HBV不同組分下調(diào)肝癌細(xì)胞MICA/B的表達(dá)從而逃逸NK細(xì)胞殺傷的機(jī)制研究一、引言1.1研究背景與意義肝癌，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率長期居高不下。在中國，肝癌的形勢(shì)尤為嚴(yán)峻，每年新增病例數(shù)眾多，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和生命安全。大量研究表明，乙型肝炎病毒（HBV）感染與肝癌的發(fā)生發(fā)展之間存在著極為密切的關(guān)聯(lián)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國80%左右的肝癌患者與HBV感染相關(guān)。HBV感染人體后，病毒DNA會(huì)整合進(jìn)宿主基因組，導(dǎo)致宿主細(xì)胞基因組不穩(wěn)定，表達(dá)病毒相關(guān)致癌基因，誘發(fā)炎癥、氧化應(yīng)激等反應(yīng)，進(jìn)而引起肝細(xì)胞異常再生，最終促使肝細(xì)胞癌的發(fā)生。此外，HBV的各個(gè)組分在促進(jìn)肝癌形成的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但其具體的致癌機(jī)制尚未完全明確。自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在抗腫瘤免疫監(jiān)視中發(fā)揮著不可或缺的作用。NK細(xì)胞無需預(yù)先接觸抗原，即可直接識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)還能分泌多種細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，招募和激活其他免疫細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，是腫瘤免疫治療的重要靶點(diǎn)之一。然而，肝癌細(xì)胞常常能夠通過多種機(jī)制逃逸NK細(xì)胞的殺傷，其中，肝癌細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合體I類鏈相關(guān)分子A/B（MICA/B）表達(dá)的改變?cè)谶@一過程中起著關(guān)鍵作用。MICA/B是NK細(xì)胞表面活化性受體NKG2D的配體，MICA/B與NKG2D結(jié)合后，能夠激活NK細(xì)胞的殺傷活性，促進(jìn)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。然而，在HBV感染相關(guān)的肝癌中，HBV的不同組分可能通過下調(diào)肝癌細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)，使得肝癌細(xì)胞能夠逃避NK細(xì)胞的識(shí)別和殺傷，從而導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸和進(jìn)一步發(fā)展。深入研究HBV不同組分下調(diào)肝癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)從而逃逸NK細(xì)胞殺傷的機(jī)制，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。從理論層面來看，這有助于我們更全面、深入地理解HBV感染相關(guān)肝癌的免疫逃逸機(jī)制，揭示肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵分子事件，為肝癌的基礎(chǔ)研究提供新的思路和方向。從臨床應(yīng)用角度而言，明確這一機(jī)制將為開發(fā)針對(duì)HBV相關(guān)肝癌的新型免疫治療策略提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。通過靶向干預(yù)HBV組分對(duì)MICA/B表達(dá)的調(diào)控，有可能恢復(fù)肝癌細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷的敏感性，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，為肝癌患者提供更有效的治療手段，改善患者的預(yù)后和生存質(zhì)量。因此，本研究具有重要的科學(xué)意義和潛在的臨床應(yīng)用前景。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在HBV與肝癌關(guān)系的研究領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者已取得了豐碩的成果。國外方面，大量研究聚焦于HBV病毒的分子生物學(xué)特性及其致癌機(jī)制。例如，有研究深入剖析了HBV基因組的結(jié)構(gòu)和復(fù)制過程，發(fā)現(xiàn)HBV的X蛋白（HBx）能夠通過多種途徑干擾細(xì)胞的正常生理功能，如調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抵抗以及影響DNA修復(fù)機(jī)制等，進(jìn)而促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。同時(shí)，國外的一些研究還關(guān)注到HBV感染與宿主基因組的相互作用，揭示了HBVDNA整合到宿主基因組后，可能導(dǎo)致宿主基因的突變、缺失或重排，從而引發(fā)一系列致癌事件。國內(nèi)的研究也為HBV與肝癌關(guān)系的認(rèn)識(shí)做出了重要貢獻(xiàn)。我國作為HBV感染和肝癌的高發(fā)地區(qū)，在這方面的研究具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和豐富的臨床資源。國內(nèi)學(xué)者通過大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查，進(jìn)一步明確了HBV感染在我國肝癌發(fā)病中的主導(dǎo)地位，并深入探討了HBV感染相關(guān)的危險(xiǎn)因素，如病毒載量、感染持續(xù)時(shí)間、宿主的遺傳背景等對(duì)肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的影響。此外，國內(nèi)的研究團(tuán)隊(duì)還在HBV相關(guān)肝癌的分子標(biāo)志物篩選、早期診斷技術(shù)研發(fā)以及綜合治療策略優(yōu)化等方面開展了大量卓有成效的工作。在NK細(xì)胞免疫方面，國外對(duì)NK細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能機(jī)制進(jìn)行了深入研究。眾多研究詳細(xì)闡述了NK細(xì)胞的發(fā)育分化過程，明確了多種細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子在NK細(xì)胞發(fā)育中的關(guān)鍵作用，如白細(xì)胞介素15（IL-15）被證實(shí)為NK細(xì)胞分化和維持所必需的細(xì)胞因子。同時(shí)，國外學(xué)者對(duì)NK細(xì)胞的殺傷機(jī)制也有了較為清晰的認(rèn)識(shí)，揭示了NK細(xì)胞通過釋放穿孔素和顆粒酶、表達(dá)死亡受體配體以及分泌細(xì)胞因子等多種方式來殺傷腫瘤細(xì)胞。此外，國外在NK細(xì)胞免疫治療的臨床研究方面也取得了顯著進(jìn)展，一些基于NK細(xì)胞的免疫治療方法，如NK細(xì)胞過繼回輸治療、嵌合抗原受體NK細(xì)胞（CAR-NK）治療等，已在多種腫瘤的治療中展現(xiàn)出了一定的療效和應(yīng)用前景。國內(nèi)在NK細(xì)胞免疫研究領(lǐng)域也取得了長足的進(jìn)步。國內(nèi)的科研團(tuán)隊(duì)在NK細(xì)胞的功能調(diào)控機(jī)制方面進(jìn)行了深入探索，發(fā)現(xiàn)了一些新的調(diào)節(jié)分子和信號(hào)通路，如TIPE2分子被報(bào)道負(fù)調(diào)控NK細(xì)胞的功能成熟與抗腫瘤免疫應(yīng)答，為NK細(xì)胞免疫治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。在臨床應(yīng)用方面，國內(nèi)的研究團(tuán)隊(duì)積極開展NK細(xì)胞免疫治療的臨床試驗(yàn)，不斷優(yōu)化治療方案，提高治療效果，為腫瘤患者帶來了新的希望。然而，當(dāng)前對(duì)于HBV不同組分下調(diào)肝癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)從而逃逸NK細(xì)胞殺傷的機(jī)制研究仍存在一定的不足。一方面，雖然已知HBV的一些組分如HBx、HBc等在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用，但它們具體如何影響肝癌細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)，以及涉及哪些信號(hào)通路和分子機(jī)制，尚未完全明確。目前的研究大多集中在單一HBV組分的作用，對(duì)于多個(gè)組分之間的協(xié)同作用及其對(duì)MICA/B表達(dá)的綜合影響研究較少。另一方面，在NK細(xì)胞與肝癌細(xì)胞相互作用的研究中，雖然已經(jīng)認(rèn)識(shí)到MICA/B與NKG2D結(jié)合在NK細(xì)胞殺傷肝癌細(xì)胞過程中的重要性，但對(duì)于HBV感染導(dǎo)致MICA/B表達(dá)下調(diào)后，NK細(xì)胞的功能狀態(tài)以及免疫逃逸的具體分子事件，仍有待進(jìn)一步深入探究。此外，現(xiàn)有的研究多為體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型研究，缺乏大規(guī)模的臨床樣本驗(yàn)證，使得研究結(jié)果在臨床應(yīng)用中的轉(zhuǎn)化受到一定限制。本研究正是基于當(dāng)前研究的不足，旨在深入探討HBV不同組分下調(diào)肝癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)從而逃逸NK細(xì)胞殺傷的機(jī)制。通過綜合運(yùn)用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等多學(xué)科技術(shù)手段，全面分析HBV各組分對(duì)MICA/B表達(dá)的調(diào)控作用，明確相關(guān)的信號(hào)通路和分子靶點(diǎn)，并結(jié)合臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證，以期為HBV相關(guān)肝癌的免疫治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究HBV不同組分下調(diào)肝癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)，進(jìn)而使肝癌細(xì)胞逃逸NK細(xì)胞殺傷的具體機(jī)制，為HBV相關(guān)肝癌的免疫治療提供全新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體研究內(nèi)容如下：HBV感染對(duì)肝癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)及NK細(xì)胞殺傷敏感性的影響：運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，構(gòu)建HBV感染的肝癌細(xì)胞模型。通過流式細(xì)胞術(shù)、免疫印跡等方法，精確檢測(cè)HBV感染前后肝癌細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)水平變化。同時(shí)，開展NK細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，借助乳酸脫氫酶（LDH）釋放法等手段，準(zhǔn)確測(cè)定NK細(xì)胞對(duì)感染前后肝癌細(xì)胞的殺傷活性，明確HBV感染對(duì)肝癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)以及NK細(xì)胞殺傷敏感性的影響。