內(nèi)生菌與反枝莧協(xié)同修復鉻污染土壤的機制與效能探究一、引言1.1研究背景與意義隨著工業(yè)化進程的加速，土壤污染問題日益嚴峻，其中鉻污染已成為全球關注的焦點。鉻在自然界中主要以Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）兩種形態(tài)存在，由于Cr（Ⅵ）具有高溶解性、高遷移性和高毒性的特點，其對土壤生態(tài)系統(tǒng)和人類健康構成的威脅更為嚴重。當土壤中鉻含量超標時，會抑制土壤硝化作用，影響土壤的氮循環(huán)，還能在植物體內(nèi)蓄積，通過食物鏈進入人體和動物體內(nèi)，對健康構成威脅，長期攝入被重金屬污染的食物，會導致慢性中毒，損害神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等，甚至引發(fā)癌癥。中國鉻污染場地主要分布在東部沿海地區(qū)、中西部地區(qū)和一些礦產(chǎn)資源豐富的地區(qū)，這些場地主要來源于歷史上的重金屬冶煉、電鍍、化工等行業(yè)的廢棄場地。近年來，我國土壤環(huán)境安全形勢嚴峻，污染事件時有發(fā)生，其中，“危廢污泥化肥”事件尤為觸目驚心，為土壤安全敲響了警鐘。2023年8月，央廣網(wǎng)曝光了不法商人將含有重金屬鉻的危廢污泥違規(guī)加工成肥料并銷往全國各地的事件，這些“毒肥料”一旦流入農(nóng)田，不僅會污染土壤，導致農(nóng)作物減產(chǎn)、品質(zhì)下降，還會通過食物鏈危害人體健康。傳統(tǒng)的鉻污染土壤修復技術如物理法和化學法，雖在一定程度上能降低土壤中鉻的含量，但存在成本高、工藝復雜、易造成二次污染等缺點，難以大規(guī)模推廣應用。例如，化學還原法需要使用大量的化學試劑，這些試劑可能會對土壤結構和生態(tài)環(huán)境造成破壞；物理分離法需要消耗大量的能源，且分離效果有限。相比之下，植物修復技術作為一種綠色、環(huán)保、經(jīng)濟的原位修復方法，具有操作簡便、無二次污染、可持續(xù)性強等優(yōu)點，近年來受到了廣泛關注。植物修復技術主要是利用植物及其根系與土壤、地下水中污染物的相互作用，通過植物吸收、降解、轉(zhuǎn)化或積累污染物，從而實現(xiàn)對土壤和地下水的凈化和修復。然而，單一的植物修復技術也存在修復效率低、植物生長受污染物抑制等問題。研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生菌能夠與植物形成互利共生關系，不僅能促進植物生長，還能增強植物對重金屬的耐受性和富集能力，為提高植物修復效率提供了新的思路。反枝莧作為一種常見的一年生草本植物，具有生長迅速、生物量大、適應能力強等特點，在植物修復方面展現(xiàn)出了潛在的應用前景。相關研究表明，反枝莧對多種重金屬具有一定的富集能力，能夠在重金屬污染的土壤中正常生長。本研究創(chuàng)新性地提出將內(nèi)生菌與反枝莧聯(lián)合應用于鉻污染土壤的修復，旨在充分發(fā)揮內(nèi)生菌和反枝莧的協(xié)同作用，提高鉻污染土壤的修復效率，為解決土壤鉻污染問題提供新的技術手段和理論依據(jù)。通過深入探究內(nèi)生菌聯(lián)合反枝莧修復鉻污染土壤的機制和影響因素，有望為實際修復工程提供科學指導，推動植物-微生物聯(lián)合修復技術的發(fā)展和應用，具有重要的理論意義和實踐價值。1.2研究目標與關鍵問題本研究旨在深入探究內(nèi)生菌聯(lián)合反枝莧對鉻污染土壤的修復效果與機制，通過篩選高效鉻抗性內(nèi)生菌，揭示其與反枝莧協(xié)同修復鉻污染土壤的作用過程，為植物-微生物聯(lián)合修復鉻污染土壤技術的實際應用提供理論支持和技術指導。具體研究目標如下：篩選高效鉻抗性內(nèi)生菌：從鉻污染土壤中生長的反枝莧體內(nèi)分離和篩選出具有高效鉻抗性和促生特性的內(nèi)生菌，并對其進行鑒定和特性分析。