第七章受體放射分析〔RBA〕第一節(jié)概論

至今，研究受體親和力和受體數(shù)量最根本，最主要的方法仍然是受體的放射性配基結(jié)合分析〔radioligandbindingassayofreceptors，RBA〕，簡稱受體放射分析。它是應(yīng)用放射性核素標(biāo)記配基與特異性的受體結(jié)合，研究受體的親和力和受體的數(shù)量，也是研究受體亞型的常用方法。迄今為止，所有已發(fā)現(xiàn)的受體〔receptor〕都是具有特定氨基酸序列和特定構(gòu)型的蛋白質(zhì)。每一種受體在細(xì)胞上都有特定的宏觀分布〔器官和組織特異性〕和微觀分布〔細(xì)胞或細(xì)胞核〕。雖然受體在總蛋白分子中所占的份額很小，約為十萬到百萬分之一，但受體的功能卻十分重要，它接受細(xì)胞外的特定信號〔神經(jīng)遞質(zhì)、激素、某些藥物等〕，通過受體后特定的信號傳遞系統(tǒng)，引起細(xì)胞的特定反響，因此，受體是高等動物適應(yīng)環(huán)境、協(xié)調(diào)機(jī)體各種細(xì)胞功能的關(guān)鍵分子?？梢哉J(rèn)為，受體是細(xì)胞適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境最重要的門戶，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中更是信息傳遞和儲存的樞紐。一、受體的分類和受體亞型按受體所在的部位不同分為細(xì)胞膜受體和細(xì)胞核受體。每種受體都有特異的內(nèi)源性和外源性配基，但是藥理實驗和放射配基結(jié)合實驗發(fā)現(xiàn)，不少受體存在兩種或兩種以上的亞型。所謂受體的亞型是指受體分子結(jié)構(gòu)上既有局部相同之處，也存在局部差異，它們對一定的配基有不同的親和力，在生物學(xué)上具有各自不同的效應(yīng)。受體亞型的區(qū)分是生物進(jìn)化的結(jié)果，有利于機(jī)體處理信息的能力及適應(yīng)性更強。二、跨膜受體的信號傳遞通路跨膜受體是含糖或不含糖的蛋白質(zhì)分子，它的主要作用是將細(xì)胞外的信號傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，信號再從細(xì)胞漿傳遞到效應(yīng)器，最后是一個特定的生物學(xué)效應(yīng)。信號的這種傳導(dǎo)過程稱為信號傳導(dǎo)通路〔signaltransudationpathway〕，它是當(dāng)今生物學(xué)領(lǐng)域中一個重大的研究課題。受體信號傳導(dǎo)確實切通路和機(jī)理至今仍未完全說明，同學(xué)們可參閱“細(xì)胞生物學(xué)〞等相關(guān)課程。三、受體與配基結(jié)合的特性1、可飽和性〔satiability〕每個細(xì)胞所含受體數(shù)是有限的，因此配基與受體結(jié)合的反響曲線應(yīng)該具有可飽和性，受體結(jié)合反響呈高親和性和低容量，而非特異結(jié)合那么呈低親和性和高容量，后者的劑量反響曲線不呈可飽和性。2、可逆性〔reversibility〕激素、遞質(zhì)和藥物與特異性受體結(jié)合反響是可逆的，當(dāng)受體周圍的配基濃度降低，結(jié)合反響就逆向進(jìn)行，即配基受體復(fù)合物很快解離，解離后的配基是原形，不起代謝變化，這跟酶與底物作用結(jié)果不同，底物經(jīng)酶作用后變成代謝產(chǎn)物。4、與效應(yīng)的一致性受體的主要功能是介導(dǎo)配基的生物效應(yīng)，如果一種蛋白能與某種物質(zhì)結(jié)合而不介導(dǎo)特定的生物效應(yīng)，那么這種蛋白不能稱之為受體。所以用生物效應(yīng)作為觀察受體和配基性質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)是十分必要的。從配基的角度分析，有的是陽性效應(yīng)，有的是陰性效應(yīng)。陽性效應(yīng)就是配基與受體結(jié)合后引起陽性生理效應(yīng)，稱為沖動劑。陰性效應(yīng)就是配基與受體結(jié)合后不但不引起陽性生理效應(yīng)，而且阻斷內(nèi)源性配基的陽性生理作用，稱為拮抗劑或阻斷劑。四、受體的生理調(diào)節(jié)