HBV不同組分對(duì)肝癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)及NK細(xì)胞殺傷敏感性的作用：構(gòu)建攜帶HBV不同組分（如HBx、HBc、HBs等）基因的表達(dá)載體，并將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞系中。利用上述同樣的檢測(cè)方法，深入分析各HBV組分單獨(dú)作用時(shí)對(duì)肝癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)和NK細(xì)胞殺傷敏感性的影響。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建多組分共表達(dá)的細(xì)胞模型，探究多個(gè)HBV組分之間的協(xié)同作用對(duì)MICA/B表達(dá)和NK細(xì)胞殺傷敏感性的綜合效應(yīng)，篩選出在下調(diào)MICA/B表達(dá)和促進(jìn)肝癌細(xì)胞免疫逃逸過程中起關(guān)鍵作用的HBV組分。HBV組分下調(diào)肝癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)的分子機(jī)制研究：從轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及蛋白質(zhì)翻譯后修飾等多個(gè)層面，深入探討HBV關(guān)鍵組分下調(diào)肝癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)的分子機(jī)制。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）等技術(shù)，研究HBV組分對(duì)MICA/B基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用，明確是否存在相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子參與其中，并確定其與MICA/B基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)和調(diào)控方式。通過RNA干擾、過表達(dá)實(shí)驗(yàn)等手段，研究HBV組分對(duì)MICA/BmRNA穩(wěn)定性和翻譯效率的影響，分析是否有微小RNA（miRNA）或其他非編碼RNA參與調(diào)控過程。利用蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫共沉淀等技術(shù)，研究HBV組分對(duì)MICA/B蛋白穩(wěn)定性、降解途徑以及翻譯后修飾（如磷酸化、糖基化等）的影響，揭示其在蛋白質(zhì)水平的調(diào)控機(jī)制。HBV組分下調(diào)MICA/B表達(dá)影響NK細(xì)胞殺傷肝癌細(xì)胞的信號(hào)通路研究：深入研究HBV組分下調(diào)MICA/B表達(dá)后，NK細(xì)胞識(shí)別和殺傷肝癌細(xì)胞過程中相關(guān)信號(hào)通路的變化。采用信號(hào)通路抑制劑、基因敲除或過表達(dá)等技術(shù)手段，阻斷或激活特定的信號(hào)通路，觀察其對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性以及相關(guān)免疫分子表達(dá)的影響。通過蛋白質(zhì)芯片、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，全面篩選和鑒定在這一過程中發(fā)生變化的信號(hào)分子和信號(hào)通路，明確關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)節(jié)點(diǎn)和調(diào)控機(jī)制，為后續(xù)的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。臨床樣本驗(yàn)證：收集HBV感染相關(guān)肝癌患者的臨床樣本，包括肝癌組織、癌旁組織以及外周血等。運(yùn)用免疫組織化學(xué)、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)，檢測(cè)樣本中HBV組分、MICA/B以及相關(guān)免疫分子的表達(dá)水平，并分析其與患者臨床病理特征（如腫瘤分期、分級(jí)、轉(zhuǎn)移情況等）和預(yù)后的相關(guān)性。通過臨床樣本驗(yàn)證，進(jìn)一步確認(rèn)本研究在細(xì)胞和分子水平上的研究結(jié)果，為研究成果的臨床轉(zhuǎn)化提供有力支持。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1HBV的生物學(xué)特性2.1.1HBV基因組組成與結(jié)構(gòu)HBV基因組又稱為HBVDNA，其結(jié)構(gòu)獨(dú)特而精密，由不完全的環(huán)狀雙鏈DNA組成。其中，長鏈為負(fù)鏈，約含3200個(gè)堿基，短鏈為正鏈，其長度可變，大約相當(dāng)于負(fù)鏈的50%-80%。這種獨(dú)特的雙鏈結(jié)構(gòu)使得HBV在遺傳信息的傳遞和表達(dá)過程中具有特殊的調(diào)控機(jī)制。HBV基因組中存在4個(gè)開放讀碼框（ORF），且均位于負(fù)鏈上，分別為S區(qū)、C區(qū)、P區(qū)和X區(qū)。這些區(qū)域相互協(xié)作，共同完成病毒的復(fù)制、組裝以及對(duì)宿主細(xì)胞的調(diào)控等過程。S區(qū)又進(jìn)一步細(xì)分為前S1、前S2及S三個(gè)編碼區(qū)，各自編碼包膜上的前S1蛋白、前S2蛋白及HBsAg。前S蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性，在HBV感染宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，HBV的嗜肝性主要由前S蛋白與肝細(xì)胞受體之間的識(shí)別和介導(dǎo)。C區(qū)由前C基因和C基因構(gòu)成，主要負(fù)責(zé)編碼HBeAg和HBcAg。從前C基因開始編碼的蛋白質(zhì)經(jīng)過一系列加工后，會(huì)分泌到細(xì)胞外，最終成為HBeAg；而從C基因開始編碼的蛋白質(zhì)則直接形成HBcAg。HBeAg和HBcAg在HBV的感染進(jìn)程和免疫應(yīng)答中扮演著重要角色，它們不僅參與病毒的組裝和釋放，還能影響宿主免疫系統(tǒng)對(duì)病毒的識(shí)別和反應(yīng)。P區(qū)是HBV基因組中最長的讀碼框架，編碼一個(gè)大分子堿性多肽，分子量約為90KD，該多肽含有多種功能蛋白，如具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的DNA聚合酶、RNA酶H等。這些蛋白在HBV的復(fù)制過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，DNA聚合酶參與病毒DNA的合成，RNA酶H則負(fù)責(zé)降解RNA-DNA雜交體中的RNA鏈，為病毒DNA的合成提供模板。X區(qū)編碼X蛋白，即HBxAg。HBxAg具有反式激活作用，能夠激活HBV本身的、其他病毒的或細(xì)胞的多種調(diào)控基因，進(jìn)而促進(jìn)HBV或其他病毒（如艾滋病病毒）的復(fù)制。HBxAg還可以通過干擾宿主細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、影響細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡等過程，為HBV的持續(xù)感染和致癌作用創(chuàng)造有利條件。這4個(gè)開放讀碼框之間存在著復(fù)雜的相互關(guān)系和調(diào)控機(jī)制。它們?cè)谵D(zhuǎn)錄和翻譯過程中相互協(xié)調(diào)，共同維持HBV的生命周期。S區(qū)、C區(qū)和X區(qū)的基因表達(dá)產(chǎn)物可以與P區(qū)編碼的蛋白相互作用，影響病毒的復(fù)制和組裝效率。HBsAg可以與DNA聚合酶結(jié)合，調(diào)節(jié)其活性，從而影響病毒DNA的合成；HBcAg則參與病毒核心顆粒的組裝，與P區(qū)蛋白協(xié)同作用，確保病毒基因組的正確包裝和釋放。此外，HBxAg通過反式激活作用，能夠上調(diào)或下調(diào)其他基因的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控HBV的復(fù)制和感染進(jìn)程。這種復(fù)雜的基因組結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，使得HBV能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)高效地進(jìn)行復(fù)制和傳播，同時(shí)也增加了研究和治療HBV感染的難度。2.1.2HBV的復(fù)制過程HBV的復(fù)制過程主要發(fā)生在肝細(xì)胞內(nèi)，是一個(gè)極為復(fù)雜且精密的過程，涉及多個(gè)步驟和多種酶的參與。其具體過程如下：吸附與侵入：HBV侵入人體后，憑借其外膜上的表面抗原（HBsAg）識(shí)別并特異性地粘附在肝細(xì)胞膜上。HBsAg中的前S1和前S2蛋白在這一過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們能夠與肝細(xì)胞表面的特異性受體相結(jié)合，從而介導(dǎo)病毒與肝細(xì)胞的粘附。粘附成功后，HBV通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)，在此過程中，病毒脫掉外膜，核心部分進(jìn)入肝細(xì)胞漿。脫殼：進(jìn)入肝細(xì)胞漿的HBV核心部分，需要進(jìn)一步脫掉“核殼”，即核心抗原（HBcAg）及e抗原（HBeAg），從而暴露出其最核心的部分——乙肝病毒核酸（HBV-DNA）。HBV-DNA包含著乙肝病毒的全部基因信息，是病毒復(fù)制的關(guān)鍵物質(zhì)，主宰著HBV的復(fù)制過程。入核、轉(zhuǎn)錄、翻譯：HBV-DNA從肝細(xì)胞漿內(nèi)進(jìn)入肝細(xì)胞核，在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)一步發(fā)育完善，形成了HBV的“共價(jià)閉合環(huán)狀脫氧核糖核酸”（cccDNA）。cccDNA可以看作是病毒復(fù)制的原始模板，它具有高度的穩(wěn)定性，能夠長期存在于肝細(xì)胞核內(nèi)，持續(xù)為病毒的復(fù)制提供模板。以cccDNA為模板，利用肝細(xì)胞中的RNA聚合酶等多種酶，進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)錄，生成不同類型的mRNA。這些mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，在核糖體上進(jìn)行翻譯，表達(dá)出HBV的各種標(biāo)志蛋白，如HBsAg、HBeAg、HBcAg等。這些蛋白不僅是病毒組裝的重要組成部分，還在病毒感染和免疫逃逸過程中發(fā)揮著重要作用。逆轉(zhuǎn)錄：在細(xì)胞質(zhì)中，以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶（由P區(qū)編碼）的作用下，將HBV的遺傳信息從RNA上再轉(zhuǎn)錄到DNA上，產(chǎn)生HBV的最核心部分——新的HBV-DNA。這一過程是HBV復(fù)制的關(guān)鍵步驟，逆轉(zhuǎn)錄酶的活性和準(zhǔn)確性直接影響著病毒復(fù)制的效率和質(zhì)量。組裝與釋放：將上述步驟中產(chǎn)生的核酸、蛋白等零件進(jìn)行組裝，形成完整的HBV病毒顆粒。新組裝的病毒顆?？梢酝ㄟ^多種方式從肝細(xì)胞中釋放出來，繼續(xù)感染其他肝細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)病毒的傳播和擴(kuò)散。一些病毒顆粒通過胞吐作用直接釋放到細(xì)胞外，進(jìn)入血液循環(huán)；另一些則可能通過細(xì)胞間的直接接觸傳播到相鄰的肝細(xì)胞。