Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在胃癌中的表達(dá)、機(jī)制及臨床意義探究一、引言1.1研究背景與目的1.1.1胃癌現(xiàn)狀胃癌作為一種常見且危害嚴(yán)重的消化道惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)都帶來了沉重的疾病負(fù)擔(dān)。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2020年全球胃癌新發(fā)病例約108.9萬例，占所有惡性腫瘤發(fā)病的5.6%，居惡性腫瘤發(fā)病人數(shù)的第五位；死亡病例數(shù)約76.9萬例，占所有惡性腫瘤死亡的7.7%，居惡性腫瘤死亡人數(shù)的第四位。我國更是胃癌高發(fā)國家，發(fā)病和死亡人數(shù)約占全球的一半。2019年中國國家癌癥中心的數(shù)據(jù)表明，胃癌的發(fā)病率和死亡率在我國所有惡性腫瘤中分別位列第二位和第三位，是發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤。從地域分布來看，我國農(nóng)村地區(qū)的胃癌發(fā)病率高于城市，偏遠(yuǎn)地區(qū)高于沿海地區(qū)。這種差異可能與經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平、環(huán)境因素以及飲食結(jié)構(gòu)等有關(guān)。在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)，居民的飲食可能更多地包含腌制、熏制食品，這些食物中含有較多的亞硝酸鹽等致癌物質(zhì)，同時，衛(wèi)生條件和醫(yī)療資源的相對匱乏也不利于胃癌的早期發(fā)現(xiàn)與防治。從性別差異上，男性胃癌的發(fā)病率是女性的3倍，死亡率是女性的2.7倍，且主要集中在60-69歲的男性群體。這可能與男性較高的吸煙、飲酒比例，較大的社會壓力以及不良的飲食習(xí)慣等因素密切相關(guān)。早期胃癌癥狀往往不典型，僅表現(xiàn)為反酸、噯氣、上腹部不適等，與胃炎、胃潰瘍等良性疾病癥狀相似，這導(dǎo)致大多數(shù)患者確診時已處于晚期。而胃癌的預(yù)后與分期密切相關(guān)，早期胃癌經(jīng)過規(guī)范治療后5年生存率較高，可達(dá)90%以上，而晚期胃癌5年生存率則低于20%。因此，加強(qiáng)對胃癌發(fā)病機(jī)制的研究，尋找有效的早期診斷標(biāo)志物和治療靶點，對于改善胃癌患者的預(yù)后、降低死亡率具有重要意義。1.1.2Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路概述Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條在進(jìn)化上高度保守的信號通路，廣泛存在于從無脊椎動物到脊椎動物的各類生物體內(nèi)。其發(fā)現(xiàn)可追溯到1917年，Morgan及其同事在突變的果蠅中發(fā)現(xiàn)了Notch基因，因其部分功能缺失會在果蠅翅膀邊緣造成缺刻而得名。到了20世紀(jì)80年代中期，Artavanis-Tsakonas研究小組首次成功克隆了該基因，并揭示其編碼一類大的跨膜受體，即Notch受體。Notch信號通路主要由Notch受體、Notch配體（DSL蛋白）、CSL（CBF-1，Suppressorofhairless，Lag的合稱）DNA結(jié)合蛋白、其他效應(yīng)物和Notch的調(diào)節(jié)分子等組成。在哺乳動物中，存在4種Notch受體（Notch1-4）和5種Notch配體（Delta-like1,3,4，Jagged1和Jagged2）。Notch受體是一種膜蛋白，由胞外區(qū)（NEC）、跨膜區(qū)（TM）和胞內(nèi)區(qū)（NICD/ICN）三部分構(gòu)成。其中，胞外區(qū)包含29-36個串聯(lián)的表皮生長因子(epidermalgrowthfactor，EGF)序列及3個富含半胱氨酸的LinNotch重復(fù)序列(LinNotchrepeats，LNR)，主要負(fù)責(zé)與配體結(jié)合并啟動Notch信號；跨膜區(qū)為單孔跨膜結(jié)構(gòu)，在甘氨酸-1743和纈氨酸-1744之間有一個裂解位點(S3位點)；胞內(nèi)區(qū)則包含多個重要結(jié)構(gòu)域，如1個RAM(RBP2Jkappaassociatedmolecular)區(qū)，可與DNA結(jié)合蛋白(C2promoterbindingprotein，CBF)結(jié)合；6個錨蛋白重復(fù)序列(ankyrinrepeats，ANK)，是啟動Notch的增強(qiáng)子，介導(dǎo)Notch與其他蛋白質(zhì)之間的相互作用；2個核定位信號(nuclearlocalizationsignal，NLS)；1個翻譯啟動區(qū)(translationalactivedomain，TAD)；1個PEST(Proline，P(脯氨酸)；Glutamate，E(谷氨酸)；Serine，S(絲氨酸)；Threonine，T(蘇氨酸))區(qū)域，與Notch受體的降解有關(guān)。Notch配體又稱為DSL蛋白，也是一種跨膜蛋白，包含一個氨基末端，胞外區(qū)含有數(shù)量不等的EGF-R結(jié)構(gòu)域和DSL結(jié)構(gòu)域（富含半胱氨酸），這是與Notch受體結(jié)合的關(guān)鍵部位。細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子CSL蛋白在哺乳動物中叫RBP-JK(recombinationsignalbindingprotein-Jk)，是轉(zhuǎn)錄抑制因子，在Notch信號通路中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它能識別并結(jié)合特定的DNA序列(GTGGGAA)，這個序列位于Notch誘導(dǎo)基因的啟動子上。Notch信號的活化過程較為復(fù)雜，需要經(jīng)過三次剪切。首先，在Notch成熟過程中，在高爾基體內(nèi)furin樣轉(zhuǎn)化酶的作用下，于第1個裂解點(S1，胞外區(qū)1654位精氨酸殘基-1655位替氨醢殘基之間)發(fā)生裂解，產(chǎn)生胞外區(qū)和跨膜片段2個亞基，二者以二硫鍵連接形成異二聚體形式的Notch受體，位于細(xì)胞膜表面；當(dāng)Notch配體與受體結(jié)合后，在金屬蛋白酶/腫瘤壞死因子-a轉(zhuǎn)換酶作用下，在第2個裂解點(S2，胞外近膜區(qū)1710丙氨酸-1711纈氨酸殘基之間)裂解為2個片段，N端裂解產(chǎn)物（胞外區(qū)）被配體表達(dá)細(xì)胞吞噬，而C端裂解產(chǎn)物進(jìn)一步在跨膜區(qū)的第3個裂解點(S3，1743甘氨酸殘基-1744纈氨酸殘基之間)經(jīng)高分子量多蛋白聯(lián)合體（其中主要包括r-分泌酶，突變型早老素和各種的輔因子）裂解，釋放出Notch蛋白的活化形式NICD（ICN）。NICD進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合，形成NICD/CSL轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，從而激活HES、HEY、HERP等堿性-螺旋-環(huán)-螺旋(basichelix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的靶基因，發(fā)揮生物學(xué)作用。Notch信號通路在細(xì)胞的正常發(fā)育過程中扮演著至關(guān)重要的角色，影響細(xì)胞正常形態(tài)發(fā)生的多個過程，包括多能祖細(xì)胞的分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖及細(xì)胞邊界的形成等。例如，在胚胎發(fā)育過程中，Notch信號通路參與調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的分化，決定神經(jīng)細(xì)胞的命運；在造血干細(xì)胞的分化過程中，Notch信號也起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，影響血細(xì)胞的生成和分化方向。1.1.3研究目的本研究旨在深入探究Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在胃癌組織中的表達(dá)水平，分析其與胃癌患者臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)，明確Notch信號通路在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制，進(jìn)一步探討通過干預(yù)Notch信號通路為胃癌治療提供新策略的可能性。具體來說，一方面，通過檢測不同分期、不同病理類型的胃癌組織以及癌旁正常組織中Notch受體、配體及相關(guān)下游靶基因的表達(dá)情況，揭示Notch信號通路在胃癌中的表達(dá)變化規(guī)律，尋找與胃癌預(yù)后相關(guān)的潛在分子標(biāo)志物。另一方面，利用細(xì)胞實驗，研究干擾或激活Notch信號通路對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響，從細(xì)胞水平闡明Notch信號通路在胃癌發(fā)展中的作用機(jī)制。此外，通過對臨床樣本和細(xì)胞實驗結(jié)果的綜合分析，為以Notch信號通路為靶點的胃癌靶向治療提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)，期望能夠為提高胃癌患者的生存率和生活質(zhì)量開辟新的途徑。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在胃癌的研究領(lǐng)域中，Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已成為國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點之一，眾多研究從不同角度揭示了其與胃癌發(fā)生、發(fā)展的緊密聯(lián)系。國外方面，早在20世紀(jì)末，就有研究開始關(guān)注Notch信號通路在腫瘤中的異常激活。隨著研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)Notch信號通路在胃癌組織中的表達(dá)水平與正常胃組織存在顯著差異。例如，在一項對胃癌細(xì)胞系和臨床樣本的研究中，發(fā)現(xiàn)Notch1受體及其配體Jagged1在胃癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)，且這種高表達(dá)與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期密切相關(guān)。進(jìn)一步的功能研究表明，激活Notch信號通路能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，而抑制Notch信號通路則可以顯著抑制胃癌細(xì)胞的這些惡性生物學(xué)行為。在機(jī)制研究上，國外研究指出，Notch信號通路可能通過調(diào)控下游靶基因如HES1、HEY1等的表達(dá)，影響胃癌細(xì)胞的周期進(jìn)程和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌的發(fā)展。同時，Notch信號通路還與其他信號通路如Wnt/β-catenin信號通路、PI3K/Akt信號通路等存在相互作用，共同調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。