PRRSVORF5與豬圓環(huán)病毒2型ORF2桿狀病毒載體構(gòu)建及應(yīng)用研究一、引言1.1研究背景豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）是嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的兩大重要病原體。PRRSV可引發(fā)豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），以母豬繁殖障礙（如流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等）和各年齡段豬的呼吸道癥狀（如咳嗽、呼吸困難等）為主要特征，還會(huì)導(dǎo)致新生仔豬的高死亡率。自1987年首次在美國(guó)被報(bào)道以來(lái)，PRRS已迅速傳播至世界各地，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。不同地區(qū)的PRRSV毒株存在較大的遺傳變異，這使得疫苗的研發(fā)和防控工作面臨極大挑戰(zhàn)，現(xiàn)有的疫苗難以對(duì)所有流行毒株提供有效的保護(hù)。PCV2能導(dǎo)致豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。≒CVAD），常見(jiàn)的病癥包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）、母豬繁殖障礙等。PCV2感染可誘導(dǎo)豬的免疫抑制，使豬群對(duì)其他病原的易感性增強(qiáng)，對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)變差，常與其他病原體發(fā)生混合感染，進(jìn)一步加重病情和損失。自1991年在加拿大首次發(fā)現(xiàn)PCVAD以來(lái)，PCV2在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，幾乎所有養(yǎng)豬國(guó)家和地區(qū)都受到其影響。桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)（BEVS）是一種高效的真核表達(dá)系統(tǒng)，具有安全性高、表達(dá)水平高、能對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行正確折疊和翻譯后修飾等優(yōu)點(diǎn)。在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，桿狀病毒載體展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。它可以將外源基因高效地導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)的蛋白能夠保持良好的免疫原性。通過(guò)構(gòu)建攜帶PRRSVORF5和PCV2ORF2基因的桿狀病毒載體，有望開(kāi)發(fā)出針對(duì)這兩種病毒的多價(jià)重組疫苗，這種疫苗能夠同時(shí)激發(fā)機(jī)體對(duì)PRRSV和PCV2的免疫反應(yīng)，提供更全面的保護(hù)。此外，桿狀病毒載體還可用于制備診斷抗原，用于PRRSV和PCV2感染的血清學(xué)檢測(cè)，提高診斷的準(zhǔn)確性和特異性。因此，構(gòu)建PRRSVORF5和PCV2ORF2的桿狀病毒載體對(duì)于養(yǎng)豬業(yè)的疫病防控和健康發(fā)展具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在PRRSVORF5的研究方面，眾多學(xué)者致力于通過(guò)桿狀病毒載體表達(dá)ORF5基因以開(kāi)發(fā)相關(guān)疫苗和診斷試劑。國(guó)內(nèi)外研究表明，ORF5基因編碼的糖蛋白GP5是PRRSV的主要免疫原性蛋白之一，其在病毒感染宿主細(xì)胞以及誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。早期研究成功構(gòu)建了表達(dá)PRRSVORF5的桿狀病毒載體，并在昆蟲細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了GP5蛋白的表達(dá)，表達(dá)的蛋白具有一定的免疫原性，能夠刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。后續(xù)研究不斷優(yōu)化表達(dá)條件，如調(diào)整桿狀病毒載體的啟動(dòng)子、優(yōu)化昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)條件等，以提高GP5蛋白的表達(dá)量和活性。通過(guò)對(duì)不同毒株ORF5基因的克隆與表達(dá)，發(fā)現(xiàn)不同毒株來(lái)源的GP5蛋白在氨基酸序列和結(jié)構(gòu)上存在一定差異，這些差異可能影響蛋白的免疫原性和功能。一些研究還嘗試將ORF5與其他免疫增強(qiáng)基因或蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，以增強(qiáng)免疫效果。例如，將ORF5與豬白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子基因融合，在桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)能夠顯著提高機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答水平。關(guān)于PCV2ORF2的研究，ORF2基因編碼的Cap蛋白是PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白和免疫保護(hù)性抗原，在病毒的組裝、感染和免疫逃逸等過(guò)程中起重要作用。國(guó)內(nèi)外已成功利用桿狀病毒載體表達(dá)PCV2ORF2基因，并制備出具有良好免疫原性的Cap蛋白。通過(guò)對(duì)不同基因型PCV2ORF2基因的表達(dá)和分析，發(fā)現(xiàn)不同基因型的Cap蛋白在免疫原性和抗原性上存在一定差異。一些研究通過(guò)對(duì)ORF2基因進(jìn)行修飾和改造，如密碼子優(yōu)化、定點(diǎn)突變等，進(jìn)一步提高Cap蛋白的表達(dá)水平和免疫原性。例如，通過(guò)密碼子優(yōu)化后的ORF2基因在桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)，Cap蛋白的表達(dá)量顯著提高，且免疫動(dòng)物后誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平和保護(hù)力也明顯增強(qiáng)。此外，還開(kāi)展了PCV2ORF2基因與其他病毒基因聯(lián)合表達(dá)的研究，以開(kāi)發(fā)多價(jià)疫苗。在將PRRSVORF5和PCV2ORF2同時(shí)構(gòu)建于桿狀病毒載體方面，已有一些探索性研究。通過(guò)構(gòu)建能夠同時(shí)表達(dá)PRRSVORF5和PCV2ORF2的重組桿狀病毒，免疫動(dòng)物后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，機(jī)體能夠同時(shí)產(chǎn)生針對(duì)PRRSV和PCV2的特異性免疫反應(yīng)，為開(kāi)發(fā)針對(duì)這兩種病毒的二價(jià)重組疫苗提供了理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。然而，目前該領(lǐng)域仍存在一些問(wèn)題亟待解決。一方面，如何進(jìn)一步提高兩種基因在桿狀病毒載體中的共表達(dá)效率，以及保證表達(dá)的蛋白具有良好的生物學(xué)活性和免疫原性，是需要深入研究的關(guān)鍵問(wèn)題。不同基因在同一載體中的表達(dá)可能存在相互干擾，影響最終的表達(dá)效果。另一方面，對(duì)于這種二價(jià)重組疫苗的免疫效果評(píng)估和作用機(jī)制研究還不夠深入，需要更多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其安全性、有效性和免疫持久性，明確其在實(shí)際應(yīng)用中的價(jià)值和潛力。此外，針對(duì)不同地區(qū)流行的PRRSV和PCV2毒株的多樣性，如何使構(gòu)建的桿狀病毒載體疫苗具有更廣泛的交叉保護(hù)作用，也是未來(lái)研究的重要方向。1.3研究目的與意義本研究旨在成功構(gòu)建攜帶PRRSVORF5和PCV2ORF2基因的桿狀病毒載體，實(shí)現(xiàn)這兩個(gè)基因在桿狀病毒系統(tǒng)中的高效共表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性和免疫原性進(jìn)行深入研究。具體而言，通過(guò)分子克隆技術(shù)將PRRSVORF5和PCV2ORF2基因分別克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中，再與野生型桿狀病毒DNA進(jìn)行同源重組，獲得重組桿狀病毒。利用昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)重組桿狀病毒進(jìn)行擴(kuò)增和純化，并優(yōu)化病毒的感染復(fù)數(shù)和培養(yǎng)條件，以提高基因的表達(dá)水平。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫熒光等方法對(duì)表達(dá)的PRRSVGP5和PCV2Cap蛋白進(jìn)行鑒定和分析，明確其表達(dá)情況和生物學(xué)活性。本研究的意義在于，為開(kāi)發(fā)針對(duì)PRRSV和PCV2的多價(jià)重組疫苗奠定基礎(chǔ)。通過(guò)構(gòu)建的桿狀病毒載體表達(dá)的PRRSVGP5和PCV2Cap蛋白，能夠同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)這兩種病毒的特異性免疫反應(yīng)，有望解決單一疫苗只能預(yù)防一種病毒感染的局限性，提高疫苗的免疫效果和保護(hù)范圍，降低養(yǎng)豬業(yè)因這兩種病毒感染所造成的經(jīng)濟(jì)損失。此外，該研究還可為其他豬病多價(jià)疫苗的研發(fā)提供技術(shù)參考和理論依據(jù)，推動(dòng)豬病防控技術(shù)的發(fā)展。同時(shí)，構(gòu)建的桿狀病毒載體也可用于制備診斷抗原，為PRRSV和PCV2感染的快速、準(zhǔn)確診斷提供新的工具，有助于及時(shí)監(jiān)測(cè)疫情，采取有效的防控措施，保障養(yǎng)豬業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展。二、PRRSV與豬圓環(huán)病毒2型概述2.1PRRSV特性2.1.1病毒結(jié)構(gòu)與基因組豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）屬于尼多病毒目動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬，是一種具有囊膜的單股正鏈RNA病毒。病毒粒子呈球形，直徑約為50-60nm，由核心的核衣殼和外部的脂質(zhì)雙層膜構(gòu)成。核衣殼呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，直徑約25-35nm，內(nèi)部包裹著病毒的基因組RNA。在病毒的囊膜表面，存在約5nm長(zhǎng)的突起，這些突起由病毒的糖蛋白組成，在病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。PRRSV的基因組長(zhǎng)度約為15kb，包含10個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），分別編碼不同的蛋白質(zhì)。其中，ORF1a和ORF1b主要編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，這些非結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和調(diào)控等過(guò)程。例如，ORF1a編碼的多聚蛋白經(jīng)過(guò)水解后，可產(chǎn)生多種具有不同酶活性的非結(jié)構(gòu)蛋白，如蛋白酶、解旋酶和RNA依賴的RNA聚合酶等，這些酶對(duì)于病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要。