研究協(xié)同修復效果：通過盆栽試驗和田間試驗，研究內(nèi)生菌聯(lián)合反枝莧對鉻污染土壤的修復效果，包括土壤中鉻含量的降低、植物對鉻的富集能力以及土壤理化性質(zhì)的改善等。揭示協(xié)同修復機制：從生理生化和分子生物學水平，探究內(nèi)生菌增強反枝莧對鉻的耐受性和富集能力的機制，以及內(nèi)生菌與反枝莧之間的相互作用關系。為實現(xiàn)上述研究目標，需要解決以下關鍵問題：如何篩選出高效鉻抗性內(nèi)生菌：采用何種方法和標準從反枝莧體內(nèi)分離和篩選出具有高效鉻抗性和促生特性的內(nèi)生菌，以及如何對其進行準確鑒定和特性分析。內(nèi)生菌聯(lián)合反枝莧的協(xié)同修復效果如何：在不同鉻污染程度和環(huán)境條件下，內(nèi)生菌聯(lián)合反枝莧對鉻污染土壤的修復效果如何，以及如何優(yōu)化修復條件以提高修復效率。協(xié)同修復機制是什么：內(nèi)生菌通過何種途徑和方式增強反枝莧對鉻的耐受性和富集能力，以及內(nèi)生菌與反枝莧之間的信號傳遞和物質(zhì)交換機制是怎樣的。1.3研究創(chuàng)新點與實踐價值本研究在鉻污染土壤修復領域具有多方面的創(chuàng)新點，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：菌株篩選創(chuàng)新：從鉻污染土壤中生長的反枝莧體內(nèi)分離和篩選內(nèi)生菌，相較于傳統(tǒng)的從環(huán)境土壤中直接分離內(nèi)生菌，這種方法能夠更有針對性地篩選出與反枝莧具有良好共生關系且對鉻具有高效抗性和促生特性的內(nèi)生菌，為后續(xù)的聯(lián)合修復研究提供了更優(yōu)質(zhì)的菌株資源。修復機制創(chuàng)新：本研究從生理生化和分子生物學水平深入探究內(nèi)生菌增強反枝莧對鉻的耐受性和富集能力的機制，以及內(nèi)生菌與反枝莧之間的相互作用關系，彌補了現(xiàn)有研究在這方面的不足，為植物-微生物聯(lián)合修復鉻污染土壤技術提供了更深入的理論基礎。實踐應用創(chuàng)新：通過盆栽試驗和田間試驗，研究內(nèi)生菌聯(lián)合反枝莧對鉻污染土壤的修復效果，將實驗室研究成果與實際應用相結合，為鉻污染土壤的修復提供了切實可行的技術方案，具有較強的實踐指導意義。本研究成果對于推動鉻污染土壤修復技術的發(fā)展和環(huán)境保護具有重要的實踐價值：為鉻污染土壤修復提供新的技術手段：本研究提出的內(nèi)生菌聯(lián)合反枝莧修復鉻污染土壤的方法，具有成本低、操作簡單、無二次污染等優(yōu)點，為解決鉻污染土壤問題提供了一種新的綠色、環(huán)保的技術選擇，有望在實際修復工程中得到廣泛應用。促進植物-微生物聯(lián)合修復技術的發(fā)展：深入研究內(nèi)生菌與反枝莧的協(xié)同修復機制，有助于進一步完善植物-微生物聯(lián)合修復技術的理論體系，為該技術在其他重金屬污染土壤修復中的應用提供參考和借鑒，推動植物-微生物聯(lián)合修復技術的發(fā)展和創(chuàng)新。為環(huán)境保護和生態(tài)安全提供保障：鉻污染土壤嚴重威脅生態(tài)環(huán)境和人類健康，本研究成果的應用能夠有效降低土壤中鉻的含量，減少鉻對環(huán)境的污染和對人體健康的危害，對于保護生態(tài)環(huán)境、維護生態(tài)平衡和保障人類健康具有重要意義。二、鉻污染土壤及修復技術概述2.1鉻的性質(zhì)、存在形態(tài)與危害鉻（Chromium，化學符號Cr）是一種具有重要工業(yè)價值的過渡金屬元素，在元素周期表中位于第24位，原子量為51.996。