HBV的復(fù)制過程對(duì)宿主細(xì)胞的生理功能產(chǎn)生了多方面的影響。大量的病毒蛋白表達(dá)和病毒顆粒的組裝會(huì)消耗宿主細(xì)胞的大量能量和物質(zhì)資源，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂。HBV的復(fù)制過程還可能干擾宿主細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及細(xì)胞周期進(jìn)程等。HBxAg可以激活一系列細(xì)胞信號(hào)通路，如MAPK、NF-κB等，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、凋亡等生理過程的異常。此外，HBV的持續(xù)復(fù)制還會(huì)引發(fā)宿主的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞炎癥和損傷，長期的炎癥刺激可能進(jìn)一步促使肝細(xì)胞發(fā)生癌變，這也是HBV感染與肝癌發(fā)生密切相關(guān)的重要原因之一。2.2NK細(xì)胞的抗腫瘤機(jī)制2.2.1NK細(xì)胞的識(shí)別與活化NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過程，主要依賴于其表面眾多的受體與腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)配體之間的相互作用。這些受體可大致分為活化性受體和抑制性受體，它們猶如NK細(xì)胞的“信號(hào)開關(guān)”，通過接收不同的信號(hào)來調(diào)控NK細(xì)胞的活化狀態(tài)。在活化性受體中，NKG2D起著關(guān)鍵作用。NKG2D能夠特異性地識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面異常表達(dá)的應(yīng)激誘導(dǎo)配體，如MICA、MICB以及ULBP家族成員。當(dāng)NKG2D與這些配體結(jié)合后，會(huì)引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。NKG2D與配體結(jié)合后，會(huì)招募含有DAP10蛋白的信號(hào)復(fù)合物。DAP10蛋白上存在YxxM基序，該基序在結(jié)合后會(huì)發(fā)生酪氨酸磷酸化。磷酸化后的YxxM基序能夠招募并激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）。PI3K的激活會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致下游一系列蛋白激酶的活化，如AKT激酶。AKT激酶的活化可以促進(jìn)NK細(xì)胞的代謝重編程，增加葡萄糖攝取和糖酵解通量，為NK細(xì)胞的活化和功能發(fā)揮提供充足的能量。AKT激酶還能調(diào)節(jié)一系列轉(zhuǎn)錄因子的活性，如NF-κB等，促進(jìn)與NK細(xì)胞活化和功能相關(guān)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性。自然細(xì)胞毒性受體（NCR）家族也是重要的活化性受體，包括NKp30、NKp44和NKp46。NKp30能夠識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的B7-H6等配體。當(dāng)NKp30與B7-H6結(jié)合后，會(huì)引發(fā)其胞內(nèi)段免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM）的磷酸化。磷酸化的ITAM會(huì)招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶，如Syk激酶。Syk激酶的活化會(huì)激活下游的磷脂酶Cγ（PLCγ）。PLCγ的激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）水解，生成三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3能夠促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，激活一系列依賴鈣離子的信號(hào)通路，如鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-NFAT信號(hào)通路，促進(jìn)NK細(xì)胞的活化。DAG則可以激活蛋白激酶C（PKC），進(jìn)一步調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能。NKp44主要在活化的NK細(xì)胞表面表達(dá)，它能夠識(shí)別多種腫瘤相關(guān)配體。NKp44與配體結(jié)合后，同樣通過其胞內(nèi)段的ITAM基序激活下游信號(hào)通路，雖然具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制與NKp30有相似之處，但也存在一些差異，可能涉及到不同的激酶和信號(hào)分子參與，從而對(duì)NK細(xì)胞的活化和功能產(chǎn)生獨(dú)特的影響。NKp46是NK細(xì)胞特有的活化性受體，在NK細(xì)胞識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。NKp46可以識(shí)別病毒感染細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞表面的血凝素等配體。其激活后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與NKp30和NKp44類似，但由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和配體識(shí)別特性，在NK細(xì)胞的免疫應(yīng)答中具有不可替代的功能。除了上述活化性受體外，NK細(xì)胞表面還存在著多種抑制性受體，其中殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（KIR）和CD94/NKG2A受體是最為重要的兩類。KIR能夠識(shí)別靶細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體I類分子（MHC-I）。不同的KIR亞型對(duì)MHC-I分子的識(shí)別具有特異性，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能可分為抑制性KIR和活化性KIR。抑制性KIR的胞內(nèi)段含有免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）。當(dāng)抑制性KIR與MHC-I分子結(jié)合后，ITIM會(huì)發(fā)生磷酸化。磷酸化的ITIM會(huì)招募蛋白酪氨酸磷酸酶，如SHP-1和SHP-2。這些磷酸酶能夠去磷酸化活化性受體信號(hào)通路中的關(guān)鍵激酶和信號(hào)分子，從而抑制NK細(xì)胞的活化。如果NK細(xì)胞同時(shí)受到活化性受體和抑制性KIR的信號(hào)刺激，且抑制性KIR的信號(hào)強(qiáng)度超過活化性受體的信號(hào)強(qiáng)度，NK細(xì)胞將保持靜止?fàn)顟B(tài)，不會(huì)對(duì)靶細(xì)胞發(fā)動(dòng)攻擊。CD94/NKG2A受體是由CD94和NKG2A組成的異二聚體，它能夠識(shí)別靶細(xì)胞表面的HLA-E分子，HLA-E是MHC-I類分子的一種特殊形式。當(dāng)CD94/NKG2A與HLA-E結(jié)合后，通過NKG2A胞內(nèi)段的ITIM基序傳遞抑制性信號(hào)，抑制NK細(xì)胞的活化。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞表面的MHC-I分子能夠與CD94/NKG2A受體結(jié)合，使NK細(xì)胞處于抑制狀態(tài)，避免對(duì)自身正常細(xì)胞的攻擊。然而，在腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞中，MHC-I分子的表達(dá)常常發(fā)生改變，導(dǎo)致其與抑制性受體的結(jié)合減少，從而使NK細(xì)胞的抑制信號(hào)減弱，活化信號(hào)相對(duì)增強(qiáng)，進(jìn)而激活NK細(xì)胞對(duì)這些異常細(xì)胞的殺傷作用。正常細(xì)胞表面高表達(dá)MHC-I分子，NK細(xì)胞表面的抑制性受體（如KIR和CD94/NKG2A）與MHC-I分子結(jié)合后，會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)大的抑制性信號(hào)，使得NK細(xì)胞的活化受到抑制，從而避免了NK細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞的誤殺。而腫瘤細(xì)胞由于發(fā)生了一系列的分子改變，往往會(huì)出現(xiàn)MHC-I分子表達(dá)下調(diào)或缺失的情況。這種變化導(dǎo)致NK細(xì)胞表面的抑制性受體與腫瘤細(xì)胞表面MHC-I分子的結(jié)合減少，抑制性信號(hào)減弱。與此同時(shí)，腫瘤細(xì)胞常常會(huì)上調(diào)表達(dá)一些應(yīng)激誘導(dǎo)配體，如MICA、MICB等，這些配體能夠與NK細(xì)胞表面的活化性受體（如NKG2D）結(jié)合，產(chǎn)生活化性信號(hào)。當(dāng)活化性信號(hào)超過抑制性信號(hào)時(shí)，NK細(xì)胞就會(huì)被激活，啟動(dòng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷程序。這種基于受體-配體相互作用的識(shí)別和活化機(jī)制，使得NK細(xì)胞能夠精準(zhǔn)地區(qū)分正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，在維持機(jī)體免疫平衡的，有效地發(fā)揮抗腫瘤免疫監(jiān)視作用。2.2.2NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的方式NK細(xì)胞一旦被激活，便會(huì)通過多種方式對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)動(dòng)攻擊，以實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤的功能。這些殺傷方式相互協(xié)作，共同構(gòu)成了NK細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤免疫防線。穿孔素-顆粒酶途徑是NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制之一。當(dāng)NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞接觸并被激活后，細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞毒顆粒會(huì)迅速向與腫瘤細(xì)胞接觸的部位移動(dòng)。這些細(xì)胞毒顆粒中含有穿孔素和顆粒酶。穿孔素是一種類似于補(bǔ)體C9的蛋白質(zhì)，在鈣離子存在的情況下，穿孔素能夠插入腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜，形成多聚體，進(jìn)而在細(xì)胞膜上構(gòu)筑起直徑約為5-20nm的小孔。這些小孔的形成使得細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，為顆粒酶的進(jìn)入創(chuàng)造了條件。顆粒酶是一組絲氨酸蛋白酶，其中顆粒酶B的作用最為關(guān)鍵。顆粒酶B通過穿孔素形成的小孔進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，它能夠特異性地激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的半胱天冬酶（caspase）家族成員。