細(xì)胞膜上受體的數(shù)量和親和性隨細(xì)胞所處的環(huán)境而發(fā)生變化。受體的這種生理調(diào)節(jié)現(xiàn)象與人體的疾病、藥物作用有著密切的關(guān)系。受體的生理調(diào)節(jié)作用可分為向上調(diào)節(jié)和向下調(diào)節(jié)。

1、向下調(diào)節(jié)〔down-regulation〕細(xì)胞所處環(huán)境中某種沖動劑的濃度增高或長期作用，其結(jié)果使相應(yīng)受體的數(shù)量減少，并出現(xiàn)受體對此物質(zhì)的敏感性下降，或耐受性增高等現(xiàn)象，如哮喘病人長期服用β-沖動劑產(chǎn)生的耐受性增高，即藥效減弱。第二節(jié)受體配基結(jié)合反響的根本原理一、簡單單位點系統(tǒng)受體與配基相互結(jié)合的根本規(guī)律〔一〕質(zhì)量作用定律〔massactionlaw〕對某種受體而言，它的全部受體都以相同的親和性以單分子與特定的配基相結(jié)合〔分子比為1：1〕，而且不表現(xiàn)明顯的正負(fù)協(xié)同作用，理論上講結(jié)合后產(chǎn)生的生物效應(yīng)也應(yīng)完全相同。即為簡單單位點系統(tǒng)。有時，一個受體系統(tǒng)中存在兩〔多〕種亞型，但所用配基無選擇性，盡管亞型的生物效應(yīng)可能不全相同，結(jié)合反響卻表現(xiàn)出完全相同的特征，這時，也可作為單位點系統(tǒng)來看待?！捕硰?fù)合物的濃度和配基濃度的關(guān)系：上式展開，重排，得到下式：可以看出，[RL]和[LT]并非線性關(guān)系，而是曲線關(guān)系，對一定數(shù)量〔[RT]固定〕和一定親和力〔KD固定〕的受體來說，配基濃度從零開始上升時，復(fù)合物濃度先是上升很快，以后逐漸變慢，最后絕大多數(shù)受體都變?yōu)閺?fù)合物，也就是受體被飽和了。這就是飽和曲線〔saturationcurve)〔圖9－1〕。曲線的高度主要反映受體的數(shù)量多少，曲線上升的快慢那么主要反映受體和配基的親和力〔親和力越高，上升越快〕?！踩撤翘禺惤Y(jié)合〔non－specificbinding，NSB〕上述飽和曲線是受體與配基的特異結(jié)合形成的。這種結(jié)合的特點是低容量〔受體的數(shù)量不多〕和高親和力，所以容易飽和。但是，任何受體標(biāo)本除特異結(jié)合外，還會有一局部非特異結(jié)合，當(dāng)別離特異結(jié)合的復(fù)合物測量放射性時，這局部非特異結(jié)合的放射性混在一起，測到的是總放射性〔totalbinding，TB〕，必需先減去非特異結(jié)合〔NSB〕，才能得到特異結(jié)合〔specificbinding，SB〕的放射性。NSB主要來自雜蛋白，反響器壁，別離材料的吸附，它的特點是，容量很大，而親和力低，因此在一般情況下不被飽和，也就是隨著配基濃度的升高，它不呈飽和曲線，而是一條上升的直線〔圖9－l〕。另外，如果系統(tǒng)中存在大量同種受體的非標(biāo)記配基，那么放射性的SB被非標(biāo)記配基取代，而NSB由于容量很大，空余的位點很多，放射性不被取代。所以要從TB中減去NSB，最根本的方法是做一系列平行管，所有的條件都與TB管相同，只是多加100-1000倍量的非標(biāo)記配基，將SB完全取代掉，這時的放射性結(jié)合即為NSB。由于NSB和放射配基呈直線關(guān)系，多點飽和法的實驗中往往只需做3-4點，再用直線回歸法求出其余各點的放射性?！