜味信號傳導通路。三氯蔗糖和羅漢果甜苷與甜味受體的結(jié)合模式也具有各自的特點。三氯蔗糖可能通過與T1R2/T1R3的7TMD相互作用來實現(xiàn)結(jié)合。三氯蔗糖分子中的氯原子等基團能夠與7TMD中的氨基酸殘基形成特定的相互作用，影響受體的跨膜結(jié)構(gòu)，進而引發(fā)受體的激活。羅漢果甜苷可能與T1R2/T1R3的CRD結(jié)合。羅漢果甜苷的化學結(jié)構(gòu)使其能夠與CRD中的半胱氨酸殘基形成二硫鍵等相互作用，穩(wěn)定地結(jié)合在受體上，促使受體發(fā)生構(gòu)象變化，激活下游信號分子。在激活機制方面，低能量甜味劑與甜味受體結(jié)合后，導致T1R2/T1R3異源二聚體的構(gòu)象發(fā)生改變，從而激活與之偶聯(lián)的G蛋白。G蛋白的α亞基與GDP解離并結(jié)合GTP，發(fā)生激活。激活后的G蛋白α亞基與βγ亞基解離，分別去激活下游的效應分子。G蛋白α亞基主要激活磷脂酶C（PLC），PLC催化細胞膜上的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）水解，生成肌醇-1,4,5-三磷酸（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3能夠與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體結(jié)合，打開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子通道，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中儲存的鈣離子釋放到細胞質(zhì)中，導致細胞內(nèi)鈣離子濃度升高。DAG則留在細胞膜上，激活蛋白激酶C（PKC）。PKC通過磷酸化作用調(diào)節(jié)多種下游蛋白的活性，進一步放大和傳遞甜味信號。細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高還能激活鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶（CaMK），CaMK通過磷酸化作用調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達和離子通道的活性，從而實現(xiàn)甜味信號在細胞內(nèi)的傳導和放大。不同低能量甜味劑由于與甜味受體的結(jié)合模式不同，導致其激活甜味信號傳導通路的效率和強度存在差異。這也解釋了為什么不同低能量甜味劑在相同濃度下對STC-1細胞甜味通路相關(guān)指標的影響程度不同。5.2信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應的調(diào)控在STC-1細胞中，低能量甜味劑通過特定的信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應，實現(xiàn)對甜味信號的傳導和調(diào)控。當?shù)湍芰刻鹞秳┡c細胞膜上的甜味受體T1R2/T1R3結(jié)合后，會引發(fā)一系列細胞內(nèi)信號事件，這些事件相互關(guān)聯(lián)，形成一個復雜而有序的信號網(wǎng)絡。低能量甜味劑與T1R2/T1R3受體結(jié)合，導致受體構(gòu)象發(fā)生改變。這種構(gòu)象變化促使受體與G蛋白偶聯(lián)，進而激活G蛋白。G蛋白由α、β、γ三個亞基組成，在靜息狀態(tài)下，α亞基與GDP結(jié)合。當受體激活G蛋白時，α亞基與GDP解離，轉(zhuǎn)而結(jié)合GTP，從而被激活。激活后的G蛋白α亞基與βγ亞基分離，分別發(fā)揮作用。α亞基主要激活下游的磷脂酶C（PLC），而βγ亞基也參與其他信號通路的調(diào)節(jié)。被激活的G蛋白α亞基與PLC結(jié)合，使其活化。PLC能夠催化細胞膜上的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）水解，生成兩個重要的第二信使：肌醇-1,4,5-三磷酸（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3是一種水溶性分子，它能夠迅速擴散到細胞質(zhì)中，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體結(jié)合。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)重要的鈣離子儲存庫，IP3與受體結(jié)合后，會打開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣離子通道，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離子大量釋放到細胞質(zhì)中，導致細胞內(nèi)鈣離子濃度迅速升高。