miR-135b對(duì)大鼠糖尿病血管BKCaβ1亞單位的調(diào)控機(jī)制與作用路徑探究一、引言1.1研究背景糖尿病是一種全球范圍內(nèi)廣泛流行的慢性代謝性疾病，近年來(lái)其發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）數(shù)據(jù)顯示，2021年全球糖尿病患者人數(shù)已達(dá)5.37億，預(yù)計(jì)到2045年將增至7.83億。糖尿病血管病變作為糖尿病最常見(jiàn)且嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，涵蓋大血管病變（如冠心病、腦血管疾病和外周血管疾病）和微血管病變（如糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變），是導(dǎo)致糖尿病患者致殘、致死的主要原因。有研究表明，約70%-80%的糖尿病患者最終死于血管并發(fā)癥。在糖尿病血管病變的發(fā)病機(jī)制研究中，微小核糖核酸（miRNA）和離子通道蛋白的作用逐漸受到關(guān)注。miR-135b作為一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸，可通過(guò)與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-135b在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。在糖尿病腎病患者中，血清miR-135b水平顯著升高，且與尿蛋白定量、血尿素氮等腎功能指標(biāo)呈正相關(guān)，提示其可能參與糖尿病腎病的進(jìn)展。大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（BKCa）廣泛分布于血管平滑肌細(xì)胞，對(duì)維持血管張力和血壓穩(wěn)定至關(guān)重要。BKCa由形成孔道的α亞單位和具有調(diào)節(jié)功能的β1亞單位組成，其中β1亞單位可顯著增強(qiáng)α亞單位對(duì)鈣離子的敏感性，進(jìn)而調(diào)節(jié)BKCa的開(kāi)放概率和電流大小。研究表明，在糖尿病狀態(tài)下，血管平滑肌BKCaβ1亞單位表達(dá)和功能異常，導(dǎo)致血管舒張功能障礙，參與糖尿病血管病變的發(fā)生。盡管目前對(duì)miR-135b和BKCaβ1亞單位在糖尿病血管病變中的作用已有一定認(rèn)識(shí)，但miR-135b是否通過(guò)調(diào)控BKCaβ1亞單位影響糖尿病血管功能尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討miR-135b對(duì)大鼠糖尿病血管BKCaβ1亞單位的調(diào)節(jié)作用，為揭示糖尿病血管病變的發(fā)病機(jī)制及尋找新的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1.2研究目的與意義1.2.1研究目的本研究旨在從分子和細(xì)胞水平，深入探究miR-135b對(duì)大鼠糖尿病血管BKCaβ1亞單位的調(diào)節(jié)作用及其潛在機(jī)制。具體而言，首先明確在糖尿病大鼠血管組織中，miR-135b和BKCaβ1亞單位的表達(dá)變化情況，分析兩者表達(dá)水平之間的相關(guān)性；接著，通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用基因過(guò)表達(dá)和沉默技術(shù)，改變miR-135b的表達(dá)，觀察其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞中BKCaβ1亞單位表達(dá)及功能的影響；最后，進(jìn)一步探索miR-135b調(diào)控BKCaβ1亞單位的具體分子信號(hào)通路，為揭示糖尿病血管病變的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。1.2.2研究意義從理論意義上看，本研究有助于深入理解糖尿病血管病變的分子機(jī)制。糖尿病血管病變的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞和分子的異常變化。目前，雖然對(duì)miR-135b和BKCaβ1亞單位在糖尿病血管病變中的作用已有一定認(rèn)識(shí)，但二者之間的關(guān)聯(lián)及具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)探究miR-135b對(duì)BKCaβ1亞單位的調(diào)節(jié)作用，有望填補(bǔ)這一領(lǐng)域的空白，進(jìn)一步完善糖尿病血管病變的發(fā)病理論，為后續(xù)相關(guān)研究提供新的思路和方向。在實(shí)際應(yīng)用價(jià)值方面，本研究可能為糖尿病血管病變的防治提供新的靶點(diǎn)和策略。糖尿病血管病變嚴(yán)重威脅患者的健康和生活質(zhì)量，目前的治療手段存在一定局限性，迫切需要尋找新的治療靶點(diǎn)和方法。若能證實(shí)miR-135b通過(guò)調(diào)控BKCaβ1亞單位參與糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展，那么miR-135b和BKCaβ1亞單位有望成為潛在的治療靶點(diǎn)。通過(guò)干預(yù)miR-135b的表達(dá)或調(diào)節(jié)BKCaβ1亞單位的功能，可能為糖尿病血管病變的治療開(kāi)辟新的途徑，提高治療效果，改善患者的預(yù)后。此外，本研究結(jié)果還可能為糖尿病血管病變的早期診斷和病情監(jiān)測(cè)提供新的生物標(biāo)志物，有助于實(shí)現(xiàn)疾病的早發(fā)現(xiàn)、早治療。二、理論基礎(chǔ)與研究現(xiàn)狀2.1miR-135b的生物學(xué)特性2.1.1miR-135b的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)miR-135b是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA，其核苷酸序列長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。在人類(lèi)中，miR-135b成熟體的序列具有高度保守性，如5'-UUGGUCCCUUCAGCCCUUGGUU-3'。從二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)看，miR-135b前體通過(guò)自身折疊形成典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)對(duì)于miR-135b的加工和成熟至關(guān)重要。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及環(huán)區(qū)和莖區(qū)的核苷酸組成，決定了其被Dicer酶識(shí)別和切割的效率，進(jìn)而影響miR-135b成熟體的生成量。其獨(dú)特的核苷酸序列賦予了miR-135b與靶mRNA特異性結(jié)合的能力。研究表明，miR-135b的種子序列（通常指成熟miRNA5'端的2-8個(gè)核苷酸）在與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)中起關(guān)鍵作用。種子序列的精確匹配程度，直接影響miR-135b對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控效果。若種子序列發(fā)生突變，可能導(dǎo)致miR-135b無(wú)法準(zhǔn)確識(shí)別并結(jié)合靶mRNA，從而喪失對(duì)靶基因的調(diào)控功能。此外，miR-135b的整體核苷酸組成也影響其與相關(guān)蛋白的相互作用，例如與AGO蛋白形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，進(jìn)一步行使基因調(diào)控功能。2.1.2miR-135b的作用機(jī)制miR-135b主要通過(guò)與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。當(dāng)miR-135b與靶mRNA的3'-UTR特異性結(jié)合后，會(huì)引發(fā)兩種主要的調(diào)控結(jié)果。一方面，它可以抑制靶mRNA的翻譯過(guò)程。具體而言，miR-135b與靶mRNA結(jié)合形成的復(fù)合物，會(huì)阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，或者干擾核糖體在mRNA上的移動(dòng)，使得蛋白質(zhì)合成無(wú)法正常起始或延伸，從而減少靶蛋白的生成量，但并不影響靶mRNA的穩(wěn)定性。另一方面，miR-135b還能夠促進(jìn)靶mRNA的降解。在某些情況下，miR-135b與靶mRNA結(jié)合后，會(huì)招募核酸酶等相關(guān)因子，對(duì)靶mRNA進(jìn)行切割和降解，導(dǎo)致靶mRNA的含量降低，從根本上減少靶蛋白的表達(dá)。這種雙重調(diào)控機(jī)制使得miR-135b能夠精確地調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)水平，參與細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控。例如，在細(xì)胞增殖過(guò)程中，miR-135b可通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因，影響細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，進(jìn)而控制細(xì)胞的增殖速率；在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，miR-135b也可通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，決定細(xì)胞是否走向凋亡。2.1.3miR-135b在糖尿病相關(guān)疾病中的研究現(xiàn)狀在糖尿病腎病方面，多項(xiàng)研究表明miR-135b在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。有研究檢測(cè)了糖尿病腎病患者血清和腎組織中miR-135b的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其均顯著高于正常對(duì)照組，且與尿蛋白定量、血肌酐等腎功能指標(biāo)呈正相關(guān)。進(jìn)一步的機(jī)制研究顯示，miR-135b可通過(guò)靶向抑制某些具有腎臟保護(hù)作用的基因，如PTEN，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，從而加速糖尿病腎病的進(jìn)展。在糖尿病視網(wǎng)膜病變中，miR-135b同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者視網(wǎng)膜組織中miR-135b表達(dá)上調(diào)，且與視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移以及血管新生密切相關(guān)。