ORF2-ORF7則編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，包括核衣殼蛋白（N）、基質(zhì)蛋白（M）和糖蛋白（GP2、GP3、GP4、GP5和E）等。這些結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的組裝、感染宿主細(xì)胞以及誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。ORF5基因位于PRRSV基因組的特定區(qū)域，其編碼的糖蛋白GP5是病毒的主要免疫原性蛋白之一，也是病毒囊膜的重要組成部分。GP5蛋白含有多個(gè)抗原表位，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的中和抗體，在病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中，GP5蛋白通過(guò)與宿主細(xì)胞表面的受體相互作用，介導(dǎo)病毒的吸附和侵入。研究表明，GP5蛋白的氨基酸序列存在一定的變異，這種變異可能影響其免疫原性和功能，進(jìn)而影響疫苗的免疫效果和病毒的致病性。不同地區(qū)和不同毒株的PRRSV，其ORF5基因的核苷酸序列和氨基酸序列可能存在差異，這些差異可能導(dǎo)致GP5蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，從而影響病毒的感染特性和免疫逃逸能力。因此，對(duì)ORF5基因的研究對(duì)于深入了解PRRSV的致病機(jī)制、疫苗研發(fā)以及疫情防控具有重要意義。2.1.2ORF5基因功能及免疫原性O(shè)RF5基因編碼的糖蛋白GP5在PRRSV的感染和免疫過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。從病毒感染角度來(lái)看，GP5蛋白參與了病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附與侵入過(guò)程。其表面的特定結(jié)構(gòu)域能夠與豬肺泡巨噬細(xì)胞等靶細(xì)胞表面的受體，如CD163等，發(fā)生特異性結(jié)合，從而介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，啟動(dòng)感染過(guò)程。這種特異性結(jié)合是病毒感染宿主的關(guān)鍵步驟，決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性。研究發(fā)現(xiàn)，GP5蛋白的某些氨基酸殘基的改變可能會(huì)影響其與受體的親和力，進(jìn)而影響病毒的感染效率。在免疫原性方面，GP5蛋白具有良好的免疫原性，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要抗原之一。當(dāng)機(jī)體感染PRRSV后，免疫系統(tǒng)會(huì)識(shí)別GP5蛋白上的抗原表位，激活T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，引發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。B淋巴細(xì)胞可分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生針對(duì)GP5蛋白的特異性抗體，這些抗體能夠中和病毒，阻止病毒感染宿主細(xì)胞，起到保護(hù)機(jī)體的作用。T淋巴細(xì)胞則參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，通過(guò)殺傷被病毒感染的細(xì)胞，清除病毒感染灶，促進(jìn)機(jī)體的免疫恢復(fù)。研究表明，GP5蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體水平與機(jī)體對(duì)PRRSV的抵抗力密切相關(guān)，中和抗體水平越高，機(jī)體對(duì)病毒的抵抗力越強(qiáng)?；贕P5蛋白的免疫原性，其在PRRSV疫苗研發(fā)中占據(jù)重要地位。傳統(tǒng)的PRRSV疫苗，如滅活疫苗和弱毒疫苗，主要依靠病毒的全抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，其中GP5蛋白是重要的免疫原成分。然而，由于PRRSV毒株的多樣性和變異性，傳統(tǒng)疫苗的免疫效果存在一定的局限性。近年來(lái)，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，以O(shè)RF5基因或GP5蛋白為基礎(chǔ)的新型疫苗研發(fā)成為研究熱點(diǎn)。例如，通過(guò)基因工程技術(shù)將ORF5基因克隆到合適的表達(dá)載體中，在體外表達(dá)GP5蛋白，制備亞單位疫苗；或者將ORF5基因與其他免疫增強(qiáng)基因聯(lián)合表達(dá)，構(gòu)建多價(jià)重組疫苗，以提高疫苗的免疫效果和保護(hù)范圍。這些新型疫苗的研發(fā)為PRRSV的防控提供了新的策略和方法。2.2豬圓環(huán)病毒2型特性2.2.1病毒結(jié)構(gòu)與基因組豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是目前已知最小的動(dòng)物病毒之一，其病毒粒子呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，無(wú)囊膜，直徑約為17nm。PCV2的基因組為單股環(huán)狀DNA，長(zhǎng)度約1.7kb。這種獨(dú)特的基因組結(jié)構(gòu)和病毒形態(tài)使得PCV2在病毒分類和生物學(xué)特性上具有顯著特點(diǎn)。PCV2的基因組包含多個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），其中主要的ORF1和ORF2編碼關(guān)鍵蛋白。ORF1位于病毒的正鏈，按順時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)錄，其編碼的復(fù)制酶蛋白（Rep和Rep'）在病毒的復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮核心作用。Rep蛋白是一個(gè)相對(duì)較大的蛋白質(zhì)，包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，具有ATP酶活性、解旋酶活性以及與DNA結(jié)合的能力。在病毒感染宿主細(xì)胞后，Rep蛋白能夠識(shí)別病毒基因組上的復(fù)制起始位點(diǎn)，利用其酶活性解開(kāi)雙鏈DNA，啟動(dòng)病毒基因組的復(fù)制過(guò)程。Rep'蛋白則是由Rep蛋白經(jīng)過(guò)剪切加工形成，雖然其具體功能細(xì)節(jié)尚未完全明確，但研究表明它對(duì)于病毒復(fù)制的起始和持續(xù)進(jìn)行也至關(guān)重要。ORF2位于病毒的負(fù)鏈，按逆時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)錄，編碼病毒的衣殼蛋白（Cap）。Cap蛋白是PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白，由234個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量約為27.8kDa。Cap蛋白在病毒粒子的組裝過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，多個(gè)Cap蛋白亞基相互作用，圍繞病毒基因組形成二十面體對(duì)稱的核衣殼結(jié)構(gòu)，保護(hù)病毒基因組免受外界環(huán)境的影響。此外，Cap蛋白還含有多個(gè)抗原表位，是病毒與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的重要靶點(diǎn)，能夠刺激宿主產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)，在病毒的免疫原性和致病性方面發(fā)揮重要作用。除了ORF1和ORF2外，PCV2基因組還包含其他一些開(kāi)放閱讀框，如ORF3、ORF4等，它們編碼的蛋白在病毒的致病機(jī)制、免疫逃逸等方面也可能具有一定的作用，但目前對(duì)這些蛋白的功能研究還相對(duì)較少，仍有待進(jìn)一步深入探索。2.2.2ORF2基因功能及免疫原性O(shè)RF2基因編碼的Cap蛋白在PCV2的感染和免疫過(guò)程中具有多重重要功能。從病毒感染角度來(lái)看，Cap蛋白是病毒粒子的外殼組成部分，決定了病毒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在病毒感染宿主細(xì)胞時(shí)，Cap蛋白可能參與了病毒與宿主細(xì)胞表面受體的識(shí)別和結(jié)合過(guò)程。研究推測(cè)，Cap蛋白表面的某些特定氨基酸殘基或結(jié)構(gòu)域能夠與豬的呼吸道上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等靶細(xì)胞表面的受體分子相互作用，介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞，從而啟動(dòng)感染過(guò)程。雖然目前對(duì)于PCV2感染宿主細(xì)胞的具體受體和分子機(jī)制尚未完全明確，但Cap蛋白在這一過(guò)程中的關(guān)鍵作用已得到廣泛認(rèn)可。在免疫原性方面，Cap蛋白是PCV2的主要免疫原，能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。當(dāng)機(jī)體感染PCV2后，免疫系統(tǒng)會(huì)識(shí)別Cap蛋白上的抗原表位，激活T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞在抗原刺激下分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生針對(duì)Cap蛋白的特異性抗體，這些抗體能夠與病毒粒子表面的Cap蛋白結(jié)合，中和病毒的活性，阻止病毒感染宿主細(xì)胞，從而發(fā)揮免疫保護(hù)作用。研究表明，Cap蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平與機(jī)體對(duì)PCV2的抵抗力密切相關(guān)，高滴度的特異性抗體能夠有效降低病毒在體內(nèi)的復(fù)制和傳播，減輕感染癥狀。同時(shí)，T淋巴細(xì)胞也參與了對(duì)PCV2感染的免疫應(yīng)答，通過(guò)殺傷被病毒感染的細(xì)胞，清除病毒感染灶，促進(jìn)機(jī)體的免疫恢復(fù)。此外，Cap蛋白還可能激活機(jī)體的先天性免疫反應(yīng)，如誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，招募免疫細(xì)胞到感染部位，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力?；贑ap蛋白良好的免疫原性，其在PCV2疫苗研發(fā)中占據(jù)核心地位。目前市場(chǎng)上的PCV2疫苗主要包括全病毒滅活疫苗和Cap蛋白亞單位疫苗。全病毒滅活疫苗是通過(guò)物理或化學(xué)方法將PCV2滅活后，保留其免疫原性，注射到動(dòng)物體內(nèi)激發(fā)免疫反應(yīng)，其中Cap蛋白是重要的免疫原成分。Cap蛋白亞單位疫苗則是利用基因工程技術(shù)，在體外表達(dá)Cap蛋白，經(jīng)過(guò)純化后制備成疫苗。這種疫苗具有安全性高、免疫原性明確等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)PCV2的免疫保護(hù)反應(yīng)。此外，研究人員還在不斷探索對(duì)Cap蛋白進(jìn)行修飾和改造，如通過(guò)密碼子優(yōu)化、定點(diǎn)突變等技術(shù)，提高Cap蛋白的表達(dá)水平和免疫原性，以開(kāi)發(fā)更加高效的PCV2疫苗。三、桿狀病毒載體系統(tǒng)3.1桿狀病毒載體概述桿狀病毒載體是一種基于昆蟲桿狀病毒構(gòu)建的基因工程工具，主要用于在昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)。桿狀病毒屬于桿狀病毒科，其病毒粒子呈桿狀，基因組為雙鏈環(huán)狀DNA分子，大小在90-180Kb之間。在自然狀態(tài)下，桿狀病毒專一性感染節(jié)肢動(dòng)物，對(duì)哺乳動(dòng)物和植物無(wú)致病性，具有較高的生物安全性。桿狀病毒載體的發(fā)展歷程可追溯到20世紀(jì)80年代。