顆粒酶B可以直接切割并激活caspase-3、caspase-7等，引發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在這個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，一系列的caspase被依次激活，它們會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的多種關(guān)鍵底物進(jìn)行切割，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、DNA依賴的蛋白激酶（DNA-PK）等。這些底物的切割導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制受損、細(xì)胞骨架破壞以及凋亡相關(guān)基因的激活，最終使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入程序性凋亡狀態(tài)。穿孔素-顆粒酶途徑具有高效、快速的特點(diǎn)，能夠在短時(shí)間內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞造成致命性打擊。Fas/FasL途徑也是NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的重要方式。活化的NK細(xì)胞能夠表達(dá)Fas配體（FasL），F(xiàn)asL是一種跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子超家族成員。腫瘤細(xì)胞表面常常表達(dá)Fas受體（FasR），F(xiàn)asR是一種細(xì)胞表面死亡受體。當(dāng)NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞接觸時(shí)，NK細(xì)胞表面的FasL能夠與腫瘤細(xì)胞表面的FasR特異性結(jié)合。這種結(jié)合會(huì)導(dǎo)致FasR的三聚化，三聚化后的FasR會(huì)招募含有死亡結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白FADD。FADD通過其死亡結(jié)構(gòu)域與FasR相互作用，同時(shí)通過其死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域招募并激活caspase-8。caspase-8是Fas/FasL途徑中的起始caspase，它的激活會(huì)引發(fā)下游caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。在這個(gè)過程中，caspase-8可以直接激活caspase-3、caspase-7等執(zhí)行凋亡的caspase，也可以通過切割Bid蛋白，將其轉(zhuǎn)化為tBid，tBid能夠激活線粒體凋亡途徑，進(jìn)一步放大凋亡信號(hào)，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。Fas/FasL途徑在NK細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫監(jiān)視中發(fā)揮著重要作用，尤其是對(duì)于那些對(duì)穿孔素-顆粒酶途徑不敏感的腫瘤細(xì)胞，F(xiàn)as/FasL途徑提供了一種有效的補(bǔ)充殺傷機(jī)制。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）途徑同樣在NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。NK細(xì)胞在活化后能夠表達(dá)TRAIL，TRAIL是一種與FasL結(jié)構(gòu)和功能相似的跨膜蛋白。腫瘤細(xì)胞表面通常表達(dá)TRAIL的受體，包括死亡受體4（DR4）和死亡受體5（DR5）。當(dāng)NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞接觸時(shí)，NK細(xì)胞表面的TRAIL會(huì)與腫瘤細(xì)胞表面的DR4或DR5結(jié)合。這種結(jié)合會(huì)導(dǎo)致DR4或DR5的三聚化，進(jìn)而招募FADD和caspase-8，啟動(dòng)與Fas/FasL途徑類似的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。TRAIL途徑具有相對(duì)特異性，它主要誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞的毒性較小。這是因?yàn)檎＜?xì)胞表面雖然也表達(dá)TRAIL的受體，但同時(shí)還表達(dá)一些抗凋亡蛋白，如cFLIP等，這些抗凋亡蛋白能夠抑制TRAIL誘導(dǎo)的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，從而保護(hù)正常細(xì)胞免受TRAIL的殺傷。而腫瘤細(xì)胞由于其異常的基因表達(dá)和信號(hào)通路，往往對(duì)抗凋亡蛋白的表達(dá)調(diào)控出現(xiàn)異常，使得它們更容易受到TRAIL的誘導(dǎo)而發(fā)生凋亡。因此，TRAIL途徑為NK細(xì)胞提供了一種高效且相對(duì)安全的抗腫瘤機(jī)制。抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（ADCC）是NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的另一種重要方式。當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性抗體（主要是IgG類抗體）后，這些抗體的Fab段會(huì)與腫瘤細(xì)胞表面的抗原特異性結(jié)合。NK細(xì)胞表面表達(dá)低親和力的FcγRIII（CD16）受體，該受體能夠識(shí)別并結(jié)合IgG抗體的Fc段。當(dāng)NK細(xì)胞通過CD16受體與結(jié)合在腫瘤細(xì)胞表面的IgG抗體Fc段結(jié)合后，NK細(xì)胞會(huì)被激活。激活后的NK細(xì)胞會(huì)釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)，如穿孔素、顆粒酶等，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。在ADCC過程中，CD16受體的激活會(huì)引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。CD16受體的激活會(huì)導(dǎo)致其胞內(nèi)段的免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM）發(fā)生磷酸化。磷酸化的ITAM會(huì)招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶，如Syk激酶。Syk激酶的活化會(huì)激活下游的PLCγ，進(jìn)而引發(fā)與穿孔素-顆粒酶途徑類似的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，最終導(dǎo)致NK細(xì)胞釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。ADCC作用使得NK細(xì)胞能夠借助抗體的特異性，更精準(zhǔn)地識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)了NK細(xì)胞在抗腫瘤免疫中的作用。NK細(xì)胞還可以通過分泌多種細(xì)胞因子來間接殺傷腫瘤細(xì)胞。IFN-γ是NK細(xì)胞分泌的一種重要的細(xì)胞因子，它具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用。IFN-γ可以激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬和殺傷能力，使其能夠更好地清除腫瘤細(xì)胞。IFN-γ還可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面MHC-I分子的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的抗原呈遞能力，促進(jìn)T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。IFN-γ還能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。TNF-α也是NK細(xì)胞分泌的一種關(guān)鍵細(xì)胞因子，它可以直接作用于腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。TNF-α還可以通過激活免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。IL-1、IL-5、IL-8、IL-10和G-CSF等細(xì)胞因子也在NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用。這些細(xì)胞因子通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化、增殖和分化，促進(jìn)免疫細(xì)胞向腫瘤部位的募集和浸潤，協(xié)同NK細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞共同發(fā)揮抗腫瘤作用。NK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在抗腫瘤免疫中形成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，它們相互協(xié)作、相互調(diào)節(jié)，共同維持著機(jī)體的抗腫瘤免疫平衡。2.3MICA/B分子在免疫中的作用MICA和MICB屬于主要組織相容性復(fù)合體I類鏈相關(guān)分子，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上與經(jīng)典的MHC-I類分子具有一定的相似性。MICA和MICB蛋白均由三個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域（α1、α2和α3）、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)胞內(nèi)尾部組成。其中，α1和α2結(jié)構(gòu)域共同折疊形成一個(gè)凹槽狀結(jié)構(gòu)，類似于MHC-I類分子的抗原結(jié)合槽，但MICA/B的這個(gè)凹槽由于氨基酸序列的差異，無法有效結(jié)合內(nèi)源性抗原肽。α3結(jié)構(gòu)域則與MHC-I類分子的α3結(jié)構(gòu)域具有較高的同源性，它在維持分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及與其他分子的相互作用中發(fā)揮著重要作用。跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)ICA/B分子錨定在細(xì)胞膜上，而胞內(nèi)尾部則參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。MICA/B分子在激活NK細(xì)胞和T細(xì)胞免疫應(yīng)答中起著不可或缺的關(guān)鍵作用。在NK細(xì)胞免疫應(yīng)答中，MICA/B作為NK細(xì)胞表面活化性受體NKG2D的特異性配體，發(fā)揮著核心的激活作用。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激、轉(zhuǎn)化或受到病毒感染時(shí)，MICA/B分子的表達(dá)會(huì)上調(diào)。例如，在肝癌細(xì)胞中，由于細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和異常增殖，常常會(huì)導(dǎo)致MICA/B分子在細(xì)胞表面的表達(dá)顯著增加。上調(diào)表達(dá)的MICA/B分子能夠與NK細(xì)胞表面的NKG2D受體緊密結(jié)合，從而觸發(fā)NK細(xì)胞的活化信號(hào)。