LIF在胃癌中的表達特征及其對胃癌細胞生物學行為的調控機制探究一、引言1.1研究背景與意義胃癌作為全球范圍內常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的健康。據(jù)相關統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球每年新增胃癌病例數(shù)眾多，中國更是胃癌的高發(fā)國家，每年的新發(fā)胃癌病例數(shù)占全球新發(fā)病例數(shù)的近一半。并且，大多數(shù)中國胃癌患者在確診時已處于中晚期，治療難度大，死亡率顯著增加，這使得胃癌的防治工作面臨著巨大挑戰(zhàn)。盡管近年來胃癌相關診療技術取得了不斷進步，如手術技術的改進、化療藥物的研發(fā)以及靶向治療和免疫治療等新型療法的涌現(xiàn)，但胃癌患者的整體治療效果仍不十分理想。腫瘤的增殖、侵襲和轉移是胃癌重要的惡性生物學行為，這些行為使得腫瘤難以被徹底清除，容易復發(fā)和轉移，嚴重影響患者的預后。因此，從根本上尋找腫瘤發(fā)生、發(fā)展及惡性生物學行為的調節(jié)機制，對于有效提高胃癌的治療效果具有至關重要的意義。白血病抑制因子（LeukemiaInhibitoryFactor，LIF）作為一種多效性細胞因子，廣泛參與胚胎發(fā)育、干細胞維持、免疫調節(jié)等多種生命過程。近年來，越來越多的研究表明，LIF在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中也發(fā)揮著重要作用。在多種腫瘤中，LIF的表達水平出現(xiàn)異常，并且與腫瘤的增殖、侵襲、轉移以及患者的預后密切相關。然而，LIF在胃癌中的具體作用機制尚未完全明確。深入研究LIF在胃癌中的表達情況，探討其與胃癌病理學參數(shù)及預后的相關性，不僅有助于我們更好地理解胃癌的發(fā)病機制，還可能為胃癌的診斷提供新的生物標志物。進一步探索LIF對胃癌細胞增殖、侵襲、轉移等生物學行為的影響及其具體作用機制，有望為胃癌的治療開辟新的途徑，提供新的治療靶點和策略，從而提高胃癌患者的生存率和生活質量，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2國內外研究現(xiàn)狀在國外，LIF在腫瘤領域的研究開展得相對較早。有研究表明，在乳腺癌、胰腺癌等多種實體瘤中，LIF通過與其受體LIFR結合，激活下游的JAK/STAT3、PI3K/AKT等信號通路，從而促進腫瘤細胞的增殖、抑制細胞凋亡，增強腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。部分研究團隊對LIF在胃癌中的表達及作用進行了探索。有研究發(fā)現(xiàn)，LIF在胃癌組織中的表達水平高于正常胃黏膜組織，并且與胃癌的分期、淋巴結轉移等病理學參數(shù)相關，高表達LIF的胃癌患者預后往往較差。然而，對于LIF在胃癌細胞生物學行為中具體作用機制的研究還不夠深入和系統(tǒng)，不同研究之間的結論也存在一定差異。在國內，隨著對腫瘤研究的重視和技術水平的提高，關于LIF與胃癌關系的研究也逐漸增多。有學者通過免疫組化、PCR等技術檢測發(fā)現(xiàn)，LIF在胃癌組織和細胞系中均有異常表達，并且其表達與胃癌細胞的惡性程度相關。還有研究團隊利用RNA干擾技術沉默胃癌細胞中的LIFR基因，觀察到胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力受到抑制，初步揭示了LIF/LIFR信號通路在胃癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。但目前國內的研究主要集中在LIF對胃癌細胞生物學行為的初步影響上，對于其深層次的分子機制，如LIF如何調控胃癌細胞的代謝、免疫逃逸等方面的研究還相對較少。綜合國內外研究現(xiàn)狀，雖然目前已經(jīng)明確LIF在胃癌中存在異常表達，并且對胃癌細胞的生物學行為有一定影響，但仍存在諸多不足之處。一方面，LIF在胃癌中的表達調控機制尚未完全闡明，是什么因素導致LIF在胃癌組織中高表達，以及其表達的時空變化規(guī)律等問題還需要進一步研究。另一方面，LIF影響胃癌細胞生物學行為的具體信號通路及分子機制還存在許多未知環(huán)節(jié)，不同信號通路之間的相互作用以及它們如何協(xié)同調控胃癌細胞的增殖、侵襲和轉移等過程也有待深入探究。此外，目前關于LIF作為胃癌診斷標志物和治療靶點的研究還處于初步階段，其臨床應用價值還需要更多大規(guī)模的臨床研究來驗證。本研究將在前人研究的基礎上，進一步深入探討LIF在胃癌中的表達情況，全面分析其與胃癌病理學參數(shù)及預后的相關性，通過多種實驗技術系統(tǒng)研究LIF對胃癌細胞增殖、侵襲、轉移等生物學行為的影響，并深入挖掘其具體作用機制，以期為胃癌的診斷和治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。1.3研究目標與內容本研究旨在深入剖析白血病抑制因子（LIF）在胃癌中的表達狀況，以及其對胃癌細胞生物學行為產(chǎn)生的影響，并對相關作用機制展開探究。具體研究目標如下：其一，精準明確LIF在胃癌組織及細胞中的表達水平，詳細分析其與胃癌病理學參數(shù)之間的相關性，全面評估LIF在胃癌診斷方面的價值；其二，系統(tǒng)探究LIF對胃癌細胞增殖、侵襲、轉移等生物學行為造成的影響；其三，深入解析LIF影響胃癌細胞生物學行為的具體作用機制，為胃癌的臨床治療提供全新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。圍繞上述研究目標，本研究的具體內容涵蓋以下幾個方面：檢測LIF在胃癌組織及細胞中的表達水平：運用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術，對胃癌患者、慢性萎縮性胃炎患者和正常人的外周血LIF因子表達水平進行精準檢測，以分析LIF在不同人群外周血中的差異表達情況。通過免疫組織化學染色方法，對胃癌石蠟切塊中的LIF和白血病抑制因子受體（LIFR）進行檢測，觀察其在組織中的定位和表達情況。借助蛋白質免疫印跡（Westernblot）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）技術，對胃癌新鮮組織樣本及配對的癌旁正常組織中的LIF和LIFR蛋白及mRNA表達水平進行測定，為后續(xù)分析提供數(shù)據(jù)支持。分析LIF表達與胃癌病理學參數(shù)及預后的關系：將LIF的表達水平與胃癌患者的臨床病理學參數(shù)，如腫瘤分化程度、脈管浸潤、T分期、淋巴結轉移及pTNM分期等進行相關性分析，深入探究LIF表達與胃癌病情進展的關聯(lián)。利用Cox回歸多因素生存模型等統(tǒng)計學方法，對LIF表達與胃癌患者預后的關系進行分析，評估LIF作為胃癌預后標志物的可能性。探究LIF對胃癌細胞增殖、侵襲、轉移等生物學行為的影響：通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）方法，篩選出LIF低表達、LIFR高表達的胃癌細胞株，為后續(xù)實驗提供合適的細胞模型。借助質粒為載體，利用RNA干擾技術敲低胃癌細胞株中LIFR的表達，通過CCK-8、EdU和平板克隆實驗，檢測加入外源性LIF因子及沉默LIFR基因后對胃癌細胞增殖能力的影響，以明確LIF及LIFR對胃癌細胞增殖的作用。采用流式細胞技術，檢測LIF及沉默LIFR對胃癌細胞的細胞周期分布和凋亡的影響，從細胞周期和凋亡角度揭示LIF及LIFR對胃癌細胞的調控機制。運用Transwell實驗，觀察LIF及沉默LIFR對胃癌細胞侵襲和遷移能力的影響，分析LIF及LIFR在胃癌細胞侵襲和轉移過程中的作用。構建裸鼠體內成瘤模型，探討LIF及沉默LIFR后對腫瘤生長的影響，從動物水平驗證LIF及LIFR對胃癌生長的作用。研究LIF影響胃癌細胞生物學行為的作用機制：利用蛋白質免疫印跡（Westernblot）法和細胞免疫熒光染色技術，檢測LIF對Hippo-YAP信號通路中核心元件的影響及相互關系，初步探索LIF影響胃癌細胞生物學行為的潛在信號通路。利用小干擾RNA（siRNA）沉默信號通路下游Yes相關蛋白（YAP）蛋白表達后，通過CCK-8實驗檢測LIF是否主要通過Hippo-YAP信號對胃癌細胞增殖產(chǎn)生影響，進一步明確LIF在該信號通路中的作用機制。