例如，在一項對胃癌細(xì)胞系的研究中，發(fā)現(xiàn)激活Notch信號通路能夠上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵蛋白β-catenin的表達(dá)，促進(jìn)其入核，進(jìn)而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。在動物實驗方面，通過構(gòu)建胃癌小鼠模型，發(fā)現(xiàn)抑制Notch信號通路可以有效抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，延長小鼠的生存期。這些研究為深入理解Notch信號通路在胃癌中的作用機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。國內(nèi)的研究也取得了豐碩的成果。在臨床研究方面，大量的臨床樣本分析顯示，Notch信號通路相關(guān)分子在胃癌組織中的表達(dá)異常與患者的預(yù)后密切相關(guān)。如一項納入了數(shù)百例胃癌患者的研究表明，Notch2受體的高表達(dá)與胃癌患者的低生存率顯著相關(guān)，是影響胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素。在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，國內(nèi)學(xué)者通過細(xì)胞實驗和動物實驗，深入探討了Notch信號通路在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。例如，研究發(fā)現(xiàn)Notch信號通路可以通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。具體來說，激活Notch信號通路能夠上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug等的表達(dá)，導(dǎo)致上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin等表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。此外，國內(nèi)研究還關(guān)注到Notch信號通路與胃癌微環(huán)境之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可以通過分泌細(xì)胞因子激活Notch信號通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和耐藥。盡管國內(nèi)外在Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與胃癌的研究上取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些不足之處。目前的研究主要集中在Notch信號通路與胃癌細(xì)胞本身生物學(xué)行為的關(guān)系上，對于Notch信號通路在胃癌微環(huán)境中的動態(tài)變化及其對腫瘤免疫細(xì)胞功能的影響研究相對較少。胃癌微環(huán)境中存在多種細(xì)胞類型，如免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，Notch信號通路在這些細(xì)胞與胃癌細(xì)胞之間的相互作用機(jī)制尚不完全清楚。雖然已知Notch信號通路與其他信號通路存在交互作用，但這些信號通路之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制尚未完全明確，尤其是在不同臨床病理特征的胃癌患者中，信號通路之間的協(xié)同或拮抗作用是否存在差異，仍有待進(jìn)一步研究?，F(xiàn)有針對Notch信號通路的干預(yù)研究多處于細(xì)胞實驗和動物實驗階段，如何將這些研究成果轉(zhuǎn)化為有效的臨床治療手段，還需要解決藥物的安全性、有效性以及靶向性等諸多問題。未來的研究可以進(jìn)一步深入探討Notch信號通路在胃癌微環(huán)境中的作用機(jī)制，加強(qiáng)對多信號通路網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的研究，并積極開展臨床轉(zhuǎn)化研究，以期為胃癌的精準(zhǔn)治療提供新的策略和靶點。1.3研究意義與創(chuàng)新點1.3.1理論意義本研究深入探討Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在胃癌中的表達(dá)及作用機(jī)制，對于豐富胃癌發(fā)病機(jī)制的理論體系具有重要意義。目前，雖然已經(jīng)明確胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及多個基因和信號通路的異常改變，但具體的分子機(jī)制尚未完全闡明。Notch信號通路作為一條在進(jìn)化上高度保守的信號通路，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過研究其在胃癌中的表達(dá)情況以及與胃癌臨床病理特征的關(guān)聯(lián)，可以進(jìn)一步揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，填補(bǔ)該領(lǐng)域在Notch信號通路方面的部分理論空白。例如，明確Notch信號通路中不同成員（如Notch受體、配體及下游靶基因）在胃癌組織中的表達(dá)變化規(guī)律，有助于我們從分子層面理解胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，為深入研究胃癌的發(fā)病機(jī)制提供新的視角。同時，本研究對于深化對Notch信號通路在腫瘤中作用的認(rèn)知也具有重要價值。以往對Notch信號通路在腫瘤中的研究多集中在一些常見腫瘤類型，但對于其在胃癌中的具體作用機(jī)制及與其他信號通路的交互作用研究尚不夠深入。本研究將通過細(xì)胞實驗和臨床樣本分析，全面探究Notch信號通路在胃癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中的作用，以及其與其他相關(guān)信號通路（如Wnt/β-catenin信號通路、PI3K/Akt信號通路等）之間的相互關(guān)系，進(jìn)一步完善Notch信號通路在腫瘤領(lǐng)域的理論體系，為腫瘤生物學(xué)的發(fā)展提供有力的理論支持。1.3.2實踐意義在臨床實踐中，本研究具有多方面的重要價值。首先，為胃癌的早期診斷提供新思路。目前，胃癌的早期診斷主要依賴于胃鏡檢查和病理活檢，但這些方法存在一定的局限性，如胃鏡檢查屬于侵入性操作，患者依從性較差，且早期胃癌的病理特征不明顯，容易導(dǎo)致誤診和漏診。本研究通過檢測胃癌組織中Notch信號通路相關(guān)分子的表達(dá)水平，有可能篩選出與胃癌早期發(fā)生密切相關(guān)的分子標(biāo)志物。例如，如果發(fā)現(xiàn)某些Notch受體或配體在早期胃癌組織中就呈現(xiàn)出特異性的高表達(dá)或低表達(dá)，那么這些分子就有可能作為潛在的診斷標(biāo)志物，用于胃癌的早期篩查和診斷。通過開發(fā)針對這些分子標(biāo)志物的檢測方法，如血清學(xué)檢測、基因檢測等，可以實現(xiàn)胃癌的早期無創(chuàng)或微創(chuàng)診斷，提高胃癌的早期診斷率，為患者爭取更多的治療時機(jī)。其次，為胃癌的治療提供潛在靶點。當(dāng)前，胃癌的治療主要包括手術(shù)、化療、放療和靶向治療等，但對于晚期胃癌患者，現(xiàn)有的治療手段效果仍不理想，患者的生存率較低。Notch信號通路在胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要作用，因此，靶向Notch信號通路有望成為胃癌治療的新策略。本研究通過明確Notch信號通路在胃癌中的作用機(jī)制，為開發(fā)針對該信號通路的靶向治療藥物提供了理論依據(jù)。例如，針對Notch信號通路中的關(guān)鍵分子（如Notch受體、γ-分泌酶等）設(shè)計特異性的抑制劑，阻斷Notch信號通路的激活，從而抑制胃癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。這些靶向治療藥物可以與傳統(tǒng)的治療方法聯(lián)合使用，提高治療效果，減少不良反應(yīng)，改善患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。最后，為胃癌患者的預(yù)后評估提供新的指標(biāo)。胃癌患者的預(yù)后受到多種因素的影響，如腫瘤的分期、病理類型、治療方法等。目前，常用的預(yù)后評估指標(biāo)存在一定的局限性，不能準(zhǔn)確地預(yù)測患者的預(yù)后情況。本研究通過分析Notch信號通路相關(guān)分子的表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，有可能發(fā)現(xiàn)新的預(yù)后評估指標(biāo)。例如，如果發(fā)現(xiàn)某些Notch信號通路相關(guān)分子的高表達(dá)與胃癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，那么這些分子就可以作為獨立的預(yù)后指標(biāo)，用于評估患者的預(yù)后情況，指導(dǎo)臨床醫(yī)生制定個性化的治療方案，提高患者的生存率。1.3.3創(chuàng)新點本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在研究角度和研究方法兩個方面。在研究角度上，本研究從多維度深入探討Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在胃癌中的作用。不僅關(guān)注Notch信號通路在胃癌細(xì)胞本身生物學(xué)行為中的作用，還將研究視角拓展到胃癌微環(huán)境中，探究Notch信號通路在胃癌細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞（如免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等）之間的相互作用機(jī)制。這種多維度的研究角度能夠更全面地揭示Notch信號通路在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為胃癌的防治提供更全面的理論依據(jù)。例如，通過研究腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與胃癌細(xì)胞之間的Notch信號通路交互作用，了解其對腫瘤免疫逃逸和腫瘤生長的影響，從而為調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境提供新的靶點。在研究方法上，本研究采用多組學(xué)分析與傳統(tǒng)實驗方法相結(jié)合的方式。傳統(tǒng)的研究方法如免疫組化、Westernblot、RT-PCR等雖然能夠檢測Notch信號通路相關(guān)分子的表達(dá)水平，但難以全面揭示其作用機(jī)制。本研究將引入轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)，從基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)等多個層面系統(tǒng)分析Notch信號通路在胃癌中的變化規(guī)律及其與其他信號通路的相互關(guān)系。通過多組學(xué)數(shù)據(jù)分析，可以挖掘出潛在的關(guān)鍵分子和信號通路，為進(jìn)一步深入研究提供線索。