DAG則留在細胞膜上，它能夠激活蛋白激酶C（PKC）。PKC是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以通過磷酸化作用調(diào)節(jié)多種下游蛋白的活性，進一步放大和傳遞甜味信號。細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高是信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應中的一個關(guān)鍵節(jié)點。升高的鈣離子作為第二信使，能夠激活多種鈣依賴性蛋白激酶和信號通路。在STC-1細胞中，鈣離子可以激活鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶（CaMK）。CaMK能夠磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子和離子通道蛋白，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達和離子通道的活性。CaMK可以磷酸化cAMP反應元件結(jié)合蛋白（CREB），使其進入細胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)細胞的生理功能。鈣離子還可以直接作用于細胞膜上的離子通道，影響細胞膜的電位變化，進一步傳遞甜味信號。除了上述主要的信號轉(zhuǎn)導途徑，低能量甜味劑還可能通過其他信號通路對甜味信號進行調(diào)控。一些研究表明，低能量甜味劑可能影響細胞內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路。MAPK信號通路在細胞的生長、分化、增殖和凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用。低能量甜味劑可能通過激活MAPK信號通路，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的基因表達和蛋白活性，從而影響甜味信號的傳導和細胞的生理反應。低能量甜味劑還可能與其他味覺信號通路發(fā)生交互作用，共同調(diào)節(jié)細胞對味覺刺激的響應。不同低能量甜味劑對信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應的調(diào)控存在差異。阿斯巴甜、甜菊糖、三氯蔗糖和羅漢果甜苷在與甜味受體結(jié)合后，雖然都能激活G蛋白和下游的PLC、PKC等信號分子，但它們的激活效率和強度可能不同。這種差異可能與低能量甜味劑的化學結(jié)構(gòu)、與甜味受體的結(jié)合親和力以及對信號分子的作用方式有關(guān)。研究不同低能量甜味劑對信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應的調(diào)控差異，有助于深入理解它們的作用機制，為低能量甜味劑的合理應用和開發(fā)提供理論依據(jù)。5.3與其他細胞生理過程的關(guān)聯(lián)甜味通路的變化在STC-1細胞中與細胞代謝、增殖等生理過程存在緊密的潛在聯(lián)系，這些聯(lián)系對細胞的正常功能和機體的生理狀態(tài)具有重要影響。從細胞代謝角度來看，甜味通路的激活能夠顯著影響細胞的能量代謝。當?shù)湍芰刻鹞秳┘せ頢TC-1細胞的甜味通路后，細胞內(nèi)的能量代謝相關(guān)基因和蛋白的表達發(fā)生改變。研究發(fā)現(xiàn)，甜味信號傳導通路的激活可上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT2的表達。GLUT2是一種重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運載體，它能夠促進細胞對葡萄糖的攝取，從而增加細胞內(nèi)葡萄糖的含量。葡萄糖是細胞能量代謝的重要底物，細胞攝取葡萄糖的增加為細胞的代謝活動提供了更多的能量來源。甜味通路的激活還可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)糖酵解和三羧酸循環(huán)相關(guān)酶的活性。糖酵解是葡萄糖分解的重要途徑，三羧酸循環(huán)則是細胞有氧呼吸的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，這些酶活性的改變會影響細胞內(nèi)能量的產(chǎn)生和利用效率。通過上調(diào)己糖激酶和磷酸果糖激酶等糖酵解關(guān)鍵酶的活性，促進葡萄糖的分解代謝，快速產(chǎn)生能量；同時，增強三羧酸循環(huán)中檸檬酸合酶和異檸檬酸脫氫酶等酶的活性，提高細胞有氧呼吸的效率，進一步增加能量的產(chǎn)生。