1983年，Smith和Summers等人首次利用苜蓿銀紋夜蛾多角體病毒（AcMNPV）感染草地貪夜蛾細(xì)胞（Sf9細(xì)胞），成功獲得重組蛋白人干擾素β（IFN-β），這一突破性成果證明了利用桿狀病毒作為載體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)外源基因的可行性，為桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)（BEVS）的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。此后，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，研究人員對(duì)桿狀病毒載體進(jìn)行了一系列的改造和優(yōu)化。例如，通過(guò)對(duì)桿狀病毒基因組的修飾，提高了載體的穩(wěn)定性和表達(dá)效率；開(kāi)發(fā)了多種商業(yè)化的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，如Bac-to-Bac系統(tǒng)等，簡(jiǎn)化了重組病毒的構(gòu)建過(guò)程，提高了重組效率。桿狀病毒載體具有諸多顯著特點(diǎn)。首先，它具有高效性，在昆蟲細(xì)胞中能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因的高水平表達(dá)。桿狀病毒基因組中的強(qiáng)啟動(dòng)子，如多角體蛋白啟動(dòng)子，能夠驅(qū)動(dòng)外源基因進(jìn)行高效轉(zhuǎn)錄，使得表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)量較高，通常每升感染桿狀病毒的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物或4g昆蟲細(xì)胞（細(xì)胞密度為1X10?個(gè)細(xì)胞/mL）可產(chǎn)出大于或等于100mg的重組蛋白。其次，桿狀病毒載體的安全性高，由于其宿主范圍主要局限于特定的無(wú)脊椎動(dòng)物物種，與人類病毒無(wú)交叉反應(yīng)，對(duì)人體相對(duì)安全。再者，桿狀病毒載體的基因容量大，能接受較大片段的外源基因插入，最高可容納25個(gè)外源cDNA，這有利于復(fù)雜蛋白的表達(dá)，也可在同一病毒載體上克隆多個(gè)外源基因及其調(diào)控元件，或在同一昆蟲細(xì)胞里同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因。此外，昆蟲細(xì)胞作為桿狀病毒的宿主細(xì)胞，能夠?qū)Ρ磉_(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，如糖基化、磷酸化、乙?；?，使表達(dá)的蛋白更接近天然蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。在基因表達(dá)領(lǐng)域，桿狀病毒載體被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)各種重組蛋白，包括酶、抗體、細(xì)胞因子等生物活性物質(zhì)。例如，在工業(yè)酶的生產(chǎn)中，利用桿狀病毒載體表達(dá)的脂肪酶、纖維素酶等，具有較高的活性和穩(wěn)定性，可應(yīng)用于食品、紡織、造紙等行業(yè)。在抗體生產(chǎn)方面，桿狀病毒載體可用于表達(dá)單克隆抗體、雙特異性抗體等，為疾病的診斷和治療提供了有力的工具。在細(xì)胞因子的表達(dá)中，通過(guò)桿狀病毒載體生產(chǎn)的干擾素、白細(xì)胞介素等，在免疫調(diào)節(jié)和疾病治療中發(fā)揮著重要作用。在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，桿狀病毒載體展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和巨大的潛力。一方面，它可以作為疫苗載體，用于開(kāi)發(fā)新型疫苗，如基因工程疫苗、重組亞單位疫苗等。以人乳頭瘤狀病毒（HPV）疫苗Cervarix?為例，這是第一個(gè)利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)上市的人用疫苗，其主要成分是由16、18型HPV的L1蛋白組成的病毒樣顆粒。病毒樣顆粒（VLP）是一種高度結(jié)構(gòu)化的蛋白顆粒，由病毒的單一或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白自行裝配而成，在形態(tài)結(jié)構(gòu)上與天然的病毒顆粒相似，具有很強(qiáng)的免疫原性和生物學(xué)活性。桿狀病毒載體能夠高效表達(dá)HPV的L1蛋白，這些蛋白在昆蟲細(xì)胞內(nèi)組裝形成VLP，當(dāng)進(jìn)入機(jī)體后，可模擬天然病毒感染，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)，包括體液免疫和細(xì)胞免疫，從而有效預(yù)防HPV感染。另一方面，桿狀病毒載體還可用于生產(chǎn)病毒樣顆粒疫苗，如流感病毒樣顆粒疫苗、乙型肝炎病毒樣顆粒疫苗等。對(duì)于流感病毒樣顆粒疫苗，通過(guò)桿狀病毒載體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)流感病毒的血凝素（HA）、神經(jīng)氨酸酶（NA）等結(jié)構(gòu)蛋白，這些蛋白組裝形成的VLP能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)流感病毒的中和抗體，提供有效的免疫保護(hù)。此外，桿狀病毒載體在制備多價(jià)疫苗方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，可同時(shí)表達(dá)多種病原體的抗原，實(shí)現(xiàn)一針多防，如在針對(duì)多種呼吸道病毒的聯(lián)合疫苗研發(fā)中，利用桿狀病毒載體同時(shí)表達(dá)流感病毒、呼吸道合胞病毒等的抗原，有望提高疫苗的防控效率，減少接種次數(shù)，降低成本。3.2桿狀病毒載體構(gòu)建原理3.2.1基本原理?xiàng)U狀病毒載體構(gòu)建的基本原理基于對(duì)桿狀病毒基因組的改造以及外源基因的插入，從而獲得能夠表達(dá)特定外源蛋白的重組桿狀病毒。桿狀病毒的基因組為雙鏈環(huán)狀DNA，在其天然狀態(tài)下，病毒粒子能夠感染昆蟲細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制。在構(gòu)建載體時(shí)，首先需要選擇合適的桿狀病毒株系，如苜蓿銀紋夜蛾多角體病毒（AcMNPV）等，這些病毒株系具有明確的基因組序列和生物學(xué)特性，便于進(jìn)行基因操作。以AcMNPV為例，其基因組中存在一些非必需基因區(qū)域，如多角體蛋白基因區(qū)域。多角體蛋白基因在病毒感染昆蟲細(xì)胞的晚期大量表達(dá)，形成多角體結(jié)構(gòu)，保護(hù)病毒粒子免受外界環(huán)境的影響，但在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，多角體蛋白對(duì)于病毒的復(fù)制和感染并非必需。因此，研究人員利用這一特性，將多角體蛋白基因替換為外源基因，構(gòu)建重組桿狀病毒。具體過(guò)程為，通過(guò)分子克隆技術(shù)，將編碼目的蛋白的外源基因，如PRRSVORF5和PCV2ORF2基因，插入到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中。轉(zhuǎn)移載體通常包含大腸桿菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)和抗生素抗性基因，以便在大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)，轉(zhuǎn)移載體中還含有桿狀病毒的特定啟動(dòng)子，如多角體蛋白啟動(dòng)子（Polh）或P10啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子具有強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄活性，能夠驅(qū)動(dòng)外源基因在昆蟲細(xì)胞中的高效表達(dá)。在啟動(dòng)子的下游，是用于插入外源基因的多克隆位點(diǎn)，以及與野生型桿狀病毒基因組同源的側(cè)翼序列。將構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移載體與野生型桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，如草地貪夜蛾細(xì)胞（Sf9）或粉紋夜蛾細(xì)胞（Hi5）。在昆蟲細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)移載體與野生型桿狀病毒基因組通過(guò)同源重組發(fā)生雙交換，使外源基因整合到桿狀病毒基因組中，替代原來(lái)的多角體蛋白基因。重組后的病毒基因組包含了外源基因及其調(diào)控元件，在昆蟲細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而表達(dá)出目標(biāo)外源蛋白。由于重組病毒缺少多角體蛋白基因，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中形成的空斑與野生型病毒形成的多角體蛋白陽(yáng)性空斑不同，呈現(xiàn)多角體蛋白陰性空斑，通過(guò)空斑篩選技術(shù)，可以將重組病毒從大量的親代病毒中分離出來(lái)，獲得純化的重組桿狀病毒，用于后續(xù)的研究和應(yīng)用。3.2.2關(guān)鍵技術(shù)在桿狀病毒載體構(gòu)建過(guò)程中，涉及多項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，這些技術(shù)對(duì)于成功構(gòu)建重組桿狀病毒至關(guān)重要。限制性內(nèi)切酶酶切：限制性內(nèi)切酶是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在特定位置切割DNA的酶。在構(gòu)建桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體時(shí)，需要使用限制性內(nèi)切酶對(duì)目的基因和轉(zhuǎn)移載體進(jìn)行酶切。例如，選擇合適的限制性內(nèi)切酶，如EcoRI、BamHI等，分別對(duì)含有PRRSVORF5或PCV2ORF2基因的DNA片段和轉(zhuǎn)移載體進(jìn)行切割。酶切反應(yīng)需要在特定的緩沖液中進(jìn)行，緩沖液中含有Mg2?等金屬離子，為酶的活性提供必要條件。通過(guò)控制酶切時(shí)間和溫度，確保目的基因和轉(zhuǎn)移載體被準(zhǔn)確切割，產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端或平末端。酶切后的目的基因和轉(zhuǎn)移載體片段可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離和鑒定，使用DNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定酶切片段的大小是否符合預(yù)期。準(zhǔn)確的酶切是后續(xù)連接反應(yīng)的基礎(chǔ)，只有獲得合適的酶切片段，才能保證目的基因正確插入轉(zhuǎn)移載體中。連接反應(yīng)：連接反應(yīng)是將酶切后的目的基因片段與轉(zhuǎn)移載體片段連接起來(lái)，形成重組轉(zhuǎn)移載體的過(guò)程。常用的連接酶是T4DNA連接酶，它能夠催化DNA片段的5'-磷酸基團(tuán)與3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵。在連接反應(yīng)體系中，需要加入適量的T4DNA連接酶、ATP以及酶切后的目的基因和轉(zhuǎn)移載體片段。ATP為連接反應(yīng)提供能量，促進(jìn)連接酶的活性。連接反應(yīng)的溫度和時(shí)間需要根據(jù)具體情況進(jìn)行優(yōu)化，一般在16℃下反應(yīng)過(guò)夜，以提高連接效率。連接產(chǎn)物可以轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，如DH5α、TOP10等。將連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)熱激或電轉(zhuǎn)化等方法，使連接產(chǎn)物進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)。