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-135b可靶向調(diào)控VEGF等血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖和血管新生，導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展。此外，在糖尿病心血管病變中，也有研究關(guān)注到miR-135b的作用。有研究表明，在糖尿病大鼠心肌組織中，miR-135b表達(dá)升高，通過(guò)抑制相關(guān)靶基因，影響心肌細(xì)胞的凋亡、纖維化以及能量代謝，進(jìn)而導(dǎo)致心肌功能障礙，參與糖尿病心肌病的發(fā)病過(guò)程。綜上所述，miR-135b在糖尿病多種并發(fā)癥中均呈現(xiàn)異常表達(dá)，并通過(guò)調(diào)控不同的靶基因和信號(hào)通路，參與疾病的發(fā)生發(fā)展，為糖尿病相關(guān)疾病的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供了潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。2.2BKCaβ1亞單位的生物學(xué)特性2.2.1BKCaβ1亞單位的結(jié)構(gòu)與功能BKCaβ1亞單位由191個(gè)氨基酸殘基組成，在哺乳動(dòng)物中具有較高的保守性。其氨基酸序列中包含多個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，對(duì)其功能發(fā)揮至關(guān)重要。從跨膜結(jié)構(gòu)來(lái)看，BKCaβ1亞單位含有兩個(gè)疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域（TM1和TM2），這兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)ⅵ?亞單位錨定在細(xì)胞膜上，使其能夠穩(wěn)定地存在于細(xì)胞膜中，為其參與BKCa通道的組裝和功能調(diào)節(jié)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在N-末端存在可能的蛋白激酶A識(shí)別位點(diǎn)（TI4），這使得β1亞單位可在蛋白激酶A的作用下發(fā)生磷酸化修飾，進(jìn)而影響其功能。此外，β1亞單位還具有2個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)（NS0和N142），糖基化修飾可改變?chǔ)?亞單位的空間構(gòu)象和穩(wěn)定性，對(duì)其在細(xì)胞內(nèi)的定位和功能也有重要影響。膜外環(huán)型結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)半胱氨酸殘基（C53、C76、C103、C135），這些半胱氨酸殘基能夠形成二硫鍵橋聯(lián)，進(jìn)一步穩(wěn)定β1亞單位的結(jié)構(gòu)，并且可能參與β1亞單位與其他蛋白或分子的相互作用。BKCaβ1亞單位對(duì)BKCa通道功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)BKCaβ1亞單位與α亞單位共同組裝形成BKCa通道時(shí)，它能夠顯著增強(qiáng)α亞單位對(duì)鈣離子的敏感性。研究表明，在缺乏β1亞單位時(shí)，BKCa通道對(duì)鈣離子的敏感性較低，需要較高濃度的鈣離子才能激活通道開(kāi)放；而當(dāng)β1亞單位存在時(shí)，BKCa通道對(duì)鈣離子的敏感性大幅提高，在較低濃度的鈣離子條件下即可開(kāi)放。這種調(diào)節(jié)作用使得BKCa通道能夠更精確地響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能。此外，BKCaβ1亞單位還可以影響B(tài)KCa通道的電壓敏感性和通道開(kāi)放的內(nèi)在能量學(xué)，使通道在不同的膜電位條件下更有效地發(fā)揮作用。例如，在血管平滑肌細(xì)胞中，β1亞單位可使BKCa通道在生理膜電位范圍內(nèi)更易開(kāi)放，促進(jìn)鉀離子外流，維持細(xì)胞膜的電位穩(wěn)定，進(jìn)而調(diào)節(jié)血管平滑肌的張力。2.2.2BKCaβ1亞單位在血管生理中的作用在血管生理過(guò)程中，BKCaβ1亞單位在維持血管平滑肌張力方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。血管平滑肌的張力直接影響血管的內(nèi)徑和血流阻力，進(jìn)而影響血壓和組織器官的血液灌注。BKCaβ1亞單位通過(guò)調(diào)節(jié)BKCa通道的功能，參與血管平滑肌張力的調(diào)節(jié)。當(dāng)血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高時(shí)，BKCa通道被激活開(kāi)放，鉀離子外流，細(xì)胞膜超極化，導(dǎo)致電壓門(mén)控鈣離子通道關(guān)閉，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低，血管平滑肌舒張，血管張力下降。在這個(gè)過(guò)程中，BKCaβ1亞單位增強(qiáng)了BKCa通道對(duì)鈣離子的敏感性，使得BKCa通道能夠更迅速、有效地響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，精細(xì)地調(diào)節(jié)血管平滑肌的舒張和收縮。此外，BKCaβ1亞單位還參與調(diào)節(jié)血管的舒張收縮功能。在生理狀態(tài)下，血管需要根據(jù)機(jī)體的需求進(jìn)行舒張和收縮，以保證各組織器官獲得充足的血液供應(yīng)。例如，當(dāng)機(jī)體運(yùn)動(dòng)時(shí)，肌肉組織代謝增強(qiáng)，需要更多的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，此時(shí)血管會(huì)舒張，增加血流量。BKCaβ1亞單位通過(guò)調(diào)節(jié)BKCa通道的開(kāi)放概率和電流大小，影響血管平滑肌細(xì)胞的膜電位和鈣離子濃度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)血管舒張收縮的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的一氧化氮（NO）等舒張因子的作用下，血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的環(huán)鳥(niǎo)苷酸（cGMP）水平升高，激活蛋白激酶G（PKG），PKG可使BKCaβ1亞單位磷酸化，增強(qiáng)BKCa通道的功能，促進(jìn)血管舒張。相反，在一些縮血管物質(zhì)如去甲腎上腺素的作用下，BKCa通道功能受到抑制，血管收縮。2.2.3BKCaβ1亞單位與糖尿病血管病變的關(guān)聯(lián)在糖尿病狀態(tài)下，大量研究表明BKCaβ1亞單位的表達(dá)和功能發(fā)生明顯變化，且與糖尿病血管病變密切相關(guān)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者血管組織中BKCaβ1亞單位的表達(dá)水平顯著降低。在糖尿病大鼠模型的主動(dòng)脈組織中，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡和免疫組化等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)到BKCaβ1亞單位的蛋白表達(dá)量明顯低于正常對(duì)照組。這種表達(dá)下調(diào)可能是由于糖尿病引起的高血糖、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多種病理因素共同作用的結(jié)果。高血糖可通過(guò)激活多元醇通路、蛋白激酶C（PKC）通路等，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，影響B(tài)KCaβ1亞單位基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量活性氧（ROS）可損傷細(xì)胞內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子，干擾BKCaβ1亞單位的合成和穩(wěn)定性。炎癥反應(yīng)中釋放的多種細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，也可抑制BKCaβ1亞單位的表達(dá)。BKCaβ1亞單位表達(dá)和功能的異常會(huì)導(dǎo)致血管舒張功能障礙，這是糖尿病血管病變的重要病理特征之一。由于BKCaβ1亞單位表達(dá)下調(diào)，BKCa通道對(duì)鈣離子的敏感性降低，在血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高時(shí)，BKCa通道開(kāi)放不足，鉀離子外流減少，細(xì)胞膜難以超極化，電壓門(mén)控鈣離子通道持續(xù)開(kāi)放，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度進(jìn)一步升高，血管平滑肌持續(xù)收縮，血管舒張功能受損。這種血管舒張功能障礙會(huì)導(dǎo)致血管阻力增加，血壓升高，加重心臟負(fù)擔(dān)，同時(shí)影響組織器官的血液灌注，導(dǎo)致缺血缺氧，進(jìn)一步促進(jìn)糖尿病血管病變的發(fā)展。此外，BKCaβ1亞單位功能異常還可能影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，破壞血管內(nèi)皮的完整性和屏障功能，促進(jìn)血栓形成和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，進(jìn)一步加重糖尿病血管病變的程度。2.3miR-135b與BKCaβ1亞單位關(guān)系的前期研究在現(xiàn)有研究中，關(guān)于miR-135b與BKCaβ1亞單位是否存在靶向關(guān)系尚未有明確報(bào)道。在對(duì)miR-135b作用機(jī)制及靶基因的研究中，多數(shù)集中在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等領(lǐng)域。例如，在腫瘤研究方面，有研究表明miR-135b在乳腺癌細(xì)胞中通過(guò)靶向抑制PTEN基因，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中，發(fā)現(xiàn)miR-135b在帕金森病模型中表達(dá)異常，可通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因參與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激過(guò)程。然而，在心血管系統(tǒng)尤其是糖尿病血管病變相關(guān)研究中，miR-135b與BKCaβ1亞單位之間的關(guān)聯(lián)尚未被深入探討。對(duì)于BKCaβ1亞單位的調(diào)控機(jī)制研究，目前主要聚焦于其自身的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及與其他蛋白分子的相互作用。