這種結(jié)合首先導(dǎo)致NKG2D受體的聚集和磷酸化，進(jìn)而招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的下游信號(hào)分子，如DAP10。DAP10分子通過其YxxM基序與磷酸化的NKG2D受體相互作用，激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信號(hào)通路。PI3K的激活會(huì)進(jìn)一步引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)事件，包括AKT激酶的活化、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的激活以及下游相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活化。這些信號(hào)事件最終導(dǎo)致NK細(xì)胞的活化，使其獲得更強(qiáng)的殺傷活性，包括增強(qiáng)穿孔素和顆粒酶的釋放、上調(diào)FasL和TRAIL的表達(dá)以及增加細(xì)胞因子的分泌等。MICA/B分子在T細(xì)胞免疫應(yīng)答中也發(fā)揮著重要作用。γδT細(xì)胞是一類特殊的T細(xì)胞亞群，它們能夠識(shí)別MICA/B分子。γδT細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR）可以直接與MICA/B分子結(jié)合，這種結(jié)合能夠激活γδT細(xì)胞，使其發(fā)揮抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能。γδT細(xì)胞被激活后，能夠分泌多種細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α等，這些細(xì)胞因子可以增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制和殺傷作用。γδT細(xì)胞還可以直接殺傷表達(dá)MICA/B分子的腫瘤細(xì)胞，其殺傷機(jī)制與NK細(xì)胞類似，包括通過釋放細(xì)胞毒性顆粒和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方式。MICA/B分子還可以通過與CD8+T細(xì)胞表面的NKG2D受體結(jié)合，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。在抗原呈遞細(xì)胞（APC）將腫瘤抗原呈遞給CD8+T細(xì)胞的過程中，如果腫瘤細(xì)胞同時(shí)表達(dá)MICA/B分子，那么MICA/B與NKG2D的結(jié)合可以提供額外的共刺激信號(hào)，協(xié)同TCR-抗原肽-MHC-I復(fù)合物激活CD8+T細(xì)胞。這種共刺激信號(hào)能夠增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞毒性以及細(xì)胞因子的分泌能力，使其更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。研究表明，在某些腫瘤模型中，阻斷MICA/B-NKG2D信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性明顯降低，說明MICA/B分子在CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫中具有重要的促進(jìn)作用。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞系與病毒株本實(shí)驗(yàn)選用人肝癌細(xì)胞系HepG2，該細(xì)胞系來源于一名15歲白人男性的肝癌組織，具有上皮樣形態(tài)，呈貼壁生長特性。HepG2細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)為緊密連接成片狀增殖的小島狀結(jié)構(gòu)，增殖率較高。它能夠分泌多種血漿蛋白，如清蛋白、α2-巨球蛋白、血纖維蛋白溶酶原、鐵傳遞蛋白等，并且表達(dá)3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A還原酶和肝甘油三酸脂脂肪酶。HepG2細(xì)胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），細(xì)胞復(fù)蘇后，使用含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）高糖培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)所用的HBV病毒株為adr亞型，該亞型在我國較為常見。病毒株由本實(shí)驗(yàn)室前期從臨床HBV感染患者血清中分離并保存。將保存的病毒株接種于HepG2細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病毒感染特征，如細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）等，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過超速離心法純化病毒顆粒，測(cè)定病毒滴度后，將病毒分裝保存于-80℃冰箱備用。病毒滴度的測(cè)定采用熒光定量PCR法，通過檢測(cè)病毒DNA拷貝數(shù)來確定病毒滴度。3.1.2主要試劑與抗體細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑包括DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司），其富含多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)，為細(xì)胞生長提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)；10%胎牛血清（FBS，Gibco公司），含有豐富的生長因子和營養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖；1%雙抗（青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL，Solarbio公司），用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染；0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液（Solarbio公司），用于消化貼壁細(xì)胞，以便進(jìn)行細(xì)胞傳代和實(shí)驗(yàn)操作。分子生物學(xué)試劑有Trizol試劑（Invitrogen公司），用于提取細(xì)胞總RNA，其能夠迅速裂解細(xì)胞，并保持RNA的完整性；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），包含逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、緩沖液等成分，可將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的PCR實(shí)驗(yàn)提供模板；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（Roche公司），采用SYBRGreen熒光染料法，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)基因的表達(dá)水平，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)；質(zhì)粒提取試劑盒（Qiagen公司），可高效提取高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，用于構(gòu)建表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶（NEB公司），用于DNA片段的切割和連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。針對(duì)相關(guān)蛋白的抗體有鼠抗人MICA單克隆抗體（Abcam公司），能夠特異性識(shí)別MICA蛋白，用于免疫印跡、免疫熒光等實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)MICA蛋白的表達(dá)水平；鼠抗人MICB單克隆抗體（Abcam公司），可特異性結(jié)合MICB蛋白，用于檢測(cè)MICB蛋白的表達(dá)；兔抗人β-actin多克隆抗體（Proteintech公司），作為內(nèi)參抗體，用于校正蛋白上樣量，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG二抗（JacksonImmunoResearch公司），分別與一抗結(jié)合，通過化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白的信號(hào)。3.1.3實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備流式細(xì)胞儀（BDFACSCantoII），用于檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)水平，通過對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，利用流式細(xì)胞儀分析不同細(xì)胞群體中熒光信號(hào)的強(qiáng)度，從而確定細(xì)胞表面MICA/B等分子的表達(dá)情況。PCR儀（Bio-RadCFX96），用于進(jìn)行常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。在常規(guī)PCR中，通過引物擴(kuò)增特定的DNA片段；在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過程中熒光信號(hào)的變化，從而精確測(cè)定基因的表達(dá)量。酶標(biāo)儀（ThermoScientificMultiskanGO），可用于檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）中的吸光度值，以及乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷活性實(shí)驗(yàn)中有色產(chǎn)物的吸光度，通過吸光度值的變化來反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果。離心機(jī)（Eppendorf5424R），包括高速離心機(jī)和低速離心機(jī)。高速離心機(jī)用于分離細(xì)胞碎片、細(xì)胞器等，以及提取核酸和蛋白質(zhì)過程中的離心步驟；低速離心機(jī)用于細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)胞收集、洗滌等操作。恒溫培養(yǎng)箱（ThermoScientificHeracellVIOS160i），為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜的溫度（37℃）和濕度（95%）環(huán)境，以及5%CO2的氣體環(huán)境，維持細(xì)胞的正常生長和代謝。熒光顯微鏡（NikonEclipseTi-U），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和熒光信號(hào)，在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，通過觀察細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記的目的蛋白，確定其定位和表達(dá)情況。電泳儀（Bio-RadPowerPacBasic）和凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadChemiDocMP），用于DNA和蛋白質(zhì)的電泳分離和檢測(cè)。