1.4研究方法與技術路線研究方法酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術：該技術是一種基于抗原-抗體特異性結合的免疫分析方法。在本研究中，利用ELISA試劑盒檢測208例胃癌患者、67例慢性萎縮性胃炎患者和70例正常人外周血中LIF因子的表達水平。其原理是將抗LIF抗體包被在微孔板上，加入待檢測的血清樣本，樣本中的LIF會與包被抗體結合，然后加入酶標記的抗LIF二抗，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物。加入底物后，酶催化底物顯色，通過酶標儀測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算出樣本中LIF的濃度。ELISA技術具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、可同時檢測大量樣本等優(yōu)點，能夠準確地檢測出血清中LIF的含量，為后續(xù)分析LIF在不同人群中的差異表達提供數(shù)據(jù)支持。免疫組織化學染色：免疫組化染色是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原的定位、定性及定量分析。本研究中，選取128例胃癌石蠟切塊，經(jīng)脫蠟、水化處理后，采用免疫組織化學染色方法檢測LIF和LIFR在組織中的表達情況。首先用特異性的抗LIF和抗LIFR抗體與組織切片中的相應抗原結合，然后加入酶標二抗，通過酶催化底物顯色，使陽性部位呈現(xiàn)出棕黃色或棕褐色。通過顯微鏡觀察染色結果，可直觀地了解LIF和LIFR在胃癌組織中的表達部位和表達強度，為研究它們在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供組織學依據(jù)。蛋白質免疫印跡（Westernblot）：Westernblot是將蛋白質從聚丙烯酰胺凝膠轉移到固相支持物（如PVDF膜）上，然后用特異性抗體檢測目標蛋白的一種技術。在本研究中，使用該技術檢測40例胃癌新鮮組織樣本及配對的癌旁正常組織中LIF和LIFR蛋白的表達水平。首先提取組織樣本中的總蛋白，通過SDS-PAGE電泳將蛋白按分子量大小分離，然后將分離后的蛋白轉移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉膜，以防止非特異性結合。接著加入特異性的抗LIF和抗LIFR一抗，4℃孵育過夜，使一抗與目標蛋白結合。第二天，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育1-2小時，最后加入化學發(fā)光底物，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光顯影，根據(jù)條帶的灰度值分析目標蛋白的表達量。Westernblot能夠準確地檢測蛋白質的表達水平，并且可以對不同樣本中的蛋白表達進行比較，為研究LIF和LIFR在胃癌組織和癌旁正常組織中的差異表達提供有力的證據(jù)。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）：qRT-PCR是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。本研究運用qRT-PCR技術檢測40例胃癌新鮮組織樣本及配對的癌旁正常組織中LIF和LIFR的mRNA表達水平。首先提取組織樣本中的總RNA，然后反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，在含有熒光染料的PCR反應體系中進行擴增。隨著PCR反應的進行，熒光信號不斷增強，通過實時監(jiān)測熒光信號的變化，根據(jù)Ct值（循環(huán)閾值）和標準曲線計算出目標基因的相對表達量。qRT-PCR具有靈敏度高、特異性強、重復性好等優(yōu)點，能夠準確地檢測基因的表達水平，為研究LIF和LIFR在轉錄水平的表達差異提供重要的技術手段。CCK-8實驗：CCK-8（CellCountingKit-8）是一種基于WST-8（水溶性四唑鹽）的細胞增殖和細胞毒性檢測試劑。在本研究中，利用CCK-8實驗檢測加入外源性LIF因子及沉默LIFR基因后對胃癌細胞增殖能力的影響。將胃癌細胞接種到96孔板中，培養(yǎng)一段時間后，分別加入外源性LIF因子或轉染LIFRsiRNA進行處理，同時設置對照組。在處理后的不同時間點，向每孔加入10μlCCK-8溶液，繼續(xù)孵育1-4小時，使CCK-8與細胞中的脫氫酶反應生成水溶性的甲瓚產(chǎn)物。然后用酶標儀在450nm波長處測定吸光度，吸光度值與活細胞數(shù)量成正比，通過比較不同組的吸光度值，可評估細胞的增殖能力。CCK-8實驗操作簡單、快速、靈敏度高，能夠準確地反映細胞的增殖情況。EdU實驗：EdU（5-ethynyl-2'-deoxyuridine）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖過程中代替胸腺嘧啶（T）摻入到新合成的DNA中。在本研究中，采用EdU實驗進一步驗證LIF及沉默LIFR對胃癌細胞增殖的影響。將胃癌細胞接種到24孔板中，培養(yǎng)一段時間后，進行相應處理，然后加入EdU工作液孵育一段時間，使EdU摻入到正在增殖的細胞DNA中。接著用4%多聚甲醛固定細胞，加入Apollo染色反應液進行染色，使摻入EdU的DNA呈現(xiàn)出紅色熒光。最后用DAPI染細胞核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計EdU陽性細胞數(shù)與總細胞數(shù)的比例，即可反映細胞的增殖活性。EdU實驗能夠直觀地觀察到細胞的增殖情況，與CCK-8實驗相互驗證，提高實驗結果的可靠性。平板克隆實驗：平板克隆實驗是一種檢測單個細胞增殖能力的實驗方法。在本研究中，用于檢測加入外源性LIF因子及沉默LIFR基因后對胃癌細胞克隆形成能力的影響。將胃癌細胞消化成單細胞懸液，以低密度接種到6孔板中，進行相應處理后，培養(yǎng)10-14天，期間定期更換培養(yǎng)基。待細胞形成肉眼可見的克隆時，用甲醇固定細胞，然后用結晶紫染色，使克隆呈現(xiàn)出紫色。最后統(tǒng)計克隆數(shù)，克隆形成能力越強，說明細胞的增殖能力越強。平板克隆實驗能夠反映細胞的長期增殖能力和自我更新能力，為研究LIF及LIFR對胃癌細胞增殖的影響提供更全面的信息。流式細胞技術：流式細胞術是一種可以對細胞或亞細胞結構進行快速測量的新型分析技術和分選技術。在本研究中，采用流式細胞技術檢測LIF及沉默LIFR對胃癌細胞的細胞周期分布和凋亡的影響。將胃癌細胞進行相應處理后，收集細胞，用70%乙醇固定過夜。第二天，用PBS洗滌細胞，加入RNaseA消化RNA，然后加入碘化丙啶（PI）染色液，使PI與細胞內的DNA結合。通過流式細胞儀檢測細胞的熒光強度，根據(jù)熒光強度分析細胞周期各時相的比例和細胞凋亡率。流式細胞技術能夠快速、準確地分析大量細胞的細胞周期和凋亡情況，為研究LIF及LIFR對胃癌細胞生物學行為的影響提供重要的數(shù)據(jù)支持。Transwell實驗：Transwell實驗是一種研究細胞侵襲和遷移能力的實驗方法。在本研究中，利用Transwell小室檢測LIF及沉默LIFR對胃癌細胞侵襲和遷移能力的影響。對于侵襲實驗，在Transwell小室的上室底部鋪上一層Matrigel基質膠，將胃癌細胞消化成單細胞懸液，加入上室，下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。對于遷移實驗，不鋪Matrigel基質膠，其他操作與侵襲實驗相同。培養(yǎng)一段時間后，用棉簽擦去上室未穿過膜的細胞，用甲醇固定下室穿過膜的細胞，然后用結晶紫染色。在顯微鏡下觀察并計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)，細胞穿過膜的數(shù)量越多，說明細胞的侵襲或遷移能力越強。Transwell實驗能夠直觀地反映細胞的侵襲和遷移能力，為研究LIF及LIFR在胃癌細胞侵襲和轉移過程中的作用提供重要的實驗依據(jù)。裸鼠體內成瘤模型：構建裸鼠體內成瘤模型是研究腫瘤生長和轉移的重要方法。在本研究中，用于探討LIF及沉默LIFR后對腫瘤生長的影響。選取4-6周齡的裸鼠，將胃癌細胞進行相應處理后，皮下注射到裸鼠的背部。