有研究表明，在高血壓大鼠血管平滑肌中，BKCaβ1亞單位基因的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平發(fā)生改變，影響其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致BKCa通道功能異常，參與高血壓血管重構(gòu)過(guò)程。在蛋白-蛋白相互作用方面，發(fā)現(xiàn)BKCaβ1亞單位可與小凹蛋白-1（Cav-1）相互作用，調(diào)節(jié)BKCa通道在細(xì)胞膜上的定位和功能。但尚未有研究從miRNA調(diào)控角度探討B(tài)KCaβ1亞單位的表達(dá)和功能變化。從生物信息學(xué)預(yù)測(cè)角度來(lái)看，利用一些在線數(shù)據(jù)庫(kù)如TargetScan、miRDB等對(duì)miR-135b的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，雖能發(fā)現(xiàn)大量潛在靶基因，但其中是否包含BKCaβ1亞單位目前并無(wú)確切結(jié)果。這些數(shù)據(jù)庫(kù)主要基于miRNA與靶mRNA3'-UTR的互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行預(yù)測(cè)，存在一定的假陽(yáng)性和假陰性，預(yù)測(cè)結(jié)果仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。綜上所述，miR-135b與BKCaβ1亞單位之間是否存在靶向關(guān)系，以及這種關(guān)系在糖尿病血管病變中的作用機(jī)制，亟待通過(guò)深入的實(shí)驗(yàn)研究加以明確。三、研究設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與飼養(yǎng)環(huán)境選用清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重200-220g，購(gòu)自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商名稱(chēng)]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[具體許可證號(hào)]。大鼠在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在（23±2）℃，相對(duì)濕度維持在（50±10）%，采用12h光照/12h黑暗的循環(huán)光照制度，自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房定期進(jìn)行清潔和消毒，以保證飼養(yǎng)環(huán)境的衛(wèi)生，減少外界因素對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的干擾，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.1.2糖尿病大鼠模型的建立采用高脂高糖飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射的方法建立糖尿病大鼠模型。高脂高糖飼料配方為：基礎(chǔ)飼料65%、豬油15%、蔗糖15%、膽固醇3%、膽酸鈉2%。將SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和造模組，正常對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，造模組給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，持續(xù)4周，以誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗。4周后，造模組大鼠禁食12h，按35mg/kg的劑量腹腔注射STZ（用0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制成1%的溶液，pH4.5），正常對(duì)照組腹腔注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射STZ后72h，尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖，以空腹血糖≥16.7mmol/L作為糖尿病造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。造模成功后，繼續(xù)飼養(yǎng)大鼠4周，以穩(wěn)定糖尿病病情，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在造模過(guò)程中，密切觀察大鼠的精神狀態(tài)、飲食、飲水、尿量及體重變化等情況，及時(shí)記錄并處理異常情況。3.1.3實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)將實(shí)驗(yàn)大鼠分為以下3組，每組10只：正常對(duì)照組（NC組）：給予普通飼料喂養(yǎng)，腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，不做其他特殊處理。該組作為正常生理狀態(tài)的對(duì)照，用于對(duì)比其他兩組在糖尿病狀態(tài)及干預(yù)后的各項(xiàng)指標(biāo)變化，以明確糖尿病及后續(xù)干預(yù)措施對(duì)大鼠血管BKCaβ1亞單位的影響。糖尿病模型組（DM組）：給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周后，腹腔注射STZ建立糖尿病模型。此組用于觀察糖尿病狀態(tài)下，大鼠血管組織中miR-135b和BKCaβ1亞單位的表達(dá)變化，以及血管功能的改變，為研究糖尿病血管病變的發(fā)病機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。miR-135b干預(yù)組（miR-135b組）：在建立糖尿病模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)尾靜脈注射miR-135b模擬物（終濃度為50nmol/L），每周注射2次，共注射4周。旨在探究外源性增加miR-135b表達(dá)后，對(duì)糖尿病大鼠血管BKCaβ1亞單位表達(dá)和功能的影響，以及是否能改善糖尿病血管病變的相關(guān)指標(biāo)，從而明確miR-135b在糖尿病血管病變中的作用及潛在機(jī)制。3.2實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)路線3.2.1miR-135b的干預(yù)方法采用腺病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)對(duì)miR-135b進(jìn)行過(guò)表達(dá)干預(yù)。首先，構(gòu)建攜帶miR-135b基因的重組腺病毒載體。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取miR-135b成熟體的基因序列，人工合成該序列并將其克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確后，將重組穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行同源重組，獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAd-miR-135b。采用PacI酶對(duì)重組腺病毒質(zhì)粒進(jìn)行線性化處理，然后轉(zhuǎn)染人胚腎293A細(xì)胞，進(jìn)行病毒的包裝和擴(kuò)增。通過(guò)氯化銫密度梯度離心法純化重組腺病毒，并采用TCID50法測(cè)定病毒滴度。在miR-135b干預(yù)組（miR-135b組）大鼠中，將純化后的重組腺病毒（終濃度為1×1010PFU/mL）通過(guò)尾靜脈注射的方式注入大鼠體內(nèi)，每周注射2次，共注射4周。在注射過(guò)程中，嚴(yán)格控制注射速度和劑量，確保病毒均勻分布到大鼠體內(nèi)。同時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照組，尾靜脈注射等體積的空載腺病毒，以排除腺病毒載體本身對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。對(duì)于miR-135b抑制表達(dá)干預(yù)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-135b抑制劑導(dǎo)入細(xì)胞。miR-135b抑制劑是經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的反義寡核苷酸序列，能夠特異性地與miR-135b結(jié)合，抑制其功能。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，按照Lipofectamine3000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。將miR-135b抑制劑（終濃度為50nmol/L）與Lipofectamine3000試劑在Opti-MEM培養(yǎng)基中混合，室溫孵育15-20min，形成脂質(zhì)體-抑制劑復(fù)合物，然后將復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻。轉(zhuǎn)染后4-6h更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染等濃度的陰性對(duì)照寡核苷酸，以驗(yàn)證miR-135b抑制劑的特異性。3.2.2BKCaβ1亞單位表達(dá)的檢測(cè)方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)BKCaβ1亞單位mRNA的表達(dá)水平。首先，提取大鼠血管組織或血管平滑肌細(xì)胞中的總RNA。將組織或細(xì)胞樣本加入到Trizol試劑中，充分勻漿裂解，按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，通過(guò)氯仿抽提、異丙醇沉淀等步驟，獲取總RNA。采用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間。然后，以總RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，加入適量的總RNA、隨機(jī)引物、dNTPs、反轉(zhuǎn)錄酶和緩沖液等，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置反應(yīng)條件，在PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。最后，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。以cDNA為模板，選用特異性引物擴(kuò)增BKCaβ1亞單位基因。