最新：ESMO關于在腫瘤患者中使用循環(huán)腫瘤DNA檢測的建議

摘要

血漿循環(huán)腫瘤DNA(circulatingtumourDNA,ctDNA)的檢

測正飛速發(fā)展，有強有力的證據(jù)支持其在腫瘤患者中的應用。歐洲

腫瘤內(nèi)科學會(EuropeanSocietyforMedicalOncology,ESMO)

召集了一個專家工作組來審查ctDNA檢測的分析和臨床的效度和

效用。對于晚期腫瘤患者，經(jīng)過驗證且足夠敏感的ctDNA檢測在識

別可靶向突變以指導靶向治療方面具有實用價值，也許能夠在臨床

實踐中常規(guī)應用，但也應考慮到檢測方法的局限性。由于ctDNA在

檢測融合和拷貝數(shù)變異方面的局限性，組織檢測仍然是許多腫瘤患

者首選的檢測方法；但當臨床需要更快的結果時，或組織活檢無法

進行或不適合時，可常規(guī)使用ctDNA檢測。

由于ctDNA檢測的假陰性結果，當ctDNA檢測并未獲得提示信

息時，可再次進行組織檢測。在接受治療的早期腫瘤患者中，檢測

分子殘留病變或分子復發(fā)在許多瘤種中預測復發(fā)方面具有很好的臨

床作用。但在常規(guī)臨床實踐中不推薦分子殘留病變/分子復發(fā)檢測，

原因在于目前缺乏ctDNA指導治療的臨床證據(jù)。ctDNA檢測的其

他潛在應用(尚在研發(fā)中，不建議用于常規(guī)實踐)包括通過ctDNA

水平的早期動態(tài)變化來識別對治療無效的患者，在臨床進展前監(jiān)測

對治療耐藥的突變的出現(xiàn)，以及篩查無癥狀的腫瘤患者。對結杲報

告、ctDNA檢測的未來發(fā)展和未來的臨床研究提出了建議。

【關鍵詞】循環(huán)腫瘤DNA,液體活檢，精準醫(yī)學

引言

液體活檢是一個廣泛的概念，包括分析循環(huán)核酸、腫瘤細胞或外泌

體以作為一種工具對腫瘤進行分子分析，以指導臨床決策⑴。液體活

檢技術正在迅速發(fā)展，臨床應用的證據(jù)越來越多。為了在臨床中常規(guī)

應用ctDNA,必須顯示其分析和臨床有效性，證明其臨床作用，質量

要求必須滿足定義明確且有證據(jù)支持的報告標準0。在這篇建議稿中，

我們著重討論了這些關鍵的考慮因素，特別關注作為液體活檢分析物

的血漿中循環(huán)腫瘤DNA(circulatingtumourDNA,ctDNA),并

強調(diào)在常規(guī)臨床實踐中，ctDNA檢測有足夠的證據(jù)可以用于晚期腫瘤

的基因分型以指導分子靶向治療。我們承認其他液體活檢的價值，如

循環(huán)腫瘤細胞(circulatingtumourcells,CTC)和不同種類的循環(huán)

RNA或外泌體的檢測，以及在其他體液(如尿液、唾液或腦脊液)中

ctDNA的檢測和應用一一盡管這些不在本篇建議的范疇之內(nèi)。我們建

議讀者參考文章末尾的術語表，以獲得液體活檢領域常用術語的詳細

定義。

方法

為了就ctDNA進行基因檢測的許多非標準化方面及其在臨床中的

潛在用途達成一些共識，歐洲腫瘤內(nèi)科學會(ESMO)精準醫(yī)學工作

組召集了一組專家來制訂建議。該小組回顧了在解釋陽性或陰性結果

時需要考慮的ctDNA檢測的許多不同技術方面，從而提供使用實驗室

開發(fā)的或商業(yè)化ctDNA檢測進行治療決策時所需要的一些質量標準。

然后，專家小組回顧了ctDNA在腫瘤治療中不同階段的證據(jù)，給出了

一些一般性和針對具體瘤種的建議。我們還就在未來的臨床試臉設計

或腫瘤篩查等場景中應用ctDNA的期望給出了一些見解。

ctDNA分析的技術考量

ctDNA分析的現(xiàn)狀和挑戰(zhàn)