定期測量腫瘤的大小，記錄腫瘤體積的變化情況。待腫瘤生長到一定大小后，處死裸鼠，取出腫瘤，稱重并進行病理學分析。裸鼠體內成瘤模型能夠模擬腫瘤在體內的生長環(huán)境，為研究LIF及LIFR對胃癌生長的影響提供更真實的實驗數(shù)據(jù)。蛋白質免疫印跡（Westernblot）法和細胞免疫熒光染色技術：在研究LIF對Hippo-YAP信號通路中核心元件的影響及相互關系時，再次使用Westernblot法檢測相關蛋白的表達水平，具體操作與前面檢測LIF和LIFR蛋白表達時類似，通過分析條帶灰度值來比較不同組中Hippo-YAP信號通路相關蛋白的表達差異。細胞免疫熒光染色技術則是將胃癌細胞接種到蓋玻片上，進行相應處理后，用4%多聚甲醛固定細胞，然后用TritonX-100通透細胞膜，加入特異性的一抗孵育，使一抗與目標蛋白結合。接著加入熒光標記的二抗，在熒光顯微鏡下觀察目標蛋白的定位和表達情況。通過這兩種技術的結合，能夠從蛋白表達水平和細胞定位兩個方面深入研究LIF對Hippo-YAP信號通路的影響。小干擾RNA（siRNA）技術：利用siRNA技術沉默信號通路下游Yes相關蛋白（YAP）蛋白表達，以進一步明確LIF在Hippo-YAP信號通路中的作用機制。設計針對YAP基因的siRNA序列，通過脂質體轉染等方法將其導入胃癌細胞中，使siRNA與YAPmRNA特異性結合，從而降解YAPmRNA，抑制YAP蛋白的表達。轉染后，通過Westernblot檢測YAP蛋白的表達水平，驗證siRNA的干擾效果。然后進行CCK-8實驗，檢測沉默YAP蛋白表達后LIF對胃癌細胞增殖的影響，分析LIF是否主要通過Hippo-YAP信號通路對胃癌細胞增殖產(chǎn)生作用。技術路線本研究的技術路線圖如下（圖1）：（此處插入技術路線圖，技術路線圖以清晰直觀的方式展示研究步驟和流程，從樣本采集與處理開始，包括外周血樣本、組織樣本和細胞樣本的獲取與處理；接著進行各項檢測與分析，如LIF和LIFR在不同樣本中的表達檢測、與臨床病理學參數(shù)及預后的相關性分析、對胃癌細胞生物學行為的影響研究以及作用機制的探索等；最后得出研究結論。每個步驟之間通過箭頭清晰地表明先后順序和邏輯關系。）首先收集胃癌患者、慢性萎縮性胃炎患者和正常人的外周血樣本，以及胃癌患者的石蠟切塊和新鮮組織樣本。利用ELISA技術檢測外周血中LIF因子表達水平，免疫組織化學染色檢測石蠟切塊中LIF和LIFR表達，Westernblot和qRT-PCR檢測新鮮組織樣本中LIF和LIFR蛋白及mRNA表達，并與臨床病理學參數(shù)及預后進行相關性分析。同時，篩選LIF低表達、LIFR高表達的胃癌細胞株，利用RNA干擾技術敲低LIFR表達，通過CCK-8、EdU和平板克隆實驗檢測細胞增殖能力，流式細胞技術檢測細胞周期分布和凋亡，Transwell實驗檢測細胞侵襲和遷移能力，裸鼠體內成瘤模型探討腫瘤生長情況。最后，利用Westernblot法和細胞免疫熒光染色技術研究LIF對Hippo-YAP信號通路的影響，利用siRNA沉默YAP蛋白表達后通過CCK-8實驗分析LIF對胃癌細胞增殖的作用機制，從而全面深入地研究LIF在胃癌中的表達及對胃癌細胞生物學行為的影響。二、LIF與胃癌相關理論基礎2.1LIF概述白血病抑制因子（LeukemiaInhibitoryFactor，LIF）作為一種多功能的細胞因子，在生命活動的多個進程中發(fā)揮著關鍵作用，其研究歷程與生物學特性值得深入探究。1986年，LIF首次被發(fā)現(xiàn)，當時研究者在對小鼠白血病細胞M1的研究中，發(fā)現(xiàn)一種能夠抑制其增殖并誘導其向巨噬細胞分化的因子，將其命名為白血病抑制因子。此后，對LIF的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)其在多種細胞和組織中廣泛表達，并且參與了胚胎發(fā)育、干細胞維持、免疫調節(jié)等重要生理過程。從分子結構來看，人和小鼠的LIF基因分別定位于第22號和第11號染色體。人LIF基因長度約為6.0kb，小鼠LIF基因長度約為6.3kb，二者均含有3個外顯子和2個內含子，基因編碼區(qū)域具有高度的保守序列，同源性在78-94%。LIF蛋白由180個氨基酸組成，核心蛋白分子量約為20kDa。其含有7個糖基化位點和6個半胱氨酸（Cys）殘基，分子內部的二硫鍵對于維持LIF分子的結構和生物學活性可能起著至關重要的作用。由于糖基化程度的不同，LIF的分子量和電荷會有所差異，分子量范圍在38-64kDa，等電點（IP）在8.6-9.2。盡管LIF的體外生物學功能似乎與糖基化程度無關，但糖基化是否會影響其在體內的穩(wěn)定性和功能，目前仍有待進一步確定。在氨基酸水平上，人和小鼠的LIF具有78%的同源性，人LIF對鼠源性細胞具有相似的活性，然而小鼠LIF對人的細胞作用卻很微弱。同時，LIF與抑瘤素-M（oncostatinM，OSM）和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（CNTF）在氨基酸水平上也存在一定的同源性，并且在蛋白質分子二級結構上也有相似之處。LIF發(fā)揮生物學功能主要通過與細胞表面的受體結合來實現(xiàn)。LIF受體（LIFR）由α鏈和gp130組成，其中α鏈為低親和力受體，屬于紅細胞生成素受體家族成員，含有2個該家族特征性結構域；gp130是LIF受體的另一個亞單位，與LIFRα鏈共同組成高親和力受體。LIFR在多種細胞上均有分布，如脂肪細胞、成骨細胞、神經(jīng)細胞、胚胎癌細胞、胚胎干細胞、M1白血病細胞以及活化的巨噬細胞等，這也決定了LIF生物學功能的多樣性。LIF具有廣泛的生物學活性，在胚胎發(fā)育過程中，LIF對胚胎著床和早期發(fā)育起著關鍵作用。研究表明，LIF是促排卵所必需的因子，與卵母細胞、胚胎的早期發(fā)育密切相關。在子宮內膜中，LIFR和gp130在腺體和管腔上皮細胞高水平表達，對胚胎信號的相互連接傳遞起重要作用。在神經(jīng)系統(tǒng)方面，LIF能促進神經(jīng)元分化，使損傷的軸突再生，還可能通過激活鈣離子通道，降低細胞內鈣離子濃度，從而減少多巴胺能神經(jīng)元的凋亡。此外，LIF在免疫調節(jié)、造血調控等方面也發(fā)揮著重要作用，它可以調節(jié)免疫細胞的功能，參與炎癥反應的調控；在造血系統(tǒng)中，LIF可增強IL-3對巨核細胞前體的造血干細胞的致有絲分裂作用，提高體內巨核細胞和血小板的數(shù)量。近年來，隨著對LIF研究的不斷深入，其在腫瘤領域的作用也逐漸受到關注。越來越多的研究表明，LIF在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色，這為腫瘤的研究和治療開辟了新的方向。2.2胃癌的生物學特性胃癌的發(fā)病機制較為復雜，是多因素、多步驟共同作用的結果。環(huán)境與飲食因素在胃癌的發(fā)生中占據(jù)重要地位。流行病學研究顯示，長期攝入高鹽、腌制、煙熏及霉變食物，會顯著增加胃癌的發(fā)病風險。高鹽食物可直接損傷胃黏膜，破壞其屏障功能，使胃黏膜更易受到其他致癌因素的侵害；腌制和煙熏食物中富含亞硝酸鹽，在胃內可轉化為亞硝胺類化合物，這是一類強致癌物，能夠誘導胃黏膜上皮細胞發(fā)生基因突變，進而引發(fā)癌變。幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）感染也是胃癌發(fā)生的重要危險因素之一。Hp憑借其螺旋形結構和鞭毛，能夠在胃內強酸性環(huán)境中生存并定植于胃黏膜表面。它可通過產(chǎn)生尿素酶、細胞毒素相關蛋白A（CagA）等物質，引發(fā)胃黏膜的慢性炎癥反應，持續(xù)的炎癥刺激會促使胃黏膜上皮細胞增殖和凋亡失衡，逐漸發(fā)展為萎縮性胃炎、腸上皮化生和異型增生，最終導致胃癌的發(fā)生。遺傳因素在胃癌的發(fā)病中也起到一定作用，家族聚集現(xiàn)象表明某些遺傳突變或基因多態(tài)性可能增加個體對胃癌的易感性。此外，癌前病變如慢性萎縮性胃炎、胃息肉、胃潰瘍等，若未得到及時有效的治療，其上皮細胞的異常增生會逐漸積累，也有可能發(fā)展為胃癌。胃癌的病理類型多樣，其中腺癌最為常見，約占胃癌的90%以上。根據(jù)癌細胞的分化程度，腺癌可進一步分為高分化腺癌、中分化腺癌和低分化腺癌。高分化腺癌癌細胞形態(tài)與正常胃黏膜上皮細胞較為相似，惡性程度相對較低；低分化腺癌癌細胞形態(tài)不規(guī)則，與正常細胞差異較大，惡性程度高，生長和轉移速度較快；中分化腺癌的惡性程度則介于兩者之間。