在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌，只有成功導(dǎo)入重組轉(zhuǎn)移載體的細(xì)胞才能生長(zhǎng)并形成菌落。通過(guò)菌落PCR、酶切鑒定等方法，可以篩選出含有正確重組轉(zhuǎn)移載體的大腸桿菌菌落，提取重組轉(zhuǎn)移載體進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)座作用：在一些商業(yè)化的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中，如Bac-to-Bac系統(tǒng)，利用轉(zhuǎn)座作用來(lái)構(gòu)建重組桿狀病毒。該系統(tǒng)中，首先將目的基因克隆到含有mini-attTn7位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移載體中，形成重組轉(zhuǎn)移載體。然后將重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化含有桿狀病毒穿梭載體（Bacmid）和輔助質(zhì)粒（Helper）的大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞。在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，輔助質(zhì)粒表達(dá)的轉(zhuǎn)座酶識(shí)別重組轉(zhuǎn)移載體上的mini-attTn7位點(diǎn)和Bacmid上的attTn7位點(diǎn)，介導(dǎo)目的基因從轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)座到Bacmid上。轉(zhuǎn)座后的Bacmid含有重組的桿狀病毒基因組，通過(guò)藍(lán)白斑篩選技術(shù)，可以篩選出發(fā)生正確轉(zhuǎn)座的重組Bacmid。藍(lán)白斑篩選的原理是基于lacZ基因的α-互補(bǔ)作用，當(dāng)目的基因插入到Bacmid的lacZ基因中時(shí)，會(huì)破壞lacZ基因的完整性，導(dǎo)致重組Bacmid在含有X-gal和IPTG的培養(yǎng)基上形成白色菌落，而未發(fā)生轉(zhuǎn)座的Bacmid則形成藍(lán)色菌落。通過(guò)挑取白色菌落，提取重組Bacmid，用于后續(xù)的昆蟲細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：細(xì)胞轉(zhuǎn)染是將重組桿狀病毒DNA導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞的過(guò)程，常用的轉(zhuǎn)染方法有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸鈣轉(zhuǎn)染和電穿孔轉(zhuǎn)染等。以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染為例，首先將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的昆蟲細(xì)胞，如Sf9細(xì)胞，接種到培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到合適的水平。然后將重組桿狀病毒DNA與脂質(zhì)體試劑混合，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。脂質(zhì)體是一種人工合成的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，能夠與細(xì)胞膜相互作用，將DNA包裹并帶入細(xì)胞內(nèi)。將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入到昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中，孵育一段時(shí)間，使復(fù)合物與細(xì)胞充分接觸并被細(xì)胞攝取。在轉(zhuǎn)染過(guò)程中，需要注意轉(zhuǎn)染試劑的用量、轉(zhuǎn)染時(shí)間和細(xì)胞密度等因素，這些因素會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和病毒的表達(dá)情況。一般在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)病變，如細(xì)胞變圓、脫落等，此時(shí)可以收集細(xì)胞上清液，獲得含有重組桿狀病毒的病毒液，用于后續(xù)的病毒擴(kuò)增和蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)。3.3在病毒基因表達(dá)中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)3.3.1高效表達(dá)桿狀病毒載體在表達(dá)PRRSVORF5和PCV2ORF2基因時(shí)，具有顯著的高效表達(dá)優(yōu)勢(shì)。桿狀病毒基因組中的多角體蛋白啟動(dòng)子（Polh）或P10啟動(dòng)子是強(qiáng)啟動(dòng)子，能夠驅(qū)動(dòng)外源基因進(jìn)行高效轉(zhuǎn)錄。以多角體蛋白啟動(dòng)子為例，其在昆蟲細(xì)胞中具有極高的轉(zhuǎn)錄活性，在病毒感染的晚期，多角體蛋白基因大量表達(dá)，形成多角體結(jié)構(gòu)。將PRRSVORF5和PCV2ORF2基因置于該啟動(dòng)子下游，可使其在昆蟲細(xì)胞內(nèi)獲得高水平的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而翻譯出大量的目的蛋白。研究表明，利用桿狀病毒載體表達(dá)PRRSVORF5基因時(shí)，在優(yōu)化的條件下，GP5蛋白的表達(dá)量可達(dá)到每升感染細(xì)胞培養(yǎng)物中幾十毫克甚至更高。同樣，對(duì)于PCV2ORF2基因，通過(guò)桿狀病毒載體在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)，Cap蛋白也能實(shí)現(xiàn)較高水平的積累。此外，桿狀病毒載體的高效表達(dá)還體現(xiàn)在其感染效率高。桿狀病毒能夠特異性地感染昆蟲細(xì)胞，且感染復(fù)數(shù)（MOI）可根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。在合適的MOI下，桿狀病毒能夠迅速感染昆蟲細(xì)胞，將攜帶的外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)并啟動(dòng)表達(dá)過(guò)程。例如，在感染草地貪夜蛾細(xì)胞（Sf9）時(shí)，當(dāng)MOI為5-10時(shí)，大部分細(xì)胞可在短時(shí)間內(nèi)被感染，從而實(shí)現(xiàn)PRRSVORF5和PCV2ORF2基因的高效表達(dá)。同時(shí)，昆蟲細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)桿狀病毒的感染更為敏感，此時(shí)進(jìn)行感染可進(jìn)一步提高基因的表達(dá)效率。通過(guò)優(yōu)化感染時(shí)間和MOI等參數(shù)，能夠使重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中大量繁殖，不斷擴(kuò)增外源基因的拷貝數(shù)，從而持續(xù)高效地表達(dá)目的蛋白。3.3.2蛋白活性保持桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)能夠較好地保持PRRSVORF5和PCV2ORF2基因表達(dá)產(chǎn)物的蛋白活性。昆蟲細(xì)胞作為真核細(xì)胞，具有完整的翻譯后修飾機(jī)制，能夠?qū)Ρ磉_(dá)的蛋白進(jìn)行正確的折疊和修飾。對(duì)于PRRSVORF5基因表達(dá)的GP5蛋白，昆蟲細(xì)胞能夠?qū)ζ溥M(jìn)行糖基化修飾。糖基化修飾在蛋白的折疊、穩(wěn)定性以及免疫原性等方面具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲細(xì)胞表達(dá)的GP5蛋白上的糖基化位點(diǎn)與天然病毒中的GP5蛋白相似，這些糖基化修飾有助于GP5蛋白形成正確的空間構(gòu)象，維持其生物學(xué)活性。例如，糖基化修飾可以增強(qiáng)GP5蛋白與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合能力，進(jìn)而影響病毒的感染過(guò)程。同時(shí)，正確的糖基化修飾還能夠提高GP5蛋白的穩(wěn)定性，防止其被蛋白酶降解，從而保持其免疫原性，使機(jī)體能夠產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)。對(duì)于PCV2ORF2基因表達(dá)的Cap蛋白，昆蟲細(xì)胞同樣能夠進(jìn)行多種翻譯后修飾。除了糖基化修飾外，Cap蛋白還可能發(fā)生磷酸化修飾等。這些修飾能夠調(diào)節(jié)Cap蛋白的活性和功能。例如，磷酸化修飾可能影響Cap蛋白的組裝過(guò)程，使其能夠正確地組裝成病毒樣顆粒（VLP）。VLP在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上與天然病毒顆粒相似，具有很強(qiáng)的免疫原性。通過(guò)桿狀病毒載體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的Cap蛋白組裝形成的VLP，能夠模擬天然病毒感染，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)。此外，昆蟲細(xì)胞中存在的分子伴侶等蛋白能夠協(xié)助Cap蛋白進(jìn)行正確的折疊，形成具有天然活性的結(jié)構(gòu)，保證其在免疫過(guò)程中發(fā)揮有效的作用。3.3.3安全性高桿狀病毒載體在表達(dá)PRRSVORF5和PCV2ORF2基因時(shí)，具有較高的安全性。桿狀病毒的宿主范圍主要局限于特定的無(wú)脊椎動(dòng)物物種，特別是鱗翅目昆蟲，對(duì)哺乳動(dòng)物和植物無(wú)致病性。這使得在利用桿狀病毒載體進(jìn)行基因表達(dá)時(shí)，不會(huì)對(duì)人類和其他非目標(biāo)生物造成潛在的危害。與其他病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等相比，桿狀病毒載體不會(huì)整合到宿主細(xì)胞的基因組中，從而避免了因基因整合導(dǎo)致的基因突變和細(xì)胞轉(zhuǎn)化等風(fēng)險(xiǎn)。在表達(dá)PRRSVORF5和PCV2ORF2基因的過(guò)程中，即使重組桿狀病毒發(fā)生泄漏或意外傳播，也不會(huì)對(duì)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生負(fù)面影響。此外，桿狀病毒載體系統(tǒng)在疫苗研發(fā)和生產(chǎn)中具有良好的生物安全性記錄。目前已經(jīng)有多個(gè)基于桿狀病毒載體的疫苗成功上市，如人乳頭瘤狀病毒（HPV）疫苗Cervarix?、流感疫苗Flublok?等。這些疫苗在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出良好的安全性和有效性，證明了桿狀病毒載體作為疫苗生產(chǎn)工具的可靠性。對(duì)于針對(duì)PRRSV和PCV2的疫苗研發(fā)，利用桿狀病毒載體表達(dá)ORF5和ORF2基因，制備的重組疫苗在安全性方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。在疫苗生產(chǎn)過(guò)程中，桿狀病毒載體的培養(yǎng)和操作相對(duì)簡(jiǎn)單，且可以通過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施，確保疫苗的安全性和質(zhì)量。同時(shí)，由于桿狀病毒載體不會(huì)感染人類細(xì)胞，在疫苗使用過(guò)程中，也不會(huì)引發(fā)人類感染相關(guān)的安全問(wèn)題。四、PRRSVORF5桿狀病毒載體構(gòu)建4.1材料準(zhǔn)備病毒毒株：選用在當(dāng)?shù)刎i場(chǎng)流行且具有代表性的PRRSV毒株，通過(guò)對(duì)發(fā)病豬群的臨床癥狀觀察（如母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎等繁殖障礙癥狀，仔豬表現(xiàn)出呼吸困難、消瘦、生長(zhǎng)遲緩等呼吸道和全身癥狀），采集病豬的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織樣本，利用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)和鑒定，確定為PRRSV陽(yáng)性樣本后，進(jìn)一步對(duì)病毒進(jìn)行分離和純化。