菜摹砈catchard作圖〔Scatchardplot〕將9－1寫成以下形式：KD＝[RT－RL］[L]／「RL]上式重排，得到著名的Scatchard函數(shù)：可以看出，當(dāng)RT和KD固定時，〔RL〕／[L]和[RL]是線性關(guān)系，也就是說，以［RL］為橫坐標(biāo)，以「RL」／［L」為縱坐標(biāo)，將得到一條直線。這是簡單單位點系統(tǒng)的一個重要特征。橫截距即為RT值〔當(dāng)［RL」／［L」＝0時，［RT」＝「RL」〕，直線斜率的倒數(shù)就是KD〔圖9－3〕。Scatchard作圖除進(jìn)行數(shù)據(jù)處理外，還能判斷一些較復(fù)雜的情況。例如，一般來說，Scatchard作圖在以下情況下不呈直線：①雙位點或多位點系統(tǒng)，亦即受體有兩種以上親和力；②受體有正協(xié)同〔nositivecooperatively〕或負(fù)協(xié)同〔negativecooperatively〕現(xiàn)象；③非特異結(jié)合的測定所用非標(biāo)記配基濃度不對，或把一局部非特異結(jié)合也抑制了，或?qū)μ禺惤Y(jié)合的抑制不完全?！参濉痴?fù)協(xié)同作用何謂正負(fù)協(xié)同作用？它是指當(dāng)一局部受體與配基結(jié)合后使相鄰的受體的親和力發(fā)生改變，倘假設(shè)親和力逐步下降，稱之為負(fù)協(xié)同作用〔如圖9－4中曲線〔2〕〕，親和力逐步增大，稱之為正協(xié)同作用?！睬€〔3〕〕?！擦呈荏w與配基反響的動力學(xué)〔kinetics〕受體與配基的結(jié)合反響一般都較快〔多數(shù)在數(shù)十秒至數(shù)十分鐘〕到達(dá)平衡。當(dāng)周圍的游離配基急劇下降，或非標(biāo)記配基濃度急劇升高時，放射性復(fù)合物的解離也很快〔圖9－6〕，這種快速結(jié)合和快速解離對保證受體的迅速反響有很重要的意義?！财摺掣偁幮匀〈错憽瞔ompetitivedisplacementreaction)在一個受體和放射配基的反響系統(tǒng)中參加另一個化合物，它假設(shè)能和受體的配基結(jié)合位點結(jié)合，那么會與放射配基競爭與受體結(jié)合，最終將表現(xiàn)為放射配基與受體形成復(fù)合物的能力降低〔親和力降低〕，但受體數(shù)量不變所以叫競爭性取代反響，此時，非標(biāo)記的起競爭作用的配基稱為競爭劑〔competitiveagent〕，它們和受體結(jié)合后不改變受體分子的結(jié)構(gòu)。表示競爭劑抑制作用強弱的指標(biāo)有二個：IC50值和KI。IC50值是指抑制50％受體與放射配基結(jié)合所需競爭劑的濃度，IC50值大，說明競爭劑抑制作用小。KI那么是指競爭劑的平衡解離常數(shù)，KI越小，說明競爭劑抑制作用越大。

二、雙位點系統(tǒng)一種配基可以和兩種以上的受體亞型結(jié)合，每種亞型都有相應(yīng)的KD值。這一局部的內(nèi)容感興趣的同學(xué)自己閱讀！第三節(jié)受體放射分析的根本方法一、放射性配基的要求制備優(yōu)良的放射性配基是受體結(jié)合試驗的首要條件。對任何一種受體系統(tǒng)，通常都有好幾種標(biāo)記配基可供選擇。選擇應(yīng)從兩方面考慮：①配基的特性；②實驗?zāi)康摹?/p>