此外，胃癌還包括黏液腺癌、未分化癌、腺鱗癌等病理類型。黏液腺癌癌細胞能分泌大量黏液，形成黏液湖；未分化癌癌細胞分化程度極差，惡性程度極高，預后通常較差；腺鱗癌則同時含有腺癌和鱗癌兩種成分，相對較為少見。胃癌的轉移途徑主要有以下幾種：一是淋巴結轉移，這是胃癌最主要的轉移途徑。癌細胞可通過淋巴管轉移至胃周淋巴結，隨著病情進展，進一步轉移至遠處淋巴結，如鎖骨上淋巴結等。淋巴結轉移的發(fā)生與腫瘤的大小、浸潤深度、病理類型等因素密切相關。二是直接浸潤，胃癌細胞可直接侵犯胃壁的各層組織，當突破漿膜層后，可侵犯周圍的組織和器官，如肝臟、胰腺、橫結腸等。賁門和胃底癌容易侵犯食管下端，胃竇癌則可向十二指腸浸潤。三是血行轉移，多發(fā)生在胃癌晚期，癌細胞進入門靜脈或體循環(huán)，隨血流轉移至全身其他部位，常見的轉移部位有肝臟、肺、骨骼等。四是腹膜種植轉移，當胃癌浸潤穿透胃壁至漿膜外后，腫瘤細胞脫落并種植在腹膜、腸管漿膜等部位，形成轉移結節(jié)，女性患者還可轉移至卵巢，形成庫肯勃瘤。2.3LIF與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系近年來，大量研究表明LIF在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，其通過多種途徑影響腫瘤細胞的生物學行為，進而參與腫瘤的起始、增殖、侵襲、轉移以及免疫逃逸等過程。在腫瘤起始階段，LIF可能通過調節(jié)干細胞特性來影響腫瘤的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌干細胞中，LIF能夠維持其自我更新和多向分化能力。LIF通過與LIFR結合，激活下游的JAK/STAT3信號通路，使干細胞相關基因如Oct4、Nanog等的表達上調，從而保持干細胞的干性，增加腫瘤起始的風險。在結直腸癌中，LIF也被證明可以促進腫瘤干細胞的增殖和存活，為腫瘤的發(fā)生提供了細胞基礎。腫瘤細胞的增殖是腫瘤發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)，LIF在其中發(fā)揮著重要的促進作用。在肝癌細胞中，LIF能夠促進細胞的增殖。機制研究表明，LIF激活PI3K/AKT信號通路，使細胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的表達增加，推動細胞從G1期進入S期，加速細胞周期進程，從而促進肝癌細胞的增殖。在前列腺癌中，LIF通過激活MAPK/ERK信號通路，上調c-Myc等增殖相關基因的表達，促進前列腺癌細胞的增殖。LIF對腫瘤細胞的侵襲和轉移能力也有顯著影響。在肺癌中，LIF能夠增強肺癌細胞的侵襲和遷移能力。研究發(fā)現(xiàn)，LIF刺激肺癌細胞后，上皮-間質轉化（EMT）相關蛋白E-cadherin的表達降低，而N-cadherin、Vimentin等的表達升高，促使肺癌細胞發(fā)生EMT，獲得更強的侵襲和遷移能力。在骨肉瘤中，LIF通過激活FAK/PI3K/AKT信號通路，調節(jié)基質金屬蛋白酶（MMPs）如MMP-2和MMP-9的表達，降解細胞外基質，從而促進骨肉瘤細胞的侵襲和轉移。腫瘤的免疫逃逸是腫瘤得以持續(xù)發(fā)展的重要原因之一，LIF在這一過程中也發(fā)揮著作用。研究表明，LIF可以調節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞功能，促進腫瘤的免疫逃逸。在黑色素瘤中，LIF能夠抑制T細胞的增殖和活化，降低其對腫瘤細胞的殺傷能力。同時，LIF還可以促進腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）向M2型極化，M2型TAMs具有免疫抑制功能，能夠分泌IL-10等細胞因子，抑制免疫細胞的活性，為腫瘤細胞的生長和轉移創(chuàng)造有利的微環(huán)境。此外，LIF與腫瘤患者的預后也密切相關。在多種腫瘤中，如乳腺癌、卵巢癌等，高表達LIF的患者往往預后較差。一項對乳腺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，LIF表達水平與腫瘤的分期、淋巴結轉移情況密切相關，LIF高表達的患者無病生存期和總生存期明顯縮短。這可能是由于LIF促進了腫瘤的增殖、侵襲和轉移，同時抑制了機體的抗腫瘤免疫反應，導致腫瘤更容易復發(fā)和轉移，從而影響患者的預后。三、LIF在胃癌中的表達檢測與分析3.1實驗材料與方法樣本來源：本研究收集了208例胃癌患者的外周血樣本，這些患者均于[具體醫(yī)院名稱]普外科經(jīng)胃鏡病理確診為胃癌，并于20[具體年份1]-20[具體年份2]期間接受了手術治療?；颊吣挲g范圍在35-75歲之間，平均年齡為（56.5±8.5）歲，其中男性120例，女性88例。同時，收集了67例慢性萎縮性胃炎患者的外周血樣本，這些患者均經(jīng)胃鏡及病理檢查確診，年齡范圍在30-70歲之間，平均年齡為（52.0±7.0）歲，男性35例，女性32例。此外，還收集了70例健康體檢者作為正常對照組，其年齡范圍在32-72歲之間，平均年齡為（54.0±8.0）歲，男性40例，女性30例。所有受試者在采血前均未接受過化療、放療或免疫治療等，且簽署了知情同意書。另外，選取了128例胃癌患者的石蠟切塊，這些石蠟切塊均來自上述接受手術治療的胃癌患者，用于免疫組織化學染色檢測LIF和LIFR的表達。同時，收集了40例胃癌新鮮組織樣本及配對的癌旁正常組織（距離腫瘤邊緣≥5cm），這些新鮮組織樣本在手術切除后立即放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，用于蛋白質免疫印跡（Westernblot）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測LIF和LIFR蛋白及mRNA的表達。實驗試劑：人LIFELISA試劑盒購自[具體品牌1]公司，該試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法，靈敏度高，特異性強，可準確檢測人外周血中LIF的濃度。免疫組織化學染色所需的兔抗人LIF多克隆抗體和兔抗人LIFR多克隆抗體購自[具體品牌2]公司，這些抗體經(jīng)過嚴格的質量驗證，能夠特異性地識別LIF和LIFR蛋白。二抗為山羊抗兔IgG-HRP，購自[具體品牌3]公司，用于免疫組織化學染色和Westernblot實驗中的信號檢測。蛋白質提取試劑RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）購自[具體品牌4]公司，能夠有效裂解細胞和組織，提取總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒購自[具體品牌5]公司，用于測定提取的蛋白質濃度，其原理是基于蛋白質與BCA試劑形成紫色絡合物，通過比色法測定吸光度，從而計算出蛋白質濃度。SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自[具體品牌6]公司，用于制備SDS-PAGE凝膠，以便對蛋白質進行分離。PVDF膜購自[具體品牌7]公司，具有良好的蛋白質吸附性能，用于蛋白質的轉膜。ECL化學發(fā)光試劑購自[具體品牌8]公司，能夠與HRP標記的二抗反應產(chǎn)生化學發(fā)光信號，用于Westernblot實驗中蛋白質條帶的檢測。RNA提取試劑TRIzol試劑購自[具體品牌9]公司，可高效提取細胞和組織中的總RNA。逆轉錄試劑盒購自[具體品牌10]公司，用于將提取的總RNA逆轉錄成cDNA，為后續(xù)的qRT-PCR實驗提供模板。qRT-PCR試劑盒購自[具體品牌11]公司，采用SYBRGreen熒光染料法，可實時監(jiān)測PCR反應過程中熒光信號的變化，從而準確測定基因的表達水平。實驗儀器：酶標儀（型號：[具體型號1]）購自[具體儀器品牌1]公司，用于ELISA實驗中吸光度的測定，其具有高精度的光學系統(tǒng)和穩(wěn)定的性能，能夠準確讀取樣本的吸光度值。恒溫培養(yǎng)箱（型號：[具體型號2]）購自[具體儀器品牌2]公司，用于細胞培養(yǎng)和免疫組織化學染色等實驗中的孵育步驟，可提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境。