血漿DNA構成DNA片段，其與蛋白質結合，保護這些片段在血

液中不被降解。在健康人體內(nèi)，血漿DNA主要來自造血細胞13-6],血

漿DNA濃度從微乎其微到100ng/mL血漿⑺。血漿DNA的釋放主

要發(fā)生在細胞死亡、凋亡和壞死的過程中，但其他生物過程也可能參

與其中網(wǎng)。在腫瘤患者中，血漿DNA的可變濃度來自腫瘤（即ctDNA

濃度）⑹。理論上，ctDNA是腫瘤中許多不同亞克隆釋放的DNA的

混合體，其能夠獲得特定腫瘤的異質性，因此，因此可以更好地描述

腫瘤的基因圖譜。

正常細胞和腫瘤細胞釋放的DNA片段似乎在大小上略有不同；正

常細胞來源的血漿DNA片段峰值為166bp左右,與核小體和連接子

上纏繞的DNA大小一致，而ctDNA片段在143-145bp左右富集，

可能與沒有連接子的單核小體大小一致[9/瞑ctDNA的大小、基因組

宿主相關情況。與ctDNA分析的成功密切相關的是適當選擇ctDNA

檢測的類型，以解決特定的科學和臨床問題。目前，還沒有任何一種

單一的ctDNA檢測方法適用于所有目的（例如，早期檢測、MRD分

析、基因變異鑒定和評估腫瘤基因異質性、確定耐藥的分子機制及其

衰減時間）。例如，在早期疾病檢測、早期疾病患者的監(jiān)測或MRD

分析的情況下，依靠有限數(shù)量ctDNA的超靈敏檢測是必須的（例如基

于甲基化或患者特異性的測序分析）；而在腫瘤已經(jīng)轉移的情況下，

則可能需要一套不同的檢測方法來識別治療耐藥相關的突變和腫瘤基

因異質性。不同的檢測方法有不同的檢測限值（LoD;能夠可靠地從

噪音背景中區(qū)分出來的最低分析物濃度）和定量限值（LoQ;濃度可

以精確測定的分析物的最低水平），這最終決定了需要多少數(shù)量的血

漿DNA和ctDNA濃度才能獲得一個有意義的結果IM。

分析前變量

ctDNA的分析需要理解分析前和分析參數(shù)，這些參數(shù)可能會影響

在特定臨床背景下結果的準確性和可重復性。分析前的主要變量是影

響ctDNA釋放、樣品量、收集管、儲存條件和處理等患者特異性因素。

患者特有的因素包括生理狀況（如劇烈運動）、炎癥以及急慢性疾病。

ctDNA和ctDNA濃度的水平可能會受到化療、靶向治療、免疫治療

和放射治療等治療的影響，這一變化可以分為兩個階段：急性變化（幾

天到幾周），這是由于治療對腫瘤細胞和正常細胞的直接影響引起的，

而長期變化（幾周到幾個月）則與治療后的腫瘤退縮有關。因此，應

根據(jù)科學問題和臨床情況仔細規(guī)劃血漿收集的時間?？捎糜跈z測的血

漿DNA的數(shù)量與從血漿中提取的體積成正比，因此必須提前規(guī)劃采樣

的體積，以確保有足夠的分析物來解決臨床問題。防止白細胞和其他

細胞體外破裂的細胞保存管可以將血漿提取所需的時間從4?6h(在

EDTAK2管口5］中)到幾天不等。不僅要注意在樣品收集和處理過程中

避免白細胞的裂解，而且要注意在采樣管和標準操作流程(standard

operatingprocedures,SOP)的選擇，這些采樣管和標準操作程序

需要能夠滿足擬開展的ctDNA分析要求。血液儲存期間，周圍的環(huán)境

溫度變化越小越好。血漿DNA提取和定量的方法應該根據(jù)他們與檢測

方法的兼容性來選擇。樣品的處理應始終遵循已驗證的SOP,并優(yōu)先

在實驗室的專用區(qū)域進行，以盡量減少污染的風險。

分析前變量可能會不同程度地影響不同的ctDNA分析,根據(jù)檢測

到的變異類型［例如拷貝數(shù)改變(copynumberalterations,CNA)、

體細胞點突變、表觀遺傳特征和片段組學］或檢測技術［例如下一代測序

(NGS)、微滴式數(shù)字PCR、基于質譜的技術和其他］的不同,不同的

ctDNA檢測方法可能會受到分析前變量的不同影響。個體研究者［mu］

和一些聯(lián)盟”19］的研究試圖提供分析前參數(shù)和SOPS的指南。

分析變量和考量因素

假陽性結果。許多患者，即使有相對嚴重的晚期腫瘤，其血漿中的

ctDNA水平也可能較低。ctDNA檢測中無法檢測到變異可能是由于在

患者的腫瘤中沒有被檢測的變異（真陰性）或ctDNA水平或比例較低

從而導致變異無法檢出（假陰性）。

當出現(xiàn)假陰性檢測結果時，需要考慮多種技術因素，如進行分析的

血漿DNA量，以及在不同類型的變異之間可能存在差異的檢測靈敏度。

例如,檢測單個核苛酸變異［（singlenucleotidevariant,SNV）或

突變］的能力可能不同于結構變異（如基因融合）或CNA（如擴增）。

ctDNA檢測可檢測SNV和小插入或刪除,具有高靈敏度，但可能降

低了檢測拷貝數(shù)變化或基因融合的靈敏度。在基于組織的檢測中，基

于RNA的檢測正越來越多地用于檢測基囚融合和剪接變異，即使

ctDNA有足夠高的純度，ctDNA檢測也可能無法敏感地檢測出這些變

異。雜合性缺失、低水平拷貝數(shù)增加或減少等變異在ctDNA檢測中技

術上更難檢測，目前許多檢測方法的靈敏度都很低。

血漿中ctDNA濃度與腫瘤分期和體積有關120,21一些臨床和病理

因素也與ctDNA水平相關。例如，在非小細胞肺癌（non-small-cell

lungcancer;NSCLC）中,鱗狀細胞癌患者的血漿ctDNA濃度高于

腺癌,在增殖指數(shù)和壞死程度較高的病例中ctDNA也較高【21】。腫瘤

的解剖位置也與血漿中的ctDNA水平相關［NSCLC的胸內(nèi)vs.胸外轉

移；結直腸癌（colorectalcancerzCRC）肝vs腹膜vs肺轉移］,

而腦腫瘤的CtDNA水平最低［2。，22-2叫

因此，對ctDNA檢測結果的解釋必須考慮到血漿樣本中ctDNA含

量不足以檢測不同類型變異的可能性?；谀[瘤比例估算的新方法，

例如使用CNA、DNA甲基化模式或血漿DNA片段模式，也許能夠通

過確保獲得足夠的腫瘤DNA從而增加給出可靠陰性結果的可能性

[26-28]O

附圖S1展示了一些無信息結果和假陰性結果的例子(詳見

https://doi.Org/10.1016/j.annonc.2022.05.520.)。

生物原因的假陽性結果一克隆性造血和胚系變異。在整個生命過程

中，由于多種原因，如環(huán)境和化學物質的暴露，或細胞分裂過程中的

復制錯誤，體細胞變異在正常組織中不斷積累【2叫如果這些體細胞變

異帶來了選擇性生長優(yōu)勢，它可能會導致克隆性擴增，導致體細胞嵌

合，并增加后續(xù)驅動突變的可能性，最終有可能發(fā)展成腫瘤。血液中

的血漿DNA主要來自于凋亡的造血細胞[3叫因此，這些細胞中的克

