Plantcellengineering應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法，借助工程學(xué)的試驗(yàn)方法和技術(shù)，在細(xì)胞水平上研究改造園藝植物遺傳特性和生物學(xué)特性，以獲得特定的細(xì)胞、細(xì)胞產(chǎn)品或園藝植物新品種的科學(xué)?，F(xiàn)在是1頁\一共有59頁\編輯于星期二現(xiàn)在是2頁\一共有59頁\編輯于星期二MaincontentsPlantcellcultureProtoplastIsolationandFusion現(xiàn)在是3頁\一共有59頁\編輯于星期二1.

Plantcellculture

Haberlandt(Austria): Cultivateisolatedplantcells

invitroonanartificialmedium--->現(xiàn)在是4頁\一共有59頁\編輯于星期二Concept：

指對植物器官或愈傷組織上分離出來的單細(xì)胞(或小細(xì)胞團(tuán))進(jìn)行培養(yǎng)，形成單細(xì)胞無性系或再生植物的技術(shù)。Significance：（1）研究細(xì)胞生理代謝過程及各種影響因子；（2）用于植物品種的改良；（3）用于植物次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn)。現(xiàn)在是5頁\一共有59頁\編輯于星期二1.1.1Isolationofsinglecella.Isolationofsinglecellfromleafdirectly（1）mechanicalmethod：研磨→過濾，離心→細(xì)胞純化（2）enzymolysismethod：果膠酶、膜穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑硫酸葡聚糖鉀甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等1.1Singlecellculture

現(xiàn)在是6頁\一共有59頁\編輯于星期二Basicproceduresofenzymolysismethod取葉片，表面消毒撕掉下表皮，切成小塊加入酶解液（0.5%果膠酶+0.8%甘露醇+1%硫酸葡聚糖鉀）搖床上保溫培養(yǎng)現(xiàn)在是7頁\一共有59頁\編輯于星期二b.

Isolationofsinglecellfromcallustissue（1）離體器官（2）愈傷組織（3）繼代培養(yǎng)2個月（4）轉(zhuǎn)至液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)（5）懸浮細(xì)胞（6）無菌過濾，離心（7）單細(xì)胞現(xiàn)在是8頁\一共有59頁\編輯于星期二 對分離得到的單個細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)其分裂增殖，形成細(xì)胞團(tuán)，再通過細(xì)胞分化形成芽、根等器官或胚狀體，直到長成完整植株的技術(shù)。

1.1.2Methodsofsinglecellculture現(xiàn)在是9頁\一共有59頁\編輯于星期二CulturemethodsPlateculture平板培養(yǎng)Nurseculture看護(hù)培養(yǎng)Microculture微室培養(yǎng)Conditionedmediumculture條件培養(yǎng)基培養(yǎng)現(xiàn)在是10頁\一共有59頁\編輯于星期二a.Plateculture:分散的植物細(xì)胞接種于含薄層固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)過程稱為平板培養(yǎng)法。

方法是將經(jīng)機(jī)械破碎過篩或酶(纖維素酶及果膠酶等)消化分散純化的細(xì)胞，經(jīng)計(jì)數(shù)及稀釋，接種到加熱熔化而剛冷卻至35℃左右的固體培養(yǎng)基中充分混勻，傾入培養(yǎng)皿中，石蠟密封，于25℃培養(yǎng)，約20天后細(xì)胞即可生長成團(tuán)。統(tǒng)計(jì)生長情況?，F(xiàn)在是11頁\一共有59頁\編輯于星期二現(xiàn)在是12頁\一共有59頁\編輯于星期二現(xiàn)在是13頁\一共有59頁\編輯于星期二現(xiàn)在是14頁\一共有59頁\編輯于星期二b.Nurseculture：

從懸浮培養(yǎng)物或脆弱愈傷組織上用針或玻璃毛細(xì)管分離單細(xì)胞，每個細(xì)胞放在一個方形濾紙片的上表面，而濾紙片放在活躍生長的愈傷組織上進(jìn)行培養(yǎng)的方法?，F(xiàn)在是15頁\一共有59頁\編輯于星期二c.Microculture:懸浮單細(xì)胞接種于凹玻片或玻璃環(huán)與蓋玻片組成的微室內(nèi)的固體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)方法。現(xiàn)在是16頁\一共有59頁\編輯于星期二1.1.3Influencingfactorsofsinglecellculturea.