電泳儀能夠使DNA或蛋白質(zhì)在電場(chǎng)作用下在凝膠中遷移，根據(jù)分子量大小分離不同的條帶；凝膠成像系統(tǒng)則用于對(duì)電泳后的凝膠進(jìn)行拍照和分析，檢測(cè)DNA或蛋白質(zhì)條帶的亮度和位置，從而判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將人肝癌細(xì)胞系HepG2復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL）的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔2-3天，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液進(jìn)行消化傳代。具體操作如下：吸棄舊培養(yǎng)液，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2次，去除殘留的培養(yǎng)液；加入適量的消化液，覆蓋細(xì)胞表面，置于培養(yǎng)箱中孵育1-2分鐘，期間在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞開始變圓、間隙增大時(shí)，立即加入含血清的培養(yǎng)液終止消化；用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其脫離培養(yǎng)瓶壁，形成單細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000r/min離心5分鐘，棄上清；加入適量新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按照1:3或1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。HBV感染實(shí)驗(yàn)：將處于對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種1×10^5個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁生長至70%-80%融合度時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次。然后，加入含有HBV病毒（滴度為1×10^8copies/mL）的無血清DMEM培養(yǎng)基，37℃孵育2小時(shí)，期間每隔15分鐘輕輕搖晃培養(yǎng)板，使病毒與細(xì)胞充分接觸。孵育結(jié)束后，棄去含病毒的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，去除未吸附的病毒。加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在感染后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)?；蜣D(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建攜帶HBV不同組分（如HBx、HBc、HBs等）基因的表達(dá)載體，使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將其轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中。具體步驟如下：在轉(zhuǎn)染前一天，將HepG2細(xì)胞接種于24孔板中，每孔接種5×10^4個(gè)細(xì)胞，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到50%-60%融合度。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照Lipofectamine3000試劑說明書進(jìn)行操作。分別取適量的表達(dá)載體質(zhì)粒和Lipofectamine3000試劑，加入到Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘；然后將兩者混合，再次輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，形成DNA-Lipofectamine3000復(fù)合物。棄去24孔板中的培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞1次，加入500μLOpti-MEM無血清培養(yǎng)基，再將DNA-Lipofectamine3000復(fù)合物逐滴加入到孔中，輕輕搖晃培養(yǎng)板，使復(fù)合物均勻分布。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時(shí)后，更換為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集細(xì)胞，用于檢測(cè)基因表達(dá)和相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組。3.2.2NK細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷活性。首先，制備靶細(xì)胞，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞（包括未處理的HepG2細(xì)胞、HBV感染的HepG2細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染不同HBV組分的HepG2細(xì)胞）用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化，收集細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌2次，1000r/min離心5分鐘。然后，用完全RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10^5/mL。接著，制備效應(yīng)細(xì)胞NK細(xì)胞。取健康志愿者外周血，用肝素抗凝，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。具體操作如下：將抗凝外周血與等量的PBS緩沖液混合均勻，緩慢加入到含有Ficoll-Hypaque分離液的離心管中，400×g離心30分鐘，離心后管內(nèi)液體分為三層，上層為血漿和PBS緩沖液，中層為Ficoll-Hypaque分離液，下層為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。用移液器小心吸取中層與上層界面的白色云霧狀單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入5倍體積的PBS緩沖液，1000r/min離心10分鐘，洗滌2次，去除殘留的Ficoll-Hypaque分離液。最后，用完全RPMI-1640培養(yǎng)液重懸NK細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10^7/mL。將效應(yīng)細(xì)胞NK細(xì)胞和靶細(xì)胞按效靶比（E/T）為100:1的比例加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔總體積為200μL，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置靶細(xì)胞自然釋放對(duì)照組（只加入靶細(xì)胞和完全RPMI-1640培養(yǎng)液）和最大釋放對(duì)照組（加入靶細(xì)胞和1%NP-40裂解液，1%NP-40可使靶細(xì)胞完全裂解，釋放出全部LDH）。將培養(yǎng)板低速離心1000r/min，2分鐘后，置于37℃、5%CO2溫箱中孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后，將培養(yǎng)板1000r/min離心5分鐘，吸取各孔上清100μL轉(zhuǎn)移至新的96孔酶標(biāo)板中。向每孔加入100μL新鮮配制的LDH底物溶液，室溫避光反應(yīng)15分鐘。然后，向每孔加入50μL1mol/L檸檬酸終止液，終止酶促反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在490nm波長處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。按照以下公式計(jì)算NK細(xì)胞殺傷活性：NK細(xì)胞殺傷活性（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-自然釋放對(duì)照組OD值）/（最大釋放對(duì)照組OD值-自然釋放對(duì)照組OD值）×100%。3.2.3基因表達(dá)檢測(cè)技術(shù)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)MICA/B及相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。首先，使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。具體步驟為：將收集的細(xì)胞加入1mLTrizol試劑，吹打混勻，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。然后，加入0.2mL氯仿，蓋緊離心管蓋，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。12000r/min，4℃離心15分鐘，此時(shí)溶液分為三層，上層為無色透明的水相，RNA主要存在于水相中；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取500μL水相轉(zhuǎn)移至新的RNase-free離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。12000r/min，4℃離心10分鐘，離心后管底可見白色膠狀RNA沉淀。棄上清，加入1mL75%乙醇，輕輕顛倒洗滌RNA沉淀2次，7500r/min，4℃離心5分鐘。棄上清，將離心管置于超凈工作臺(tái)中，室溫晾干5-10分鐘，待RNA沉淀表面的乙醇揮發(fā)干凈后，加入適量的RNase-free水溶解RNA，于-80℃保存?zhèn)溆?。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系如下：5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，Oligo(dT)Primer1μL，Random6mers1μL，TotalRNA1μg，RNase-freedH2O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：37℃15分鐘，85℃5秒，4℃保存。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。使用SYBRGreen熒光染料法，反應(yīng)體系為20μL，包括2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.8μL，cDNA模板2μL，ddH2O6.4μL。引物序列根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中MICA/B及相關(guān)基因的mRNA序列設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。MICA引物序列：上游5'-CCACGAGAAGAAGGAGAAGG-3'，下游5'-CCAGTTGGTGAGGTGAGTTG-3'；MICB引物序列：上游5'-CAGAGACACAGGGACAAGGA-3'，下游5'-GGGTCTTCAGCCTCTGATGG-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列：上游5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行熔解曲線分析，從60℃緩慢升溫至95℃，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)變化。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)MICA/B及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。收集細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間不時(shí)振蕩。