隆擴增可能會導致ctDNA結果假陽性的風險，而且這種風險容易隨著

時間的推移而改變。這種意義未明的克隆造血(clonal

haematopoiesisofindeterminatepotential,CHIP)的頻率隨著年

齡、先前的全身腫瘤治療和吸煙的增加而增加【31-34]。CHIP的存在和

某些相關發(fā)現(xiàn)(變異數(shù)、等位基因豐度和相關基因)與隨后可能發(fā)生

的血液系統(tǒng)惡性腫瘤和心血管疾病的較高風險相關，并可能與晚期腫

瘤的不良結局相關田，3叫

CHIP中的突變基因與實體腫瘤驅動基因部分重疊。已經(jīng)證明，在

大量晚期前列腺癌、肺癌和乳腺癌患者的基因分析中，可以在血漿

DNA中檢測到CHIP的變異，并可能導致CHIP相關基因(如TP53、

ATM）的假陽性⑹36-3叫這些假陽性可以通過白細胞的DNA測序很

大程度上排除，或通過對配對的腫瘤組織樣本的測序而盡量減少⑹36,37］

——盡管目前絕大多數(shù)在歐洲和美國獲批的用于臨床的商業(yè)檢測方法

13

只分析血漿DNAO最近的論文正在開發(fā)CHIP中變異基因的列表叫

即使不分析白細胞DNA,許多基因改變也不太可能是CHIP造成的假

陽性結果。例如，分別發(fā)生在腎癌和前列腺癌的VHL和SPOP熱點突

變，肺癌患者的EGFR突變，乳腺癌患者的PIK3cA和ESR1配體結合

域突變。其他的，婦KRAS突變可以發(fā)生在CHIP中，但概率較低，

因此KRAS突變在CRC和肺癌患者中更有可能是真陽性而不是假陽

性。

相比之下，僅使用血漿DNA的分析對許多抑癌基因（如TP53）

或與DNA修復相關的基因（ATM和CHEK2）具有挑戰(zhàn)性,而且對

CHIP中常見突變的基因（如DNMT3A和TET2）基本上無法解釋。

這是一個不容忽視的問題，正如最近一項69例轉移性前列腺癌患者的

小隊列研究所證明的那樣，其中幾乎一半檢測到的DNA修復缺陷變異

來自CHIP4。］。此外另一項臨床上獲批的血漿DNA檢測應用于3334

例轉移性前列腺癌患者時，這些患者中ATM和CHEK2變異在ctDNA

中出現(xiàn)的頻率是腫瘤組織中預期頻率的兩倍［4］因此，對于臨床

ctDNA檢測分析,若涉及通常包括CHIP變異的基因或臨床上可靶向

的抑癌基因（如DNA修復基因），推薦同步分析血漿DNA和白細胞

DNAO如果這是不可能的，我們鼓勵在出報告時保守一些：當估計某

些基因變異與明確的疾病特異性基因變異具有相同范圍的等位基因突

變豐度時，這些基因變異才應該被納入報告(例如：在轉移性前列腺

癌中檢測出來的ATM截斷突變與SPOP突變具有相似的突變豐度時),

尤其是當ctDNA濃度較低(0.1%~5%)時一一此時CHIP變異會增

加，且檢測疾病特異性的變異的敏感性會降低[6,3刀。單純使用突變豐度

來區(qū)分CHIP和ctDNA是不可能的,因為真陽性的腫瘤變異的豐度常

常較低。這一點被以下研究再次印證：在一項對21807例患者進行的

研究中，單純使用臨床批準的血漿DNA分析晚期腫瘤的新發(fā)變異，結

果顯示真陽性變異等位基因頻率的中位數(shù)為0.41%[42],此時，較低的

突變豐度無法被解釋為〃推測該變異不太可能是體系突變以及是臨床

相關的

在進行ctDNA檢測的患者中，還應該考慮到生物學意義上是真陽

性的一些變異(例如，ctDNA中JAK2V617F突變的晚期腫瘤患者可

能同時患有未診斷的骨髓增生性疾病)。事實上，在治療某種腫瘤的

患者中，ctDNA分析有可能識別出隱匿的第二惡性腫瘤的特異性基因

改變。

報告規(guī)范

報告推薦意見本質上取決于ctDNA檢測類型和檢測的預期用途。

除了一般的臨床分子實驗室報告推薦意見外[43,44],與ctDNA檢測特

別相關的推薦報告要素和方法包括在表1和補充表S1中(詳見https:

///10.1016/j.annonc.2022.05.520)。建議報告分析前參數(shù)，

如樣品采集日期和采集時的治療。報告語言應該傳達出與腫瘤組織檢

測不一致的可能性，特別是在血漿DNA中沒有檢測到變異的情況下，

使用諸如〃無信息或未檢測到〃的語言，而不是〃陰性能夠檢測血漿

DNA中ctDNA濃度/純度的檢測方法應該報告ctDNA濃度，并幫助

臨床醫(yī)生評估沒有檢測到體細胞變異是由于腫瘤中不存在變異還是由

于標本中ctDNA量不足。

同樣重要的是，提醒臨床醫(yī)生ctDNA檢測到的變異可能是胚系突

變或是由非腫瘤來源造成的（如CHIP）。對潛在胚系突變的分析、確

認檢測、患者咨詢和報告應遵循ESMO對于單純腫瘤測序的胚系分析

的建議【45］（表1）。同樣，在通常涉及CHIP基因中的ctDNA變異的

報告中，應提醒和警告臨床醫(yī)生這些變異的潛在非腫瘤來源⑹31如果

可以進行白細胞DNA的后續(xù)檢測以確定該變異是否與CHIP有關，則

應在報告中注明。

表1.推薦的ctDNA檢測報告要素和方法

ctDNA分析建議的技術考量因素

ctDNA分析的采血時間應根據(jù)臨床問題仔細選擇，因為不同的因素會

影響ctDNA的釋放（例如正在接受的治療、共存的炎癥反應、手術）。

為了在術后檢測MRD,最好至少在術后1周進行檢查，對于愈合時間

較長的大手術，在術后2周或更長時間進行檢查可能更合適。為了進

行晚期腫瘤的基因分型，應該盡量避免在治療有效期間或腫瘤未進展

時采血，以盡量減少假陰性結果。

在選擇血液樣本收集管時應謹慎,這將取決于采樣至處理時間和所用

的分析方法。

如果血漿是在DNA提取前儲存的，則應在-80。（：下長期儲存,溫度變

化應盡量小，并盡可能減少反復凍融過程。

假陰性（當腫瘤中實際存在的變異沒有被識別出來）是ctDNA檢測

的一個重要問題，可能是分析的血漿DNA水平低、檢測靈敏度不足或

腫瘤〃不脫落〃的結果。

在ctDNA檢測中,當涉及通常含有CHIP變異的基因時，CHIP是導

致假陽性的常見原因。對于臨床可靶向的抑癌基因的檢測，如DNA修

復基因，建議同步分析血漿DNA和白細胞DNAO對于這種檢測，建

議從接受血漿ctDNA檢測的患者中常規(guī)收集白膜層（富集有白細胞）,

以便在需要時有可用標本來排除CHIP。腫瘤易感性基因中的致病性胚

系變異可以在ctDNA中檢測到（如BRCA1、BRCA2、PALB2）,檢

測此類變異需要重新通過經(jīng)過驗證的胚系檢測來確認究竟為體系變異

還是胚系變異。

未來，臨床基因檢測分析應該評估腫瘤純度，以便能夠更加有信心地

預測〃未檢測到的結果〃和〃真陰性的結果〃。這可以通過信息分析來實現(xiàn)