Medium：特殊成分，植物激素，pHb.Celldensity：平板臨界密度103個/mLc.Environmentalconditions

：25℃，1%CO2現(xiàn)在是17頁\一共有59頁\編輯于星期二1.2.cellsuspensionculture細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)是指將游離的植物細(xì)胞按一定的細(xì)胞密度，懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的方法。適宜于大規(guī)模培養(yǎng)，細(xì)胞工程產(chǎn)業(yè)的技術(shù)基礎(chǔ).現(xiàn)在是18頁\一共有59頁\編輯于星期二1.2.1Proceduresofcellsuspensionculture

愈傷組織

1g愈傷/10ml培養(yǎng)基150、250ml三角瓶（30、70ml培養(yǎng)基）120rpm,25℃黑暗培養(yǎng),換液1次/3d以防粘稠蔗糖梯度離心或過濾法(淘汰過大或生理狀態(tài)不好的細(xì)胞團(tuán))繼代培養(yǎng)80rpm（懸浮細(xì)胞系穩(wěn)定以后）繼代時間為1周時（原懸浮液：新培養(yǎng)基=1：4）懸浮愈傷組織形成及植株再生現(xiàn)在是19頁\一共有59頁\編輯于星期二愈傷組織要求：松散性好，增殖快，再生能力強(qiáng)。其外觀一般是鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，松散易碎。適于懸浮培養(yǎng)適于再生植株現(xiàn)在是20頁\一共有59頁\編輯于星期二

a.Batchculture分批培養(yǎng)

分批培養(yǎng)是在一個封閉的系統(tǒng)中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)物增加到一定量時，需繼代培養(yǎng)，即取出少量培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)液中。

1.2.2Typesofcellsuspensionculture

現(xiàn)在是21頁\一共有59頁\編輯于星期二Thecellsincultureexhibitthefollowingfivephasesofagrowthcyclei.Lagphase,wherecellspreparetodivide.ii.Exponentialphase,wheretherateofcelldivisionishighest.iii.Linearphase,wherecelldivisionslowsbuttherateofcellsexpansionincreases.iv.Decelerationphase,wheretheratesofcelldivisionandelongationdecreases.v.Stationaryphase,wherethenumberandsizeofcellsremainconstant.現(xiàn)在是22頁\一共有59頁\編輯于星期二b.Semi-continuousculture半連續(xù)培養(yǎng)

是利用培養(yǎng)罐等裝置進(jìn)行細(xì)胞大量培養(yǎng)的一種方式。在半連續(xù)培養(yǎng)時，當(dāng)培養(yǎng)容器內(nèi)細(xì)胞增殖到一定數(shù)量后，倒出一半細(xì)胞懸浮液于另一培養(yǎng)罐等容器，再分別加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。半連續(xù)培養(yǎng)能夠重復(fù)獲得大量均一的培養(yǎng)細(xì)胞供進(jìn)一步利用?，F(xiàn)在是23頁\一共有59頁\編輯于星期二c.Continuousculture連續(xù)培養(yǎng)

是用一定容積的非密閉系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的方法，在培養(yǎng)過程中不斷注入新鮮培養(yǎng)基，而使?fàn)I養(yǎng)物連續(xù)得到補(bǔ)充，細(xì)胞生長和增殖連續(xù)進(jìn)行，同時有等體積的培養(yǎng)物排除系統(tǒng)。

Opencontinuousculture開放型Closedcontinuousculture封閉型現(xiàn)在是24頁\一共有59頁\編輯于星期二1.2.3Requirementsforgoodsuspensionculturesystema.懸浮培養(yǎng)物分散性好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般由幾十個以下的細(xì)胞組成。b.均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。c.生長迅速，懸浮細(xì)胞的量一般2-3天甚至更短時間便可增加一倍。現(xiàn)在是25頁\一共有59頁\編輯于星期二1.3ApplicationofcellcultureProductionofsecondarymetabolites

辣椒素、花青素Selectionofmutant突變體的選擇Polyploidinducement誘導(dǎo)多倍體生產(chǎn)人工種子現(xiàn)在是26頁\一共有59頁\編輯于星期二2.ProtoplastIsolationandFusion