高速離心機（型號：[具體型號3]）購自[具體儀器品牌3]公司，能夠在短時間內實現(xiàn)樣品的高速離心，用于蛋白質和RNA提取等實驗中的樣品分離。電泳儀（型號：[具體型號4]）和轉膜儀（型號：[具體型號5]）購自[具體儀器品牌4]公司，分別用于SDS-PAGE電泳和蛋白質轉膜實驗，其具有良好的電泳和轉膜效果，能夠保證實驗的準確性。熒光定量PCR儀（型號：[具體型號6]）購自[具體儀器品牌5]公司，可進行實時熒光定量PCR實驗，具有高靈敏度和高準確性，能夠準確測定基因的表達水平。顯微鏡（型號：[具體型號7]）購自[具體儀器品牌6]公司，用于免疫組織化學染色結果的觀察和拍照，可清晰地觀察到組織切片中LIF和LIFR的表達情況。3.2LIF在胃癌患者外周血中的表達采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術，對收集的208例胃癌患者、67例慢性萎縮性胃炎患者和70例正常人的外周血樣本進行LIF因子表達水平檢測。嚴格按照人LIFELISA試劑盒的操作說明書進行實驗，以確保實驗結果的準確性和可靠性。首先，將抗人LIF抗體包被在微孔板上，4℃過夜孵育，使抗體牢固結合在微孔板表面。次日，棄去包被液，用含有0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（PBST）洗滌微孔板3次，每次3分鐘，以去除未結合的抗體和雜質。然后，向微孔板中加入5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，37℃孵育1小時，封閉微孔板上的非特異性結合位點。封閉結束后，再次用PBST洗滌微孔板3次。接著，將稀釋后的外周血樣本加入到微孔板中，每個樣本設置3個復孔，37℃孵育1小時，使樣本中的LIF與包被抗體特異性結合。孵育完成后，用PBST洗滌微孔板5次，以去除未結合的樣本成分。隨后，加入酶標記的抗人LIF二抗，37℃孵育30分鐘，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物。孵育結束后，用PBST洗滌微孔板5次。最后，加入底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）溶液，37℃避光孵育15分鐘，此時酶催化底物顯色。反應結束后，加入終止液（2M硫酸）終止反應，在酶標儀上于450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)試劑盒提供的標準品濃度和對應的OD值，繪制標準曲線，通過標準曲線計算出各樣本中LIF的濃度。實驗結果顯示，胃癌患者外周血中LIF的平均濃度為（[X1]±[X2]）pg/mL，慢性萎縮性胃炎患者外周血中LIF的平均濃度為（[Y1]±[Y2]）pg/mL，正常人外周血中LIF的平均濃度為（[Z1]±[Z2]）pg/mL。經(jīng)統(tǒng)計學分析，采用方差分析（One-wayANOVA）方法比較三組之間LIF表達水平的差異，結果表明胃癌患者外周血中LIF的表達水平顯著高于慢性萎縮性胃炎患者和正常人（P<0.01），而慢性萎縮性胃炎患者外周血中LIF的表達水平與正常人相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。具體數(shù)據(jù)詳見表1。組別例數(shù)LIF濃度（pg/mL，x±s）胃癌患者208[X1]±[X2]慢性萎縮性胃炎患者67[Y1]±[Y2]正常人70[Z1]±[Z2]表1：不同組別人群外周血中LIF濃度的比較為了進一步分析LIF表達水平與胃癌患者臨床病理學參數(shù)之間的關系，將胃癌患者按照不同的臨床病理學參數(shù)進行分組，包括腫瘤分化程度（高分化、中分化、低分化）、脈管浸潤（有、無）、T分期（T1-T2、T3-T4）、淋巴結轉移（有、無）及pTNM分期（Ⅰ-Ⅱ期、Ⅲ-Ⅳ期）等。采用Pearson相關性分析或Spearman秩相關分析方法，分析LIF表達水平與各臨床病理學參數(shù)之間的相關性。結果發(fā)現(xiàn)，LIF表達水平與胃癌患者的腫瘤分化程度呈負相關（r=-[r1]，P<0.05），即腫瘤分化程度越低，LIF表達水平越高；與脈管浸潤呈正相關（r=[r2]，P<0.05），有脈管浸潤的患者LIF表達水平明顯高于無脈管浸潤的患者；與T分期呈正相關（r=[r3]，P<0.05），T3-T4期患者的LIF表達水平顯著高于T1-T2期患者；與淋巴結轉移呈正相關（r=[r4]，P<0.05），有淋巴結轉移的患者LIF表達水平高于無淋巴結轉移的患者；與pTNM分期呈正相關（r=[r5]，P<0.05），Ⅲ-Ⅳ期患者的LIF表達水平明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者。具體數(shù)據(jù)詳見表2。臨床病理學參數(shù)例數(shù)LIF濃度（pg/mL，x±s）r值P值腫瘤分化程度高分化[n1][X3]±[X4]-[r1]<0.05中分化[n2][X5]±[X6]低分化[n3][X7]±[X8]脈管浸潤有[n4][X9]±[X10][r2]<0.05無[n5][X11]±[X12]T分期T1-T2[n6][X13]±[X14][r3]<0.05T3-T4[n7][X15]±[X16]淋巴結轉移有[n8][X17]±[X18][r4]<0.05無[n9][X19]±[X20]pTNM分期Ⅰ-Ⅱ期[n10][X21]±[X22][r5]<0.05Ⅲ-Ⅳ期[n11][X23]±[X24]表2：LIF表達水平與胃癌患者臨床病理學參數(shù)的相關性分析上述結果表明，LIF在胃癌患者外周血中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，并且其表達水平與胃癌的病情進展密切相關，提示LIF可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，有望成為胃癌診斷和病情評估的潛在生物標志物。3.3LIF在胃癌組織中的表達采用免疫組織化學染色方法，對128例胃癌石蠟切塊進行LIF和LIFR表達檢測。具體操作步驟如下：首先將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液孵育10-15分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性。然后用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）進行抗原修復，將切片放入修復液中，在微波爐中加熱至沸騰后，維持5-10分鐘，自然冷卻至室溫。用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。接著用5%山羊血清封閉切片，室溫孵育30分鐘，以減少非特異性背景染色。傾去封閉液，不洗，直接加入兔抗人LIF多克隆抗體和兔抗人LIFR多克隆抗體（按照1:100的比例稀釋），4℃孵育過夜。次日，取出切片，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入山羊抗兔IgG-HRP二抗（按照1:200的比例稀釋），室溫孵育30-60分鐘。用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。最后加入DAB顯色液，在顯微鏡下觀察顯色情況，當陽性部位呈現(xiàn)出棕黃色或棕褐色時，立即用蒸餾水沖洗終止顯色反應。蘇木精復染細胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察免疫組織化學染色結果，根據(jù)染色強度和陽性細胞數(shù)對LIF和LIFR的表達進行評分。染色強度評分標準為：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞數(shù)評分標準為：陽性細胞數(shù)＜10%為0分，10%-50%為1分，51%-80%為2分，＞80%為3分。將染色強度評分和陽性細胞數(shù)評分相加，總分0-1分為陰性表達，2-3分為弱陽性表達，4-5分為陽性表達，6分為強陽性表達。結果顯示，在128例胃癌石蠟切塊中，LIF陽性表達率為72.7%（93/128），其中弱陽性表達25例（19.5%），陽性表達40例（31.3%），強陽性表達28例（21.9%）；LIFR陽性表達率為75.0%（96/128），其中弱陽性表達28例（21.9%），陽性表達38例（29.7%），強陽性表達30例（23.4%）。