（例如檢測其他腫瘤，而非CHIP,從而獲得足夠高突變豐度的突變）,

或通過正交純度分析實現(xiàn)。

潛在的臨床指征一臨床應用的證據(jù)

晚期腫瘤基因分型

精準醫(yī)學依賴于腫瘤基因組變異的識別，來改善預后和靶向治療具

有腫瘤驅動作用的生物分子特征。傳統(tǒng)上，這是通過腫瘤組織活檢來

完成的；但這有一些局限性。除了患者的不適、風險和并發(fā)癥之外，

腫瘤活檢可能是不可行的。在需要緊急治療的患者中，延遲獲得組織

活檢及其分子結果可能限制治療選擇，而液體活檢可以提供更快的結

果［4叫以組織活檢為基礎的基因分型可能受到腫瘤細胞含量少及固定

問題的限制，如骨活檢和NSCLC活檢；在一些情況下，ctDNA檢測

可以通過相同的覆蓋率和較少的檢測失敗率獲得更多的信息量［46,47］。

此外，ctDNA檢測適用于無法獲得組織，或預計很難取樣、或很可能

延遲取樣的情況。腫瘤活檢所描繪的分子特征僅限于單個腫瘤部位（空

間），并在時間上是固定的。而惡性腫瘤的時間及空間的異質性已經(jīng)

廣為人知14叫ctDNA的優(yōu)點是更容易連續(xù)獲得，并提供來自患者多個

轉移部位的〃基因組池〃的信息。當組織檢測只能在原發(fā)腫瘤中進行時,

液體活檢可以為異時轉移的患者提供更精確的基因分型。

ctDNA的釋放被認為與腫瘤的生長成正比，而腫瘤的生長與紐胞

死亡和更新有關，生長最快的腫瘤克隆釋放的ctDNA最多,這在理論

上是最有臨床意義的［49］。然而，也有例外，仍有一些證據(jù)令人困惑［5。］.

需要更多的研究來了解ctDNA釋放入血的分子基礎。重復液體活檢可

以檢測藥物的獲得性耐藥變異（例如制對激酶抑制劑的選擇性壓刀產(chǎn)

生的變異），以便根據(jù)獲得性耐藥基因特征及其與親代驅動變異的關

系，來更好地選擇下一個治療方案。

與組織檢測相比，ctDNA檢測也有一些局限性,主要是假陰性和

陽性的比率較高（如前幾節(jié)所述）；同樣，血液樣本中存在的腫瘤濃

度較低，會限制對突變豐度（variantallelefraction,VAF）的可靠

評估，也會限制拷貝數(shù)改變的分析。

晚期腫瘤中ctDNA的證據(jù)。用于液體基因分型的技術可以大致分

為基于敏感的PCR技術［無論是實時PCR（RT-PCR）或數(shù)字PCR域

NGS平臺。數(shù)字PCR成本較低，但只能識別有限的基因變異。相比之

下，錯誤校正的NGS方法花費較多，但能夠對廣泛的變異進行高通量

檢測。多項前瞻性和回顧性研究已報道ctDNA液體活檢與組織PCR

和NGS檢測在晚期惡性腫瘤中具有良好的特異性和陽性預測價值

（95%~99%）【51-54］。最近關于液體活檢的大型前瞻性研究已經(jīng)證實

了液體活檢在乳腺癌【47］、胃腸道（GI）【46廂肺癌⑶,53］的SNVs檢測方

面具有較高的準確性，并且當在入組研究的患者人群中使用時也有較

高的準確性。盡管大多數(shù)靶向治療是在組織檢測的基礎上批準的，

ctDNA檢測的高陽性預測值為ctDNA檢測的臨床應用提供了潛在證

據(jù)的信心。值得注意的是，液體活檢平臺的"臨床〃準確性參數(shù)實際上是

與腫瘤組織的分析結果進行比較而得出的，不應與分析的準確度參數(shù)

相混淆。液體活檢的臨床準確性參數(shù)的解釋受到腫瘤異質性/進化的挑

戰(zhàn)；在這些比較中，基于組織的單點活檢測序因為采樣有限，所以可

能無法總是代表金標準。

ctDNA分析臨床有效性的證據(jù)水平是這樣的：只要了解并考慮到

其局限性（見前面ctDNA分析的技術考慮部分），經(jīng)過驗證的、足夠

敏感的ctDNA檢測就可以用于常規(guī)實踐來進行晚期腫瘤的基因分型。

此建議適用于單核甘酸和小插入/缺失變異的檢測。這一建議得到了來

自肺癌⑶】、膽管癌［55,56］、乳腺癌【47】、GI腫瘤157】和其他腫瘤【53-60］

的前瞻性研究的支持，這些研究僅使用液體活檢來指導治療也取得了

相似的療效?，F(xiàn)在的證據(jù)基礎已經(jīng)足以支持：具有臨床有效性證據(jù)的

檢測方法在指導I級可靶向變異的治療方面具有臨床實用價值——這

是已經(jīng)得到一些專業(yè)協(xié)會的認可［6］表2列出了針對特定腫瘤的液體

活檢建議。

VAF可以提供信息幫助明確變異是否具有亞克隆性質；理論上亞克

隆變異不太可能從靶向該變異的治療中受益。然而，目前VAF不應用

于臨床實踐中的決策，因為（i）尚不清楚液體活檢是否能準確評估亞

克隆性，（ii）沒有足夠的證據(jù)表明真正的亞克隆變異可以預測療效不

佳的情況。

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晚期腫瘤液體活檢基因分型的局限。如前所述，液體活檢的一個潛