例如，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選出在胃癌中差異表達(dá)的Notch信號通路相關(guān)基因，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，分析這些基因所編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)變化及修飾情況，從而更深入地了解Notch信號通路在胃癌中的調(diào)控機(jī)制。這種多組學(xué)分析與傳統(tǒng)實驗方法相結(jié)合的研究方法，能夠更深入、全面地揭示Notch信號通路在胃癌中的作用機(jī)制，為胃癌的研究帶來創(chuàng)新性的成果。二、Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的生物學(xué)特性2.1Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的組成2.1.1Notch受體在哺乳動物中，Notch受體家族包含Notch1、Notch2、Notch3和Notch4這4個成員。它們均為單次跨膜蛋白，其結(jié)構(gòu)主要由胞外區(qū)（NEC）、跨膜區(qū)（TM）和胞內(nèi)區(qū)（NICD/ICN）這三個關(guān)鍵部分構(gòu)成。Notch受體的胞外區(qū)較為復(fù)雜，包含29-36個串聯(lián)排列的表皮生長因子(epidermalgrowthfactor，EGF)序列。這些EGF序列富含半胱氨酸，能夠通過二硫鍵形成特定的空間結(jié)構(gòu)，對受體與配體之間的特異性識別和結(jié)合起到關(guān)鍵作用。例如，在胚胎發(fā)育過程中，Notch1受體的EGF序列可精準(zhǔn)識別并結(jié)合配體Delta-like1，從而啟動Notch信號通路，調(diào)控細(xì)胞的分化命運。除了EGF序列，胞外區(qū)還含有3個富含半胱氨酸的Lin-Notch重復(fù)序列(Lin-Notchrepeats，LNR)。LNR結(jié)構(gòu)域在維持Notch受體的穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用，同時也參與調(diào)節(jié)受體與配體結(jié)合后的信號激活過程。研究表明，LNR結(jié)構(gòu)域的突變會導(dǎo)致Notch受體無法正常激活，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常發(fā)育。在Notch受體成熟過程中，在高爾基體內(nèi)furin樣轉(zhuǎn)化酶的作用下，于第1個裂解點(S1，胞外區(qū)1654位精氨酸殘基-1655位替氨醢殘基之間)發(fā)生裂解，產(chǎn)生胞外區(qū)和跨膜片段2個亞基，二者以二硫鍵連接形成異二聚體形式的Notch受體，位于細(xì)胞膜表面?？缒^(qū)為單孔跨膜結(jié)構(gòu)，是Notch受體錨定在細(xì)胞膜上的關(guān)鍵區(qū)域。在甘氨酸-1743和纈氨酸-1744之間存在一個重要的裂解位點(S3位點)。當(dāng)Notch信號通路被激活時，跨膜區(qū)會在該位點發(fā)生裂解，這對于后續(xù)信號的傳導(dǎo)至關(guān)重要。當(dāng)Notch配體與受體結(jié)合后，在金屬蛋白酶/腫瘤壞死因子-a轉(zhuǎn)換酶作用下，在第2個裂解點(S2，胞外近膜區(qū)1710丙氨酸-1711纈氨酸殘基之間)裂解為2個片段，N端裂解產(chǎn)物（胞外區(qū)）被配體表達(dá)細(xì)胞吞噬，而C端裂解產(chǎn)物進(jìn)一步在跨膜區(qū)的第3個裂解點(S3，1743甘氨酸殘基-1744纈氨酸殘基之間)經(jīng)高分子量多蛋白聯(lián)合體（其中主要包括r-分泌酶，突變型早老素和各種的輔因子）裂解，釋放出Notch蛋白的活化形式NICD（ICN）。Notch受體的胞內(nèi)區(qū)包含多個重要的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域在信號傳導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著核心作用。其中，1個RAM(RBP2Jkappaassociatedmolecular)區(qū)能夠與DNA結(jié)合蛋白(C2promoterbindingprotein，CBF)特異性結(jié)合。這種結(jié)合是Notch信號從細(xì)胞膜傳遞到細(xì)胞核的關(guān)鍵步驟，通過與CBF的相互作用，NICD可以招募其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。6個錨蛋白重復(fù)序列(ankyrinrepeats，ANK)是啟動Notch信號的增強(qiáng)子，它們介導(dǎo)Notch與其他蛋白質(zhì)之間的相互作用。ANK結(jié)構(gòu)域可以與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，形成復(fù)雜的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步放大和調(diào)節(jié)Notch信號。在細(xì)胞增殖過程中，ANK結(jié)構(gòu)域可與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白相互作用，影響細(xì)胞周期進(jìn)程。2個核定位信號(nuclearlocalizationsignal，NLS)負(fù)責(zé)引導(dǎo)NICD進(jìn)入細(xì)胞核，確保信號能夠準(zhǔn)確傳遞到基因轉(zhuǎn)錄的場所。1個翻譯啟動區(qū)(translationalactivedomain，TAD)參與調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)下游靶基因的表達(dá)。1個PEST(Proline，P(脯氨酸)；Glutamate，E(谷氨酸)；Serine，S(絲氨酸)；Threonine，T(蘇氨酸))區(qū)域則與Notch受體的降解有關(guān)。當(dāng)Notch信號傳導(dǎo)完成后，PEST區(qū)域會被相關(guān)蛋白酶識別，啟動Notch受體的降解過程，以維持細(xì)胞內(nèi)信號的平衡。這4種Notch受體在組織分布上存在一定的差異。Notch1廣泛表達(dá)于多種組織和細(xì)胞中，包括造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。在造血干細(xì)胞的分化過程中，Notch1信號通路的激活可促進(jìn)造血干細(xì)胞向T淋巴細(xì)胞方向分化。Notch2在脾臟、肺、腎臟等組織中表達(dá)較高，在免疫細(xì)胞的發(fā)育和功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，Notch2參與調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的發(fā)育和活化，對體液免疫應(yīng)答具有重要影響。Notch3主要在血管平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)系統(tǒng)等組織中表達(dá)，與血管發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)的功能密切相關(guān)。在血管發(fā)育過程中，Notch3可調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的增殖和分化，維持血管的正常結(jié)構(gòu)和功能。Notch4則在胎盤、心臟、血管內(nèi)皮細(xì)胞等組織中表達(dá)，在胚胎發(fā)育和血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在胎盤發(fā)育過程中，Notch4信號通路的正常激活對于胎盤血管的形成和功能維持至關(guān)重要。不同的Notch受體在功能上既有相似之處，也存在一定的差異。它們都參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等基本生物學(xué)過程的調(diào)控，但在具體的調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)效應(yīng)上有所不同。在細(xì)胞增殖調(diào)控方面，Notch1和Notch2都可以促進(jìn)某些細(xì)胞類型的增殖，但它們可能通過不同的下游信號分子來實現(xiàn)這一功能。Notch1可能通過激活細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖；而Notch2則可能通過調(diào)節(jié)其他細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞增殖。在細(xì)胞分化調(diào)控方面，Notch受體的功能也具有細(xì)胞特異性。在神經(jīng)干細(xì)胞的分化過程中，Notch1信號通路的激活可抑制神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，促進(jìn)其維持干細(xì)胞狀態(tài)或向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化；而在心肌細(xì)胞的發(fā)育過程中，Notch信號通路的激活則促進(jìn)心肌細(xì)胞的分化和成熟。這些差異表明，Notch受體在不同的組織和細(xì)胞環(huán)境中，通過與不同的配體和信號分子相互作用，實現(xiàn)對細(xì)胞命運的精準(zhǔn)調(diào)控。2.1.2Notch配體Notch配體，又被稱為DSL蛋白，同樣屬于單次跨膜蛋白。在哺乳動物中，目前已發(fā)現(xiàn)的Notch配體共有5種，分別為Dll1（Delta-like1）、Dll3（Delta-like3）、Dll4（Delta-like4）、Jagged1和Jagged2。這些配體的結(jié)構(gòu)具有一些共同特征。它們都包含一個氨基末端，胞外區(qū)含有數(shù)量不等的EGF-R（表皮生長因子受體）結(jié)構(gòu)域和DSL結(jié)構(gòu)域（富含半胱氨酸）。DSL結(jié)構(gòu)域是配體與Notch受體結(jié)合的關(guān)鍵部位，其高度保守的氨基酸序列和獨特的空間構(gòu)象確保了配體與受體之間的特異性識別和緊密結(jié)合。研究表明，DSL結(jié)構(gòu)域中的某些氨基酸殘基突變會導(dǎo)致配體與受體的結(jié)合能力顯著下降，進(jìn)而影響Notch信號通路的激活。例如，Dll1配體的DSL結(jié)構(gòu)域中某關(guān)鍵氨基酸的突變，會使得Dll1無法正常結(jié)合Notch1受體，導(dǎo)致相關(guān)細(xì)胞的分化過程異常。而EGF-R結(jié)構(gòu)域則可能參與調(diào)節(jié)配體的穩(wěn)定性、細(xì)胞表面定位以及與其他細(xì)胞表面分子的相互作用。這5種Notch配體在組織分布和功能上也存在各自的特點。Dll1在造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等多種組織中廣泛表達(dá)。在造血干細(xì)胞的分化過程中，Dll1與Notch1受體結(jié)合，激活Notch信號通路，促進(jìn)造血干細(xì)胞向T淋巴細(xì)胞分化。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，Dll1參與神經(jīng)干細(xì)胞的分化調(diào)控，影響神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生。