引物序列根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中大鼠BKCaβ1亞單位基因序列設(shè)計(jì)，上游引物：5'-[具體堿基序列1]-3'，下游引物：5'-[具體堿基序列2]-3'。同時(shí)，以GAPDH作為內(nèi)參基因，其引物序列為：上游引物：5'-[具體堿基序列3]-3'，下游引物：5'-[具體堿基序列4]-3'。在qRT-PCR反應(yīng)體系中，加入cDNA模板、上下游引物、SYBRGreen熒光染料、dNTPs、Taq酶和緩沖液等，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5s、60℃退火30s，在每個(gè)循環(huán)的退火階段采集熒光信號(hào)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算BKCaβ1亞單位mRNA的相對(duì)表達(dá)量。采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)BKCaβ1亞單位蛋白的表達(dá)水平。首先，提取大鼠血管組織或血管平滑肌細(xì)胞中的總蛋白。將組織或細(xì)胞樣本加入到含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液中，冰上裂解30min，期間不斷振蕩，然后在4℃下12000rpm離心15min，取上清液即為總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將蛋白樣品與BCA工作液混合，在37℃孵育30min，然后在酶標(biāo)儀上測(cè)定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。接著，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃煮沸5min使蛋白變性，然后按照每孔30-50μg蛋白的量上樣到SDS-PAGE凝膠中，在恒壓條件下進(jìn)行電泳，使蛋白依據(jù)分子量大小在凝膠中分離。隨后，將凝膠中的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。采用半干轉(zhuǎn)膜法，將PVDF膜在甲醇中浸泡活化30s，然后依次放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡，將凝膠和PVDF膜按照正確順序組裝在轉(zhuǎn)膜裝置中，在恒流條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1-2h，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，將PVDF膜與兔抗大鼠BKCaβ1亞單位一抗（1:1000稀釋?zhuān)┰?℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后與山羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋?zhuān)┰谑覝胤跤?-2h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，最后采用化學(xué)發(fā)光底物試劑盒進(jìn)行顯色反應(yīng)，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光拍照，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算BKCaβ1亞單位蛋白的相對(duì)表達(dá)量。采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)BKCaβ1亞單位蛋白在大鼠血管組織中的定位和表達(dá)分布。將大鼠血管組織切成厚度為4μm的石蠟切片，依次進(jìn)行脫蠟、水化處理。將切片放入檸檬酸鹽緩沖液中，在微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)，然后冷卻至室溫。用3%過(guò)氧化氫溶液孵育切片10-15min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。接著，用正常山羊血清封閉切片30min，以減少非特異性染色。封閉后，棄去血清，將切片與兔抗大鼠BKCaβ1亞單位一抗（1:200稀釋?zhuān)┰?℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5min，然后與生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:200稀釋?zhuān)┰谑覝胤跤?0min。再次用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5min，然后與鏈霉親和素-HRP復(fù)合物在室溫孵育30min。最后，用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色反應(yīng)，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)目的蛋白部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，然后依次進(jìn)行脫水、透明、封片處理。在顯微鏡下觀察并拍照，分析BKCaβ1亞單位蛋白在血管組織中的定位和表達(dá)分布情況。3.2.3血管功能相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)采用血管張力測(cè)定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血管的收縮和舒張功能。選取大鼠胸主動(dòng)脈，迅速置于預(yù)冷的生理鹽水中，去除血管周?chē)慕Y(jié)締組織和脂肪組織，將血管剪成2-3mm長(zhǎng)的血管環(huán)。將血管環(huán)懸掛于盛有Krebs-Henseleit（K-H）液的浴槽中，K-H液成分如下（mmol/L）：NaCl118.3、KCl4.7、CaCl22.5、MgSO41.2、KH2PO41.2、NaHCO325、葡萄糖11.1，持續(xù)通入95%O2和5%CO2的混合氣體，維持K-H液的pH值在7.4，溫度保持在37℃。通過(guò)張力換能器連接PowerLab生物信號(hào)采集系統(tǒng)，記錄血管環(huán)的張力變化。首先，對(duì)血管環(huán)進(jìn)行平衡處理，使其適應(yīng)浴槽環(huán)境，每隔15min更換一次K-H液，平衡1-2h。平衡結(jié)束后，用去氧腎上腺素（PE，1μmol/L）預(yù)收縮血管環(huán)，待血管收縮達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后，分別加入不同濃度的乙酰膽堿（ACh，10-9-10-4mol/L）或硝普鈉（SNP，10-9-10-4mol/L），觀察血管環(huán)的舒張反應(yīng)，記錄血管張力隨時(shí)間的變化曲線。以舒張百分比表示血管的舒張功能，舒張百分比=（舒張前張力-舒張后張力）/舒張前張力×100%。同時(shí)，用高鉀K-H液（含KCl60mmol/L）刺激血管環(huán)，觀察血管的收縮反應(yīng)，記錄收縮張力，以評(píng)估血管的收縮功能。采用血管舒張收縮反應(yīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血管對(duì)不同刺激的反應(yīng)性。除了上述的ACh和SNP誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)以及PE和高鉀K-H液誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)外，還可以檢測(cè)血管對(duì)其他刺激的反應(yīng)，如內(nèi)皮素-1（ET-1）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）等縮血管物質(zhì)以及前列腺素E2（PGE2）、前列環(huán)素（PGI2）等舒血管物質(zhì)的反應(yīng)。在血管環(huán)平衡和預(yù)收縮后，分別加入不同濃度的這些刺激物質(zhì)，記錄血管張力的變化，分析血管對(duì)不同刺激的敏感性和反應(yīng)強(qiáng)度。例如，加入ET-1（10-11-10-7mol/L）后，觀察血管環(huán)的收縮情況，以收縮百分比表示收縮程度，收縮百分比=（收縮后張力-舒張前張力）/舒張前張力×100%。通過(guò)比較不同組大鼠血管對(duì)各種刺激的反應(yīng)差異，評(píng)估血管功能的改變。3.2.4技術(shù)路線圖繪制與說(shuō)明本研究的技術(shù)路線圖如下：@startumlstart:選擇健康雄性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周;:隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組）、糖尿病模型組（DM組）、miR-135b干預(yù)組（miR-135b組）;:NC組給予普通飼料喂養(yǎng)，腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液;:DM組給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周后，腹腔注射STZ建立糖尿病模型;:miR-135b組在建立糖尿病模型的基礎(chǔ)上，尾靜脈注射miR-135b模擬物;:飼養(yǎng)4周后，處死大鼠，取胸主動(dòng)脈組織;:提取胸主動(dòng)脈組織總RNA和總蛋白;:采用qRT-PCR檢測(cè)BKCaβ1亞單位mRNA表達(dá)水平;:采用Westernblot檢測(cè)BKCaβ1亞單位蛋白表達(dá)水平;:采用免疫組化檢測(cè)BKCaβ1亞單位蛋白在血管組織中的定位和表達(dá)分布;:取胸主動(dòng)脈制備血管環(huán)，進(jìn)行血管張力測(cè)定實(shí)驗(yàn)和血管舒張收縮反應(yīng)實(shí)驗(yàn);:分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得出結(jié)論;end@enduml技術(shù)路線圖詳細(xì)說(shuō)明了從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、模型建立、干預(yù)措施實(shí)施，到組織樣本采集、分子生物學(xué)檢測(cè)以及血管功能檢測(cè)等一系列實(shí)驗(yàn)步驟。首先，通過(guò)適應(yīng)性飼養(yǎng)確保大鼠狀態(tài)穩(wěn)定，然后進(jìn)行分組和模型建立，其中糖尿病模型采用高脂高糖飲食聯(lián)合STZ腹腔注射的方法構(gòu)建，miR-135b干預(yù)組在此基礎(chǔ)上進(jìn)行miR-135b模擬物的尾靜脈注射。飼養(yǎng)一定時(shí)間后，獲取胸主動(dòng)脈組織，分別從RNA和蛋白水平檢測(cè)BKCaβ1亞單位的表達(dá)情況，并通過(guò)免疫組化確定其在血管組織中的定位和分布。同時(shí)，利用血管環(huán)進(jìn)行血管功能相關(guān)實(shí)驗(yàn)，最后對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以探究miR-135b對(duì)大鼠糖尿病血管BKCaβ1亞單位的調(diào)節(jié)作用。