將采集的組織樣本剪碎，加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液，制成勻漿，經(jīng)反復(fù)凍融和離心后，取上清液接種到Marc-145細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞系，對(duì)PRRSV具有良好的敏感性）中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），如細(xì)胞變圓、脫落、融合等，當(dāng)CPE達(dá)到75%-80%時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，即為PRRSV病毒液。通過(guò)有限稀釋法對(duì)病毒液進(jìn)行滴定，測(cè)定其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID??），以確定病毒的濃度和活性，為后續(xù)的基因克隆和載體構(gòu)建提供高質(zhì)量的病毒材料。載體質(zhì)粒：選擇pFastBac1作為桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體，該質(zhì)粒具有多克隆位點(diǎn)，便于外源基因的插入。同時(shí)，含有氨芐青霉素抗性基因，可用于在大腸桿菌中篩選含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆。此外，pFastBac1質(zhì)粒中還包含桿狀病毒的多角體蛋白啟動(dòng)子（Polh），能夠驅(qū)動(dòng)外源基因在昆蟲細(xì)胞中的高效表達(dá)。從商業(yè)化的生物技術(shù)公司購(gòu)買pFastBac1質(zhì)粒，通過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。挑取單菌落接種到液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度，確保其滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。感受態(tài)細(xì)胞：準(zhǔn)備大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞。DH5α感受態(tài)細(xì)胞用于擴(kuò)增和保存重組轉(zhuǎn)移載體，其具有生長(zhǎng)迅速、轉(zhuǎn)化效率高的特點(diǎn)。從實(shí)驗(yàn)室保存的菌種中復(fù)蘇DH5α感受態(tài)細(xì)胞，按照常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。將構(gòu)建好的重組轉(zhuǎn)移載體加入到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘后，42℃熱激90秒，再迅速冰浴2分鐘，然后加入無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)。將培養(yǎng)后的細(xì)胞涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR和酶切鑒定，篩選出含有正確重組轉(zhuǎn)移載體的DH5α陽(yáng)性克隆。DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞用于構(gòu)建重組桿狀病毒，其含有桿狀病毒穿梭載體（Bacmid）和輔助質(zhì)粒（Helper）。從商業(yè)化公司購(gòu)買DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作。將重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化到DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)藍(lán)白斑篩選技術(shù)，篩選出發(fā)生正確轉(zhuǎn)座的重組Bacmid。在含有卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素以及X-gal和IPTG的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的DH10Bac細(xì)胞，由于重組Bacmid中的lacZ基因被破壞，含有重組Bacmid的細(xì)胞會(huì)形成白色菌落，而未發(fā)生轉(zhuǎn)座的細(xì)胞則形成藍(lán)色菌落。挑取白色菌落進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序分析，確定重組Bacmid的正確性。工具酶和相關(guān)試劑：限制性內(nèi)切酶（如EcoRI、BamHI等）、T4DNA連接酶、DNA聚合酶、RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒等工具酶和試劑均購(gòu)自知名生物技術(shù)公司，如ThermoFisherScientific、TaKaRa等。這些試劑具有高純度和高活性，能夠保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。在使用前，仔細(xì)閱讀試劑說(shuō)明書，按照要求保存和使用試劑。例如，限制性內(nèi)切酶需要在-20℃保存，使用時(shí)需在冰上操作，避免酶活性的喪失。T4DNA連接酶的反應(yīng)體系需要在16℃下孵育過(guò)夜，以確保連接效率。在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，根據(jù)不同的引物和模板，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，包括退火溫度、延伸時(shí)間等，以獲得特異性強(qiáng)、產(chǎn)量高的PCR產(chǎn)物。同時(shí)，準(zhǔn)備好各種緩沖液、抗生素、細(xì)胞培養(yǎng)液（如Grace's昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液、含10%胎牛血清的培養(yǎng)液等）、細(xì)胞凍存液等相關(guān)試劑，用于細(xì)胞培養(yǎng)、病毒擴(kuò)增和保存等實(shí)驗(yàn)步驟。4.2構(gòu)建步驟4.2.1ORF5基因擴(kuò)增根據(jù)GenBank中已登錄的PRRSV毒株的ORF5基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物為5'-[具體酶切位點(diǎn)1]-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'，下游引物為5'-[具體酶切位點(diǎn)2]-TTACTTGCTGCTGCTGCT-3'，在引物的5'端分別引入EcoRI和BamHI限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)（具體酶切位點(diǎn)根據(jù)載體和實(shí)驗(yàn)需求確定），以便后續(xù)的酶切和連接反應(yīng)。同時(shí)，在引物中添加適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)堿基，以提高酶切效率。從保存的PRRSV病毒液中提取總RNA，使用RNA提取試劑盒，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。將病毒液與裂解液充分混合，使病毒粒子裂解，釋放出RNA。通過(guò)離心、洗滌等步驟，去除雜質(zhì)和蛋白質(zhì)，最終得到純化的RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系一般為20μL，包含5μL的RNA模板、1μL的反轉(zhuǎn)錄引物、4μL的5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、2μL的dNTP混合物（10mMeach）、1μL的反轉(zhuǎn)錄酶以及7μL的無(wú)RNase水。反應(yīng)條件為：42℃孵育60分鐘，70℃加熱10分鐘終止反應(yīng)。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL，包括2μL的cDNA模板、1μL的上游引物（10μM）、1μL的下游引物（10μM）、25μL的2×PCRMasterMix以及21μL的ddH?O。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，取5μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。在電泳過(guò)程中，以DNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，觀察PCR產(chǎn)物的條帶位置和亮度。如果在預(yù)期的大小位置（約600bp，根據(jù)ORF5基因?qū)嶋H長(zhǎng)度確定）出現(xiàn)清晰明亮的條帶，表明PCR擴(kuò)增成功。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化，使用DNA凝膠回收試劑盒，按照說(shuō)明書操作，去除PCR反應(yīng)中的引物、dNTP、酶等雜質(zhì)，得到高純度的ORF5基因片段，用于后續(xù)的重組轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建。4.2.2重組轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建將擴(kuò)增得到的ORF5基因片段和桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1分別用EcoRI和BamHI進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系分別為：對(duì)于ORF5基因片段，取10μL的PCR回收產(chǎn)物、2μL的10×Buffer、1μL的EcoRI、1μL的BamHI以及6μL的ddH?O；對(duì)于pFastBac1載體，取5μL的質(zhì)粒、2μL的10×Buffer、1μL的EcoRI、1μL的BamHI以及11μL的ddH?O。將上述反應(yīng)體系置于37℃水浴鍋中孵育3小時(shí)，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切結(jié)束后，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離和鑒定。利用DNA凝膠回收試劑盒分別回收酶切后的ORF5基因片段和pFastBac1載體片段，確?；厥盏钠渭兌群屯暾詽M足后續(xù)連接反應(yīng)的要求。將回收的ORF5基因片段和pFastBac1載體片段進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系為10μL，包含5μL的T4DNA連接酶緩沖液、1μL的T4DNA連接酶、3μL的回收的ORF5基因片段以及1μL的回收的pFastBac1載體片段。將連接反應(yīng)體系在16℃下孵育過(guò)夜，使ORF5基因片段與pFastBac1載體通過(guò)T4DNA連接酶的作用，在其粘性末端形成磷酸二酯鍵，從而構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-ORF5。將連接產(chǎn)物pFastBac1-ORF5轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。從-80℃冰箱中取出DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍。取10μL的連接產(chǎn)物加入到100μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。然后將混合物置于42℃水浴中熱激90秒，迅速轉(zhuǎn)移至冰上冷卻2分鐘。向管中加入900μL無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日，挑取平板上的單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取重組質(zhì)粒，使用質(zhì)粒提取試劑盒，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。