Dll3主要在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)，在成年組織中的表達(dá)相對較低。它在神經(jīng)干細(xì)胞的分化以及胚胎體節(jié)的形成過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，Dll3基因敲除的小鼠會出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育異常和體節(jié)分化缺陷。Dll4在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，在血管生成過程中起著關(guān)鍵作用。它與Notch受體結(jié)合，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，影響血管的形成和重塑。在腫瘤血管生成中，Dll4-Notch信號通路的異常激活可促進(jìn)腫瘤血管的生成，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)支持。Jagged1在肝臟、心臟、肺等多種組織中均有表達(dá)。在肝臟發(fā)育過程中，Jagged1與Notch受體相互作用，調(diào)控肝干細(xì)胞的分化和肝臟組織的形成。在心血管系統(tǒng)中，Jagged1參與心臟瓣膜的發(fā)育和血管平滑肌細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，Jagged1基因的突變與Alagille綜合征相關(guān)，該綜合征患者會出現(xiàn)肝臟、心臟、骨骼等多系統(tǒng)的發(fā)育異常。Jagged2的表達(dá)相對較為局限，主要在神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、肺等組織中表達(dá)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，Jagged2參與神經(jīng)干細(xì)胞的分化和神經(jīng)元的遷移過程。在腎臟發(fā)育中，Jagged2可能參與調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞的分化和腎臟功能的形成。不同的Notch配體與受體之間存在一定的結(jié)合特異性。一般來說，Dll1、Dll3和Dll4更傾向于與Notch1和Notch2受體結(jié)合。在造血干細(xì)胞向T淋巴細(xì)胞分化的過程中，Dll1主要與Notch1受體結(jié)合，激活Notch信號通路，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的發(fā)育。而Jagged1和Jagged2則與Notch2、Notch3和Notch4受體的結(jié)合能力相對較強(qiáng)。在肝臟發(fā)育過程中，Jagged1與Notch2受體結(jié)合，調(diào)控肝干細(xì)胞的分化方向。這種結(jié)合特異性并非絕對，在某些特殊情況下，配體與受體之間的結(jié)合也可能發(fā)生變化。在腫瘤微環(huán)境中，由于細(xì)胞因子和生長因子的異常表達(dá)，可能會導(dǎo)致Notch配體與受體的結(jié)合模式發(fā)生改變，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。2.1.3其他關(guān)鍵分子除了Notch受體和配體，Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中還存在其他一些關(guān)鍵分子，它們在信號通路的激活、傳導(dǎo)以及調(diào)控過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。ADAM（adisintegrinandmetalloprotease），即去整合素和金屬蛋白酶，是一類重要的膜結(jié)合蛋白酶。在Notch信號通路中，ADAM主要參與Notch受體的裂解過程。當(dāng)Notch配體與受體結(jié)合后，會誘導(dǎo)Notch受體發(fā)生構(gòu)象變化，從而暴露出ADAM的作用位點。ADAM家族中的腫瘤壞死因子-α-轉(zhuǎn)換酶（tumornecrosisfactor-α-convertingenzyme，TACE，也稱為ADAM17）能夠在Notch受體的S2位點進(jìn)行切割。這一切割過程使得Notch受體的胞外部分被部分切除，剩余的部分仍然與細(xì)胞膜相連，形成“Notch-introTM”。ADAM對Notch受體的切割是Notch信號通路激活的關(guān)鍵步驟之一，它為后續(xù)γ-分泌酶對Notch受體的進(jìn)一步切割以及NICD的釋放奠定了基礎(chǔ)。研究表明，抑制ADAM的活性可以有效阻斷Notch信號通路的激活。在腫瘤細(xì)胞中，通過使用ADAM抑制劑，可以減少Notch信號通路的激活，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。γ-分泌酶是一種高分子量的多蛋白復(fù)合體，主要由早老素（presenilin）、Nicastrin、APH-1和PEN-2等成分組成。在Notch信號通路中，γ-分泌酶負(fù)責(zé)在Notch受體的S3位點進(jìn)行切割。經(jīng)過ADAM在S2位點切割后的Notch受體，成為γ-分泌酶的作用底物。γ-分泌酶在S3位點的切割，能夠釋放出Notch蛋白的活化形式NICD（Notchintracellulardomain）。NICD隨后進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合，啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。γ-分泌酶對Notch受體的切割是Notch信號傳導(dǎo)到細(xì)胞核的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。早老素是γ-分泌酶的核心成分，其基因突變會導(dǎo)致γ-分泌酶活性異常，進(jìn)而影響Notch信號通路的正常傳導(dǎo)。早老素突變與阿爾茨海默病的發(fā)生密切相關(guān)，這也提示了Notch信號通路與神經(jīng)系統(tǒng)疾病之間的潛在聯(lián)系。CSL（CBF-1，Suppressorofhairless，Lag的合稱），在哺乳動物中也被稱為RBP-JK（recombinationsignalbindingprotein-Jk），是一種DNA結(jié)合蛋白，在Notch信號通路中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。在沒有NICD存在時，CSL能夠識別并結(jié)合特定的DNA序列(GTGGGAA)，這個序列位于Notch誘導(dǎo)基因的啟動子上。此時，CSL會招募阻遏蛋白SMRT（silencingmediatorforretinoidandthyroidhormonereceptors）和組蛋白脫乙酰酶（histonedeacetylase，HDAC），形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)NICD進(jìn)入細(xì)胞核后，其RAM區(qū)會與CSL蛋白結(jié)合。這種結(jié)合會導(dǎo)致CSL構(gòu)象發(fā)生改變，使其從轉(zhuǎn)錄抑制因子轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄激活因子。NICD與CSL結(jié)合后，會招募Mastermind樣轉(zhuǎn)錄共激活因子1（MAML1）等共激活分子，形成輔激活因子復(fù)合物。該復(fù)合物能夠與DNA形成多蛋白-DNA復(fù)合體，從而激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，如HES（hairyandenhancerofsplit）、HEY（hairy/enhancer-of-splitrelatedwithYRPWmotif）、HERP（HES-relatedrepressorprotein）等堿性-螺旋-環(huán)-螺旋(basichelix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的靶基因。CSL在Notch信號通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著核心作用，它能夠根據(jù)Notch信號的激活狀態(tài)，精確地調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。2.2Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活機(jī)制2.2.1受體-配體結(jié)合Notch信號通路的激活起始于相鄰細(xì)胞間Notch受體與配體的特異性結(jié)合。當(dāng)表達(dá)Notch配體的細(xì)胞與表達(dá)Notch受體的細(xì)胞緊密接觸時，配體的DSL結(jié)構(gòu)域與受體胞外區(qū)的EGF序列相互作用，從而啟動信號通路。在胚胎發(fā)育過程中，神經(jīng)干細(xì)胞與周圍細(xì)胞之間通過這種方式傳遞Notch信號，調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的分化命運。配體與受體結(jié)合后，會誘導(dǎo)Notch受體發(fā)生構(gòu)象變化。這種構(gòu)象變化使得Notch受體的S2位點暴露，進(jìn)而激活A(yù)DAM酶。ADAM酶屬于去整合素和金屬蛋白酶家族，其中腫瘤壞死因子-α-轉(zhuǎn)換酶（TACE，也稱為ADAM17）在Notch信號通路中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TACE能夠識別并結(jié)合到Notch受體的S2位點，利用其金屬蛋白酶活性，在胞外近膜區(qū)1710丙氨酸-1711纈氨酸殘基之間對Notch受體進(jìn)行切割。這一切割過程使得Notch受體的胞外部分被部分切除，剩余的部分仍然與細(xì)胞膜相連，形成“Notch-introTM”。研究表明，在腫瘤細(xì)胞中，ADAM17的高表達(dá)與Notch信號通路的過度激活密切相關(guān)，抑制ADAM17的活性可以有效減少Notch受體的S2切割，從而阻斷Notch信號通路的激活。在這一過程中，配體的內(nèi)化也起到了重要作用。配體與受體結(jié)合后，會被細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入配體表達(dá)細(xì)胞。配體內(nèi)化產(chǎn)生的拉力進(jìn)一步誘導(dǎo)了Notch受體的構(gòu)象改變，促進(jìn)了S2切割的發(fā)生。配體內(nèi)化還可以促進(jìn)配體的循環(huán)利用，并且內(nèi)化后發(fā)生的一些翻譯后修飾能增強(qiáng)配體活性。在果蠅的發(fā)育過程中，Delta配體的內(nèi)化對于Notch信號的有效傳遞至關(guān)重要，Delta配體的內(nèi)化缺陷會導(dǎo)致Notch信號通路無法正常激活，進(jìn)而影響果蠅的正常發(fā)育。2.2.2信號傳導(dǎo)與級聯(lián)反應(yīng)經(jīng)過ADAM酶在S2位點的切割后，Notch受體的C端裂解產(chǎn)物進(jìn)一步在跨膜區(qū)的S3位點發(fā)生切割。這一步切割由γ-分泌酶負(fù)責(zé)，γ-分泌酶是一種高分子量的多蛋白復(fù)合體，主要由早老素（presenilin）、Nicastrin、APH-1和PEN-2等成分組成。