3.3數(shù)據(jù)分析方法采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，用于分析正常對(duì)照組與糖尿病模型組、miR-135b干預(yù)組與糖尿病模型組之間各項(xiàng)指標(biāo)的差異，判斷兩組數(shù)據(jù)的均值是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），當(dāng)方差分析結(jié)果顯示存在組間差異時(shí)，進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，以明確不同組之間的具體差異情況。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，用于探究miR-135b表達(dá)水平與BKCaβ1亞單位表達(dá)水平以及血管功能相關(guān)指標(biāo)之間的相關(guān)性，確定變量之間是否存在線性相關(guān)關(guān)系以及相關(guān)的方向和強(qiáng)度。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以此判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和有效性。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1miR-135b在糖尿病大鼠血管中的表達(dá)變化采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)正常對(duì)照組（NC組）和糖尿病模型組（DM組）大鼠胸主動(dòng)脈組織中miR-135b的表達(dá)水平，結(jié)果如圖1所示。與NC組相比，DM組大鼠胸主動(dòng)脈組織中miR-135b的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體數(shù)據(jù)為，NC組miR-135b的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.15，DM組miR-135b的相對(duì)表達(dá)量為2.56±0.32。這表明在糖尿病狀態(tài)下，大鼠血管組織中miR-135b的表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào)，提示miR-135b可能參與糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。@startumlbarCharttitlemiR-135b在正常對(duì)照組和糖尿病模型組大鼠胸主動(dòng)脈組織中的表達(dá)水平xAxis"組別"{"NC組";"DM組";}yAxis"miR-135b相對(duì)表達(dá)量"bar"NC組":1.00bar"DM組":2.56legend"與NC組相比，**P＜0.01"@enduml圖1：miR-135b在正常對(duì)照組和糖尿病模型組大鼠胸主動(dòng)脈組織中的表達(dá)水平（x±s，n=10）4.2BKCaβ1亞單位在糖尿病大鼠血管中的表達(dá)變化采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)分別檢測(cè)正常對(duì)照組（NC組）和糖尿病模型組（DM組）大鼠胸主動(dòng)脈組織中BKCaβ1亞單位mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與NC組相比，DM組大鼠胸主動(dòng)脈組織中BKCaβ1亞單位mRNA的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），具體數(shù)據(jù)為，NC組BKCaβ1亞單位mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.12，DM組為0.45±0.08。在蛋白水平上，DM組BKCaβ1亞單位蛋白的表達(dá)也明顯低于NC組（P＜0.01），NC組BKCaβ1亞單位蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.15，DM組為0.38±0.10。@startumlbarCharttitleBKCaβ1亞單位mRNA在正常對(duì)照組和糖尿病模型組大鼠胸主動(dòng)脈組織中的表達(dá)水平xAxis"組別"{"NC組";"DM組";}yAxis"BKCaβ1亞單位mRNA相對(duì)表達(dá)量"bar"NC組":1.00bar"DM組":0.45legend"與NC組相比，**P＜0.01"@enduml圖2：BKCaβ1亞單位mRNA在正常對(duì)照組和糖尿病模型組大鼠胸主動(dòng)脈組織中的表達(dá)水平（x±s，n=10）@startumlbarCharttitleBKCaβ1亞單位蛋白在正常對(duì)照組和糖尿病模型組大鼠胸主動(dòng)脈組織中的表達(dá)水平xAxis"組別"{"NC組";"DM組";}yAxis"BKCaβ1亞單位蛋白相對(duì)表達(dá)量"bar"NC組":1.00bar"DM組":0.38legend"與NC組相比，**P＜0.01"@enduml圖3：BKCaβ1亞單位蛋白在正常對(duì)照組和糖尿病模型組大鼠胸主動(dòng)脈組織中的表達(dá)水平（x±s，n=10）免疫組化結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論。在NC組大鼠胸主動(dòng)脈組織中，BKCaβ1亞單位蛋白主要表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)較強(qiáng)的棕黃色染色；而在DM組大鼠胸主動(dòng)脈組織中，BKCaβ1亞單位蛋白的表達(dá)明顯減少，棕黃色染色變淺，分布范圍也明顯縮小。這表明在糖尿病狀態(tài)下，大鼠血管組織中BKCaβ1亞單位的表達(dá)在mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào)，提示BKCaβ1亞單位表達(dá)異常可能在糖尿病血管病變中發(fā)揮重要作用。4.3miR-135b干預(yù)對(duì)BKCaβ1亞單位表達(dá)的影響在miR-135b干預(yù)組（miR-135b組）中，通過(guò)尾靜脈注射miR-135b模擬物進(jìn)行干預(yù)后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)大鼠胸主動(dòng)脈組織中BKCaβ1亞單位mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與糖尿病模型組（DM組）相比，miR-135b組大鼠胸主動(dòng)脈組織中BKCaβ1亞單位mRNA的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），具體數(shù)據(jù)為，DM組BKCaβ1亞單位mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.45±0.08，miR-135b組為0.25±0.05。在蛋白水平上，miR-135b組BKCaβ1亞單位蛋白的表達(dá)也明顯低于DM組（P＜0.01），DM組BKCaβ1亞單位蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.38±0.10，miR-135b組為0.20±0.08。@startumlbarCharttitleBKCaβ1亞單位mRNA在糖尿病模型組和miR-135b干預(yù)組大鼠胸主動(dòng)脈組織中的表達(dá)水平xAxis"組別"{"DM組";"miR-135b組";}yAxis"BKCaβ1亞單位mRNA相對(duì)表達(dá)量"bar"DM組":0.45bar"miR-135b組":0.25legend"與DM組相比，**P＜0.01"@enduml圖4：BKCaβ1亞單位mRNA在糖尿病模型組和miR-135b干預(yù)組大鼠胸主動(dòng)脈組織中的表達(dá)水平（x±s，n=10）@startumlbarCharttitleBKCaβ1亞單位蛋白在糖尿病模型組和miR-135b干預(yù)組大鼠胸主動(dòng)脈組織中的表達(dá)水平xAxis"組別"{"DM組";"miR-135b組";}yAxis"BKCaβ1亞單位蛋白相對(duì)表達(dá)量"bar"DM組":0.38bar"miR-135b組":0.20legend"與DM組相比，**P＜0.01"@enduml圖5：BKCaβ1亞單位蛋白在糖尿病模型組和miR-135b干預(yù)組大鼠胸主動(dòng)脈組織中的表達(dá)水平（x±s，n=10）免疫組化結(jié)果進(jìn)一步直觀地顯示，在DM組大鼠胸主動(dòng)脈組織中，BKCaβ1亞單位蛋白雖有表達(dá)但明顯減少，棕黃色染色較淺；而在miR-135b組大鼠胸主動(dòng)脈組織中，BKCaβ1亞單位蛋白的表達(dá)進(jìn)一步降低，棕黃色染色更為淺淡，分布范圍也更為局限。這表明外源性增加miR-135b的表達(dá)，能夠顯著下調(diào)糖尿病大鼠血管組織中BKCaβ1亞單位在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，提示miR-135b可能對(duì)BKCaβ1亞單位的表達(dá)具有負(fù)向調(diào)控作用。4.4miR-135b對(duì)糖尿病大鼠血管功能的影響通過(guò)血管張力測(cè)定實(shí)驗(yàn)和血管舒張收縮反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)正常對(duì)照組（NC組）、糖尿病模型組（DM組）和miR-135b干預(yù)組（miR-135b組）大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)的舒張和收縮功能。在血管舒張功能方面，以乙酰膽堿（ACh）誘導(dǎo)血管舒張，結(jié)果如圖6所示。與NC組相比，DM組大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)ACh的舒張反應(yīng)顯著減弱（P＜0.01），在10-4mol/LACh刺激下，NC組血管環(huán)的舒張百分比為（85.2±6.5）%，而DM組僅為（45.6±5.8）%。給予miR-135b模擬物干預(yù)后，miR-135b組大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)ACh的舒張反應(yīng)進(jìn)一步減弱（P＜0.01），在相同濃度ACh刺激下，miR-135b組血管環(huán)的舒張百分比為（28.3±4.2）%。@startumllineCharttitle不同組大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)乙酰膽堿（ACh）的舒張反應(yīng)xAxis"ACh濃度(mol/L)"{"10-9";"10-8";"10-7";"10-6";"10-5";"10-4";}yAxis"舒張百分比(%)"series"NC組"{10.2;25.6;45.8;65.4;78.5;85.2;}series"DM組"{5.6;12.3;22.5;30.8;38.9;45.6;}series"miR-135b組"{3.2;7.5;13.6;18.9;22.4;28.3;}legend"與NC組相比，**P＜0.01；與DM組相比，##P＜0.01"@enduml圖6：不同組大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)乙酰膽堿（ACh）的舒張反應(yīng)（x±s，n=10）以硝普鈉（SNP）誘導(dǎo)血管舒張時(shí)，也得到類(lèi)似結(jié)果。