在的主要臨床局限性是其敏感性不完善，有假陰性結果的風險。如果

是為了尋找可靶向變異而進行檢測但并沒有檢測到時，應該被認為是

〃無信息〃的結果；此時，建議用重新使用組織檢測（折返組織檢測）進

行確認。

重新進行組織檢測可以幫助從"無信息檢測〃（譯者注：不使用配對

組織的ctDNA檢測）的結果中區(qū)分〃真陰性〃結果，但實際上，這一措

施能夠大幅度減少假陰性結果的證據(jù)是非常有限的；因此，重新組織

檢測在一些情況下并不是必須的。這些對于臨床常規(guī)應用均具有提醒

作用。

在檢測中進行分子確認已明確有足量的ctDNA（ctDNA濃度）來進行

變異的檢測（如果腫瘤中存在變異）。例如，檢測出某一體系突變具

有較高的VAF——當確認該突變不是來自于CHIP或者胚系突變時。

當具有中度或較高水平的VAF突變被鑒定出來時，有理由假設其他的

SNVs也同樣被鑒定出來了，而那些沒有被鑒定出的突變就是真陰性結

果。上述這些判讀只應該由專家進行，因為他們對于所使用檢測的特

點比較了解，比如檢測的局限性以及對于混雜因素的考量（例如拷貝

數(shù)變化對于VAF的影響）。但是當使用ctDNA檢測時,將樣本的融

合變異或拷貝數(shù)變異解釋為〃真陰性〃仍很困難。使用正交方法確認存在

足量的ctDNA（已在技術考量部分討論過）。但是，檢測腫瘤含量的

技術正在開發(fā),這些方法仍處于實驗階段，不能用于常規(guī)臨床實踐。

液體活檢在檢測特定的變異方面可能有局限性。只有在ctDNA含

量較高時，ctDNA樣本的體系的拷貝數(shù)變化才能夠被準確地識別【62,63］；

因此，只有當無法進行組織評估時，才應使用ctDNA替代組織進行拷

貝數(shù)的評估。微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）狀態(tài)和腫瘤突變負荷（TMB）是