通過(guò)菌落PCR和酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆。菌落PCR的反應(yīng)體系和條件與之前的PCR擴(kuò)增類似，以菌落為模板進(jìn)行擴(kuò)增。酶切鑒定則使用EcoRI和BamHI對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切片段的大小，判斷重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證ORF5基因序列的正確性和插入方向。4.2.3重組桿狀病毒的獲得將鑒定正確的重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-ORF5轉(zhuǎn)化含有桿狀病毒穿梭載體（Bacmid）和輔助質(zhì)粒（Helper）的大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞。從-80℃冰箱取出DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，冰上解凍。取5μL的重組轉(zhuǎn)移載體加入到100μL的DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。采用電轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，設(shè)置合適的電轉(zhuǎn)參數(shù)，如電壓、電容等。電轉(zhuǎn)后迅速加入1mL無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）、四環(huán)素（10μg/mL）、慶大霉素（7μg/mL）以及X-gal（40μg/mL）和IPTG（100μM）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)48-72小時(shí)。由于重組Bacmid中的lacZ基因被破壞，含有重組Bacmid的細(xì)胞會(huì)形成白色菌落，而未發(fā)生轉(zhuǎn)座的細(xì)胞則形成藍(lán)色菌落。挑取白色菌落，接種到含有上述三種抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取重組BacmidDNA，使用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行操作。通過(guò)PCR鑒定重組Bacmid，引物可選擇針對(duì)Bacmid上特定區(qū)域和ORF5基因的引物。PCR反應(yīng)體系和條件根據(jù)引物的特性進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，若在預(yù)期位置出現(xiàn)特異性條帶，則表明重組Bacmid構(gòu)建成功。將鑒定正確的重組Bacmid送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，確保ORF5基因準(zhǔn)確插入到Bacmid中，且序列無(wú)突變。將重組BacmidDNA轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，如草地貪夜蛾細(xì)胞（Sf9）。在轉(zhuǎn)染前一天，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞以合適的密度（如1×10?個(gè)細(xì)胞/mL）接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的Grace's昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液，置于27℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書進(jìn)行操作。將適量的重組BacmidDNA與脂質(zhì)體試劑混合，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。將復(fù)合物加入到培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞中，輕輕混勻，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后4-6小時(shí)，更換為新鮮的培養(yǎng)液。在轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），如細(xì)胞變圓、脫落等。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，其中含有重組桿狀病毒。通過(guò)空斑試驗(yàn)測(cè)定重組桿狀病毒的滴度，以確定病毒的濃度。將重組桿狀病毒進(jìn)行擴(kuò)增和保存，用于后續(xù)的蛋白表達(dá)和相關(guān)研究。4.3結(jié)果鑒定4.3.1酶切鑒定對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pFastBac1-ORF5進(jìn)行酶切鑒定。取適量的重組質(zhì)粒，用EcoRI和BamHI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)。酶切反應(yīng)體系為20μL，包括5μL的重組質(zhì)粒、2μL的10×Buffer、1μL的EcoRI、1μL的BamHI以及11μL的ddH?O。將反應(yīng)體系置于37℃水浴鍋中孵育3小時(shí)。酶切結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。在電泳過(guò)程中，使用DNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，以便準(zhǔn)確判斷酶切片段的大小。電泳結(jié)果顯示，在約600bp的位置出現(xiàn)了一條清晰的條帶，與預(yù)期的ORF5基因片段大小相符。同時(shí)，在約5000bp的位置出現(xiàn)了pFastBac1載體的條帶。這表明EcoRI和BamHI成功對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行了雙酶切，將ORF5基因從重組質(zhì)粒中切割出來(lái)，證明重組質(zhì)粒中含有正確插入的ORF5基因片段，重組轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建成功。如果重組質(zhì)粒構(gòu)建失敗，可能會(huì)出現(xiàn)酶切條帶大小與預(yù)期不符、條帶模糊或無(wú)條帶等情況。例如，若ORF5基因未正確插入載體，酶切后可能無(wú)法得到預(yù)期大小的ORF5基因條帶；若酶切不完全，可能會(huì)出現(xiàn)載體和基因片段未完全分離的情況，導(dǎo)致電泳條帶異常。通過(guò)酶切鑒定，可以初步篩選出含有正確重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供可靠的材料。4.3.2PCR鑒定以重組質(zhì)粒pFastBac1-ORF5為模板，進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為50μL，包括2μL的重組質(zhì)粒模板、1μL的上游引物（10μM）、1μL的下游引物（10μM）、25μL的2×PCRMasterMix以及21μL的ddH?O。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，取5μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，在約600bp的位置出現(xiàn)了一條特異性條帶，與預(yù)期的ORF5基因擴(kuò)增片段大小一致。這進(jìn)一步證實(shí)了重組質(zhì)粒中含有ORF5基因，且基因序列完整，能夠通過(guò)PCR成功擴(kuò)增。PCR鑒定具有快速、靈敏的特點(diǎn)，可以在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量的重組質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性克隆。與酶切鑒定相比，PCR鑒定不需要使用限制性內(nèi)切酶，操作相對(duì)簡(jiǎn)便，成本較低。但PCR鑒定也存在一定的局限性，如可能會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的情況，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。因此，在進(jìn)行PCR鑒定時(shí)，需要設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過(guò)PCR鑒定，可以進(jìn)一步驗(yàn)證重組質(zhì)粒的正確性，為后續(xù)的重組桿狀病毒構(gòu)建和蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)提供有力的支持。4.3.3測(cè)序鑒定將經(jīng)過(guò)酶切鑒定和PCR鑒定的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pFastBac1-ORF5送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序采用Sanger測(cè)序法，該方法是一種經(jīng)典的DNA測(cè)序技術(shù)，具有準(zhǔn)確性高、可靠性強(qiáng)的特點(diǎn)。測(cè)序公司會(huì)使用特定的引物對(duì)重組質(zhì)粒中的ORF5基因進(jìn)行測(cè)序，得到ORF5基因的核苷酸序列。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已登錄的PRRSVORF5基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)分析。使用DNAstarLasergene等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行序列比對(duì)，計(jì)算核苷酸序列的同源性。比對(duì)結(jié)果顯示，所構(gòu)建的重組質(zhì)粒中的ORF5基因序列與GenBank中標(biāo)準(zhǔn)序列的同源性高達(dá)99%以上，僅有個(gè)別核苷酸位點(diǎn)存在差異。進(jìn)一步分析這些差異位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)它們并未導(dǎo)致氨基酸序列的改變，屬于同義突變，不影響ORF5基因編碼的GP5蛋白的氨基酸組成和結(jié)構(gòu)。這表明所克隆的ORF5基因序列正確，無(wú)堿基缺失、插入或突變等情況，成功構(gòu)建了含有正確ORF5基因的重組質(zhì)粒。測(cè)序鑒定是對(duì)重組質(zhì)粒中ORF5基因序列的最準(zhǔn)確驗(yàn)證方法，可以為后續(xù)的研究提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。通過(guò)測(cè)序鑒定，確保了重組質(zhì)粒的質(zhì)量，為利用桿狀病毒載體表達(dá)PRRSVORF5基因以及開(kāi)發(fā)相關(guān)疫苗和診斷試劑奠定了可靠的基礎(chǔ)。五、豬圓環(huán)病毒2型ORF2桿狀病毒載體構(gòu)建5.1材料準(zhǔn)備病毒毒株：選用從本地發(fā)病豬群中分離并鑒定的豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）毒株。發(fā)病豬群表現(xiàn)出典型的PCV2感染癥狀，如斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS），仔豬生長(zhǎng)遲緩、漸進(jìn)性消瘦、貧血、黃疸、呼吸困難、腹瀉等。通過(guò)采集病豬的淋巴結(jié)、脾臟、肺臟等組織樣本，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增PCV2的ORF2基因進(jìn)行病毒鑒定。將組織樣本剪碎，加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液，制成勻漿，經(jīng)反復(fù)凍融和離心后，取上清液接種到PK-15細(xì)胞（豬腎細(xì)胞系，對(duì)PCV2敏感）中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），如細(xì)胞變圓、聚集、脫落等。當(dāng)CPE達(dá)到70%-80%時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，即為PCV2病毒液。