原生質(zhì)體的游離與融合現(xiàn)在是27頁\一共有59頁\編輯于星期二2.1.ProtoplastIsolation

Methodsmechanicalmethodsenzymaticmethods現(xiàn)在是28頁\一共有59頁\編輯于星期二現(xiàn)在是29頁\一共有59頁\編輯于星期二MechanicalmethodApplicationrangelargeandhighlyvacuolatedcellsofstoragetissuesonionbulbscales,radishrootandbeetroottissue現(xiàn)在是30頁\一共有59頁\編輯于星期二Disadvantages(i)Itisrestrictedtocertaintissueswhichhavelargevacuolatedcells.(ii)Yieldofprotoplastsisgenerallyverylow.Protoplastsfromlessvacuolatedandhighlymeristematiccellsdonotshowgoodyield.(iii)Themethodistediousandlaborious.(iv)Viabilityofprotoplastsislowbecauseofthepresenceofsubstancesreleasedbydamagedcells.現(xiàn)在是31頁\一共有59頁\編輯于星期二2.1.2EnzymaticmethodCocking在1960年證實(shí)了用酶從高等植物中分離出原生質(zhì)體的可能性。Cockingin1960demonstratedthepossibilityofenzymaticisolationofprotoplastsfromhigherplants.現(xiàn)在是32頁\一共有59頁\編輯于星期二Influencingfactors(1)PhysiologicalstateoftissueandcellmaterialProtoplastshavebeenisolatedfromavarietyoftissuesandorgansincludingleaves,petioles,shootapices,roots,fruits,coleoptiles,hypocotyls,stem,embryos,microspores,callusandcellsuspensionculturesofalargenumberofplantspecies.

分離材料包括葉片、葉柄、芽尖、根、果實(shí)、胚芽鞘、胚軸、莖、胚芽、花粉粒、愈傷組織和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物等。植物幼苗或新生枝的完全伸展葉片的葉肉組織是分離原生質(zhì)體的最方便、最合適的植物材料。現(xiàn)在是33頁\一共有59頁\編輯于星期二(2)

EnzymesThereleaseofprotoplastsisverymuchdependentonthenatureandcompositionofenzymesusedtodigestthecellwall.原生質(zhì)體的釋放在很大程度上取決于用于消化細(xì)胞壁的酶的性質(zhì)和組成?，F(xiàn)在是34頁\一共有59頁\編輯于星期二Threeprimarycomponentsofthecellwall:cellulose,hemicelluloseandpectinsubstances.細(xì)胞壁主要成分:纖維素、半纖維素和果膠類物質(zhì)。Celluloseandhemicelluloses:thecomponentsofprimaryandsecondarystructureofcellwallPectin:acomponentofmiddlelamellathatjoinsthecells.纖維素和半纖維素是細(xì)胞壁初生結(jié)構(gòu)和次生結(jié)構(gòu)的成分，而果膠類物質(zhì)是連接細(xì)胞的胞間層的成分?，F(xiàn)在是35頁\一共有59頁\編輯于星期二Pectinase:mainlydegradesthemiddlelamellaCellulaseandhemicellulase:digestthecellulosicandhemicellulosiccomponentsofthecellwall,respectively.果膠酶主要是降解中層，而纖維素酶和半纖維素酶分別用于消化細(xì)胞壁的纖維素和半纖維素成分。

現(xiàn)在是36頁\一共有59頁\編輯于星期二現(xiàn)在是37頁\一共有59頁\編輯于星期二TheactivityoftheenzymeispHdependentandisgenerallyindicatedbythemanufacturer.pH:4.7-6.0.Temperature:25-30℃Treatmenttime:30min-20h現(xiàn)在是38頁\一共有59頁\編輯于星期二(3)Osmoticum滲透劑Protoplastsreleaseddirectlyintostandardcellculturemediumwillburst.Hence,inisolatingprotoplasts,thewallpressurethatismechanicallysupportedbycellwallmustbereplacedwithanappropriateosmoticpressureintheprotoplastisolationmixtureandalsolaterintheculturemedium.原生質(zhì)體直接釋放到標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中會破裂，因此，在分離原生質(zhì)體期間，對原來由細(xì)胞壁機(jī)械維持的壓力用原生質(zhì)體分離混合液以及后來培養(yǎng)基的適當(dāng)滲透壓代替。

現(xiàn)在是39頁\一共有59頁\編輯于星期二低(或負(fù))滲透勢常是由于加入各種離子或非離子型溶質(zhì)產(chǎn)生的。

Non-ionicsubstances非離子型物質(zhì):carbohydrates,mannitol,sorbitol,glucose,fructose,galactoseorsucrose.Ionicsubstances離子型物質(zhì):KCl、CaCl2,MgSO4最常用的滲透劑:Mannitol,sorbitol現(xiàn)在是40頁\一共有59頁\編輯于星期二

(4)Protoplastpurification原生質(zhì)體的純化

酶消化后得到的混合物含有亞細(xì)胞碎片、未消化的細(xì)胞、破碎的和完好的原生質(zhì)體。對這個混合物通過過濾(filtration)、離心(centrifugation)和漂洗(washing)聯(lián)合的方法進(jìn)行純化?，F(xiàn)在是41頁\一共有59頁\編輯于星期二(5)Protoplastviabilityanddensity原生質(zhì)體的活力和密度