免疫治療的潛在療效預測標志物，已經(jīng)通過定制的方法在ctDNA中進

行了研究。使用血漿分析MSI狀態(tài)已被證實具有較好的臨床實用性，

因此可用來指導治療3）。一些ctDNA的panel測序可以評估血液TMB

（bTMB）,以作為組織TMB的替代。此時，有證據(jù)表明，不應僅根

據(jù)bTMB來選擇患者進行免疫治療。bTMB與ctDNA的含量高度相

關,因此有效的檢測需要至少需要一定含量的ctDAN（當組織中腫瘤

細胞含量較低時，這一點也適用于組織的檢測）。止匕外，預測免疫治

療效果的臨床相關界值可能根據(jù)所使用的檢測方法類型和腫瘤類型而

有所不同。盡管如此，使用ctDNA檢測評估腫瘤負荷是一個活躍的研

究領域，希望能夠有助于選擇更適合的患者進行免疫治療，特別是在

難以進行影像檢查或影像結果存在疑問時。

特定腫瘤的推薦。I和II級變異的腫瘤特異性推薦的總結見表2。

肺癌。目前的ESMO轉移性NSCLC臨床實踐指南建議對所有非鱗

癌NSCLC和具有特殊臨床特征的NSCLC鱗癌亞型患者（例如從不吸

煙）進行基因分型。ctDNA檢測可用于未經(jīng)治療的患者，且更推薦在

以下情況中使用：當預期獲得腫瘤組織進行基因分型會有明顯延遲、

有創(chuàng)操作可能有風險或禁忌、或骨是唯一可進行活檢的部位時【65］。在

未經(jīng)治療的患者中，可將ctDNA作為組織NGS評估標志物的補充或

替代。主要表現(xiàn)為小體積的胸內(nèi)腫瘤，或者以顱內(nèi)病灶為主的疾病與

較高的假陰性結果相關。ctDNA檢測對于基因融合的敏感性往往較低。

此外，必須注意的是，組織RNA測序可以識別更廣泛的剪接位點變體，

如MET外顯子14'跳躍性'突變和融合變異（如ALK、RET、ROS1或

NTRK1/2/3【661。如果可以，與NDNA相比,用同樣的方法進行組織

檢測仍然是金標準，盡管任何組織檢測都可能受限于較低的腫瘤細胞

數(shù)量或質量。

對于經(jīng)治的患者，使奧西替尼治療成為可能的EGFRT790M耐藥

突變［67］首先建立了T790M突變的臨床檢測模式：當血液中未檢測到

T790M突變時，再進行組織取樣及檢測一一這可以避免有創(chuàng)的取樣過

程。組織學改變，如神經(jīng)內(nèi)分泌或鱗癌轉化，目前不能通過這種方法

識別，如果臨床懷疑出現(xiàn)，則不應依賴ctDNA。從上述針對T790M

的檢測策略中在依賴癌基因的NSCLC患者中（尤其是對EGFR突變、

ALK或R0S1陽性的腫瘤），如今已經(jīng)將ctDNA的NGS檢測很好地

確定為一種尋找繼發(fā)耐藥機制的方法。因此，對于依賴癌基因的

NSCLC,液體活檢可作為一種識別靶向治療耐藥機制的初始方法。雖

然MET擴增被認為是許多激酶抑制劑的耐藥機制（包括奧西替尼和氯

拉替尼），但在ctDNA中進行可靠的識別仍需要進一步研究。

乳腺癌?？赡苄枰獧z測MSI;在雌激素受體（estrogenreceptor,

ER）陽性、人表皮生長因子受體2（humanepidermalgrowthfactor

receptor,HER2）陰性的腫瘤，也可能需要檢測PIK3cA和ESR1突

變。由于在ctDNA中檢測HER2擴增并非首選（因方法而有所不同），

所以只有當晚期腫瘤的活檢標本無法進行HER2檢測時，才需要用

ctDNA進行HER2擴增的檢測。ESR1突變是在腫瘤中主要是亞克隆，

所以組織檢測經(jīng)常出現(xiàn)假陰性的結果，而液體活檢檢測反而更有可能

可靠地檢測出ESR1突變。BRCA1/2變異的檢測可以通過ctDNA檢

測進行，但由于目前在乳腺癌中聚腺苜二磷酸核糖聚合酶（poly

ADP-ribosepolymerasezPARP）抑制劑的適應證僅限于胚系變異,

所以需要重新進行胚系檢測來確定該變異是否為胚系的。另外，考慮

到BRCA1/2胚系變異是乳腺癌的治療靶點，所以即使液體活檢結果呈

陰性，也建議進行胚系檢測。在最近的指南中給出了建議檢測的其他

變異的詳細信息16叫

上消化道腫瘤?？紤]到其發(fā)病率和已批準的治療方法的可及性，當

組織檢測不可行或需要緊急決策進行快速治療干預時，建議對胃癌中

的ERBB2、膽管癌中的IDH1和FGFR2進行液體活檢。

CRCO當組織檢測不可行，或需要快速決定治療方案時,建議對未

經(jīng)化療的轉移性CRC進行至少包括KRAS/NRAS/BRAFV600E/MSI

的液體檢測；當考慮使用抗EGFR單抗進行再挑戰(zhàn)時，建議進行

KRAS/NRAS和EGFR細胞外結構域（EGFR-ECD,S492、G465、S464

和V441突變）的檢測【69?7引。盡管KRAS突變可能是CHIP的結果,

但KRAS突變的真實檢出率遠遠高于CHIP的貢獻，因此，液體活檢

中檢出KRAS突變足以支持我們不用抗EGFR單抗。

前列腺癌。DNA損傷修復基因的異常在晚期前列腺癌患者中非常

重要,因為約20%的去勢抵抗性前列腺癌患者已被證明存在DNA損

傷修復基因的胚系和/或體系變異，如BRCA1、BRCA2或ATM^]o

CHIP可能導致假陽性結果,此外，ctDNA檢測不能可靠地檢出純合

缺失（BRCA1/2和其他抑癌基因的常見特征）。組織檢測仍被推薦用

于指導PARP抑制劑治療的決策。

腫瘤部位的一般性推薦。在只有中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉移的腫瘤和原發(fā)腦

腫瘤中，ctDNA檢測的敏感性降低，所以液體活檢通常不適合用于這

類患者的基因分型，但是，當ctDNA是進行基因檢測的唯一標本來源

時，可以嘗試分析。數(shù)據(jù)表明，可以從腦脊液分析中獲得基因信息（本

建議中不涉及【25]）。在寡轉移和僅有淋巴結受累的腫瘤中，疾病負荷

意味著ctDNA可能較少釋放入血從而造成假陰性結果。此時，應著重

考慮組織檢測,或當腫瘤負荷增加時再次進行ctDNA檢測。

晚期腫瘤基因分型建議

液體活檢檢測的分析和臨床特異性非常高，因此陽性預測值也高。所

以，當其結果會影響標準治療選擇時，可以將ctDNA檢測用于常規(guī)臨

床實踐。然后,必須考慮到ctDNA檢測的局限性。

考慮到液體活檢的實際優(yōu)勢——快速獲得結果，無論能否可以通過介

入影像學手段取活檢，液體活檢均可以對絕大多數(shù)人進行檢測一一液

體活檢優(yōu)先的策略被推薦為作為組織基因分型的替代選擇，特別是對

于那些快速得到結其對于臨床治療非常重要的侵襲性較強的腫瘤，比

如晚期NSCLC。當無法或不適合進行組織活檢時，這同樣適用。

進行基因分型的液體活檢標本應該在腫瘤進展時（無論是未經(jīng)治療時，

還是在前線治療后）收集。當治療有效時收集的標本會導致敏感性降

低。

對于晚期腫瘤的基因分型，在臨床實踐過程中，RT-PCR,數(shù)字PCR

和NGS檢測的選擇應根據(jù)可及性、報銷狀況和特定腫瘤中I級可靶向

基因變異的數(shù)量來確定。

應謹慎解釋高外顯率的腫瘤易感基因（如BRCA1、BRCA2、PALB2）

的致病性變異；應進行有效的胚系檢測，以確認是胚系還是體系變異。

考慮到ctDNA檢測的中度敏感性和陰性預測值，如果沒有檢測到可靶

向變異，則應該重新進行組織檢測。對于有經(jīng)驗的醫(yī)生而言，如果確

認樣本中ctDNA的純度足夠,則并不一定需要重復進行組織檢測，

ctDNA檢測對融合和拷貝數(shù)變異的靈敏度較低，當有條件時，應在組

織中檢測這些變異。

所有腫瘤醫(yī)生都應該有機會得到分子腫瘤委員會的幫助，從而保證盡

早接受培訓從而保證正確的結果解讀，以及能夠對于復雜病例進行討

論來保證決策的正確性。

晚期腫瘤ctDNA用于動態(tài)監(jiān)測

ctDNA動態(tài)變化用于早期評估治療效果。由于ctDNA的半衰期較

短〔⑵，且可以無創(chuàng)地重復取樣,因此血液ctDNA可以在治療過程中

實時監(jiān)測疾病。在治療中監(jiān)測腫瘤患者的研究表明，ctDNA動態(tài)變化

與治療反應相關，可能比臨床/影像學更早地預測療效［12,75-77］。在多個

不同的腫瘤類型和治療方式(化療、靶向治療和免疫治療)中，對治

療有反應的患者在開始治療的幾周內(nèi)ctDNA水平就出現(xiàn)下降。最初的

早期下降可能反映出細胞周期阻滯導致的ctDNA釋放減少，后期反映

了腫瘤體積的縮小。此外，在開始細胞毒治療后的幾天內(nèi)，ctDNA水

平可能會出現(xiàn)短暫的上升，可能反映出短暫的釋放增加［78］。

在轉移性乳腺癌中,ctDNA比標準血清標志物如腫瘤抗原15-3

(CA15-3)顯示出更高的準確性Pl,ctDNA動態(tài)變化與化療［78］,內(nèi)