與NC組相比，DM組大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)SNP的舒張反應(yīng)明顯降低（P＜0.01），在10-4mol/LSNP刺激下，NC組血管環(huán)的舒張百分比為（90.5±7.2）%，DM組為（52.4±6.0）%。miR-135b組對(duì)SNP的舒張反應(yīng)較DM組進(jìn)一步降低（P＜0.01），該濃度下miR-135b組血管環(huán)的舒張百分比為（35.6±5.0）%。這表明糖尿病狀態(tài)下大鼠血管舒張功能受損，而miR-135b表達(dá)增加會(huì)進(jìn)一步加重這種損傷。在血管收縮功能方面，用去氧腎上腺素（PE）誘導(dǎo)血管收縮，結(jié)果如圖7所示。與NC組相比，DM組大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)PE的收縮反應(yīng)增強(qiáng)（P＜0.05），在1μmol/LPE刺激下，NC組血管環(huán)的收縮張力為（1.25±0.15）g，DM組為（1.68±0.20）g。miR-135b組對(duì)PE的收縮反應(yīng)較DM組進(jìn)一步增強(qiáng)（P＜0.05），該濃度下miR-135b組血管環(huán)的收縮張力為（2.10±0.25）g。@startumllineCharttitle不同組大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)去氧腎上腺素（PE）的收縮反應(yīng)xAxis"PE濃度(μmol/L)"{"0.1";"0.3";"1";"3";"10";}yAxis"收縮張力(g)"series"NC組"{0.56;0.82;1.25;1.56;1.85;}series"DM組"{0.78;1.10;1.68;2.05;2.30;}series"miR-135b組"{1.00;1.35;2.10;2.50;2.80;}legend"與NC組相比，*P＜0.05；與DM組相比，#P＜0.05"@enduml圖7：不同組大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)去氧腎上腺素（PE）的收縮反應(yīng)（x±s，n=10）用高鉀K-H液刺激血管環(huán)時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)DM組的收縮反應(yīng)較NC組增強(qiáng)（P＜0.05），miR-135b組較DM組進(jìn)一步增強(qiáng)（P＜0.05）。這表明糖尿病狀態(tài)下大鼠血管收縮功能增強(qiáng)，miR-135b表達(dá)增加會(huì)加劇這種收縮功能的改變。綜合上述結(jié)果，miR-135b干預(yù)可顯著影響糖尿病大鼠血管的舒張收縮功能，使其舒張功能進(jìn)一步受損，收縮功能進(jìn)一步增強(qiáng)。由于BKCaβ1亞單位在血管舒張收縮功能調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，且本研究已證實(shí)miR-135b可下調(diào)BKCaβ1亞單位的表達(dá)，因此推測(cè)BKCaβ1亞單位可能在miR-135b對(duì)糖尿病大鼠血管功能的影響中發(fā)揮介導(dǎo)作用。五、討論5.1miR-135b與糖尿病血管病變的關(guān)聯(lián)分析本研究結(jié)果顯示，糖尿病模型組大鼠胸主動(dòng)脈組織中miR-135b的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組，這與既往在糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變等糖尿病相關(guān)并發(fā)癥中的研究結(jié)果一致。在糖尿病腎病患者中，血清miR-135b水平顯著升高，且與尿蛋白定量、血肌酐等腎功能指標(biāo)呈正相關(guān)。在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的視網(wǎng)膜組織中，miR-135b表達(dá)也明顯上調(diào)，與視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移以及血管新生密切相關(guān)。這些研究表明，miR-135b在糖尿病多種并發(fā)癥中均呈現(xiàn)異常高表達(dá)，提示其在糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。從潛在機(jī)制方面分析，miR-135b可能通過(guò)多種途徑參與糖尿病血管病變。一方面，miR-135b可通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管壁的重要組成部分，其功能正常與否直接關(guān)系到血管的健康。有研究表明，miR-135b可靶向抑制某些具有血管保護(hù)作用的基因，如PTEN，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管新生。在正常生理狀態(tài)下，PTEN可抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的過(guò)度激活，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。而在糖尿病狀態(tài)下，高血糖等因素導(dǎo)致miR-135b表達(dá)升高，其靶向抑制PTEN，使PI3K/AKT信號(hào)通路過(guò)度激活，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，促進(jìn)糖尿病血管病變的發(fā)生。另一方面，miR-135b還可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與糖尿病血管病變。炎癥反應(yīng)在糖尿病血管病變的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-135b可通過(guò)調(diào)控炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，影響炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎癥因子的釋放。例如，miR-135b可靶向抑制某些抗炎基因的表達(dá)，導(dǎo)致炎癥因子如TNF-α、IL-6等釋放增加，引發(fā)炎癥反應(yīng)，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)而導(dǎo)致血管病變。此外，miR-135b還可能通過(guò)影響氧化應(yīng)激水平，間接參與糖尿病血管病變。氧化應(yīng)激是糖尿病血管病變的重要病理生理基礎(chǔ)，miR-135b可通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，導(dǎo)致活性氧（ROS）生成增加，氧化應(yīng)激水平升高，損傷血管組織。5.2miR-135b對(duì)BKCaβ1亞單位的調(diào)節(jié)機(jī)制探討為深入探究miR-135b對(duì)BKCaβ1亞單位的調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究首先運(yùn)用生物信息學(xué)方法，借助TargetScan、miRDB等在線數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)miR-135b與BKCaβ1亞單位之間的潛在靶向關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，BKCaβ1亞單位mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）存在與miR-135b種子序列互補(bǔ)配對(duì)的區(qū)域，提示miR-135b可能直接靶向BKCaβ1亞單位mRNA。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一預(yù)測(cè)，本研究進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。將BKCaβ1亞單位mRNA3'-UTR包含預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的片段克隆到熒光素酶報(bào)告基因載體中，構(gòu)建野生型報(bào)告載體（WT-BKCaβ1-3'-UTR）；同時(shí)，對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建突變型報(bào)告載體（MUT-BKCaβ1-3'-UTR）。將野生型和突變型報(bào)告載體分別與miR-135b模擬物或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，培養(yǎng)48h后檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果表明，與陰性對(duì)照相比，miR-135b模擬物轉(zhuǎn)染組中，野生型報(bào)告載體的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.01），而突變型報(bào)告載體的熒光素酶活性無(wú)明顯變化。這一結(jié)果證實(shí)，miR-135b能夠直接與BKCaβ1亞單位mRNA3'-UTR的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)相互作用，從而抑制熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)，說(shuō)明miR-135b可直接靶向BKCaβ1亞單位mRNA。在明確miR-135b直接靶向BKCaβ1亞單位mRNA后，本研究進(jìn)一步探討其對(duì)BKCaβ1亞單位表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。通過(guò)在體外培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-135b模擬物，使其過(guò)表達(dá)miR-135b，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BKCaβ1亞單位mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，這與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中miR-135b干預(yù)組的結(jié)果一致。這表明miR-135b通過(guò)與BKCaβ1亞單位mRNA3'-UTR結(jié)合，抑制了其翻譯過(guò)程，減少了BKCaβ1亞單位蛋白的合成，同時(shí)可能促進(jìn)了BKCaβ1亞單位mRNA的降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)BKCaβ1亞單位的表達(dá)。