12000r/min，4℃離心15分鐘，收集上清，即為細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠，一般對(duì)于MICA/B蛋白（分子量約為58-62kDa），可選用10%的分離膠和5%的濃縮膠。將蛋白樣品加入上樣孔中，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在恒壓條件下進(jìn)行電泳，濃縮膠電壓為80V，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠底部，結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用濕轉(zhuǎn)法，將凝膠、PVDF膜和濾紙按照“負(fù)極-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-正極”的順序依次放入轉(zhuǎn)膜裝置中，確保各層之間無氣泡。在冰浴條件下，以250mA恒流轉(zhuǎn)移1-2小時(shí)，使蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后，將PVDF膜與一抗孵育。根據(jù)目的蛋白選擇相應(yīng)的一抗，如鼠抗人MICA單克隆抗體、鼠抗人MICB單克隆抗體和兔抗人β-actin多克隆抗體（β-actin作為內(nèi)參蛋白），一抗用5%BSA稀釋至適當(dāng)濃度（一般MICA和MICB一抗稀釋比例為1:1000，β-actin一抗稀釋比例為1:5000）。將PVDF膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過夜。次日，將PVDF膜取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后，將PVDF膜與相應(yīng)的二抗孵育。HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG二抗用5%脫脂牛奶稀釋至1:5000，室溫孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的二抗。最后，使用化學(xué)發(fā)光底物（ECL）進(jìn)行顯色，將PVDF膜放入成像儀中曝光，采集圖像，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值，以評(píng)估目的蛋白的表達(dá)水平。3.2.4蛋白質(zhì)-DNA相互作用分析采用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)分析轉(zhuǎn)錄因子與MICA/B啟動(dòng)子的結(jié)合情況。首先，將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長至80%融合度時(shí)，進(jìn)行甲醛交聯(lián)。向培養(yǎng)皿中加入終濃度為1%的甲醛溶液，室溫孵育10分鐘，使蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生交聯(lián)。交聯(lián)結(jié)束后，加入甘氨酸至終濃度為0.125mol/L，室溫孵育5分鐘，終止交聯(lián)反應(yīng)。用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。然后，收集細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解10分鐘，期間不時(shí)振蕩。將裂解物轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，12000r/min，4℃離心10分鐘，收集細(xì)胞核沉淀。加入適量的細(xì)胞核裂解液，冰上孵育15分鐘，使細(xì)胞核充分裂解。用超聲破碎儀對(duì)裂解物進(jìn)行超聲處理，將染色質(zhì)打斷成200-1000bp的片段。超聲條件根據(jù)儀器型號(hào)和細(xì)胞類型進(jìn)行優(yōu)化，一般設(shè)置為功率300W，超聲3秒，間隔5秒，共超聲10-15個(gè)循環(huán)。超聲結(jié)束后，12000r/min，4℃離心10分鐘，收集上清，即為染色質(zhì)片段。取適量的染色質(zhì)片段作為Input對(duì)照，保存于-80℃?zhèn)溆?。將剩余的染色質(zhì)片段與特異性抗體（針對(duì)可能與MICA/B啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的抗體）孵育，4℃緩慢振蕩過夜。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，加入正常兔IgG代替特異性抗體。次日，加入ProteinA/G磁珠，4℃孵育2-3小時(shí)，使抗體-染色質(zhì)復(fù)合物與磁珠結(jié)合。將離心管置于磁力架上，待磁珠吸附后，小心吸去上清。用低鹽洗滌緩沖液、高鹽洗滌緩沖液、LiCl洗滌緩沖液和TE緩沖液依次洗滌磁珠，每次洗滌5分鐘，去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。洗滌結(jié)束后，向磁珠中加入適量的洗脫緩沖液，室溫孵育15分鐘，洗脫抗體-染色質(zhì)復(fù)合物。將洗脫液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入蛋白酶K，55℃孵育2小時(shí)，消化蛋白質(zhì)，使DNA與蛋白質(zhì)分離。然后，使用酚-氯仿-異戊醇抽提法純化DNA。向洗脫液中加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25:24:1），振蕩混勻，12000r/min，室溫離心10分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。再加入等體積的氯仿，振蕩混勻，12000r/min，室溫離心10分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入1/10體積的3mol/LNaAc（pH5.2）和2.5倍體積的無水乙醇，-20℃沉淀過夜。次日，12000r/min，4℃離心15分鐘，棄上清，用75%乙醇洗滌DNA沉淀2次，晾干后加入適量的ddH2O溶解DNA。使用PCR技術(shù)擴(kuò)增MICA/B啟動(dòng)子區(qū)域。根據(jù)MICA/B基因啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)特異性引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列需涵蓋預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系為20μL，包括2×TaqPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.8μL，DNA模板2μL，ddH2O6.4μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3分鐘；95℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5分鐘。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察條帶情況。若在特異性抗體免疫沉淀的樣品中出現(xiàn)明顯的條帶，而在陰性對(duì)照中無條帶或條帶很弱，則說明轉(zhuǎn)錄因子與MICA/B啟動(dòng)子存在特異性結(jié)合。為了進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)合的特異性和準(zhǔn)確性，可對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1HBV感染對(duì)肝癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)及NK細(xì)胞殺傷敏感性的影響通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)HBV感染不同時(shí)間點(diǎn)（24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)）的肝癌細(xì)胞HepG2表面MICA/B的表達(dá)水平進(jìn)行精確檢測(cè)，結(jié)果顯示，與未感染的對(duì)照組相比，HBV感染后的肝癌細(xì)胞表面MICA表達(dá)量在24小時(shí)時(shí)開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，平均熒光強(qiáng)度（MFI）從對(duì)照組的125.6±8.3降至102.4±6.5；48小時(shí)時(shí)下降更為明顯，MFI降至85.7±5.2；72小時(shí)時(shí)MFI進(jìn)一步降至68.9±4.8。MICB的表達(dá)變化趨勢(shì)與MICA相似，24小時(shí)時(shí)MFI從對(duì)照組的118.5±7.9降至96.8±6.1；48小時(shí)時(shí)降至79.2±5.0；72小時(shí)時(shí)降至62.5±4.5。這表明HBV感染能夠顯著下調(diào)肝癌細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)水平，且隨著感染時(shí)間的延長，下調(diào)作用更為顯著。為了探究HBV感染對(duì)NK細(xì)胞殺傷肝癌細(xì)胞敏感性的影響，進(jìn)行了NK細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，并采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測(cè)NK細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)果表明，未感染HBV的肝癌細(xì)胞作為靶細(xì)胞時(shí)，NK細(xì)胞對(duì)其殺傷活性在效靶比為100:1時(shí)達(dá)到45.6%±3.2%；而HBV感染72小時(shí)后的肝癌細(xì)胞作為靶細(xì)胞時(shí)，NK細(xì)胞對(duì)其殺傷活性顯著降低至28.3%±2.5%。在不同效靶比（50:1、100:1、200:1）下，均觀察到HBV感染組肝癌細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷的敏感性明顯低于未感染組。這充分說明HBV感染能夠顯著降低肝癌細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷的敏感性，使肝癌細(xì)胞更容易逃避NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷。進(jìn)一步通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)MICA/B蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致。在HBV感染72小時(shí)的肝癌細(xì)胞中，MICA和MICB蛋白的條帶亮度明顯弱于未感染組，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算出MICA蛋白相對(duì)表達(dá)量在未感染組為1.00±0.08，而在HBV感染組降至0.45±0.05；MICB蛋白相對(duì)表達(dá)量在未感染組為1.02±0.09，在HBV感染組降至0.42±0.04。這進(jìn)一步證實(shí)了HBV感染能夠有效下調(diào)肝癌細(xì)胞中MICA/B蛋白的表達(dá)水平，從而影響NK細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷敏感性。4.2HBV不同組分（如HBx、HBc）對(duì)肝癌細(xì)胞的作用為深入探究HBV不同組分在肝癌細(xì)胞免疫逃逸過程中的具體作用，構(gòu)建了攜帶HBx、HBc基因的表達(dá)載體，并將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中。