〔－〕對放射性配基的根本要求1、高比活度組織細(xì)胞內(nèi)的受體濃度一般都很低，約在104-105個／細(xì)胞，或蛋白的水平，而且受體對配基的平衡解離常數(shù)約在10-9mol/L上下。因此，低比活度的配基難于到達(dá)分析靈敏度的要求。一般要求配基比活度至少在3．7×1011Bq〔10Ci〕／mmol以上。另外，配基比活度高，參加反響管的放射性配基量才有可能減少，從而有利于用小量標(biāo)本得到可靠的數(shù)據(jù)，并有利降低非特異性結(jié)合率。2、高親和力因為親和力高，可以減少標(biāo)記配基用量，從而既可降低非特異性結(jié)合，又可使放射性配基與受體的結(jié)合物解離變慢，便于進(jìn)行結(jié)合和游離配基的別離。不僅方便操作，而且獲得的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。3、特異性強即該配基與所研究受體有選擇性結(jié)合，理想的是該配基只與一種受體或受體亞型結(jié)合。但沒有一種配基是完全選擇性的，所以要結(jié)合實驗研究的目的，選擇對某一受體或其中某一亞型親和力高的放射性配基。4、穩(wěn)定性好包括標(biāo)記的穩(wěn)定性、貯藏時的穩(wěn)定性以及溫育分析時之穩(wěn)定性。

從實驗?zāi)康目紤]那么主要針對具體研究目標(biāo)來選擇。例如有的受體有幾種亞型，如果實驗的意圖是放射性配基要結(jié)合所有這幾個亞型，即可選擇無亞型選擇的配基。相反，想研究其中某一個亞型，那么應(yīng)選擇針對該亞型的高親和力配基。目前，用作受體放射分析的放射性配基多用3H、125I標(biāo)記。氚標(biāo)記配基與原型配基為同型式，生物學(xué)活性好，多數(shù)情況下比活度也能到達(dá)要求，且半衰期長，使用方便，主要缺點是需用液閃測量，操作較麻煩，一般實驗室不能進(jìn)行標(biāo)記。多肽及蛋白質(zhì)配基多用125I標(biāo)記，其優(yōu)點是可以到達(dá)較高的比活度。只要很好掌握標(biāo)記條件〔單碘標(biāo)記物〕，仍能保持較好的生物活性。另外，碘標(biāo)記法快速、方便、經(jīng)濟(jì)，一般實驗室可進(jìn)行。測量操作簡單，所以125I-配基也大量采用。需要注意的是自行標(biāo)記125I-配基要解決兩個難題：①要確定標(biāo)記物的比活度，如果比活度不確切，最后所得的受體結(jié)合位點數(shù)不確切。②標(biāo)記配基的純化：多肽的碘標(biāo)化合物往往產(chǎn)生一碘〔monoiodinated〕和二碘〔iodinated〕標(biāo)記物。這些標(biāo)記物對受體的親和力有可能是不同的。

125I核素在存放過程中要衰變，因此125I配基應(yīng)該注意比活度的衰變校正，而且要有正確的校正方法。標(biāo)記配基的存放問題：標(biāo)記配基在存放過程中，由于受到核素的衰變，放射性的損傷等原因，其化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)必然會產(chǎn)生某些變化。為減輕損傷，氚標(biāo)記物，一般采用原包裝的溶劑作適當(dāng)稀釋后，在原推薦的溫度下保存。125I標(biāo)記物常用1％BSA的緩沖液適當(dāng)稀釋后分裝，在-20℃中存放。

〔二〕放射性配基的質(zhì)量鑒定選定好某一種放射性配基后，在具體使用前還應(yīng)對其質(zhì)量作適當(dāng)?shù)蔫b定，以保證受體結(jié)合分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。例如，一般是假定和推測所用的標(biāo)記配基與原型配基具有相同的生物活性，但具體使用時，應(yīng)認(rèn)真進(jìn)行評價。這一點常常是很多研究報告的結(jié)果對同一受體出現(xiàn)很大差異的重要原因。1、放射化學(xué)純度放射性配基的放射化學(xué)純度對受體結(jié)合率及分析靈敏度均有較大影響。除新鮮產(chǎn)品外存放一定時間后的標(biāo)記配基均應(yīng)重測其放化純度，以保證分析的準(zhǔn)確性。一般要求放化純度應(yīng)在95％以上。2、結(jié)合活性鑒定受體結(jié)合分析中，放射性配基的活性特別重要，特別是生物活性。目前，測定配基的活性主要是指與受體的結(jié)合能力。即測定其最大結(jié)合活性?