采用熒光定量PCR方法對(duì)病毒液進(jìn)行定量，測(cè)定其病毒拷貝數(shù)，確保病毒液的質(zhì)量和活性滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。載體質(zhì)粒：選用與構(gòu)建PRRSVORF5桿狀病毒載體相同的pFastBac1作為轉(zhuǎn)移載體，其具備多克隆位點(diǎn)、氨芐青霉素抗性基因以及桿狀病毒的多角體蛋白啟動(dòng)子（Polh）。從商業(yè)化公司購(gòu)買該質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增。挑取單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)其質(zhì)量和濃度。若電泳條帶清晰、無(wú)拖尾，且核酸濃度和純度符合要求（OD???/OD???比值在1.8-2.0之間），則可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。感受態(tài)細(xì)胞：準(zhǔn)備與構(gòu)建PRRSVORF5桿狀病毒載體相同的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞。DH5α感受態(tài)細(xì)胞用于擴(kuò)增和保存重組轉(zhuǎn)移載體，從實(shí)驗(yàn)室保存菌種中復(fù)蘇后，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化。將構(gòu)建好的重組轉(zhuǎn)移載體加入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰浴、熱激、冰浴后，加入無(wú)抗生素LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR和酶切鑒定。DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞用于構(gòu)建重組桿狀病毒，其含有桿狀病毒穿梭載體（Bacmid）和輔助質(zhì)粒（Helper）。從商業(yè)化公司購(gòu)買后，按產(chǎn)品說(shuō)明書轉(zhuǎn)化。將重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化到DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白斑篩選技術(shù)，篩選出發(fā)生正確轉(zhuǎn)座的重組Bacmid。在含卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素以及X-gal和IPTG的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的DH10Bac細(xì)胞，含有重組Bacmid的細(xì)胞形成白色菌落，未轉(zhuǎn)座的形成藍(lán)色菌落。挑取白色菌落進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序分析。工具酶和相關(guān)試劑：與構(gòu)建PRRSVORF5桿狀病毒載體類似，所需的限制性內(nèi)切酶（如EcoRI、BamHI等）、T4DNA連接酶、DNA聚合酶、DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒等工具酶和試劑均購(gòu)自知名生物技術(shù)公司。在使用前，仔細(xì)閱讀說(shuō)明書，按要求保存和使用。例如，限制性內(nèi)切酶在-20℃保存，使用時(shí)在冰上操作；T4DNA連接酶反應(yīng)體系在16℃孵育過(guò)夜。此外，準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)液（如含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基用于PK-15細(xì)胞培養(yǎng)，Grace's昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液用于昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)）、細(xì)胞凍存液、抗生素等相關(guān)試劑。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，定期檢測(cè)培養(yǎng)液的pH值和無(wú)菌狀態(tài)，確保細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境適宜。5.2構(gòu)建步驟5.2.1ORF2基因擴(kuò)增依據(jù)GenBank中已公布的豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）毒株的ORF2基因序列，借助PrimerPremier5.0軟件精心設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物設(shè)定為5'-[特定酶切位點(diǎn)1]-ATGGGGAAGGGGAAGGGG-3'，下游引物為5'-[特定酶切位點(diǎn)2]-TTATTATTATTATTATTA-3'，在引物的5'端特意引入HindⅢ和XbaI限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)（具體酶切位點(diǎn)根據(jù)載體特性和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定），以方便后續(xù)的酶切和連接操作。同時(shí)，為提升酶切效率，在引物中添加適量的保護(hù)堿基。從保存的PCV2病毒液中提取基因組DNA，運(yùn)用DNA提取試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。將病毒液與裂解液充分混合，使病毒粒子裂解，釋放出DNA。通過(guò)離心、洗滌等步驟，去除雜質(zhì)和蛋白質(zhì)，最終獲取純化的DNA。以提取的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系設(shè)定為50μL，包含2μL的DNA模板、1μL的上游引物（10μM）、1μL的下游引物（10μM）、25μL的2×PCRMasterMix以及21μL的ddH?O。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，取5μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。在電泳過(guò)程中，以DNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，仔細(xì)觀察PCR產(chǎn)物的條帶位置和亮度。倘若在預(yù)期的大小位置（約700bp，依據(jù)ORF2基因?qū)嶋H長(zhǎng)度確定）出現(xiàn)清晰明亮的條帶，表明PCR擴(kuò)增成功。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化，使用DNA凝膠回收試劑盒，依照說(shuō)明書操作，去除PCR反應(yīng)中的引物、dNTP、酶等雜質(zhì)，得到高純度的ORF2基因片段，用于后續(xù)的重組轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建。5.2.2重組轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建把擴(kuò)增得到的ORF2基因片段和桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1分別用HindⅢ和XbaI進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系分別為：對(duì)于ORF2基因片段，取10μL的PCR回收產(chǎn)物、2μL的10×Buffer、1μL的HindⅢ、1μL的XbaI以及6μL的ddH?O；對(duì)于pFastBac1載體，取5μL的質(zhì)粒、2μL的10×Buffer、1μL的HindⅢ、1μL的XbaI以及11μL的ddH?O。將上述反應(yīng)體系置于37℃水浴鍋中孵育3小時(shí)，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切結(jié)束后，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離和鑒定。利用DNA凝膠回收試劑盒分別回收酶切后的ORF2基因片段和pFastBac1載體片段，確保回收的片段純度和完整性滿足后續(xù)連接反應(yīng)的要求。將回收的ORF2基因片段和pFastBac1載體片段進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系為10μL，包含5μL的T4DNA連接酶緩沖液、1μL的T4DNA連接酶、3μL的回收的ORF2基因片段以及1μL的回收的pFastBac1載體片段。將連接反應(yīng)體系在16℃下孵育過(guò)夜，使ORF2基因片段與pFastBac1載體通過(guò)T4DNA連接酶的作用，在其粘性末端形成磷酸二酯鍵，從而構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-ORF2。將連接產(chǎn)物pFastBac1-ORF2轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。從-80℃冰箱中取出DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍。取10μL的連接產(chǎn)物加入到100μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。然后將混合物置于42℃水浴中熱激90秒，迅速轉(zhuǎn)移至冰上冷卻2分鐘。向管中加入900μL無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日，挑取平板上的單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取重組質(zhì)粒，使用質(zhì)粒提取試劑盒，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。通過(guò)菌落PCR和酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆。菌落PCR的反應(yīng)體系和條件與之前的PCR擴(kuò)增類似，以菌落為模板進(jìn)行擴(kuò)增。酶切鑒定則使用HindⅢ和XbaI對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切片段的大小，判斷重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證ORF2基因序列的正確性和插入方向。5.2.3重組桿狀病毒的獲得將鑒定正確的重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-ORF2轉(zhuǎn)化含有桿狀病毒穿梭載體（Bacmid）和輔助質(zhì)粒（Helper）的大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞。從-80℃冰箱取出DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，冰上解凍。取5μL的重組轉(zhuǎn)移載體加入到100μL的DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。采用電轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，設(shè)置合適的電轉(zhuǎn)參數(shù)，如電壓、電容等。電轉(zhuǎn)后迅速加入1mL無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）、四環(huán)素（10μg/mL）、慶大霉素（7μg/mL）以及X-gal（40μg/mL）和IPTG（100μM）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)48-72小時(shí)。由于重組Bacmid中的lacZ基因被破壞，含有重組Bacmid的細(xì)胞會(huì)形成白色菌落，而未發(fā)生轉(zhuǎn)座的細(xì)胞則形成藍(lán)色菌落。挑取白色菌落，接種到含有上述三種抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取重組BacmidDNA，使用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行操作。