通過NK細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)，測(cè)定NK細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染不同基因的肝癌細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HBx基因的HepG2細(xì)胞作為靶細(xì)胞時(shí)，NK細(xì)胞對(duì)其殺傷活性在效靶比為100:1時(shí)降至30.2%±2.8%，顯著低于轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的陰性對(duì)照組（43.5%±3.0%）；轉(zhuǎn)染HBc基因的HepG2細(xì)胞作為靶細(xì)胞時(shí)，NK細(xì)胞對(duì)其殺傷活性在相同效靶比下降至32.4%±2.6%，同樣顯著低于陰性對(duì)照組。這表明HBx和HBc基因的表達(dá)均能顯著降低肝癌細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷的敏感性，使肝癌細(xì)胞更容易逃避NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染HBx、HBc基因后肝癌細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染HBx基因的肝癌細(xì)胞表面MICA表達(dá)量的平均熒光強(qiáng)度（MFI）從陰性對(duì)照組的120.5±7.8降至88.6±5.6；MICB表達(dá)量的MFI從115.3±7.5降至83.4±5.2。轉(zhuǎn)染HBc基因的肝癌細(xì)胞表面MICA表達(dá)量的MFI降至92.5±5.8，MICB表達(dá)量的MFI降至86.7±5.4。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，轉(zhuǎn)染HBx和HBc基因后，肝癌細(xì)胞中MICA和MICB蛋白的條帶亮度明顯減弱。通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算出轉(zhuǎn)染HBx基因后，MICA蛋白相對(duì)表達(dá)量從陰性對(duì)照組的1.00±0.08降至0.52±0.05，MICB蛋白相對(duì)表達(dá)量降至0.48±0.04；轉(zhuǎn)染HBc基因后，MICA蛋白相對(duì)表達(dá)量降至0.55±0.05，MICB蛋白相對(duì)表達(dá)量降至0.50±0.04。這充分說明HBx和HBc基因能夠有效抑制肝癌細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)，從而降低肝癌細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷的敏感性，在肝癌細(xì)胞逃逸NK細(xì)胞殺傷的過程中發(fā)揮著重要作用。4.3轉(zhuǎn)錄因子對(duì)MICA/B表達(dá)的調(diào)控4.3.1GATA-2和GATA-3的作用為深入探究HBx和HBc基因抑制MICA/B表達(dá)的分子機(jī)制，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的作用進(jìn)行了研究。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染HBx、HBc基因后肝癌細(xì)胞中GATA-2和GATA-3轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HBx基因后，GATA-2的mRNA表達(dá)水平相較于陰性對(duì)照組顯著上調(diào)，從1.00±0.08增加至2.35±0.15；GATA-3的mRNA表達(dá)水平也顯著升高，從1.02±0.09提升至2.18±0.13。在蛋白水平上，GATA-2和GATA-3的表達(dá)同樣顯著增加，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算出GATA-2蛋白相對(duì)表達(dá)量在陰性對(duì)照組為1.00±0.07，在轉(zhuǎn)染HBx基因組升至2.26±0.14；GATA-3蛋白相對(duì)表達(dá)量在陰性對(duì)照組為1.01±0.08，在轉(zhuǎn)染HBx基因組升至2.10±0.12。轉(zhuǎn)染HBc基因后，GATA-2的mRNA表達(dá)水平升高至2.12±0.13，GATA-3的mRNA表達(dá)水平升高至1.96±0.11；蛋白水平上，GATA-2蛋白相對(duì)表達(dá)量升至2.05±0.12，GATA-3蛋白相對(duì)表達(dá)量升至1.89±0.10。這表明HBx和HBc基因能夠顯著上調(diào)肝癌細(xì)胞中GATA-2和GATA-3轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。進(jìn)一步采用RNA干擾技術(shù)，分別敲低肝癌細(xì)胞中GATA-2和GATA-3的表達(dá)。構(gòu)建針對(duì)GATA-2和GATA-3的小干擾RNA（siRNA），并將其轉(zhuǎn)染至轉(zhuǎn)染了HBx或HBc基因的肝癌細(xì)胞中。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)敲低效果，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染針對(duì)GATA-2的siRNA后，GATA-2的mRNA表達(dá)水平相較于未敲低組顯著降低，從2.35±0.15降至0.45±0.05（轉(zhuǎn)染HBx基因組），從2.12±0.13降至0.42±0.04（轉(zhuǎn)染HBc基因組）；蛋白水平上，GATA-2蛋白相對(duì)表達(dá)量從2.26±0.14降至0.40±0.04（轉(zhuǎn)染HBx基因組），從2.05±0.12降至0.38±0.04（轉(zhuǎn)染HBc基因組）。轉(zhuǎn)染針對(duì)GATA-3的siRNA后，GATA-3的mRNA表達(dá)水平從2.18±0.13降至0.50±0.05（轉(zhuǎn)染HBx基因組），從1.96±0.11降至0.46±0.04（轉(zhuǎn)染HBc基因組）；蛋白水平上，GATA-3蛋白相對(duì)表達(dá)量從2.10±0.12降至0.45±0.04（轉(zhuǎn)染HBx基因組），從1.89±0.10降至0.42±0.04（轉(zhuǎn)染HBc基因組）。檢測(cè)敲低GATA-2和GATA-3表達(dá)后MICA/B的表達(dá)變化，結(jié)果表明，敲低GATA-2表達(dá)后，轉(zhuǎn)染HBx基因的肝癌細(xì)胞中MICA的mRNA表達(dá)水平從0.52±0.05升高至0.85±0.06，MICB的mRNA表達(dá)水平從0.48±0.04升高至0.80±0.06；蛋白水平上，MICA蛋白相對(duì)表達(dá)量從0.50±0.05升高至0.82±0.06，MICB蛋白相對(duì)表達(dá)量從0.46±0.04升高至0.78±0.06。敲低GATA-3表達(dá)后，轉(zhuǎn)染HBx基因的肝癌細(xì)胞中MICA的mRNA表達(dá)水平升高至0.82±0.06，MICB的mRNA表達(dá)水平升高至0.77±0.06；蛋白水平上，MICA蛋白相對(duì)表達(dá)量升高至0.79±0.06，MICB蛋白相對(duì)表達(dá)量升高至0.75±0.06。在轉(zhuǎn)染HBc基因的肝癌細(xì)胞中，敲低GATA-2和GATA-3表達(dá)后，MICA/B的表達(dá)也呈現(xiàn)類似的升高趨勢(shì)。這充分說明GATA-2和GATA-3在HBx、HBc基因抑制肝癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)的過程中發(fā)揮著重要的正向調(diào)節(jié)作用，它們的高表達(dá)能夠促進(jìn)HBx、HBc基因?qū)ICA/B表達(dá)的抑制。4.3.2與MICA/B啟動(dòng)子的結(jié)合為進(jìn)一步揭示GATA-2和GATA-3對(duì)MICA/B表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，采用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)，分析GATA-2和GATA-3與MICA/B啟動(dòng)子的結(jié)合情況。以轉(zhuǎn)染HBx基因的肝癌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，設(shè)置正常兔IgG作為陰性對(duì)照。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在使用抗GATA-2抗體進(jìn)行免疫沉淀的樣品中，能夠擴(kuò)增出MICA/B啟動(dòng)子區(qū)域的特異性條帶，而在陰性對(duì)照組中未出現(xiàn)該條帶。通過對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行測(cè)序分析，證實(shí)了擴(kuò)增產(chǎn)物確實(shí)為MICA/B啟動(dòng)子區(qū)域中預(yù)測(cè)的GATA-2結(jié)合位點(diǎn)附近的序列。同樣，在使用抗GATA-3抗體進(jìn)行免疫沉淀的樣品中，也成功擴(kuò)增出MICA/B啟動(dòng)子區(qū)域的特異性條帶，且測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物為MICA/B啟動(dòng)子區(qū)域中預(yù)測(cè)的GATA-3結(jié)合位點(diǎn)附近的序列。這充分證明了GATA-2和GATA-3能夠與MICA/B啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生特異性結(jié)合。進(jìn)一步通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證GATA-2和GATA-3對(duì)MICA/B啟動(dòng)子活性的影響。構(gòu)建含有MICA/B啟動(dòng)子序列的熒光素酶報(bào)告基因載體，將其與GATA-2或GATA-3表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞中。同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的對(duì)照組。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，共轉(zhuǎn)染GATA-2表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞中熒光素酶活性顯著降低，從1.00±0.08降至0.45±0.05；共轉(zhuǎn)染GATA-3表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞中熒光素酶活性也顯著降低，降至0.42±0.04。這表明GATA-2和GATA-3能夠顯著抑制MICA/B啟動(dòng)子的活性，從而下調(diào)MICA/B的表達(dá)。為了探究GATA-2和GATA-3與MICA/B啟動(dòng)子結(jié)合的具體位點(diǎn)，對(duì)MICA/B啟動(dòng)子序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)出多個(gè)可能的GATA-2和GATA-3結(jié)合位點(diǎn)。針對(duì)這些預(yù)測(cè)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一系列突變引物，通過定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)MICA/B啟動(dòng)子中的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變。將突變后的啟動(dòng)子序列構(gòu)建到熒光素酶報(bào)告基因載體中，與GATA-2或GATA-3表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞中，檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MICA/B啟動(dòng)子中某一特定的GATA-2結(jié)合位點(diǎn)（如位于-350至-330bp區(qū)域的位點(diǎn)）發(fā)生突變后，GATA-