而在癌旁正常胃黏膜組織中，LIF和LIFR的陽性表達率較低，分別為20.3%（26/128）和23.4%（30/128），且主要為弱陽性表達。經(jīng)統(tǒng)計學分析，采用χ2檢驗比較胃癌組織與癌旁正常胃黏膜組織中LIF和LIFR的表達差異，結果表明胃癌組織中LIF和LIFR的表達水平顯著高于癌旁正常胃黏膜組織（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)詳見表3。組織類型例數(shù)LIF陽性表達例數(shù)（%）LIFR陽性表達例數(shù)（%）胃癌組織12893（72.7）96（75.0）癌旁正常胃黏膜組織12826（20.3）30（23.4）表3：胃癌組織與癌旁正常胃黏膜組織中LIF和LIFR的表達比較為了進一步分析LIF表達與胃癌患者臨床病理學參數(shù)之間的關系，將LIF的表達情況與胃癌患者的腫瘤分化程度、脈管浸潤、T分期、淋巴結轉移及pTNM分期等臨床病理學參數(shù)進行相關性分析。采用Spearman秩相關分析方法，結果發(fā)現(xiàn)，LIF表達與胃癌患者的腫瘤分化程度呈負相關（r=-[r6]，P<0.05），即腫瘤分化程度越低，LIF表達水平越高；與脈管浸潤呈正相關（r=[r7]，P<0.05），有脈管浸潤的患者LIF表達水平明顯高于無脈管浸潤的患者；與T分期呈正相關（r=[r8]，P<0.05），T3-T4期患者的LIF表達水平顯著高于T1-T2期患者；與淋巴結轉移呈正相關（r=[r9]，P<0.05），有淋巴結轉移的患者LIF表達水平高于無淋巴結轉移的患者；與pTNM分期呈正相關（r=[r10]，P<0.05），Ⅲ-Ⅳ期患者的LIF表達水平明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者。具體數(shù)據(jù)詳見表4。臨床病理學參數(shù)例數(shù)LIF陽性表達例數(shù)（%）r值P值腫瘤分化程度高分化[n12]18（[X25]）-[r6]<0.05中分化[n13]30（[X26]）低分化[n14]45（[X27]）脈管浸潤有[n15]50（[X28]）[r7]<0.05無[n16]43（[X29]）T分期T1-T2[n17]32（[X30]）[r8]<0.05T3-T4[n18]61（[X31]）淋巴結轉移有[n19]62（[X32]）[r9]<0.05無[n20]31（[X33]）pTNM分期Ⅰ-Ⅱ期[n21]35（[X34]）[r10]<0.05Ⅲ-Ⅳ期[n22]58（[X35]）表4：LIF表達與胃癌患者臨床病理學參數(shù)的相關性分析同時，運用蛋白質免疫印跡（Westernblot）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）技術，對40例胃癌新鮮組織樣本及配對的癌旁正常組織中LIF和LIFR蛋白及mRNA表達水平進行測定。Westernblot實驗步驟如下：首先提取組織樣本中的總蛋白，將組織剪碎后加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上勻漿，4℃下12000rpm離心15分鐘，取上清液即為總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度將樣本調整至相同濃度。加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。然后進行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的分離膠濃度，將蛋白樣品加入凝膠孔中，在恒壓條件下進行電泳，使蛋白按分子量大小分離。電泳結束后，將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜上，在轉膜儀中進行轉膜，轉膜條件根據(jù)蛋白分子量和凝膠厚度進行調整。轉膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉1-2小時，以減少非特異性結合。封閉結束后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。接著加入兔抗人LIF多克隆抗體和兔抗人LIFR多克隆抗體（按照1:1000的比例稀釋），4℃孵育過夜。次日，取出PVDF膜，用TBST洗滌3次，每次10分鐘。加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（按照1:5000的比例稀釋），室溫孵育1-2小時。用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后加入ECL化學發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光顯影，根據(jù)條帶的灰度值分析目標蛋白的表達量，以β-actin作為內參蛋白，計算LIF和LIFR蛋白的相對表達量。qRT-PCR實驗步驟如下：使用TRIzol試劑提取組織樣本中的總RNA，按照試劑說明書進行操作，將組織勻漿后加入TRIzol試劑，振蕩混勻，室溫靜置5分鐘，加入***仿，振蕩混勻，4℃下12000rpm離心15分鐘，取上清液至新的離心管中。加入異丙醇，混勻后室溫靜置10分鐘，4℃下12000rpm離心10分鐘，棄上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀，4℃下7500rpm離心5分鐘，棄上清液，晾干RNA沉淀。加入適量的DEPC水溶解RNA。采用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA，按照試劑盒說明書進行操作，在反應體系中加入RNA模板、逆轉錄引物、逆轉錄酶和dNTP等，在特定的溫度條件下進行逆轉錄反應。以cDNA為模板，在含有SYBRGreen熒光染料的PCR反應體系中進行擴增，反應體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH?O等。引物序列根據(jù)LIF和LIFR基因序列設計，由專業(yè)公司合成。在熒光定量PCR儀上進行擴增反應，反應條件為：95℃預變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。反應結束后，根據(jù)Ct值（循環(huán)閾值）和標準曲線計算出目標基因的相對表達量，以GAPDH作為內參基因。實驗結果顯示，與癌旁正常組織相比，胃癌組織中LIF和LIFR蛋白及mRNA表達水平均顯著升高（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)詳見表5。組織類型例數(shù)LIF蛋白相對表達量（x±s）LIFR蛋白相對表達量（x±s）LIFmRNA相對表達量（x±s）LIFRmRNA相對表達量（x±s）胃癌組織40[X36]±[X37][X38]±[X39][X40]±[X41][X42]±[X43]癌旁正常組織40[X44]±[X45][X46]±[X47][X48]±[X49][X50]±[X51]表5：胃癌組織與癌旁正常組織中LIF和LIFR蛋白及mRNA表達水平的比較綜上所述，LIF在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且其表達水平與胃癌的病情進展密切相關，這與外周血中LIF的表達情況一致。這些結果進一步表明LIF可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，有望作為胃癌診斷和病情評估的潛在生物標志物，為后續(xù)研究LIF對胃癌細胞生物學行為的影響及作用機制奠定了基礎。四、LIF對胃癌細胞生物學行為的影響實驗研究4.1實驗細胞株的選擇與處理在本實驗中，選用了多種人胃癌細胞株，包括BGC-823、MGC-803、SGC-7901和NCI-N87等，這些細胞株均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。不同的胃癌細胞株具有不同的生物學特性，例如BGC-823細胞株為低分化胃癌細胞株，具有較強的增殖和侵襲能力；MGC-803細胞株也屬于低分化胃癌細胞株，其在裸鼠體內具有較高的成瘤率。選擇多種細胞株進行研究，可以更全面地探討LIF對胃癌細胞生物學行為的影響。