Methods:①

Fluoresceindiacetate(FDA)stainingmethod熒光素二乙酸(FDA)染色法：FDA是一種積累在活原生質(zhì)體質(zhì)膜中的染料，能被熒光顯微鏡檢測出來。當(dāng)在細(xì)胞膜中積累熒光素二乙酸時，5min內(nèi)活的、完整的原生質(zhì)體就發(fā)出黃綠色光。現(xiàn)在是42頁\一共有59頁\編輯于星期二②Phenosafraninestaining酚藏花紅染色法：使用酚藏花紅時的終濃度為0.01％，它只能使無生命力的原生質(zhì)體被染成紅色，活的原生質(zhì)體不能被酚藏花紅染色。③CalcofluorWhite(CFW)staining熒光增白劑(CFW)染色法④ExclusionofEvansbluedyebyintactmembranes完整細(xì)胞膜的排斥Evans藍(lán)染料法現(xiàn)在是43頁\一共有59頁\編輯于星期二⑤Observationsoncyclosisorprotoplaststreamingasameasureofactivemetabolism觀察胞質(zhì)環(huán)流法檢測有活力的代謝⑥Variationofprotoplastsizewithosmoticchanges隨滲透改變的原生質(zhì)體體積變化⑦Oxygenuptakemeasuredbyanoxygenelectrodewhichindicatesrespiratorymetabolism用氧電極測放氧從而檢測代表活力的呼吸代謝⑧Photosyntheticstudies光合作用研究現(xiàn)在是44頁\一共有59頁\編輯于星期二(6)CulturetechniquesAgarculture瓊脂培養(yǎng)法

Liquidculture液體培養(yǎng)法

Liquiddropletmethod小液滴培養(yǎng)法

Hangingdropletmethod懸滴培養(yǎng)法

Feederlayer飼喂層法

Co-culturing聯(lián)合培養(yǎng)法現(xiàn)在是45頁\一共有59頁\編輯于星期二

(7)Culturemedium培養(yǎng)基成分培養(yǎng)原生質(zhì)體和培養(yǎng)植物細(xì)胞的營養(yǎng)需要是極其相似的。用于培養(yǎng)植物細(xì)胞的礦質(zhì)鹽的成分已經(jīng)被調(diào)整到使之滿足培養(yǎng)原生質(zhì)體的特殊需要。甘露醇和山梨糖醇是用于維持滲透壓最常用的化合物現(xiàn)在是46頁\一共有59頁\編輯于星期二

(8)Environmentalfactors環(huán)境因子在黑暗中或微弱光下先培養(yǎng)幾天，然后再將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到約2000～50001x的光強(qiáng)下培養(yǎng)。原生質(zhì)體培養(yǎng)的一般溫度范圍是20～28℃，建議原生質(zhì)體培養(yǎng)基的pH范圍是5．5～5．9，這個pH范圍的培養(yǎng)效果看起來很好?，F(xiàn)在是47頁\一共有59頁\編輯于星期二2.2Protoplastdevelopment

原生質(zhì)體發(fā)育2.2.1Cellwallformation細(xì)胞壁形成2.2.2Growth,divisionandplantregeneration

生長、分裂和植株再生現(xiàn)在是48頁\一共有59頁\編輯于星期二2.3Somatichybridization

體細(xì)胞雜交Concept離體條件下，通過分離的體細(xì)胞原生質(zhì)體融合產(chǎn)生雜合體，再通過其異核體的發(fā)育形成雜種植株的技術(shù)被稱為體細(xì)胞雜交。體細(xì)胞雜交包含原生質(zhì)體融合（fusionofprotoplasts）、雜種細(xì)胞的選擇（selectionofhybridcells）、雜種植株的鑒定（identificationofhybridplants）現(xiàn)在是49頁\一共有59頁\編輯于星期二原生質(zhì)體融合是基因組不同的兩個原生質(zhì)體的融合，可以通過自發(fā)融合（spontaneousfusion）和誘導(dǎo)融合（inducedfusion）的方法實(shí)現(xiàn)。2.3.1Protoplastfusion原生質(zhì)體融合現(xiàn)在是50頁\一共有59頁\編輯于星期二(1)

Spontaneousfusionmethod自然融合法

(2)

Inducedfusionmethod誘導(dǎo)融合法①Treatmentwithsodiumnitrate硝酸鈉處理法②CalciumionsathighpH高pH鈣離子③Polyethyleneglycolmethod聚乙二醇法④Electrofusion電融合現(xiàn)在是51頁\一共有59頁\編輯于星期二現(xiàn)在是52頁\一共有59頁\編輯于星期二原生質(zhì)體融合產(chǎn)物的鑒定和恢復(fù)是基于對一般可見特征的觀察，雜種細(xì)胞顯示出隱性突變的遺傳互補(bǔ)和體外生長要求的生理學(xué)互補(bǔ)。2.3.2Identifi