，F(xiàn)介紹JCKermode提出的一種方法如下：①以定量標(biāo)記配基加逐級增加至過量的受體制劑〔飽和結(jié)合實驗〕進(jìn)行反響，測定結(jié)合百分率；②以結(jié)合百分率的倒數(shù)對受體濃度的倒數(shù)作圖，獲得一條直線；③延長直線與縱座標(biāo)的交點，即可算出該標(biāo)記配基結(jié)合活性％。〔如圖〕3、比活度受體結(jié)合分析最后的結(jié)果計算時離不開準(zhǔn)確的比活度數(shù)據(jù)。必要時也可用放射受體自身置換法測定比活度。這一方法假設(shè)使用得當(dāng)，能較準(zhǔn)確測定比活度，而且也反映標(biāo)記配基的受體結(jié)合活性。二、受體標(biāo)本的制備

在受體結(jié)合實驗的研究中，所用的受體材料可以是組織切片，也可以是完整的單層培養(yǎng)細(xì)胞或游離活細(xì)胞，粗制的或純化的細(xì)胞膜受體，可溶性的受體蛋白等。

〔－〕組織切片冷凍組織切片常用明膠粘貼于玻片上，在溫育緩沖液中與標(biāo)記配基進(jìn)行反響。反響后用緩沖液洗幾次即可，切片厚度一般為5-50μm。用組織切片的目的更多是研究受體的分布〔用放射自顯影法或免疫組化法〕?！捕秤坞x的完整細(xì)胞懸液完整的活細(xì)胞可以是血細(xì)胞，培養(yǎng)的單層細(xì)胞，腫瘤的腹水型細(xì)胞以及經(jīng)處理的原代細(xì)胞等。完整細(xì)胞的優(yōu)點是在研究受體結(jié)合特性同時，能進(jìn)行生物效應(yīng)的測定。使用完整細(xì)胞的優(yōu)點如下：1、受體處于原有的正常環(huán)境中。膜未受擾亂，膜內(nèi)pH、離子梯度也保存著。受體與其相連的效應(yīng)系統(tǒng)〔如G蛋白〕也保存完好。2、在受體功能反響完全的情況下研究受體，可以同時觀察配基與受體結(jié)合的情況和細(xì)胞的生物效應(yīng)。所得的結(jié)果更能反映受體的生理特點。3、能直接給出平均每一個細(xì)胞的受體數(shù)。但完整細(xì)胞的受體分析較難控制分析條件。操作過程可能導(dǎo)致細(xì)胞外表生理活性的改變，因此結(jié)果有時不夠穩(wěn)定。另外，假設(shè)細(xì)胞上某種受體的含量低，作分析時需參加大量細(xì)胞才能獲得足夠的放射性計數(shù)，給實際工作帶來一定困難。完整細(xì)胞來源分三種：①從組織別離出游離細(xì)胞；②血細(xì)胞；③培養(yǎng)細(xì)胞。一般都需采用臺盼藍(lán)等檢查細(xì)胞活性。〔三〕膜制劑〔membranouspreparation〕絕大多數(shù)受體結(jié)合分析使用膜制劑。使用膜制劑可以減少非特異性結(jié)合率。而且，在膜制備過程中，通過洗膜的方法，可以將內(nèi)源性配基洗去，并除去局部蛋白溶解酶。膜制劑通常也保存有受體-效應(yīng)器〔包括GTP結(jié)合蛋白等〕結(jié)合系統(tǒng)。但受體功能的其他方面那么失去了。另外，膜內(nèi)離子濃度梯度、受體與細(xì)胞結(jié)構(gòu)關(guān)系也失去了。但是，受體結(jié)合需要的是膜雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)本身，而不是細(xì)胞內(nèi)其他組份。所以膜碎片內(nèi)仍保存受體的藥理學(xué)特性。細(xì)胞膜和細(xì)胞漿受體的制備一般都利用蔗糖密度梯度離心法別離不同的亞細(xì)胞組分。其優(yōu)點是除去大局部雜蛋白，以減小非特異結(jié)合。為保證所制得的膜受體保持良好的結(jié)合活性，需注意：①全部過程在0℃-4℃下進(jìn)行操作。②制備緩沖液的蔗糖密度，離子強度，pH值及其它物質(zhì)〔如EDTA，Mg2＋〕應(yīng)嚴(yán)格控制。③組織勻漿條件應(yīng)保持一致：一般先用高速分散器，后改用玻璃勻漿器將細(xì)胞破裂。勻漿的時間、速度、溫度應(yīng)盡量一致。