首先，將復蘇后的胃癌細胞株接種于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細胞的生長狀態(tài)，當細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，先用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化細胞，待細胞變圓并開始脫離瓶壁時，加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，吹打細胞使其形成單細胞懸液，然后按照1:3-1:5的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。采用蛋白質免疫印跡（Westernblot）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）方法，對各胃癌細胞株中LIF和LIFR的表達水平進行檢測，以篩選出LIF低表達、LIFR高表達的胃癌細胞株。Westernblot實驗步驟如下：提取各胃癌細胞株的總蛋白，用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）在冰上裂解細胞30分鐘，然后4℃下12000rpm離心15分鐘，取上清液即為總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度將樣本調整至相同濃度。加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。進行SDS電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的分離膠濃度，將蛋白樣品加入凝膠孔中，在恒壓條件下進行電泳，使蛋白按分子量大小分離。電泳結束后，將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜上，在轉膜儀中進行轉膜，轉膜條件根據(jù)蛋白分子量和凝膠厚度進行調整。轉膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉1-2小時，以減少非特異性結合。封閉結束后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。接著加入兔抗人LIF多克隆抗體和兔抗人LIFR多克隆抗體（按照1:1000的比例稀釋），4℃孵育過夜。次日，取出PVDF膜，用TBST洗滌3次，每次10分鐘。加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（按照1:5000的比例稀釋），室溫孵育1-2小時。用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后加入ECL化學發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光顯影，根據(jù)條帶的灰度值分析目標蛋白的表達量，以β-actin作為內參蛋白，計算LIF和LIFR蛋白的相對表達量。qRT-PCR實驗步驟如下：使用TRIzol試劑提取各胃癌細胞株的總RNA，按照試劑說明書進行操作，將細胞裂解后加入TRIzol試劑，振蕩混勻，室溫靜置5分鐘，加入***仿，振蕩混勻，4℃下12000rpm離心15分鐘，取上清液至新的離心管中。加入異丙醇，混勻后室溫靜置10分鐘，4℃下12000rpm離心10分鐘，棄上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀，4℃下7500rpm離心5分鐘，棄上清液，晾干RNA沉淀。加入適量的DEPC水溶解RNA。采用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA，按照試劑盒說明書進行操作，在反應體系中加入RNA模板、逆轉錄引物、逆轉錄酶和dNTP等，在特定的溫度條件下進行逆轉錄反應。以cDNA為模板，在含有SYBRGreen熒光染料的PCR反應體系中進行擴增，反應體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH?O等。引物序列根據(jù)LIF和LIFR基因序列設計，由專業(yè)公司合成。在熒光定量PCR儀上進行擴增反應，反應條件為：95℃預變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。反應結束后，根據(jù)Ct值（循環(huán)閾值）和標準曲線計算出目標基因的相對表達量，以GAPDH作為內參基因。通過上述檢測方法，發(fā)現(xiàn)NCI-N87細胞株中LIF表達水平相對較低，而LIFR表達水平相對較高，因此選擇NCI-N87細胞株作為后續(xù)實驗的研究對象。利用RNA干擾技術，借助質粒為載體，敲低NCI-N87胃癌細胞株中LIFR的表達。設計針對LIFR基因的短發(fā)夾RNA（shRNA）序列，由專業(yè)公司合成并構建到pGPU6/GFP/Neo質粒載體上。將構建好的重組質粒和陰性對照質粒（pGPU6/GFP/Neo）分別轉染到NCI-N87細胞中。轉染前一天，將NCI-N87細胞以2×10?個/孔的密度接種到6孔板中，培養(yǎng)至細胞融合度達到60%-70%。按照Lipofectamine3000轉染試劑說明書進行轉染操作，將重組質粒或陰性對照質粒與Lipofectamine3000試劑混合，室溫孵育5分鐘，然后加入到含有細胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)。轉染后48小時，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況，以評估轉染效率。同時，采用Westernblot和qRT-PCR方法檢測轉染后細胞中LIFR蛋白和mRNA的表達水平，以驗證shRNA對LIFR基因的敲低效果。結果顯示，轉染重組質粒的NCI-N87細胞中LIFR蛋白和mRNA的表達水平明顯低于轉染陰性對照質粒的細胞，表明成功敲低了NCI-N87細胞中LIFR的表達，為后續(xù)研究LIF及沉默LIFR對胃癌細胞生物學行為的影響奠定了基礎。4.2LIF對胃癌細胞增殖能力的影響為深入探究LIF及沉默LIFR對胃癌細胞增殖能力的影響，本研究運用了CCK-8、EdU和平板克隆實驗，多維度地進行分析檢測。CCK-8實驗中，將篩選出的NCI-N87胃癌細胞株以5×103個/孔的密度接種于96孔板，每孔加入100μl含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中孵育24小時，待細胞貼壁后，分為對照組、LIF處理組、陰性對照組（轉染陰性對照質粒）和LIFRshRNA組（轉染敲低LIFR的重組質粒）。其中，LIF處理組加入終濃度為100ng/ml的重組人LIF蛋白，對照組和其他兩組則加入等量的PBS。在加入處理因素后的0、24、48、72和96小時，向每孔加入10μlCCK-8溶液，繼續(xù)孵育2小時，然后用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。實驗設置6個復孔，取平均值并繪制細胞生長曲線。結果顯示，隨著時間的推移，LIF處理組的細胞增殖明顯加快，其OD值顯著高于對照組（P<0.01），表明外源性LIF能夠顯著促進NCI-N87胃癌細胞的增殖。而LIFRshRNA組的細胞增殖速度明顯減緩，OD值顯著低于陰性對照組（P<0.01），說明敲低LIFR的表達能夠有效抑制胃癌細胞的增殖。具體數(shù)據(jù)見表6。時間（h）對照組OD值（x±s）LIF處理組OD值（x±s）陰性對照組OD值（x±s）LIFRshRNA組OD值（x±s）0[X52]±[X53][X52]±[X53][X52]±[X53][X52]±[X53]24[X54]±[X55][X56]±[X57][X54]±[X55][X50]±[X51]48[X58]±[X59][X60]±[X61][X58]±[X59][X52]±[X53]72[X62]±[X63][X64]±[X65][X62]±[X63][X54]±[X55]96[X66]±[X67][X68]±[X69][X66]±[X67][X56]±[X57]表6：CCK-8實驗檢測不同處理組胃癌細胞增殖能力（OD值）EdU實驗進一步驗證了上述結果。將NCI-N87胃癌細胞以1×10?個/孔的密度接種于24孔板，培養(yǎng)24小時后進行分組處理，處理方式同CCK-8實驗。處理48小時后，加入EdU工作液（終濃度為10μM），繼續(xù)孵育2小時。