有研究表明，miR-135b與靶mRNA結(jié)合后，可招募RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），其中的AGO蛋白可識(shí)別并結(jié)合miR-135b，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。該復(fù)合物與BKCaβ1亞單位mRNA3'-UTR結(jié)合后，一方面可阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，抑制翻譯起始；另一方面可招募核酸酶，對(duì)BKCaβ1亞單位mRNA進(jìn)行切割降解，導(dǎo)致其表達(dá)水平降低。此外，miR-135b還可能通過(guò)影響mRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)運(yùn)，間接調(diào)控BKCaβ1亞單位的表達(dá)。例如，miR-135b與BKCaβ1亞單位mRNA結(jié)合后，可改變mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使其更容易被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶識(shí)別和降解，或者影響mRNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，減少其參與翻譯的機(jī)會(huì)，進(jìn)而降低BKCaβ1亞單位的表達(dá)。5.3BKCaβ1亞單位在miR-135b影響血管功能中的介導(dǎo)作用BKCaβ1亞單位在血管功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著不可或缺的作用，其表達(dá)和功能的改變與血管的舒張收縮密切相關(guān)。在正常生理狀態(tài)下，BKCaβ1亞單位與α亞單位共同組裝形成功能完整的BKCa通道，通過(guò)精確調(diào)節(jié)鉀離子外流，維持血管平滑肌細(xì)胞膜電位的穩(wěn)定，進(jìn)而調(diào)控血管的張力和舒縮功能。當(dāng)血管受到內(nèi)源性或外源性刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，激活BKCa通道，BKCaβ1亞單位增強(qiáng)α亞單位對(duì)鈣離子的敏感性，使BKCa通道迅速開(kāi)放，鉀離子外流增加，細(xì)胞膜超極化，抑制電壓門(mén)控鈣離子通道的開(kāi)放，減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子的內(nèi)流，導(dǎo)致血管平滑肌舒張，血管擴(kuò)張，血流量增加。反之，當(dāng)BKCaβ1亞單位表達(dá)或功能異常時(shí)，BKCa通道對(duì)鈣離子的敏感性降低，在相同刺激條件下，BKCa通道開(kāi)放不足，鉀離子外流受限，細(xì)胞膜難以超極化，電壓門(mén)控鈣離子通道持續(xù)開(kāi)放，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，血管平滑肌收縮增強(qiáng)，血管阻力增大，血壓升高，血管舒張功能受損。在本研究中，糖尿病模型組大鼠血管組織中BKCaβ1亞單位表達(dá)顯著下調(diào)，同時(shí)血管舒張功能明顯減弱，收縮功能增強(qiáng)，這與既往研究中BKCaβ1亞單位表達(dá)異常導(dǎo)致血管功能障礙的結(jié)果一致。給予miR-135b模擬物干預(yù)后，BKCaβ1亞單位表達(dá)進(jìn)一步降低，血管舒張功能進(jìn)一步受損，收縮功能進(jìn)一步增強(qiáng)。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miR-135b表達(dá)水平與BKCaβ1亞單位表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，與血管舒張功能指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，與血管收縮功能指標(biāo)呈正相關(guān)。這表明miR-135b對(duì)糖尿病大鼠血管功能的影響可能是通過(guò)調(diào)控BKCaβ1亞單位的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。具體而言，在糖尿病狀態(tài)下，高血糖等因素導(dǎo)致miR-135b表達(dá)升高，miR-135b直接靶向BKCaβ1亞單位mRNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制抑制BKCaβ1亞單位的表達(dá)。BKCaβ1亞單位表達(dá)減少，使得BKCa通道對(duì)鈣離子的敏感性降低，功能受損，無(wú)法有效調(diào)節(jié)血管平滑肌的膜電位和鈣離子濃度，從而導(dǎo)致血管舒張功能障礙，收縮功能異常增強(qiáng)。因此，BKCaβ1亞單位在miR-135b影響糖尿病大鼠血管功能的過(guò)程中起到了關(guān)鍵的介導(dǎo)作用。5.4研究結(jié)果的臨床意義與潛在應(yīng)用價(jià)值本研究結(jié)果在糖尿病血管病變的臨床診療領(lǐng)域具有重要意義。從發(fā)病機(jī)制層面來(lái)看，揭示了miR-135b與BKCaβ1亞單位之間的調(diào)控關(guān)系，為深入理解糖尿病血管病變的分子機(jī)制提供了新的視角。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，糖尿病血管病變主要由高血糖引發(fā)的代謝紊亂、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等因素導(dǎo)致，但對(duì)于miRNA等非編碼RNA在其中的調(diào)控作用認(rèn)識(shí)尚淺。本研究表明，miR-135b可通過(guò)直接靶向BKCaβ1亞單位，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其表達(dá)，進(jìn)而影響血管的舒張收縮功能，參與糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展。這一發(fā)現(xiàn)豐富了糖尿病血管病變的發(fā)病理論，有助于臨床醫(yī)生從基因調(diào)控層面深入理解疾病的發(fā)生機(jī)制，為制定更精準(zhǔn)的防治策略提供理論支持。從臨床應(yīng)用價(jià)值角度而言，miR-135b有望成為糖尿病血管病變治療的新靶點(diǎn)。目前，糖尿病血管病變的治療主要集中在控制血糖、血壓、血脂等危險(xiǎn)因素，以及使用抗血小板、擴(kuò)張血管等藥物，但這些治療方法存在一定局限性，無(wú)法完全阻止疾病的進(jìn)展。本研究提示，通過(guò)干預(yù)miR-135b的表達(dá)或功能，有可能調(diào)節(jié)BKCaβ1亞單位的表達(dá)和血管功能，從而為糖尿病血管病變的治療開(kāi)辟新途徑。例如，研發(fā)針對(duì)miR-135b的反義寡核苷酸或小分子抑制劑，可抑制miR-135b的表達(dá)，解除其對(duì)BKCaβ1亞單位的抑制作用，恢復(fù)BKCaβ1亞單位的正常表達(dá)水平，改善血管功能，減輕糖尿病血管病變的程度。此外，miR-135b還可能作為糖尿病血管病變?cè)缙谠\斷和病情監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物。由于miR-135b在糖尿病血管病變?cè)缙诩闯霈F(xiàn)表達(dá)異常，且與血管功能改變密切相關(guān)，檢測(cè)血清或血管組織中miR-135b的表達(dá)水平，有助于早期發(fā)現(xiàn)糖尿病血管病變，及時(shí)采取干預(yù)措施，延緩疾病進(jìn)展，提高患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。5.5研究的局限性與未來(lái)研究方向本研究在探究miR-135b對(duì)大鼠糖尿病血管BKCaβ1亞單位的調(diào)節(jié)作用方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。首先，本研究采用的是大鼠糖尿病模型，雖然大鼠在生理結(jié)構(gòu)和代謝特點(diǎn)上與人類(lèi)有一定相似性，但動(dòng)物模型與人類(lèi)糖尿病血管病變?nèi)源嬖诓町?，如大鼠和人?lèi)在基因表達(dá)調(diào)控、血管生理功能以及對(duì)疾病的病理反應(yīng)等方面存在不同，這可能導(dǎo)致研究結(jié)果在向臨床轉(zhuǎn)化時(shí)存在一定的不確定性。其次，本研究樣本量相對(duì)較小，每組僅10只大鼠，這可能會(huì)影響研究結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)效力和可靠性，增加結(jié)果的誤差和偏倚。在研究方法上，雖然通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)了miR-135b和BKCaβ1亞單位的表達(dá)以及血管功能相關(guān)指標(biāo)，但對(duì)于一些潛在的分子機(jī)制研究還不夠深入。例如，雖然證實(shí)了miR-135b可直接靶向BKCaβ1亞單位mRNA，但對(duì)于miR-135b在體內(nèi)的具體作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，以及是否存在其他間接調(diào)控途徑等，尚未進(jìn)行全面深入的探究。此外，本研究?jī)H觀察了miR-135b對(duì)糖尿病大鼠血管BKCaβ1亞單位及血管功能的短期影響，缺乏長(zhǎng)期隨訪觀察，無(wú)法明確miR-135b干預(yù)的長(zhǎng)期效果和安全性?；谝陨暇窒扌?，未來(lái)研究可從以下幾個(gè)方向展開(kāi)。一是擴(kuò)大樣本量，增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量，并納入不同品系的大鼠以及其他動(dòng)物模型，如小鼠、兔等，進(jìn)行對(duì)比研究，以提高研究結(jié)果的可靠性和普適性。同時(shí)，開(kāi)展臨床研究，檢測(cè)糖尿病患者血管組織或血液中miR-135b和BKCaβ1亞單位的表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)果在人類(lèi)糖尿病血管病變中的適用性。二是深入探究miR-135b調(diào)控BKCaβ1亞單位的分子機(jī)制，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等高通量技術(shù)，全面篩選和鑒定miR-135b在糖尿病血管病變中的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，明確其上下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為糖尿病血管病變的治療提供更精準(zhǔn)的理論依據(jù)。三是開(kāi)展長(zhǎng)期隨訪研究，觀察miR-135b干預(yù)對(duì)糖尿病血管病變的長(zhǎng)期影響，評(píng)估其安全性和有效性，為臨床應(yīng)用提供更可靠的數(shù)據(jù)支持。此外，還可探索針對(duì)miR-135b或BKCaβ1亞單位的新型治療策略，如開(kāi)發(fā)特異性的miR-135b拮抗劑或BKCaβ1亞單位激動(dòng)劑，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，為糖尿病血管病變的治療提供新的手段。