ICS11.120.20

CCSC30

14

山西省地方標準

DB14/T3007—2024

化妝品用原料重組人源化膠原蛋白的鑒定

Identificationprocessofrecombinanthumanizedcollagen

2024-05-29發(fā)布2024-08-28實施

山西省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB14/T3007—2024

目次

前言II

1范圍1

2規(guī)范性引用文件1

3術語和定義1

4原理1

5材料和設備1

6鑒定方法2

7結果判定3

附錄A（資料性）一種重組人源化膠原蛋白質譜鑒定結果4

I

DB14/T3007—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由山西省藥品監(jiān)督管理局提出。

本文件由山西省化妝品標準化技術委員會歸口。

本文件起草單位：山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司，山西省檢驗檢測中心（山西省標準計量技術

研究院）。

本文件主要起草人：王建、于玉鳳、盧彥宏、孫丹丹、何振瑞、李喜梅、張朝敏、張永健、劉

欣。

II

DB14/T3007—2024

化妝品用原料重組人源化膠原蛋白的鑒定

1范圍

本文件適用于化妝品用原料重組人源化膠原蛋白的鑒定。

本文件規(guī)定了化妝品用原料重組人源化膠原蛋白的鑒定項目、材料和設備、鑒定方法、結果判定

等。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文

件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適

用于本文件。

YY/T1888-2023重組人源化膠原蛋白

中華人民共和國藥典（2020年版）

3術語和定義

YY/T1888-2023界定的以及下列術語和定義適用于本文件。

3.1

肽段覆蓋率（氨基酸序列覆蓋度）Peptidecoverage

肽段覆蓋率（氨基酸序列覆蓋度）是指檢測到的肽段的氨基酸數量占該蛋白質總氨基酸數量的比

例。蛋白質經過酶切后，采用LC-MS進行檢測，鑒定到的酶切后肽段占理論序列氨基酸數量的比例。

3.2

末端氨基酸序列Terminalaminoacidsequence

末端氨基酸序列是指蛋白質序列中N端和C端的一段序列。

4原理

選用適宜的蛋白酶對重組人源化膠原蛋白進行酶解，酶解后的肽段采用高效液相色譜-串聯質譜儀

檢測肽段覆蓋率和氨基酸序列。依據樣品氨基酸序列與人膠原蛋白某亞型序列匹配度判斷是否為重組

人源化膠原蛋白。

5材料和設備

5.1試劑和材料

a)水：GB/T6682，一級；

b)碳酸氫銨：純度≥99.5%；

1

DB14/T3007—2024

c)鹽酸胍：純度≥99%；

d)二硫蘇糖醇（DTT）：純度≥99%；

e)碘乙酰胺（IAM）:純度≥99%；

f)甲酸：質譜級；

g)乙腈：質譜級；

h)超濾管；

i)胰蛋白酶（Trypsin）：測序級。

注：根據不同蛋白序列選擇適合的酶進行酶切，可采用多種酶切綜合鑒定，常用的蛋白內切酶還有賴氨酸蛋白酶

（Lys-C）、谷氨酰蛋白內切酶（Glu-C）、天冬氨酸蛋白酶（Asp-N）等。

5.2試劑配制

5.2.1碳酸氫銨溶液（50mmol/L）：準確稱取0.395g碳酸氫銨定容于100mL水中，混勻。

5.2.2鹽酸胍溶液（6mol/L）：準確稱取28.66g鹽酸胍定容于50mL的碳酸氫銨溶液（5.2.1）

中，混勻（現用現配）。

5.2.3DDT溶液（1mol/L）：準確稱取0.154g二硫蘇糖醇溶于鹽酸胍溶液（5.2.2）中，混勻

（現用現配）。

5.2.4IAM溶液（1mol/L）：準確稱取0.185gIAM溶于1mL鹽酸胍溶液（5.2.2）中，混勻后

避光放置（現用現配）。

5.2.5Trypsin溶液（0.2μg/μL）：準確稱取20μgTrypsin，溶于100μL水中，混勻。

5.2.60.1%甲酸水溶液：取1mL甲酸加水定容至1000mL,混勻。

5.2.70.1%甲酸乙腈溶液：取500μL甲酸定容于500mL乙腈中，混勻。

5.3儀器設備