γ-分泌酶在S3位點的切割，能夠釋放出Notch蛋白的活化形式NICD（Notchintracellulardomain）。NICD從細(xì)胞膜上脫離，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的NICD含有核定位信號（NLS），在相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白的協(xié)助下，NICD被轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核中，NICD的RAM區(qū)與轉(zhuǎn)錄因子CSL特異性結(jié)合。在沒有NICD存在時，CSL能夠識別并結(jié)合特定的DNA序列(GTGGGAA)，這個序列位于Notch誘導(dǎo)基因的啟動子上。此時，CSL會招募阻遏蛋白SMRT（silencingmediatorforretinoidandthyroidhormonereceptors）和組蛋白脫乙酰酶（histonedeacetylase，HDAC），形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)NICD與CSL結(jié)合后，會導(dǎo)致CSL構(gòu)象發(fā)生改變，使其從轉(zhuǎn)錄抑制因子轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄激活因子。NICD與CSL結(jié)合后，還會招募Mastermind樣轉(zhuǎn)錄共激活因子1（MAML1）等共激活分子，形成輔激活因子復(fù)合物。該復(fù)合物能夠與DNA形成多蛋白-DNA復(fù)合體，從而激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。下游靶基因主要包括HES（hairyandenhancerofsplit）、HEY（hairy/enhancer-of-splitrelatedwithYRPWmotif）、HERP（HES-relatedrepressorprotein）等堿性-螺旋-環(huán)-螺旋(basichelix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的成員。這些靶基因編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。HES1可以抑制神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，促進(jìn)其維持干細(xì)胞狀態(tài)或向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化；HEY1則參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化，影響血管的生成。Notch信號通路通過激活這些下游靶基因，實現(xiàn)對細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控，進(jìn)而在胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持以及疾病發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。2.3Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在正常生理過程中的作用2.3.1細(xì)胞分化Notch信號通路在細(xì)胞分化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，尤其是在神經(jīng)、造血等系統(tǒng)的發(fā)育中，其對細(xì)胞分化方向的決定有著重要影響。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，Notch信號通路對神經(jīng)干細(xì)胞的分化起著核心調(diào)控作用。神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新和分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的能力。當(dāng)Notch信號通路被激活時，神經(jīng)干細(xì)胞傾向于維持自我更新狀態(tài)或向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。具體來說，Notch信號通路激活后，其下游靶基因HES1等表達(dá)上調(diào)。HES1是一種堿性-螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄抑制因子，它可以抑制神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞維持干細(xì)胞特性或向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。在胚胎神經(jīng)發(fā)育過程中，當(dāng)神經(jīng)干細(xì)胞表面的Notch受體與相鄰細(xì)胞表面的配體（如Delta-like1、Jagged1等）結(jié)合后，Notch受體被激活，經(jīng)過一系列的蛋白水解過程，釋放出NICD。NICD進(jìn)入細(xì)胞核與CSL等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，進(jìn)而激活HES1等靶基因的轉(zhuǎn)錄。若抑制Notch信號通路，神經(jīng)干細(xì)胞則會更多地向神經(jīng)元方向分化。研究表明，在體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞中，使用γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號通路，可使神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的比例顯著增加。在造血系統(tǒng)發(fā)育中，Notch信號通路同樣扮演著重要角色。造血干細(xì)胞具有分化為各種血細(xì)胞的潛能，包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板等。Notch信號通路可以調(diào)控造血干細(xì)胞的分化方向。在T淋巴細(xì)胞的發(fā)育過程中，Notch信號通路起著關(guān)鍵的誘導(dǎo)作用。造血干細(xì)胞在胸腺中發(fā)育為T淋巴細(xì)胞的過程中，Notch1受體與配體Delta-like1的相互作用至關(guān)重要。當(dāng)造血干細(xì)胞表面的Notch1受體與胸腺上皮細(xì)胞表面的Delta-like1配體結(jié)合后，激活Notch信號通路，促使造血干細(xì)胞向T淋巴細(xì)胞方向分化。研究發(fā)現(xiàn)，Notch1基因敲除的小鼠，其T淋巴細(xì)胞的發(fā)育受到嚴(yán)重阻礙，幾乎無法產(chǎn)生成熟的T淋巴細(xì)胞。而在B淋巴細(xì)胞的發(fā)育過程中，Notch信號通路的作用則相對復(fù)雜。Notch信號通路的適度激活有助于維持B淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖和存活，但過度激活則可能抑制B淋巴細(xì)胞的分化。在一定階段，Notch信號通路通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，如抑制Pax5基因的表達(dá)，維持B淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞的未分化狀態(tài)；當(dāng)Notch信號通路活性降低時，Pax5基因表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的分化。在其他組織和細(xì)胞的分化過程中，Notch信號通路也發(fā)揮著重要作用。在皮膚的發(fā)育過程中，Notch信號通路參與調(diào)節(jié)表皮干細(xì)胞的分化。表皮干細(xì)胞可以分化為角質(zhì)形成細(xì)胞等多種細(xì)胞類型。Notch信號通路的激活能夠促進(jìn)表皮干細(xì)胞向角質(zhì)形成細(xì)胞分化，維持皮膚表皮的正常結(jié)構(gòu)和功能。研究表明，在表皮干細(xì)胞中，Notch1的表達(dá)水平與細(xì)胞的分化狀態(tài)密切相關(guān)，高表達(dá)的Notch1促進(jìn)細(xì)胞向角質(zhì)形成細(xì)胞分化。在胰腺的發(fā)育過程中，Notch信號通路調(diào)控胰腺祖細(xì)胞的分化。胰腺祖細(xì)胞可以分化為胰島細(xì)胞和腺泡細(xì)胞等。Notch信號通路通過調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，決定胰腺祖細(xì)胞的分化命運。激活Notch信號通路可抑制胰腺祖細(xì)胞向胰島細(xì)胞分化，促進(jìn)其向腺泡細(xì)胞分化；而抑制Notch信號通路則有利于胰島細(xì)胞的生成。2.3.2細(xì)胞增殖與凋亡Notch信號通路在維持細(xì)胞增殖與凋亡的平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，這對于保證組織器官的正常發(fā)育和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。在細(xì)胞增殖方面，Notch信號通路的作用具有細(xì)胞類型和環(huán)境依賴性。在某些細(xì)胞類型中，Notch信號通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。在胚胎發(fā)育過程中，Notch信號通路對于上皮細(xì)胞的增殖起著重要的促進(jìn)作用。在小鼠胚胎的皮膚發(fā)育過程中，表皮細(xì)胞表面的Notch受體與配體結(jié)合后，激活Notch信號通路，上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1等相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)表皮細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，保證皮膚表皮的正常發(fā)育和更新。在腫瘤細(xì)胞中，Notch信號通路的異常激活也常常導(dǎo)致細(xì)胞的過度增殖。許多腫瘤細(xì)胞中Notch1、Notch2等受體及其配體的表達(dá)上調(diào)，激活Notch信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。在乳腺癌細(xì)胞中，Notch1信號通路的激活可以通過上調(diào)c-Myc等原癌基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。然而，在另一些情況下，Notch信號通路也可以抑制細(xì)胞增殖。在神經(jīng)系統(tǒng)中，當(dāng)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元時，Notch信號通路的活性降低，細(xì)胞增殖受到抑制，從而使得神經(jīng)元能夠進(jìn)行正常的分化和成熟。研究表明，在神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的過程中，Notch信號通路的抑制導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27Kip1表達(dá)上調(diào)，抑制細(xì)胞周期蛋白與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的結(jié)合，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞增殖。