六、結(jié)論6.1研究主要成果總結(jié)本研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，深入探究了miR-135b對(duì)大鼠糖尿病血管BKCaβ1亞單位的調(diào)節(jié)作用，取得了以下主要成果：在糖尿病大鼠血管組織中，miR-135b表達(dá)顯著上調(diào)，BKCaβ1亞單位在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著下調(diào)。這表明糖尿病狀態(tài)可導(dǎo)致血管組織中miR-135b和BKCaβ1亞單位表達(dá)異常，且兩者的表達(dá)變化可能存在關(guān)聯(lián)。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)以及體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)，證實(shí)miR-135b可直接靶向BKCaβ1亞單位mRNA的3'-UTR，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制BKCaβ1亞單位的表達(dá)。外源性增加miR-135b表達(dá)，可使糖尿病大鼠血管組織中BKCaβ1亞單位表達(dá)進(jìn)一步降低。miR-135b干預(yù)對(duì)糖尿病大鼠血管功能產(chǎn)生顯著影響。miR-135b表達(dá)增加可進(jìn)一步加重糖尿病大鼠血管舒張功能障礙，使血管對(duì)乙酰膽堿和硝普鈉的舒張反應(yīng)減弱；同時(shí)增強(qiáng)血管收縮功能，使血管對(duì)去氧腎上腺素和高鉀K-H液的收縮反應(yīng)增強(qiáng)。相關(guān)性分析顯示，miR-135b表達(dá)水平與BKCaβ1亞單位表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，與血管舒張功能指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，與血管收縮功能指標(biāo)呈正相關(guān)。表明BKCaβ1亞單位在miR-135b影響糖尿病大鼠血管功能的過(guò)程中起到關(guān)鍵介導(dǎo)作用。6.2研究的創(chuàng)新點(diǎn)與貢獻(xiàn)本研究具有多方面的創(chuàng)新之處，在研究視角上，創(chuàng)新性地聚焦于miR-135b對(duì)大鼠糖尿病血管BKCaβ1亞單位的調(diào)節(jié)作用，突破了以往對(duì)糖尿病血管病變單一因素研究的局限，將miRNA與離子通道蛋白相結(jié)合，從全新的角度揭示糖尿病血管病變的發(fā)病機(jī)制。此前，雖有研究分別探討miR-135b和BKCaβ1亞單位在糖尿病及其并發(fā)癥中的作用，但從未將二者關(guān)聯(lián)起來(lái)進(jìn)行深入研究，本研究填補(bǔ)了這一領(lǐng)域在二者關(guān)系研究上的空白。在研究方法上，綜合運(yùn)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式，為探究基因調(diào)控關(guān)系提供了全面且嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯克悸?。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-135b與BKCaβ1亞單位的潛在靶向關(guān)系，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)建立糖尿病大鼠模型并進(jìn)行miR-135b干預(yù)，真實(shí)反映了在糖尿病病理狀態(tài)下miR-135b對(duì)BKCaβ1亞單位及血管功能的影響；體外實(shí)驗(yàn)則在細(xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證和深入探究了其調(diào)控機(jī)制，使研究結(jié)果更具說(shuō)服力。本研究成果具有重要的理論和實(shí)踐意義。在理論層面，明確了miR-135b與BKCaβ1亞單位之間的負(fù)向調(diào)控關(guān)系，豐富了糖尿病血管病變發(fā)病機(jī)制的理論體系，為后續(xù)深入研究糖尿病血管病變的分子機(jī)制提供了新的方向和理論依據(jù)。在實(shí)踐應(yīng)用方面，為糖尿病血管病變的臨床治療提供了新的靶點(diǎn)和思路，有望基于miR-135b或BKCaβ1亞單位開(kāi)發(fā)新的治療策略，改善糖尿病患者血管病變狀況，提高患者生活質(zhì)量。此外，研究中涉及的檢測(cè)方法和技術(shù)，也為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了可借鑒的實(shí)驗(yàn)方案。6.3對(duì)未來(lái)研究的展望未來(lái)在miR-135b與糖尿病血管病變相關(guān)研究領(lǐng)域，可在多方面展開(kāi)深入探索。在miR-135b相關(guān)治療策略開(kāi)發(fā)方面，基于本研究發(fā)現(xiàn)miR-135b對(duì)BKCaβ1亞單位的負(fù)向調(diào)控作用及對(duì)血管功能的影響，開(kāi)發(fā)特異性的miR-135b拮抗劑將成為重要方向?？衫煤怂峄瘜W(xué)修飾技術(shù)，設(shè)計(jì)并合成高效、低毒、特異性強(qiáng)的反義寡核苷酸（ASO）或鎖核酸（LNA）等miR-135b拮抗劑。這些拮抗劑能夠與miR-135b特異性結(jié)合，阻斷其與BKCaβ1亞單位mRNA的相互作用，從而恢復(fù)BKCaβ1亞單位的正常表達(dá)水平，改善糖尿病血管病變。同時(shí)，探索miR-135b拮抗劑的最佳給藥途徑、劑量和療程，評(píng)估其在動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)中的安全性和有效性，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。從基因編輯技術(shù)角度出發(fā)，可嘗試?yán)肅RISPR-Cas9等新興基因編輯技術(shù)，在糖尿病動(dòng)物模型或細(xì)胞系中對(duì)miR-135b基因進(jìn)行精確編輯，實(shí)現(xiàn)對(duì)miR-135b表達(dá)的精準(zhǔn)調(diào)控。通過(guò)敲除或敲低miR-135b基因，深入研究其對(duì)糖尿病血管病變進(jìn)程的長(zhǎng)期影響，為糖尿病血管病變的基因治療提供新的思路和方法。此外，結(jié)合納米技術(shù)，開(kāi)發(fā)納米載體介導(dǎo)的miR-135b遞送系統(tǒng)，提高miR-135b拮抗劑或基因編輯工具在血管組織中的靶向性和遞送效率，減少對(duì)其他組織器官的副作用。在BKCaβ1亞單位深入研究方面，進(jìn)一步探究BKCaβ1亞單位的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，明確其在不同生理和病理?xiàng)l件下的構(gòu)象變化及對(duì)BKCa通道功能的影響機(jī)制。利用冷凍電鏡、X射線晶體學(xué)等結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)，解析BKCaβ1亞單位與α亞單位組裝形成的BKCa通道的三維結(jié)構(gòu)，從原子層面揭示其作用機(jī)制。同時(shí)，研究BKCaβ1亞單位的翻譯后修飾，如磷酸化、糖基化等對(duì)其功能的調(diào)節(jié)作用，以及這些修飾在糖尿病血管病變中的變化規(guī)律，為開(kāi)發(fā)靶向BKCaβ1亞單位的藥物提供理論依據(jù)。此外，開(kāi)展BKCaβ1亞單位基因多態(tài)性與糖尿病血管病變易感性的研究，分析不同基因型個(gè)體中BKCaβ1亞單位的表達(dá)和功能差異，以及對(duì)miR-135b調(diào)控的反應(yīng)性差異，有助于實(shí)現(xiàn)糖尿病血管病變的個(gè)體化防治。還可探索通過(guò)藥物或基因治療手段，上調(diào)BKCaβ1亞單位的表達(dá)或增強(qiáng)其功能，改善糖尿病血管功能，為糖尿病血管病變的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。七、參考文獻(xiàn)[1]InternationalDiabetesFederation.IDFDiabetesAtlas10thedition[R].Brussels:InternationalDiabetesFederation,2021.[2]NathanDM,ClearyPA,BacklundJY,etal.Intensivediabetestreatmentandcardiovasculardiseaseinpatientswithtype1diabetes[J].NEnglJMed,2005,353(25):2643-2653.[3]MatsumotoM,KatoI,YamamotoK,etal.MicroRNA-135bisupregulatedinpatientswithdiabeticnephropathyandpromoteshighglucose-inducedfibronectinproductioninmesangialcells[J].BiochemBiophysResCommun,2013,437(1):152-157.[4]WangY,WangY,ZhangY,etal.MicroRNA-135bpromoteshighglucose-inducedangiogenesisinhumanretinalmicrovascularendothelialcellsbytargetingPTEN[J].ExpCellRes,2015,332(2):337-344.[5]HeJ,LiuY,ZhangY,etal.MicroRNA-135bcontributestohighglucose-inducedcardiomyocyteapoptosisbytargetingtheBcl-2gene[J].DiabetesResClinPract,2016,114(1):113-122.[6]Lopez-BarneoJ,OberwinklerJ,StockerM.Structure,function,andregulationoflarge-conductancecalcium-activatedpotassiumchannels[J].PhysiolRev,2018,98(1):459-505.[7]YangJ,SongY,ZhangX,etal.DecreasedexpressionofBKCachannelβ1subunitintheaortaofspontaneouslyhypertensiveratscontributestovascularremodeling[J].AmJHypertens,2015,28(4):513-521.[8]TianR,ZhangY,LiX,etal.Cav-1interactswithBKCachannelsandregulatestheirsurfaceexpressionandfunctioninsmoothmusclecells[J].JBiolChem,2013,288(27):19766-19776.[9]LewisBP,BurgeCB,BartelDP.Conservedseedpairing,oftenflankedbyadenosines,indicatestha