分泌治療【79】和聯(lián)合靶向治療出。】的無進展生存期(PFS)相關。在卵巢

癌中，治療前ctDNA水平和化療后ctDNA下降的程度與疾病進展時

間顯著相關，并且比CA125水平更有價值【8,在晚期NSCLC中,

ctDNA動態(tài)變化可以區(qū)分出影像學評估穩(wěn)定的患者中對免疫治療是否

有效177,82］,以及EGFR突變陽性的NSCLC早期ctDNA動態(tài)變化與預

后相關【83）。在轉移性CRC中，一項前瞻性試驗表明，一線化療第2

周期后ctDNA下降10倍與PFS相關；另一項研究表明,一到兩個周

期化療后ctDNA濃度變化可以預測療效和PFS184,85］。在GI惡性腫瘤

中，化療4周后ctDNA降低比腫瘤標志物癌胚抗原（CEA）預測部分

緩解和臨床獲益更有效,敏感度分別為60%和24%【8叫

越來越多的證據(jù)表明，接受免疫檢查點抑制劑治療轉移性腫瘤患者，

跟蹤連續(xù)血漿樣本中ctDNA水平的變化可以評估預后和治療獲益

【87-89］。在一項評估了近1000例接受免疫檢查點抑制劑治療的局部晚

期/轉移性腫瘤患者的免疫檢查點抑制的泛腫瘤分析中，治療中ctDNA

的動態(tài)變化似乎可以預測各種腫瘤類型的免疫治療的長期獲益【8叫分

析連續(xù)ctDNA可以早期識別具有分子應答的患者，這與RECIST應答

和初始影響學評估穩(wěn)定的患者的生存改善有關。監(jiān)測ctDNA水平的臨

床效用可以區(qū)分真正的臨床影像學進展和抗程序性細胞死亡蛋白1抗

體和抗程序性死亡配體1抗體的假性進展，在5%~10%的接受免疫治

療的患者中觀察到假性進展［9。,91】。

耐藥突變的縱向監(jiān)測。序貫ctDNA分析也可用于評估臨床進展前

出現(xiàn)的耐藥基因組機制。針對不同腫瘤類型接受靶向治療的幾項研究

表明，縱向ctDNA分析能夠在臨床進展前檢測到耐藥突變的早期出現(xiàn)。

例如，在接受抗EGFR單克隆抗體治療的CRC患者中，在影像學進展

前10個月的ctDNA中檢測到RAS和EGFR-ECD突變，并在抗EGFR

藥物停藥后消失【71,92-94］。在這種情況下，數(shù)項臨床試驗采用包含

ctDNA在內(nèi)的指標指導抗EGFR再挑戰(zhàn)決策。CHRONOS試驗顯示,

在再挑戰(zhàn)前ctDNA中沒有檢測到RAS、EGFR-ECD和BRAF突變的

患者，可從抗EGFR再挑戰(zhàn)中臨床獲益。其他研究也顯示了類似的結

果［73,95,961。對于接受芳香化酶抑制劑(aromataseinhibitor,AI)和

細胞周期蛋白依賴性激酶4/6(cyclin-dependentkinase4/6,

CDK4/6)抑制劑治療的晚期乳腺癌患者，監(jiān)測ESR1突變的出現(xiàn)具有

潛在的臨床應用價值。在PADA-1試驗中，當檢測到ESR1突變時,

患者隨機至氟維司群且繼續(xù)使用CDK4/6抑制劑的患者與繼續(xù)使用AI

和CDK4/6抑制劑相比,PFS有所改善a。在檢測到ESR1突變后,

早期使用氟維司群觀察到的PFS獲益可能無法被疾病進展后使用氟維

司群所彌補。這些數(shù)據(jù)表明，ctDNA更早而不是更晚(影像學進展時)

檢測到耐藥相關的突變可能更有決策意義，這可能是耐藥細胞負荷較

低的緣故。其他的確證試驗正在招募中。

用于監(jiān)測晚期腫瘤患者的最佳檢測方法尚未建立，目前同時在研究

腫瘤已知和腫瘤未知兩種策略。在前者中，腫瘤組織活檢的測序確定

了在液體活檢中用于序列分子特征分析的關鍵突變，而在后者中，則

是在沒有預先了解腫瘤突變譜的情況下進行ctDNA基因型的檢測。腫

瘤已知的策略在跟蹤分子應答方面可能是最準確的，但需要額外的基

線腫瘤組織測序的成本/時間，且如果限制太多，可能無法識別新出現(xiàn)