鉻的單質(zhì)呈現(xiàn)出銀白色金屬光澤，具有較高的熔點（1903±10℃）和沸點（2642℃），密度為7.14g/cm3（20℃）。其莫氏硬度達到9，僅次于硬度最大的金剛石，使得鉻在許多工業(yè)應用中展現(xiàn)出良好的耐磨性和耐腐蝕性。例如，在不銹鋼的生產(chǎn)中，鉻的加入顯著提高了鋼的抗腐蝕性能，使其能夠在各種惡劣環(huán)境下保持穩(wěn)定的性能。在土壤環(huán)境中，鉻主要以Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）兩種價態(tài)存在，它們在化學性質(zhì)和環(huán)境行為上存在顯著差異。Cr（Ⅲ）是鉻的穩(wěn)定價態(tài)，在土壤中通常以難溶性的氫氧化物、氧化物或與有機物結合的形式存在，其遷移性和生物可利用性較低。例如，Cr（Ⅲ）易與土壤中的腐殖質(zhì)等有機質(zhì)形成穩(wěn)定的絡合物，從而降低了其在土壤中的遷移能力和對生物的毒性。而Cr（Ⅵ）則具有較強的氧化性，通常以鉻酸根離子（CrO?2?、Cr?O?2?）的形式存在，在水中具有較高的溶解性和遷移性。這種高溶解性使得Cr（Ⅵ）能夠更容易地在土壤中擴散，進入地下水和地表水系統(tǒng)，從而擴大了其污染范圍。此外，Cr（Ⅵ）的化學性質(zhì)使其具有較強的生物毒性，對土壤生態(tài)系統(tǒng)和人體健康構成嚴重威脅。鉻污染對土壤生態(tài)系統(tǒng)的負面影響是多方面的。在土壤微生物群落方面，高濃度的鉻會抑制土壤中許多微生物的生長和代謝活動，破壞微生物群落的結構和功能。例如，一些研究表明，鉻污染會顯著降低土壤中細菌、真菌和放線菌的數(shù)量和活性，影響土壤中有機物的分解、氮循環(huán)和磷循環(huán)等重要生態(tài)過程。土壤酶作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中生物化學反應的催化劑，其活性也會受到鉻污染的抑制。土壤脲酶、磷酸酶和脫氫酶等酶的活性在鉻污染土壤中明顯下降，進而影響土壤中養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和釋放，降低土壤肥力。對于植物而言，鉻污染會干擾植物的正常生理代謝過程。鉻會抑制植物種子的萌發(fā)，使種子發(fā)芽率降低，影響植物的初始生長。在植物生長過程中，鉻會阻礙植物根系對水分和養(yǎng)分的吸收，導致植物生長遲緩、矮小，葉片發(fā)黃、枯萎。過量的鉻還會破壞植物細胞的結構和功能，影響光合作用、呼吸作用等重要生理過程，降低植物的抗逆性。研究發(fā)現(xiàn)，鉻會影響植物葉綠體的結構和功能，降低葉綠素含量，從而抑制光合作用的進行，使植物無法正常合成有機物質(zhì)，影響植物的生長和發(fā)育。更為嚴重的是，鉻污染通過食物鏈對人體健康產(chǎn)生潛在危害。當土壤中的鉻被植物吸收后，會在植物體內(nèi)積累。人類食用這些受污染的植物，鉻會進入人體并在體內(nèi)蓄積。長期攝入含有高濃度鉻的食物或飲用水，會對人體的多個器官和系統(tǒng)造成損害。鉻會對人體的消化系統(tǒng)產(chǎn)生刺激和腐蝕作用，引起惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等癥狀。它還會損害人體的神經(jīng)系統(tǒng)，導致頭痛、頭暈、失眠、記憶力減退等問題。在呼吸系統(tǒng)方面，吸入含鉻的粉塵或氣溶膠會引發(fā)呼吸道炎癥、咳嗽、氣喘等癥狀，長期暴露甚至可能導致肺癌等嚴重疾病。此外，鉻還具有一定的致癌性和致畸性，對人類的生殖系統(tǒng)和遺傳物質(zhì)也會產(chǎn)生不良影響。2.2鉻污染土壤來源與現(xiàn)狀鉻污染土壤的來源廣泛，主要包括工業(yè)排放、礦業(yè)活動、農(nóng)業(yè)活動以及垃圾處理等方面。