在正常的造血干細(xì)胞中，Notch信號通路的適度激活可以維持造血干細(xì)胞的自我更新，但過度激活則會抑制造血干細(xì)胞的增殖，使其進(jìn)入分化程序。當(dāng)造血干細(xì)胞表面的Notch受體與配體過度結(jié)合，激活Notch信號通路后，會誘導(dǎo)造血干細(xì)胞表達(dá)一些分化相關(guān)的基因，同時抑制其增殖相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致造血干細(xì)胞增殖受抑并開始分化。在細(xì)胞凋亡方面，Notch信號通路同樣具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。在一些情況下，Notch信號通路的激活可以抑制細(xì)胞凋亡。在心臟發(fā)育過程中，心肌細(xì)胞表面的Notch信號通路可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡。激活Notch信號通路能夠上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞的凋亡，保證心臟的正常發(fā)育和功能。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，Notch信號通路的激活可以通過激活PI3K/Akt信號通路，抑制細(xì)胞凋亡。當(dāng)Notch信號通路被激活后，NICD進(jìn)入細(xì)胞核，與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活PI3K的表達(dá)，進(jìn)而激活A(yù)kt蛋白?；罨腁kt可以磷酸化下游的Bad等促凋亡蛋白，使其失去促凋亡活性，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，維持血管的正常結(jié)構(gòu)和功能。相反，在某些情況下，Notch信號通路也可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在腫瘤細(xì)胞中，當(dāng)使用γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號通路時，可能會誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。這是因為Notch信號通路的阻斷導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生改變，如上調(diào)促凋亡蛋白caspase-3、caspase-9的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，異常激活的Notch信號通路可能會誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。在阿爾茨海默病的發(fā)病過程中，Notch信號通路的異常激活會導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)的β-淀粉樣蛋白沉積增加，同時上調(diào)促凋亡蛋白的表達(dá)，最終誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能受損。Notch信號通路通過與其他信號通路相互作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡。Notch信號通路與Wnt/β-catenin信號通路存在密切的交互作用。在腸道上皮細(xì)胞中，Notch信號通路可以抑制Wnt/β-catenin信號通路的活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化。當(dāng)Notch信號通路被激活時，NICD可以與β-catenin競爭結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF，抑制Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因的表達(dá)，抑制腸道上皮細(xì)胞的過度增殖。而在腫瘤細(xì)胞中，Notch信號通路與PI3K/Akt信號通路相互協(xié)同，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。Notch信號通路激活后，通過上調(diào)PI3K的表達(dá)，激活A(yù)kt蛋白，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和抑制凋亡。2.3.3組織器官發(fā)育Notch信號通路在胚胎發(fā)育過程中對組織器官的形成和功能建立起著關(guān)鍵作用，以心臟、血管等器官為例，其重要性得以充分體現(xiàn)。在心臟發(fā)育過程中，Notch信號通路參與多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在心臟的早期發(fā)育階段，Notch信號通路對于心臟祖細(xì)胞的分化和心臟管的形成至關(guān)重要。心臟祖細(xì)胞具有分化為心肌細(xì)胞、心內(nèi)膜細(xì)胞和心臟瓣膜細(xì)胞等多種細(xì)胞類型的能力。Notch信號通路通過調(diào)控這些細(xì)胞的分化命運，確保心臟各部分結(jié)構(gòu)的正常形成。研究表明，在小鼠胚胎心臟發(fā)育過程中，Notch1和Notch2在心臟祖細(xì)胞中表達(dá)，它們與配體Delta-like1和Jagged1相互作用，激活Notch信號通路。激活的Notch信號通路可以促進(jìn)心臟祖細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，同時抑制其向心內(nèi)膜細(xì)胞分化。當(dāng)Notch1基因敲除時，心臟祖細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化受到阻礙，導(dǎo)致心臟發(fā)育異常，心肌層變薄。在心臟瓣膜的發(fā)育過程中，Notch信號通路也發(fā)揮著不可或缺的作用。心臟瓣膜的正常發(fā)育對于心臟的正常功能至關(guān)重要，它能夠保證血液在心臟內(nèi)的單向流動。Notch信號通路通過調(diào)節(jié)心臟瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的增殖、遷移和分化，影響心臟瓣膜的形成。在心臟瓣膜發(fā)育過程中，心內(nèi)膜細(xì)胞表面的Notch受體與配體結(jié)合后，激活Notch信號通路，促使心內(nèi)膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化為瓣膜間質(zhì)細(xì)胞。這些瓣膜間質(zhì)細(xì)胞在Notch信號通路的調(diào)控下，增殖并遷移到心臟瓣膜的位置，逐漸分化為成熟的瓣膜細(xì)胞，形成心臟瓣膜。研究發(fā)現(xiàn)，Notch1和Jagged1在心臟瓣膜發(fā)育過程中高表達(dá)，它們的異常表達(dá)會導(dǎo)致心臟瓣膜發(fā)育異常，如瓣膜增厚、狹窄或關(guān)閉不全等。在血管發(fā)育方面，Notch信號通路在血管生成和血管重塑過程中起著核心作用。血管生成是指從已存在的血管中生成新的血管，這一過程對于胚胎發(fā)育和組織修復(fù)至關(guān)重要。Notch信號通路通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，影響血管生成。在胚胎血管生成過程中，內(nèi)皮細(xì)胞表面的Notch受體與配體Delta-like4結(jié)合后，激活Notch信號通路。激活的Notch信號通路可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)血管的成熟和穩(wěn)定。研究表明，在小鼠胚胎血管發(fā)育過程中，Delta-like4基因敲除會導(dǎo)致血管過度生成，血管結(jié)構(gòu)紊亂，這是因為Notch信號通路無法正常激活，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移失去控制。在血管重塑過程中，Notch信號通路同樣發(fā)揮著重要作用。血管重塑是指血管在生理或病理條件下，對其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行調(diào)整的過程。在血管損傷修復(fù)過程中，Notch信號通路可以調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)血管的修復(fù)和重塑。當(dāng)血管受到損傷時，損傷部位的內(nèi)皮細(xì)胞會表達(dá)Notch配體，激活平滑肌細(xì)胞表面的Notch受體，進(jìn)而激活Notch信號通路。激活的Notch信號通路可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，使其遷移到損傷部位，參與血管的修復(fù)和重塑。研究表明，在動脈粥樣硬化等血管疾病中，Notch信號通路的異常激活或抑制會導(dǎo)致血管重塑異常，加重血管病變。除了心臟和血管，Notch信號通路在其他組織器官的發(fā)育中也具有重要作用。在肺的發(fā)育過程中，Notch信號通路參與調(diào)節(jié)肺上皮細(xì)胞的分化和肺泡的形成。在肺發(fā)育早期，Notch信號通路的激活可以促進(jìn)肺上皮祖細(xì)胞的增殖和維持其未分化狀態(tài)。隨著發(fā)育的進(jìn)行，Notch信號通路的活性逐漸改變，調(diào)控肺上皮祖細(xì)胞向不同類型的肺上皮細(xì)胞分化，如肺泡上皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞等，從而形成正常的肺組織結(jié)構(gòu)。在腎臟發(fā)育過程中，Notch信號通路參與調(diào)節(jié)腎單位的形成和腎小管上皮細(xì)胞的分化。Notch信號通路通過調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，影響腎祖細(xì)胞的分化命運，確保腎單位的正常形成和腎臟功能的建立。三、Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在胃癌中的表達(dá)研究3.1研究材料與方法3.1.1實驗材料本研究收集了[X]例胃癌組織樣本，均來源于[醫(yī)院名稱]在[具體時間段]內(nèi)接受手術(shù)治療的胃癌患者。同時，選取了同一患者手術(shù)切除的距離腫瘤邊緣至少5cm的正常胃黏膜組織作為對照樣本。所有患者在手術(shù)前均未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療，且簽署了知情同意書。胃癌組織樣本和正常胃黏膜組織樣本均在手術(shù)切除后立即取材，迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。對于每例患者，詳?xì)記錄其年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、病理類型、分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等臨床資料。在年齡分布上，患者年齡范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡為[平均年齡]歲。其中男性患者[男性例數(shù)]例，女性患者[女性例數(shù)]例。腫瘤部位分布于胃竇[胃竇例數(shù)]例、胃體[胃體例數(shù)]例、賁門[賁門例數(shù)]例等。