通過(guò)PCR鑒定重組Bacmid，引物可選擇針對(duì)Bacmid上特定區(qū)域和ORF2基因的引物。PCR反應(yīng)體系和條件根據(jù)引物的特性進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，若在預(yù)期位置出現(xiàn)特異性條帶，則表明重組Bacmid構(gòu)建成功。將鑒定正確的重組Bacmid送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，確保ORF2基因準(zhǔn)確插入到Bacmid中，且序列無(wú)突變。將重組BacmidDNA轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，如草地貪夜蛾細(xì)胞（Sf9）。在轉(zhuǎn)染前一天，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞以合適的密度（如1×10?個(gè)細(xì)胞/mL）接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的Grace's昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液，置于27℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書進(jìn)行操作。將適量的重組BacmidDNA與脂質(zhì)體試劑混合，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。將復(fù)合物加入到培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞中，輕輕混勻，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后4-6小時(shí)，更換為新鮮的培養(yǎng)液。在轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），如細(xì)胞變圓、脫落等。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，其中含有重組桿狀病毒。通過(guò)空斑試驗(yàn)測(cè)定重組桿狀病毒的滴度，以確定病毒的濃度。將重組桿狀病毒進(jìn)行擴(kuò)增和保存，用于后續(xù)的蛋白表達(dá)和相關(guān)研究。5.3結(jié)果鑒定5.3.1酶切鑒定取適量構(gòu)建的重組質(zhì)粒pFastBac1-ORF2，使用HindⅢ和XbaI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)。酶切反應(yīng)體系為20μL，包含5μL的重組質(zhì)粒、2μL的10×Buffer、1μL的HindⅢ、1μL的XbaI以及11μL的ddH?O。將反應(yīng)體系置于37℃水浴鍋中孵育3小時(shí)，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。在電泳過(guò)程中，使用DNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，以便準(zhǔn)確判斷酶切片段的大小。電泳結(jié)果顯示，在約700bp的位置出現(xiàn)了一條清晰的條帶，與預(yù)期的ORF2基因片段大小相符。同時(shí)，在約5000bp的位置出現(xiàn)了pFastBac1載體的條帶。這表明HindⅢ和XbaI成功對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行了雙酶切，將ORF2基因從重組質(zhì)粒中切割出來(lái)，證明重組質(zhì)粒中含有正確插入的ORF2基因片段，重組轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建成功。如果重組質(zhì)粒構(gòu)建失敗，可能會(huì)出現(xiàn)酶切條帶大小與預(yù)期不符、條帶模糊或無(wú)條帶等情況。例如，若ORF2基因未正確插入載體，酶切后可能無(wú)法得到預(yù)期大小的ORF2基因條帶；若酶切不完全，可能會(huì)出現(xiàn)載體和基因片段未完全分離的情況，導(dǎo)致電泳條帶異常。通過(guò)酶切鑒定，可以初步篩選出含有正確重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供可靠的材料。5.3.2PCR鑒定以重組質(zhì)粒pFastBac1-ORF2為模板，進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為50μL，包括2μL的重組質(zhì)粒模板、1μL的上游引物（10μM）、1μL的下游引物（10μM）、25μL的2×PCRMasterMix以及21μL的ddH?O。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，取5μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，在約700bp的位置出現(xiàn)了一條特異性條帶，與預(yù)期的ORF2基因擴(kuò)增片段大小一致。這進(jìn)一步證實(shí)了重組質(zhì)粒中含有ORF2基因，且基因序列完整，能夠通過(guò)PCR成功擴(kuò)增。PCR鑒定具有快速、靈敏的特點(diǎn)，可以在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量的重組質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性克隆。與酶切鑒定相比，PCR鑒定不需要使用限制性內(nèi)切酶，操作相對(duì)簡(jiǎn)便，成本較低。但PCR鑒定也存在一定的局限性，如可能會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的情況，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。因此，在進(jìn)行PCR鑒定時(shí)，需要設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過(guò)PCR鑒定，可以進(jìn)一步驗(yàn)證重組質(zhì)粒的正確性，為后續(xù)的重組桿狀病毒構(gòu)建和蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)提供有力的支持。5.3.3測(cè)序鑒定將經(jīng)過(guò)酶切鑒定和PCR鑒定的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pFastBac1-ORF2送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序采用Sanger測(cè)序法，該方法是一種經(jīng)典的DNA測(cè)序技術(shù)，具有準(zhǔn)確性高、可靠性強(qiáng)的特點(diǎn)。測(cè)序公司會(huì)使用特定的引物對(duì)重組質(zhì)粒中的ORF2基因進(jìn)行測(cè)序，得到ORF2基因的核苷酸序列。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已登錄的豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)分析。使用DNAstarLasergene等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行序列比對(duì)，計(jì)算核苷酸序列的同源性。比對(duì)結(jié)果顯示，所構(gòu)建的重組質(zhì)粒中的ORF2基因序列與GenBank中標(biāo)準(zhǔn)序列的同源性高達(dá)99%以上，僅有個(gè)別核苷酸位點(diǎn)存在差異。進(jìn)一步分析這些差異位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)它們并未導(dǎo)致氨基酸序列的改變，屬于同義突變，不影響ORF2基因編碼的Cap蛋白的氨基酸組成和結(jié)構(gòu)。這表明所克隆的ORF2基因序列正確，無(wú)堿基缺失、插入或突變等情況，成功構(gòu)建了含有正確ORF2基因的重組質(zhì)粒。測(cè)序鑒定是對(duì)重組質(zhì)粒中ORF2基因序列的最準(zhǔn)確驗(yàn)證方法，可以為后續(xù)的研究提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。通過(guò)測(cè)序鑒定，確保了重組質(zhì)粒的質(zhì)量，為利用桿狀病毒載體表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因以及開(kāi)發(fā)相關(guān)疫苗和診斷試劑奠定了可靠的基礎(chǔ)。六、兩種桿狀病毒載體構(gòu)建的難點(diǎn)與解決策略6.1構(gòu)建過(guò)程中的難點(diǎn)分析在構(gòu)建PRRSVORF5和PCV2ORF2桿狀病毒載體的過(guò)程中，面臨諸多技術(shù)難點(diǎn)，這些難點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行和結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生重要影響。在基因擴(kuò)增階段，引物設(shè)計(jì)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。引物的特異性和有效性直接決定了能否成功擴(kuò)增出目的基因。由于PRRSV和PCV2的基因序列存在一定的變異性，不同毒株之間的ORF5和ORF2基因可能存在核苷酸差異。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，需要全面分析多個(gè)毒株的基因序列，選取保守區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，以確保引物能夠與不同毒株的基因模板有效結(jié)合。同時(shí)，引物的長(zhǎng)度、GC含量、退火溫度等參數(shù)也需要精確優(yōu)化。引物過(guò)短可能導(dǎo)致特異性降低，容易引發(fā)非特異性擴(kuò)增；引物過(guò)長(zhǎng)則可能增加引物二聚體形成的概率，影響擴(kuò)增效率。GC含量過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響引物的退火溫度和擴(kuò)增效果，一般應(yīng)將GC含量控制在40%-60%之間。此外，在實(shí)際擴(kuò)增過(guò)程中，可能會(huì)遇到擴(kuò)增效率低或特異性差的問(wèn)題。這可能是由于模板質(zhì)量不佳、酶活性不穩(wěn)定、PCR反應(yīng)條件不合適等多種因素導(dǎo)致。例如，病毒核酸提取過(guò)程中若存在雜質(zhì)污染，可能會(huì)抑制DNA聚合酶的活性，從而降低擴(kuò)增效率；PCR反應(yīng)的退火溫度不合適，可能導(dǎo)致引物與模板結(jié)合不充分或非特異性結(jié)合，影響擴(kuò)增的特異性。在重組載體構(gòu)建過(guò)程中，也存在一系列難點(diǎn)?；虿迦敕较虻恼_性是一個(gè)重要問(wèn)題。在將ORF5和ORF2基因插入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)正向插入和反向插入兩種情況。只有基因正向插入，才能在合適的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下正確表達(dá)目的蛋白。然而，連接反應(yīng)過(guò)程中，由于目的基因片段和載體片段的隨機(jī)連接，難以保證所有的重組載體都含有正向插入的基因。為了篩選出正向插入的重組載體，需要進(jìn)行大量的鑒定工作，如酶切鑒定、測(cè)序鑒定等，這增加了實(shí)驗(yàn)的工作量和時(shí)間成本。連接效率也是影響重組載體構(gòu)建的關(guān)鍵因素。T4DNA連接酶催化的連接反應(yīng)受到多種因素的影響，如目的基因片段和載體片段的濃度比例、反應(yīng)溫度和時(shí)間等。若目的基因片段和載體片段的濃度比例不合適，可能導(dǎo)致連接反應(yīng)不完全，產(chǎn)生大量的空載載體；反應(yīng)溫度過(guò)高或過(guò)低都可能影響連接酶的活性，從而降低連接效率。一般來(lái)說(shuō)，連接反應(yīng)在16℃下孵育過(guò)夜，可獲得較好的連接效果，但實(shí)際操作中仍可能出現(xiàn)連接效率不理想的情況。細(xì)胞轉(zhuǎn)染環(huán)節(jié)同樣面臨挑戰(zhàn)。轉(zhuǎn)染效率直接關(guān)系到重組桿狀病毒