工業(yè)排放是鉻污染土壤的主要來源之一，在鉻鹽生產(chǎn)、電鍍、制革、印染等行業(yè)中，大量含鉻廢水、廢氣和廢渣未經(jīng)有效處理直接排放，導致周邊土壤受到嚴重污染。例如，鉻鹽生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量的鉻渣，這些鉻渣中含有高濃度的六價鉻，若堆放不當，六價鉻會隨著雨水的淋溶作用滲入土壤，造成土壤鉻污染。電鍍行業(yè)在金屬表面處理過程中使用大量的含鉻電鍍液，部分電鍍液會通過廢水排放或泄漏的方式進入土壤，對土壤環(huán)境造成危害。礦業(yè)活動也是鉻污染土壤的重要來源。鉻礦的開采、選礦和冶煉過程中，會產(chǎn)生大量的尾礦和廢渣，這些廢棄物中含有較高濃度的鉻。如在鉻礦開采過程中，礦石的破碎、篩分等作業(yè)會產(chǎn)生大量的粉塵，其中的鉻元素會隨著粉塵的沉降進入土壤。選礦過程中產(chǎn)生的尾礦通常含有一定量的鉻，若尾礦庫建設和管理不善，尾礦中的鉻會滲漏到周圍土壤中。此外，農(nóng)業(yè)活動中的不合理施肥和灌溉也可能導致土壤鉻污染。一些磷肥、復合肥中含有一定量的鉻，長期大量施用這些肥料會使土壤中的鉻含量逐漸增加。使用含鉻的工業(yè)廢水進行灌溉，會使鉻在土壤中積累，從而造成土壤污染。垃圾處理不當也是土壤鉻污染的一個因素，一些含鉻的廢舊電池、電子垃圾等若未進行有效回收和處理，其中的鉻會在自然環(huán)境中釋放，進入土壤。全球范圍內(nèi)，鉻污染土壤問題日益嚴重。根據(jù)美國環(huán)保署（EPA）的調(diào)查數(shù)據(jù)，美國有大量的工業(yè)場地存在鉻污染問題，這些場地主要分布在中西部和東部沿海地區(qū)。在歐洲，一些工業(yè)發(fā)達的國家如德國、英國、法國等也面臨著不同程度的鉻污染土壤問題。在亞洲，印度、中國等國家由于工業(yè)化進程的加速，鉻污染土壤問題也逐漸凸顯。據(jù)統(tǒng)計，印度的一些制革工業(yè)區(qū)周邊土壤中鉻含量嚴重超標，對當?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境和居民健康造成了巨大威脅。我國的鉻污染土壤問題同樣不容忽視。隨著工業(yè)化和城市化的快速發(fā)展，我國的鉻污染土壤面積不斷擴大。根據(jù)《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》，我國部分地區(qū)土壤中鉻含量超標，主要分布在工業(yè)集中區(qū)、礦區(qū)周邊以及城市郊區(qū)等區(qū)域。在一些鉻鹽生產(chǎn)企業(yè)和電鍍企業(yè)周邊，土壤中鉻含量遠遠超過了國家土壤環(huán)境質(zhì)量標準。2011年云南曲靖發(fā)生的非法轉(zhuǎn)移鉻渣5000余噸的事件震驚全國，該事件導致當?shù)赝寥篮退w受到嚴重污染，周邊居民的生活和健康受到極大影響。此外，我國的一些礦區(qū)如新疆、西藏等地的鉻礦區(qū)，由于長期的開采活動，周邊土壤也存在不同程度的鉻污染。鉻污染土壤不僅影響土壤的質(zhì)量和生態(tài)功能，還通過食物鏈對人體健康構成潛在威脅，因此，鉻污染土壤的修復已成為我國環(huán)境保護領域的一項緊迫任務。2.3現(xiàn)有鉻污染土壤修復技術綜述2.3.1物理修復技術物理修復技術是指通過物理手段將土壤中的鉻污染物分離或去除，從而達到修復目的的方法。常見的物理修復技術包括客土法、熱解吸法、電動修復法等?？屯练ㄊ菍⑽词芪廴镜耐寥腊徇\至污染區(qū)域，與污染土壤混合或直接替換污染土壤，以此降低污染土壤中鉻的含量和濃度。該方法的操作相對簡單，修復效果較為顯著，能夠快速降低土壤中鉻的含量。在一些小型鉻污染場地，客土法可以有效地改善土壤質(zhì)量，為后續(xù)的土地利用提供條件。然而，客土法需要大量的未污染土壤，運輸和處理成本較高，且可能對周邊環(huán)境造成一定的影響?？