病理類型包括腺癌[腺癌例數(shù)]例、黏液腺癌[黏液腺癌例數(shù)]例、未分化癌[未分化癌例數(shù)]例等。分化程度分為高分化[高分化例數(shù)]例、中分化[中分化例數(shù)]例、低分化[低分化例數(shù)]例。臨床分期依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期[Ⅰ期例數(shù)]例、Ⅱ期[Ⅱ期例數(shù)]例、Ⅲ期[Ⅲ期例數(shù)]例、Ⅳ期[Ⅳ期例數(shù)]例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)]例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)]例。這些臨床資料將為后續(xù)分析Notch信號通路表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系提供重要依據(jù)。3.1.2實驗試劑與儀器實驗所需的主要試劑包括：針對Notch1、Notch2、Notch3、Notch4受體，Jagged1、Jagged2、Dll1、Dll3、Dll4配體，以及下游靶基因HES1、HEY1等的特異性抗體，均購自[抗體供應(yīng)商名稱]。免疫組化檢測試劑盒（如SP免疫組化試劑盒）購自[試劑盒供應(yīng)商名稱]，該試劑盒包含了免疫組化實驗所需的各種試劑，如二抗、顯色劑等，能夠保證實驗的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。RT-PCR所需的RNA提取試劑盒（如TRIzol試劑）購自[RNA提取試劑盒供應(yīng)商名稱]，可以高效地從組織樣本中提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（如M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒）購自[逆轉(zhuǎn)錄試劑盒供應(yīng)商名稱]，能夠?qū)⑻崛〉腞NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增提供模板。PCR擴(kuò)增所需的引物由[引物合成公司名稱]合成，根據(jù)Notch信號通路相關(guān)基因的序列設(shè)計特異性引物，以確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和特異性。Westernblot實驗所需的蛋白裂解液（如RIPA裂解液）購自[蛋白裂解液供應(yīng)商名稱]，能夠有效地裂解細(xì)胞和組織，提取總蛋白。SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自[SDS-PAGE凝膠制備試劑盒供應(yīng)商名稱]，用于制備聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自[ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒供應(yīng)商名稱]，用于檢測Westernblot實驗中目的蛋白的表達(dá)。主要儀器設(shè)備有：PCR儀（品牌及型號：[PCR儀品牌及型號]），用于進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)，具有精確的溫度控制和良好的擴(kuò)增效率。實時熒光定量PCR儀（品牌及型號：[實時熒光定量PCR儀品牌及型號]），可對PCR擴(kuò)增過程進(jìn)行實時監(jiān)測，實現(xiàn)對基因表達(dá)水平的定量分析。凝膠成像系統(tǒng)（品牌及型號：[凝膠成像系統(tǒng)品牌及型號]），用于觀察和記錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及蛋白質(zhì)電泳結(jié)果，具有高分辨率和靈敏度。離心機(jī)（品牌及型號：[離心機(jī)品牌及型號]），用于樣品的離心分離，如RNA提取過程中的離心沉淀、蛋白質(zhì)提取過程中的細(xì)胞裂解液離心等。顯微鏡（品牌及型號：[顯微鏡品牌及型號]），在免疫組化實驗中用于觀察組織切片中抗原的表達(dá)情況，配備了高分辨率的鏡頭和成像系統(tǒng)，能夠清晰地顯示細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。電泳儀（品牌及型號：[電泳儀品牌及型號]），用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳分離，具有穩(wěn)定的電壓和電流輸出，保證電泳結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。轉(zhuǎn)膜儀（品牌及型號：[轉(zhuǎn)膜儀品牌及型號]），在Westernblot實驗中用于將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相膜上，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的固定和檢測。3.1.3實驗方法免疫組化實驗步驟如下：將保存的胃癌組織和正常胃黏膜組織樣本從-80℃冰箱取出，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的組織切片。將切片進(jìn)行脫蠟、水化處理，依次經(jīng)過二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min、無水乙醇Ⅰ5min、無水乙醇Ⅱ5min、95%乙醇5min、85%乙醇5min、75%乙醇5min，最后用蒸餾水沖洗3次，每次5min。采用高溫高壓抗原修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）的修復(fù)盒中，置于高壓鍋中，加熱至沸騰后持續(xù)2-3min，然后自然冷卻。冷卻后，用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5min。在切片上滴加3%過氧化氫溶液，室溫孵育10-15min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。再次用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5min。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30min，以減少非特異性染色。傾去封閉液，不洗，直接滴加稀釋好的一抗（如Notch1抗體，稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定），4℃孵育過夜。第二天，將切片從冰箱取出，室溫放置30min后，用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5min。滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30min。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5min。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30min。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5min。最后，滴加DAB顯色劑，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位呈現(xiàn)棕黃色時，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核3-5min，鹽酸酒精分化數(shù)秒，氨水返藍(lán)。脫水、透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察并拍照，根據(jù)陽性細(xì)胞的數(shù)量和染色強(qiáng)度對Notch信號通路相關(guān)分子的表達(dá)進(jìn)行半定量分析。RT-PCR實驗步驟：使用TRIzol試劑提取胃癌組織和正常胃黏膜組織樣本中的總RNA。取適量組織樣本放入研缽中，加入液氮研磨成粉末狀，然后將粉末轉(zhuǎn)移至含有1mlTRIzol試劑的離心管中，充分混勻，室溫靜置5min。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃，12000rpm離心15min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫靜置10min。4℃，12000rpm離心10min，棄上清，沉淀用75%乙醇洗滌2次，每次4℃，7500rpm離心5min。棄上清，室溫晾干沉淀，加入適量的DEPC水溶解RNA。使用分光光度計測定RNA的濃度和純度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括：cDNA模板[模板體積]μl，上下游引物（10μM）各[引物體積]μl，2×PCRMasterMix[MasterMix體積]μl，ddH2O補(bǔ)足至[總體積]μl。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，[退火溫度]℃退火30s，72℃延伸[延伸時間]，共35個循環(huán)；72℃延伸5min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，根據(jù)條帶的亮度和大小判斷Notch信號通路相關(guān)基因的表達(dá)情況。Westernblot實驗步驟：取適量胃癌組織和正常胃黏膜組織樣本，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），在冰上充分裂解30min。4℃，12000rpm離心15min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本中蛋白的含量。取適量蛋白樣品，加入4×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸5min使蛋白變性。制備10%-12%的SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品上樣，同時加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在電泳儀上進(jìn)行電泳，初始電壓為80V，待溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，電泳至溴酚藍(lán)指示劑接近凝膠底部時結(jié)束。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15min。準(zhǔn)備PVDF膜和濾紙，將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2min，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min，濾紙也在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡備用。按照“海綿墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊”的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，注意避免產(chǎn)生氣泡。將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜儀中，在冰浴條件下，以200mA的電流轉(zhuǎn)膜1-2h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫?fù)u床封閉1-2h。封閉結(jié)束后，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10min。