④離心的時間、速度、溫度應(yīng)保持恒定。⑤為防止膜受體蛋白被蛋白酶水解常加蛋白酶抑制劑。細(xì)胞組份的別離一般采用差速離心法。通過適當(dāng)控制離心力及離心時間可使某些顆粒組份沉淀，而另一些保存在上清液中。細(xì)胞組份的一般別離流程圖見圖9－15：l、粗膜制劑〔crudemembranouspreparation〕冷凍的組織塊切碎后加低滲緩沖液進(jìn)行勻漿。低速離心〔800－3500×g〕10－15分鐘，上清波再高速高心〔10000－30000×g〕10－15分鐘〔均在4℃下進(jìn)行〕。所得即為膜制劑或粗膜制劑。兩次離心的目的是盡可能去除可溶性物質(zhì)〔如內(nèi)源性配基、GTP等〕，以免干擾結(jié)合分析。2、洗膜制劑〔washedmembranouspreparation〕有時，上述粗制劑經(jīng)洗膜步驟后可有效地進(jìn)一步降低非特異結(jié)合及內(nèi)源性配基的結(jié)合。但洗膜過程必需防止受體蛋白的分解。目前抑制受體蛋白分解作用的主要方法有：①用新鮮組織；③低溫狀態(tài)下操作膜的制備；③加蛋白酶抑制劑。3、可溶性受體蛋白大多數(shù)跨膜受體用1％〔V／V〕TritonX-100能有效地將受體蛋白從雙脂層中溶解出來，也有用Digitonin或Tween-80等物質(zhì)來溶解。溶解受體時常加蛋白酶抑制劑以保護(hù)可溶性受體蛋白不被水解。一般用100000×g的超速離心法別離可溶性和不可溶性的物質(zhì)。所有操作都應(yīng)在4℃下進(jìn)行，以免受體蛋白產(chǎn)生凝結(jié)、變性。假設(shè)受體蛋白還需進(jìn)一步純化，常用特異的配基或抗體，以親合層析法別離受體蛋白。三、結(jié)合反響的類型〔－〕標(biāo)記配基飽和法〔radioligandsaturationmethod〕它又分為單點他和及多點飽和法。1、單點飽和法〔SinglepointSaturationmethod〕定量受體制劑加大量的標(biāo)記配基使受體得以飽和結(jié)合。根據(jù)受體-配基復(fù)合物的放射性計算受體結(jié)合容量〔或結(jié)合位點數(shù)〕。這種方法操作簡便、標(biāo)本用量少。但只憑單點實驗數(shù)據(jù)計算受體結(jié)合容量，比多點法的結(jié)果略低，不能給出KD，誤差也較大。2、多點飽和法〔multi-pointsaturationmethod〕一定量的受體制劑，逐步增加標(biāo)記配基的量〔一般7-8個實驗點〕，使受體的結(jié)合趨于飽和。用曲線擬合法或直線擬合法計算受體結(jié)合容量和親和力〔RT、KD〕，結(jié)果可靠性高。但受體標(biāo)本、標(biāo)記配基用量大，工作量大。如果在此類實驗中，受體存在兩種亞型，而所選的放射配基對兩種亞型又有一定選擇性，那么得到雙位點飽和曲線，用雙位點飽和曲線的數(shù)學(xué)模型可得到兩種亞型的「RT］和KD?！捕撤菢?biāo)記配基飽和法一定量的受體制劑和標(biāo)記配基，逐漸增加非標(biāo)記配基〔一般7－8個實驗點〕，使受體飽和結(jié)合，曲線擬合法或直線擬合法計算受體結(jié)合容量和親和力。這種方法克服了多點飽和法標(biāo)記配基用量大的缺點，但由于非標(biāo)記配基的用量逐漸加大，放射性逐步減少，必需標(biāo)記配基比活度較高才能得到滿意結(jié)果。四、分析條件的選擇〔一〕標(biāo)記配基濃度試驗類型不同，選用的標(biāo)記配基濃度也有不同。單點飽和試驗要求飽和量的標(biāo)記配基。對于多點飽和試驗，應(yīng)盡可能覆蓋飽和區(qū)及非飽和區(qū)，還應(yīng)考慮最低一點有足夠的放射性滿足放射性測量統(tǒng)計上的要求，最高一點的濃度那么往往要考慮配基的來源及價格?！捕呈荏w濃度一般說在一定范圍內(nèi)受體結(jié)合位點隨組織量的增加而增加，特異性結(jié)合量與組織濃度成線性關(guān)系。