屯练ㄖ皇菍t污染物轉(zhuǎn)移，并沒有真正去除，存在二次污染的風險。熱解吸法是利用加熱的方式使土壤中的鉻污染物揮發(fā)或分解，從而實現(xiàn)與土壤的分離。在一定的溫度條件下，鉻的化合物會發(fā)生熱分解或揮發(fā)，通過收集和處理揮發(fā)物，可以降低土壤中鉻的含量。熱解吸法適用于處理揮發(fā)性較強的鉻污染物，對于高濃度的鉻污染土壤具有較好的修復效果。在一些工業(yè)廢棄場地，熱解吸法可以有效地去除土壤中的鉻，使土壤達到可再利用的標準。熱解吸法需要消耗大量的能源，設備投資和運行成本較高，且對操作技術要求嚴格。在熱解吸過程中，可能會產(chǎn)生一些有害氣體，需要進行有效的處理，以避免對環(huán)境造成二次污染。電動修復法是在土壤中施加直流電場，利用電場力的作用使土壤中的鉻離子向電極方向遷移，從而實現(xiàn)鉻的分離和去除。在電場的作用下，鉻離子會在土壤孔隙水中發(fā)生遷移，通過在電極附近收集和處理含鉻溶液，可以降低土壤中鉻的含量。電動修復法適用于處理低滲透性土壤中的鉻污染，能夠?qū)崿F(xiàn)原位修復，對環(huán)境的擾動較小。在一些城市建設用地的鉻污染修復中，電動修復法可以在不破壞土壤結構的前提下，有效地去除土壤中的鉻。電動修復法的修復周期較長，需要消耗大量的電能，且對土壤的性質(zhì)和鉻的形態(tài)有一定的要求。在修復過程中，可能會出現(xiàn)電極腐蝕、土壤酸堿度變化等問題，需要進行有效的控制和管理。2.3.2化學修復技術化學修復技術是利用化學反應改變土壤中鉻的化學形態(tài)和性質(zhì)，降低其遷移性和生物有效性，從而達到修復目的的方法。常見的化學修復技術包括化學淋洗、固化穩(wěn)定化、氧化還原等?；瘜W淋洗是利用淋洗劑與土壤中的鉻污染物發(fā)生化學反應，將其溶解或絡合，然后通過淋洗將鉻從土壤中去除。常用的淋洗劑有無機酸、堿、螯合劑等。在酸性條件下，無機酸可以與土壤中的鉻化合物發(fā)生反應，使其溶解進入溶液中，從而實現(xiàn)鉻的去除。螯合劑能夠與鉻離子形成穩(wěn)定的絡合物，增加鉻的溶解性，提高淋洗效果。化學淋洗適用于處理砂質(zhì)土壤中的鉻污染，能夠快速降低土壤中鉻的含量。在一些鉻污染嚴重的工業(yè)場地，化學淋洗可以有效地去除土壤中的鉻，使土壤達到排放標準?；瘜W淋洗會導致土壤養(yǎng)分流失，破壞土壤結構，且淋洗劑的選擇和使用不當可能會造成二次污染。淋洗后的含鉻廢水需要進行妥善處理，增加了修復成本。固化穩(wěn)定化是向土壤中添加固化劑或穩(wěn)定劑，與鉻污染物發(fā)生化學反應，形成穩(wěn)定的化合物，降低其遷移性和生物有效性。常用的固化劑有水泥、石灰等，穩(wěn)定劑有磷酸鹽、硫化物等。水泥可以與土壤中的鉻形成堅固的固化體，將鉻固定在其中，減少其在土壤中的遷移。磷酸鹽可以與鉻反應生成難溶性的磷酸鹽沉淀，降低鉻的生物有效性。固化穩(wěn)定化適用于處理中、低濃度的鉻污染土壤，能夠有效地降低土壤中鉻的風險。在一些鉻污染農(nóng)田的修復中，固化穩(wěn)定化可以在不破壞土壤原有結構的前提下，降低鉻對農(nóng)作物的危害。固化穩(wěn)定化只是將鉻固定在土壤中，并沒有真正去除，需要長期監(jiān)測和管理。固化劑和穩(wěn)定劑的添加可能會改變土壤的酸堿度和物理性質(zhì)，對土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生一定的影響。氧化還原是利用氧化劑或還原劑與土壤中的鉻發(fā)生氧化還原反應，改變其價態(tài)，從而降低其毒性和遷移性。常用的氧化劑有高錳酸鉀、過氧化氫等，還原劑有硫酸亞鐵、亞硫酸鈉等。在酸性條件下，高錳酸鉀可以將低價態(tài)的鉻氧化為高價態(tài)的鉻，使其形成難溶性的化合物沉淀下來。硫酸亞鐵可以將高價態(tài)的鉻還原為低價態(tài)的鉻，降低其毒性。