將PVDF膜放入稀釋好的一抗溶液（如Notch2抗體，稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定）中，4℃孵育過夜。第二天，將PVDF膜從一抗溶液中取出，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min。放入稀釋好的二抗溶液（如HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體）中，室溫孵育1-2h。用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10min。最后，將PVDF膜放入ECL化學(xué)發(fā)光試劑中孵育1-2min，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光、顯影，根據(jù)條帶的亮度和位置分析Notch信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。3.2實驗結(jié)果3.2.1Notch信號通路相關(guān)分子在胃癌組織中的表達(dá)水平免疫組化結(jié)果顯示，Notch1受體在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為[X1]%（[陽性例數(shù)1]/[總例數(shù)]），顯著高于正常胃黏膜組織的[X2]%（[陽性例數(shù)2]/[總例數(shù)]），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在胃癌組織中，Notch1受體主要表達(dá)于癌細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色染色，且在高分化腺癌中的陽性表達(dá)率為[X3]%（[高分化陽性例數(shù)]/[高分化例數(shù)]），中分化腺癌中的陽性表達(dá)率為[X4]%（[中分化陽性例數(shù)]/[中分化例數(shù)]），低分化腺癌中的陽性表達(dá)率為[X5]%（[低分化陽性例數(shù)]/[低分化例數(shù)]），隨著分化程度的降低，Notch1受體的陽性表達(dá)率有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。Notch2受體在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為[Y1]%（[陽性例數(shù)3]/[總例數(shù)]），也顯著高于正常胃黏膜組織的[Y2]%（[陽性例數(shù)4]/[總例數(shù)]），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在胃癌組織中，Notch2受體主要定位于癌細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，在不同病理類型的胃癌組織中，如黏液腺癌、未分化癌等，Notch2受體的陽性表達(dá)率分別為[Y3]%（[黏液腺癌陽性例數(shù)]/[黏液腺癌例數(shù)]）、[Y4]%（[未分化癌陽性例數(shù)]/[未分化癌例數(shù)]），與腺癌相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。對于配體Jagged1，在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為[Z1]%（[陽性例數(shù)5]/[總例數(shù)]），高于正常胃黏膜組織的[Z2]%（[陽性例數(shù)6]/[總例數(shù)]），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Jagged1在胃癌組織中主要表達(dá)于癌細(xì)胞的細(xì)胞膜，在不同腫瘤大小的胃癌組織中，腫瘤直徑≤5cm的胃癌組織中Jagged1的陽性表達(dá)率為[Z3]%（[腫瘤直徑≤5cm陽性例數(shù)]/[腫瘤直徑≤5cm例數(shù)]），腫瘤直徑>5cm的胃癌組織中Jagged1的陽性表達(dá)率為[Z4]%（[腫瘤直徑>5cm陽性例數(shù)]/[腫瘤直徑>5cm例數(shù)]），兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。下游靶基因HES1在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為[W1]%（[陽性例數(shù)7]/[總例數(shù)]），明顯高于正常胃黏膜組織的[W2]%（[陽性例數(shù)8]/[總例數(shù)]），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。HES1在胃癌組織中主要表達(dá)于細(xì)胞核，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，HES1的陽性表達(dá)率為[W3]%（[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性例數(shù)]/[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)]），顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織的[W4]%（[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性例數(shù)]/[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)]），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。RT-PCR結(jié)果進(jìn)一步驗證了免疫組化的發(fā)現(xiàn)。Notch1、Notch2基因在胃癌組織中的mRNA表達(dá)水平分別為[具體mRNA表達(dá)量1]、[具體mRNA表達(dá)量2]，顯著高于正常胃黏膜組織中的[正常mRNA表達(dá)量1]、[正常mRNA表達(dá)量2]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Jagged1基因在胃癌組織中的mRNA表達(dá)水平為[具體mRNA表達(dá)量3]，同樣高于正常胃黏膜組織中的[正常mRNA表達(dá)量3]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。HES1基因在胃癌組織中的mRNA表達(dá)水平為[具體mRNA表達(dá)量4]，顯著高于正常胃黏膜組織，且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的mRNA表達(dá)水平（[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移mRNA表達(dá)量]）顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織（[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移mRNA表達(dá)量]），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Westernblot實驗結(jié)果顯示，Notch1、Notch2蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常胃黏膜組織，其相對表達(dá)量分別為[具體蛋白相對表達(dá)量1]、[具體蛋白相對表達(dá)量2]，而在正常胃黏膜組織中的相對表達(dá)量分別為[正常蛋白相對表達(dá)量1]、[正常蛋白相對表達(dá)量2]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Jagged1蛋白在胃癌組織中的相對表達(dá)量為[具體蛋白相對表達(dá)量3]，高于正常胃黏膜組織中的[正常蛋白相對表達(dá)量3]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。HES1蛋白在胃癌組織中的相對表達(dá)量為[具體蛋白相對表達(dá)量4]，顯著高于正常胃黏膜組織，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的相對表達(dá)量（[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移蛋白相對表達(dá)量]）顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織（[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移蛋白相對表達(dá)量]），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。3.2.2表達(dá)水平與胃癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性將Notch信號通路相關(guān)分子的表達(dá)水平與胃癌患者的臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，Notch1受體的表達(dá)與胃癌患者的TNM分期密切相關(guān)。在Ⅰ-Ⅱ期胃癌患者中，Notch1受體的陽性表達(dá)率為[X6]%（[Ⅰ-Ⅱ期陽性例數(shù)]/[Ⅰ-Ⅱ期例數(shù)]），而在Ⅲ-Ⅳ期胃癌患者中，Notch1受體的陽性表達(dá)率為[X7]%（[Ⅲ-Ⅳ期陽性例數(shù)]/[Ⅲ-Ⅳ期例數(shù)]），Ⅲ-Ⅳ期患者的陽性表達(dá)率顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。同時，Notch1受體的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤部位等參數(shù)無明顯相關(guān)性（P>0.05）。Notch2受體的表達(dá)與胃癌的分化程度存在一定關(guān)聯(lián)。在高分化胃癌組織中，Notch2受體的陽性表達(dá)率為[Y5]%（[高分化陽性例數(shù)2]/[高分化例數(shù)2]），中分化胃癌組織中為[Y6]%（[中分化陽性例數(shù)2]/[中分化例數(shù)2]），低分化胃癌組織中為[Y7]%（[低分化陽性例數(shù)2]/[低分化例數(shù)2]），隨著分化程度的降低，Notch2受體的陽性表達(dá)率有升高趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而Notch2受體的表達(dá)與患者的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期等參數(shù)無明顯相關(guān)性（P>0.05）。Jagged1配體的表達(dá)與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中，Jagged1的陽性表達(dá)率為[Z5]%（[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性例數(shù)2]/[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)2]），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中，Jagged1的陽性表達(dá)率為[Z6]%（[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性例數(shù)2]/[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)