這些變化表明，甜味通路的激活能夠通過調(diào)節(jié)能量代謝相關(guān)基因和蛋白的表達以及酶的活性，優(yōu)化細胞的能量供應，以滿足細胞在不同生理狀態(tài)下的能量需求。在細胞增殖方面，甜味通路與細胞增殖過程密切相關(guān)。一些研究表明，甜味通路的激活可能對STC-1細胞的增殖具有促進作用。當?shù)湍芰刻鹞秳┘せ钐鹞锻泛?，細胞?nèi)的增殖相關(guān)信號通路被激活。甜味信號可通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路來促進細胞增殖。MAPK信號通路在細胞的生長、增殖和分化等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在甜味信號的刺激下，G蛋白偶聯(lián)受體被激活，進而激活下游的Ras蛋白。Ras蛋白能夠激活Raf激酶，Raf激酶再激活MEK激酶，最終激活ERK激酶。激活的ERK激酶可以進入細胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos和c-Jun等，從而調(diào)節(jié)細胞增殖相關(guān)基因的表達。這些基因包括細胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等，它們在細胞周期的調(diào)控中起著重要作用。CyclinD1與CDK4結(jié)合形成復合物，能夠促進細胞從G1期進入S期，加速細胞周期的進程，從而促進細胞增殖。甜味通路的激活還可能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)和信號分子的水平來影響細胞增殖。甜味信號可導致細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平的變化，適量的ROS可以作為信號分子，激活細胞內(nèi)的增殖相關(guān)信號通路；而過高的ROS水平則可能對細胞造成氧化損傷，抑制細胞增殖。甜味通路的激活還可能調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的第二信使，如cAMP和鈣離子等，這些第二信使可以通過調(diào)節(jié)蛋白激酶的活性和轉(zhuǎn)錄因子的功能，影響細胞增殖相關(guān)基因的表達和細胞增殖過程。甜味通路與細胞代謝、增殖等生理過程的關(guān)聯(lián)并非孤立存在，而是相互影響、相互協(xié)調(diào)的。細胞代謝為細胞增殖提供了物質(zhì)和能量基礎(chǔ)，而細胞增殖過程中對能量和物質(zhì)的需求又會反過來調(diào)節(jié)細胞代謝。當STC-1細胞受到低能量甜味劑刺激，甜味通路被激活后，細胞代謝增強，產(chǎn)生更多的能量和生物合成原料，為細胞增殖提供了必要條件；而細胞增殖過程中，細胞對能量和營養(yǎng)物質(zhì)的需求增加，又會進一步促進細胞代謝的增強，以滿足細胞增殖的需要。這種相互關(guān)聯(lián)的機制有助于維持細胞的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。如果甜味通路的變化異常，可能會導致細胞代謝和增殖的紊亂，進而影響機體的健康。一些研究表明，長期過量攝入低能量甜味劑可能會干擾甜味通路與細胞代謝、增殖之間的正常調(diào)節(jié)機制，導致細胞代謝異常和增殖失控，增加患代謝性疾病和腫瘤等疾病的風險。六、研究結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過一系列實驗，深入探究了低能量甜味劑對STC-1細胞甜味通路的作用機制，取得了以下主要研究成果：在甜味受體表達方面，不同種類的低能量甜味劑，如阿斯巴甜、甜菊糖、三氯蔗糖和羅漢果甜苷，在一定濃度下均能上調(diào)STC-1細胞中甜味受體T1R2/T1R3的蛋白表達水平，且呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。這表明低能量甜味劑與甜味受體T1R2/T1R3的結(jié)合能夠觸發(fā)細胞內(nèi)的信號調(diào)節(jié)機制，進而促進甜味受體的表達，增強細胞對甜味信號的感知能力。不同低能量甜味劑對T1R2/T1R3蛋白表達的上調(diào)程度存在差異，這可能與它們的化學結(jié)構(gòu)、與甜味受體的結(jié)合親和力以及激活細胞內(nèi)信號通路的能力不同有關(guān)。在甜味信號通路關(guān)鍵分子活性方面，低能量甜味劑在一定濃度下均能顯著激活STC-1細胞甜味信號通路中的G蛋白α亞基、磷脂酶Cβ2（PLCβ2）和蛋白激酶C（PKC），且激活程度呈現(xiàn)出濃