5.3.1高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜儀:配有電噴霧離子源（ESI）。

5.3.2高速冷凍離心機：轉速不低于12000r/min。

5.3.3分析天平：感量0.0001g。

5.3.4水浴鍋：溫度均勻度±0.3℃。

5.3.5渦旋振蕩器。

6鑒定方法

6.1樣品處理

1)取100μL重組人源化膠原蛋白溶液(1μg/μL)置于超濾管接收管中，12000r/min離心15min；

2)變性：加入100μL鹽酸胍溶液（5.2.2）；

3)還原：加入2μLDTT溶液（5.2.3），渦旋震蕩使蛋白均勻分布于溶液中，42℃孵育1h；

4)烷基化處理：超濾管接收管中加入5μLIAM溶液（5.2.4），渦旋震蕩使蛋白均勻分布于溶液

中，避光室溫放置30min，14000g離心15min；

5)置換溶液：接收管中加入100μL碳酸氫銨溶液（5.2.1），12000r/min離心15min，重復兩次；

6)酶切：將接收管取出置于新的超濾管中，再加入碳酸氫銨溶液（5.2.1）100μL，0.2Trypsin溶

液（5.2.5）15μL，旋渦震蕩，使蛋白溶液均勻分布；

7)封口膜封好放置于37℃孵育18小時；

8)將超濾管倒置離心，收集溶液。

2

DB14/T3007—2024

6.2儀器條件

6.2.1高效液相色譜參考條件

a)色譜柱：C18，150*2.1mm（內徑），粒度1.6μm，或相當者；

b)流動相A：0.1%甲酸水溶液（5.2.6）；

c)流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液（5.2.7）；

d)流速：0.2mL/min；

e)柱溫：40℃；

f)進樣體積：4μL；

g)流動相梯度洗脫程序見表1。

表1色譜分離梯度

時間（min）A（%）B（%）

0982

1982

177030

205545

21595

25595

25.1982

30982

6.2.2質譜參考條件

a)離子源：ESI；

b)檢測方式：正離子模式；

c)MS掃描范圍200-2000m/z；

d)MS/MS掃描范圍50-2500m/z。

6.3數據分析

產生的原始數據及圖譜由數據分析軟件識別標峰并導出對應圖譜，通過質譜數據和相關質譜鑒定

圖譜進行數據庫匹配，得出肽段覆蓋率及末端氨基酸序列鑒定結果（具體示例見附錄A中A.1及A.

2）。

7結果判定

樣品檢測出的氨基酸序列需與理論氨基酸序列一致，肽段覆蓋率需達到100%。將氨基酸序列檢測

結果和人膠原蛋白某亞型序列進行比對，判斷樣品是否為重組人源化膠原蛋白(具體比對示例見附錄A

中A.3）。

將樣品檢測出的氨基酸序列與人膠原蛋白某亞型序列進行比對，匹配度100%，為“A型重組人源

化膠原蛋白”；匹配度大于等于80%，小于100%，為“B型重組人源化膠原蛋白”；匹配度小于80%，

則該樣品不屬于重組人源化膠原蛋白。

3

DB14/T3007—2024

附錄A

（資料性）

一種重組人源化膠原蛋白質譜鑒定結果

A.1肽段覆蓋率鑒定結果示例。

圖A.1重組人源化膠原蛋白Trypsin酶解產物總離子流（TIC）圖

表A.1重組人源化膠原蛋白Trypsin酶解肽段信息

PeptideRTMassCalc.MassAdductStates

GPAGER2.0585.284585.287M+2H:M+H

GER2.2360.173360.176M+H

GAPGER2.2585.284585.287M+2H:M+H

GAPGFR6.85603.309603.313M+2H:M+H

GPAGPNGIPGEK8.451092.551092.56M+3H:M+2H:M+H

GPAGPNGIPGEK8.811093.541093.54M+3H:M+2H:M+H

GPAGPNGIPGEK9.051093.541093.54M+3H:M+2H:M+H

4

DB14/T3007—2024

圖A.2重組人源化膠原蛋白Lys-C酶解肽段覆蓋率

A.2末端序列鑒定結果示例。

圖A.3重組人源化膠原蛋白Lys-C酶解產物C末端肽段序列

5

DB14/T3007—2024

圖A.4重組人源化膠原蛋白Lys-C酶解產物C末端肽段二級譜圖