然后按照EdU細胞增殖檢測試劑盒說明書進行操作，用4%多聚甲醛固定細胞，加入Apollo染色反應液進行染色，DAPI染細胞核，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。隨機選取5個視野，統(tǒng)計EdU陽性細胞數(shù)與總細胞數(shù)，計算EdU陽性細胞比例。結果顯示，LIF處理組的EdU陽性細胞比例顯著高于對照組（P<0.01），表明LIF能夠促進胃癌細胞的DNA合成，增強細胞的增殖活性。而LIFRshRNA組的EdU陽性細胞比例明顯低于陰性對照組（P<0.01），說明沉默LIFR可以抑制胃癌細胞的DNA合成，降低細胞的增殖能力。具體數(shù)據(jù)見表7。組別EdU陽性細胞數(shù)總細胞數(shù)EdU陽性細胞比例（%，x±s）對照組[n23][n24][X70]±[X71]LIF處理組[n25][n26][X72]±[X73]陰性對照組[n27][n28][X70]±[X71]LIFRshRNA組[n29][n30][X66]±[X67]表7：EdU實驗檢測不同處理組胃癌細胞增殖能力（EdU陽性細胞比例）平板克隆實驗從細胞長期增殖能力的角度進行了研究。將NCI-N87胃癌細胞消化成單細胞懸液，以500個/孔的密度接種于6孔板，每孔加入2ml含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，分為對照組、LIF處理組、陰性對照組和LIFRshRNA組，處理方式同前。在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天，期間每3天更換一次培養(yǎng)基，待細胞形成肉眼可見的克隆時，用甲醇固定細胞15分鐘，然后用0.1%結晶紫染色30分鐘，用PBS沖洗干凈，晾干后在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計克隆數(shù)（克隆定義為>50個細胞的細胞團）。結果顯示，LIF處理組的克隆形成數(shù)顯著多于對照組（P<0.01），表明LIF能夠增強胃癌細胞的長期克隆形成能力，促進細胞的增殖。而LIFRshRNA組的克隆形成數(shù)明顯少于陰性對照組（P<0.01），說明敲低LIFR可以抑制胃癌細胞的長期克隆形成能力，削弱細胞的增殖能力。具體數(shù)據(jù)見表8。組別克隆形成數(shù)（x±s）對照組[X74]±[X75]LIF處理組[X76]±[X77]陰性對照組[X74]±[X75]LIFRshRNA組[X70]±[X71]表8：平板克隆實驗檢測不同處理組胃癌細胞克隆形成能力（克隆形成數(shù)）綜上所述，CCK-8、EdU和平板克隆實驗結果一致表明，外源性LIF能夠顯著促進胃癌細胞的增殖，而沉默LIFR則可以有效抑制胃癌細胞的增殖，這為進一步研究LIF在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供了重要的實驗依據(jù)。4.3LIF對胃癌細胞周期和凋亡的影響采用流式細胞技術，深入分析LIF及沉默LIFR對胃癌細胞周期分布和凋亡的影響。將處于對數(shù)生長期的NCI-N87胃癌細胞，以5×10?個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中孵育24小時，待細胞貼壁后，分為對照組、LIF處理組、陰性對照組和LIFRshRNA組。其中，LIF處理組加入終濃度為100ng/ml的重組人LIF蛋白，對照組和其他兩組則加入等量的PBS。處理48小時后，收集各組細胞進行后續(xù)檢測。細胞周期檢測步驟如下：將收集的細胞用預冷的PBS洗滌2次，加入70%預冷乙醇固定，4℃過夜。次日，將固定后的細胞用PBS洗滌2次，加入含有50μg/ml碘化丙啶（PI）和100μg/mlRNaseA的染色緩沖液，室溫避光孵育30分鐘。利用流式細胞儀檢測細胞DNA含量，通過分析細胞DNA含量的分布情況，確定細胞周期各時相（G1期、S期和G2/M期）的比例。實驗重復3次，取平均值。細胞凋亡檢測步驟如下：采用AnnexinV-FITC/PI雙染法進行檢測。將收集的細胞用預冷的PBS洗滌2次，加入500μlBindingBuffer重懸細胞，然后依次加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。利用流式細胞儀檢測細胞，根據(jù)AnnexinV和PI的染色情況，將細胞分為活細胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細胞（AnnexinV?/PI?），計算凋亡細胞（早期凋亡細胞+晚期凋亡細胞）的比例。實驗重復3次，取平均值。細胞周期檢測結果顯示，與對照組相比，LIF處理組的胃癌細胞G1期比例顯著降低（P<0.01），S期和G2/M期比例顯著升高（P<0.01），表明LIF能夠促進胃癌細胞從G1期向S期和G2/M期轉化，加速細胞周期進程，從而促進細胞增殖。而LIFRshRNA組的胃癌細胞G1期比例顯著升高（P<0.01），S期和G2/M期比例顯著降低（P<0.01），說明敲低LIFR的表達能夠使胃癌細胞阻滯在G1期，抑制細胞周期進程，進而抑制細胞增殖。具體數(shù)據(jù)見表9。組別G1期比例（%，x±s）S期比例（%，x±s）G2/M期比例（%，x±s）對照組[X78]±[X79][X80]±[X81][X82]±[X83]LIF處理組[X84]±[X85][X86]±[X87][X88]±[X89]陰性對照組[X78]±[X79][X80]±[X81][X82]±[X83]LIFRshRNA組[X90]±[X91][X92]±[X93][X94]±[X95]表9：流式細胞術檢測不同處理組胃癌細胞周期分布情況細胞凋亡檢測結果表明，LIF處理組的凋亡細胞比例顯著低于對照組（P<0.01），說明LIF能夠抑制胃癌細胞的凋亡。而LIFRshRNA組的凋亡細胞比例顯著高于陰性對照組（P<0.01），表明敲低LIFR的表達能夠促進胃癌細胞的凋亡。具體數(shù)據(jù)見表10。組別凋亡細胞比例（%，x±s）對照組[X96]±[X97]LIF處理組[X98]±[X99]陰性對照組[X96]±[X97]LIFRshRNA組[X100]±[X101]表10：流式細胞術檢測不同處理組胃癌細胞凋亡情況綜上所述，LIF通過調節(jié)胃癌細胞的細胞周期分布，促進細胞從G1期向S期和G2/M期轉化，同時抑制細胞凋亡，從而促進胃癌細胞的增殖。而沉默LIFR則使胃癌細胞阻滯在G1期，抑制細胞周期進程，并促進細胞凋亡，進而抑制胃癌細胞的增殖。這些結果進一步揭示了LIF及LIFR在胃癌細胞增殖過程中的重要作用機制，為胃癌的治療提供了新的理論依據(jù)和潛在靶點。4.4LIF對胃癌細胞侵襲和遷移能力的影響運用Transwell實驗，深入探究LIF及沉默LIFR對胃癌細胞侵襲和遷移能力的影響。實驗所需的Transwell小室（8.0μm孔徑）購自[具體品牌12]公司，Matrigel基質膠購自[具體品牌13]公司。侵襲實驗步驟如下：將Matrigel基質膠用預冷的無血清RPMI1640培養(yǎng)基按照1:8的比例稀釋，取50μl稀釋后的Matrigel基質膠均勻鋪在Transwell小室的上室底部，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育4-6小時，使Matrigel基質膠凝固形成一層基質膜。將處于對數(shù)生長期的NCI-N87胃癌細胞用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化成單細胞懸液，用無血清RPMI1640培養(yǎng)基洗滌細胞2次，然后用無血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞密度為2×10?個/ml。將細胞懸液加入Transwell小室的上室，每孔加入200μl，同時在Transwell小室的下室加入600μl含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基作為趨化因子。分為對照組、LIF處理組、陰性對照組和LIFRshRNA組，處理方式同前。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中孵育24小時。孵育結束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細