的耐藥突變。如果采用一個更廣的基因panel,腫瘤未知的策略可以

識別新出現(xiàn)的腫瘤分子的異質性，但檢測CHIP突變可能會使ctDNA

動態(tài)評估變復雜。

未來的研究方向。ctDNA動態(tài)評估的最佳時機和最準確的療效預

測閾值有待進一步研究。為了在臨床進展前監(jiān)測耐藥突變的出現(xiàn)，需

要進一步研究監(jiān)測的頻率。

需要進行隨機干預研究來評估在ctDNA動態(tài)評估的基礎上改變治

療方式是否可以改善預后，或通過避免不必要的副反應來提高生活質

量，或盡量減少經(jīng)濟成本19叫這可能包括將ctDNA下降不明顯的患

者隨機納入改變治療，或增加治療的研究。

晚期腫瘤監(jiān)測建議

目前在治療期間定期監(jiān)測ctDNA的證據(jù)不充分。盡管早期ctDNA動

態(tài)變化與預后密切相關，并且可能在臨床進展前數(shù)月就能發(fā)現(xiàn)耐藥突

變，但沒有足夠的證據(jù)表明根據(jù)這些結果進行治療可以改善預后。我

們注意到一項評估在AI和CDK4/6抑制劑治療乳腺癌期間監(jiān)測ESR1

突變的臨床效用的研究,以及在CRC中ctDNA指導的抗EGFR再挑

戰(zhàn)研究。需要隨機干預性臨床試驗來評估ctDNA監(jiān)測的實用性。

早期腫瘤MRD和分子復發(fā)監(jiān)測

大量證據(jù)表明，潛在治愈性治療后檢測到ctDNA與復發(fā)高風險相

關，常用到兩個術語。MRD是一個實體瘤的術語，用于描述原發(fā)腫瘤

經(jīng)手術和/或同步放化療后不久檢測到殘留腫瘤細胞的分子證據(jù)【99】。

MRD僅能通過PCR或測序或CTC分析等分子技術檢測到，但不能通

過常規(guī)檢測如目前基于血液的蛋白腫瘤標志物或影像學檢測到。分子

復發(fā)（MR）是指在輔助治療或隨訪過程中，在較后的時間點檢測到隱

匿性疾病的分子改變。

早期腫瘤監(jiān)測MRD和MR的臨床證據(jù)。越來越多的證據(jù)支持

ctDNA分析用于MRD檢測和MR監(jiān)測的臨床意義。主要來自病例/

對照和縱向隊列研究的數(shù)據(jù)表明，在早期乳腺癌口。。-1。2）、CRC口。3-1咐、

肺癌口⑺、膀胱癌口。8】和其他很多研究口㈣中,治療結束后立即或隨訪

期間檢測到ctDNA預示著復發(fā)風險較高。MRD/MR的檢測需要專門

針對這種情況進行優(yōu)化——用于晚期腫瘤基因型的檢測不能提供足夠

的靈敏度，并且存在CHIP突變假陽性的風險。

在不同的ctDNA檢測方法和腫瘤類型中，在沒有進一步治療的情

況下檢測ctDNA預測復發(fā)的臨床特異性很高，如果陽性結果未給予進

一步治療,通常290%口。6-1。8/1叫然而在大多數(shù)研究中,治療結束后

不久檢測的MRD的臨床敏感性并不是最優(yōu)的通常為50%[1。3,1。4,111

此外，即使采用腫瘤已知（即通過一種高靈敏度的檢測方法在ctDNA

中檢測事先在組織中已發(fā)現(xiàn)的特定的基因改變）策略定制ctDNA檢測，

通常顯示從檢測到ctDNA至臨床復發(fā)的時間＜6個月。所以現(xiàn)有的

ctDNAMRD檢測方法主要可以檢測出那些注定要早期復發(fā)的（即在

初次治療后的第一年內(nèi)發(fā)生復發(fā)）患者，可能無法檢測出晚期復發(fā)的

疾病。為了最大限度地延長檢測時間和減少假陽性，使用最敏感的

ctDNA檢測技術是至關重要的，開發(fā)能夠檢測出超低ctDNA濃度(<

0.01%)的檢測方法仍然是一個重要的研究領域【“a。

與臨床效度不同，ctDNAMRD和MR監(jiān)測的臨床效用仍有待進一

步的證實，需要前瞻性隨機研究。ctDNAMRD檢測最顯著的潛在作

用是其可以允許個體化的輔助或鞏固系統(tǒng)治療。具體來說，MRD陽性

患者可能從額外的治療中獲益最大。事實上，來自早期肺癌和膀胱癌

的數(shù)據(jù)表明，輔助/鞏固免疫治療的獲益可能僅限于ctDNA陽性的患

者1111,11刃。臨床效月的確切證據(jù)需要隨機研究，因為目前尚不清楚基

于MRD陽性結果的治療是否會影響此類患者的自然病程，并且目前

正在進行基于ctDNAMRD的個體化輔助治療的前瞻性研究。另外,

在未檢測到MRD的患者中，輔助治療理論上可能是降低治療強度。

然而，目前可用的ctDNAMRD檢測方法靈敏度較低，假陰性率較高,

提示在使用該方法指導降低治療強度時需謹慎。治療后縱向監(jiān)測MR,

即在隨訪期間進行連續(xù)的ctDNA檢測，可以通過在更晚的時間點但仍

在臨床復發(fā)前檢測到MRD，從一定程度上解決治療結束后不久檢測的

假陰性問題。無論是根治治療后立刻或者隨訪期間行ctDNA檢測,基

于MRD的降低治療強度策略都應當在非劣效設計的隨機試驗中與目

前的標準治療進行仔細比較，以明確其臨床效用。

對未來臨床試驗的思考

證據(jù)等級。根據(jù)Hayes建議門皿的以下兩種方法之一進行的輔助治

療研究，證明臨床效用(與不使用ctDNA檢測相比，ctDNA檢測是

否可以改善臨床預后和為臨床決策加碼）的證據(jù)級別應該為最高級（1

級）：

前瞻性隨機臨床試驗，主要目的是評估ctDNA檢測,且檢測結果用于

指導輔助治療或隨訪策略。

前瞻性-回顧性研究，使用先前在前瞻性試臉中收集的血液樣本，且該

試驗主要不是為了評估ctDNA指導的臨床決策（常作為探索性終點）。

需要兩個或多個獨立的研究得出類似的結果才能確立臨床應用價值。

研究設計與終點。值得注意的是,ctDNA的臨床應用是非常依賴

于情境的，取決于疾病類型、分期、可有效消除MRD的治療方法和

可能的應用（如指導術后輔助治療或標準輔助治療之后的治療、隨訪

等）。目前正在進行多個基于ctDNA的隨機臨床試驗,以確定ctDNA

在早期實體瘤中的臨床應用價值。從廣義上講，ctDNA指導的試驗可

以在以下臨床情況中進行（表3）:

根治性治療后數(shù)周：評估ctDNA檢測是否可用于ctDNA陰性患者的

降低輔助治療強度和/或ctDNA陽性患者的升級/強化治療。可采用非

劣效（對于降低強度策略）和優(yōu)效（對于強化策略）設計。完成標準

輔助治療后不久：主要目的是研究在檢測到ctDNA但影像學上沒有疾

病證據(jù)的患者中，增加〃二線〃或〃后輔助〃治療是否可以提高治愈率。

隨訪期間：確定與標準隨訪方案相比，ctDNA指導的隨訪是否會更早

發(fā)現(xiàn)復發(fā)，更多的患者接受治愈性的轉移灶切除或改善生存。

除術后分析外，ctDNA用于診斷分析的價值尚不明確。假設在根

治性治療前排除ctDNA陰性的患者（低脫落腫瘤），可能會降低治療

后假陰性結果的發(fā)生率。ctDNA的檢測周期也可能影響研究設計,特

別是在術后即刻的時間點，腫瘤醫(yī)生往往期望在術后4~6周開