在線性范圍內(nèi)，較高受體濃度，有時可增加特異性結(jié)合與非特異性結(jié)合的比值，有人提出，受體濃度應(yīng)選為約相當(dāng)于KD值。在實踐中，往往需要通過實驗來確定受體濃度。〔三〕溫育溫度與時間溫度是影響反響速率的重要因素。溫度高，結(jié)合快，到達(dá)反響平衡時間短，溫度低，反響終止時容易降溫，減少別離過程中復(fù)合物的解離。另外，溫度低對配基及受體的穩(wěn)定性有利。不同受體結(jié)合系統(tǒng)的最正確溫度和時間要經(jīng)過試驗選定。對于飽和或競爭取代試驗，應(yīng)要求反響到達(dá)平衡，故溫育時間應(yīng)足夠長以到達(dá)平衡狀態(tài)。溫育溫度與平衡時間是緊密相關(guān)的，不同的受體結(jié)合系統(tǒng)的反響平衡時間因親和力、溫育溫度、配基及受體濃度的不同而不同。一般室溫〔22℃〕操作比較方便，但有人認(rèn)為使用生理溫度37℃更好。0℃溫育平衡時間雖然長一些，但其結(jié)果之重復(fù)性更好?！菜摹尘彌_液結(jié)合分析使用過多種緩沖液，如磷酸鹽緩沖液，Tvrit-HCI緩沖液等，所選緩沖液應(yīng)不干擾結(jié)合，并在較大范圍內(nèi)可穩(wěn)定pH。一般說，結(jié)合分析的pH應(yīng)處于生理范圍，即pH7-8。鈉、鎂等離子在不同的受體系統(tǒng)中會有不同的影響。因此要根據(jù)具體目的決定選用與否。如果參加的受體蛋白量較少時，宜在緩沖液參加適量蛋白，使反響液內(nèi)蛋白濃度為0.1mg-1mg／ml為好。為了阻止肽類的降解，常在分析時參加各種肽酶抑制劑。但要視具體是哪種肽而定，以確保實際有效。因為有些蛋白酶抑制劑有抑制特異性結(jié)合的作用。五、結(jié)合與游離配基的別離受體-配基結(jié)合分析主要是測定反響平衡時結(jié)合配基的量，求解受體的密度與平衡解離常數(shù)。反響一般在到達(dá)平衡后先經(jīng)別離，再測結(jié)合局部的放射性。少數(shù)實驗測定別離后的游離局部放射性。理論上，一經(jīng)別離，反響的平衡就會被破壞，所以選擇適當(dāng)?shù)膭e離方法和環(huán)境，使受體-配基復(fù)合物在別離過程中的解離減少到最低限度。低溫是降低解離的最有效手段，別離快慢也是重要因素。常用的別離方法有離心法、過濾法、吸附法、透析法、電泳法等。假設(shè)復(fù)合物解離快，那么只能選擇快速的別離方法。同時一定要在別離時間，別離溫度等方面保持各樣品管之間的一致性，以減少誤差。〔－〕抽濾法〔濾膜法〕此法應(yīng)用十分廣泛。1、選用的濾膜材料既能阻擋復(fù)合物又不要過多產(chǎn)生對游離標(biāo)記配基的非特異性吸附。常用的濾膜是玻璃纖維濾膜，比方上海虹光造紙廠生產(chǎn)的49或69型濾膜。2、影響因素〔1〕復(fù)合物的解離：一般說，低溫時解離較慢，故濾膜及緩沖液應(yīng)保存于低溫。用冰冷緩沖液抽洗為好。〔2〕負(fù)壓：假設(shè)為多頭抽濾器，應(yīng)注意各孔壓力的均一性。3、減少標(biāo)記配基對濾膜的吸附標(biāo)記配基吸附于濾膜是抽濾法非特異性結(jié)合的主要來源之一。也是抽濾法的主要缺點，減少標(biāo)記配基吸附于濾膜的方法有：①濾膜預(yù)先用非標(biāo)記配基浸泡；②如果是多肽或蛋白標(biāo)記配基，用1％白蛋白或0.l％PEI〔polyethylenimine〕浸泡；③用一定量的淋洗液或保證一定淋洗次數(shù)，充分淋洗?！捕畴x心法這也是常用方法之一。很多受體分析建立之初都用此法。對于KD大于10-8mol/L的受體，不宜選用濾膜法別離。離心法可以在復(fù)合物很少解離的狀態(tài)下到達(dá)較好的別離效果，但非特異性結(jié)合較高?！踩澄椒ㄉ鲜鰟e離方法均系別離后測定復(fù)合物的放射性。但當(dāng)研究可溶性受體時，如類固醇激素受體，上述方法就不適合，可采用吸附法。固相吸附物有炭素、滑石粉、葡聚糖衣活性炭等。其中以活性炭使用最多。目前，已廣泛