氧化還原適用于處理不同類型的鉻污染土壤，能夠有效地降低土壤中鉻的毒性。在一些鉻污染河流底泥的修復中，氧化還原可以通過改變鉻的價態(tài)，降低其對水體的污染。氧化還原反應的條件較為苛刻，需要嚴格控制反應的pH值、溫度等參數(shù)。氧化劑和還原劑的使用可能會對土壤中的微生物和其他生物產(chǎn)生一定的影響。2.3.3生物修復技術生物修復技術是利用生物的生命活動將土壤中的鉻污染物轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì)或降低其毒性，從而達到修復目的的方法。常見的生物修復技術包括植物修復、微生物修復等。植物修復是利用植物對鉻的吸收、富集、轉(zhuǎn)化和固定等作用，降低土壤中鉻的含量和毒性。一些植物具有超富集能力，能夠在體內(nèi)積累大量的鉻，通過收割植物可以將鉻從土壤中去除。如李氏禾對鉻具有較強的富集能力，其地上部分鉻含量可達到1000mg/kg以上。植物修復還可以通過根系分泌物和根際微生物的作用，改變土壤中鉻的化學形態(tài)和生物有效性，促進鉻的吸收和轉(zhuǎn)化。植物修復具有成本低、環(huán)境友好、無二次污染等優(yōu)點，適用于大面積、低濃度的鉻污染土壤修復。在一些鉻污染農(nóng)田的修復中，種植超富集植物可以在不破壞土壤生態(tài)系統(tǒng)的前提下，有效地降低土壤中鉻的含量。植物修復的修復周期較長，植物的生長受環(huán)境條件的影響較大。一些植物對鉻的耐受性有限，在高濃度鉻污染土壤中生長受到抑制，影響修復效果。微生物修復是利用微生物的代謝活動將土壤中的鉻污染物轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì)或降低其毒性。一些微生物能夠通過還原、氧化、吸附等作用，改變鉻的價態(tài)和形態(tài)，降低其遷移性和生物有效性。如硫酸鹽還原菌可以將六價鉻還原為三價鉻，降低其毒性。微生物修復還可以通過微生物產(chǎn)生的胞外聚合物等物質(zhì)，與鉻發(fā)生絡合作用，固定鉻離子。微生物修復具有操作簡單、成本低、對環(huán)境友好等優(yōu)點，適用于處理各種類型的鉻污染土壤。在一些鉻污染地下水的修復中，利用微生物的還原作用可以有效地降低地下水中鉻的含量。微生物修復的修復效果受微生物種類、數(shù)量、活性以及環(huán)境條件等因素的影響較大。微生物的生長和代謝需要適宜的環(huán)境條件，如溫度、pH值、營養(yǎng)物質(zhì)等，在實際應用中需要進行嚴格的控制和管理。2.3.4綜合修復技術綜合修復技術是將物理、化學、生物等多種修復技術結合起來，發(fā)揮各自的優(yōu)勢，提高修復效果的方法。單一的修復技術往往存在一定的局限性，難以滿足復雜的鉻污染土壤修復需求。例如，物理修復技術雖然能夠快速去除土壤中的鉻，但成本較高，且可能對土壤結構造成破壞；化學修復技術雖然能夠有效地降低鉻的毒性，但容易造成二次污染；生物修復技術雖然環(huán)境友好，但修復周期較長。綜合修復技術通過將不同的修復技術有機結合，可以取長補短，提高修復效率和效果。在實際應用中，綜合修復技術通常根據(jù)土壤的污染程度、類型、地理位置等因素進行選擇和組合。在一些高濃度鉻污染場地，可以先采用化學淋洗等技術降低土壤中鉻的含量，然后再采用生物修復技術進一步改善土壤環(huán)境，提高土壤的生態(tài)功能。在一些低濃度鉻污染農(nóng)田，可以采用植物修復與微生物修復相結合的方法，利用植物的吸收作用和微生物的轉(zhuǎn)化作用，協(xié)同修復鉻污染土壤。近年來，隨著科技的不斷發(fā)展，綜合修復技術在鉻污染土壤修復領域得到了越來越廣泛的應用。一些研究將電動修復與化學修復相結合，利用電場的作用促進化學試劑在土壤中的傳輸和反應，提高修復效果。還有一些研究將植物修復與化學修復相結合，通過向土壤中添加化學改良劑，促進植物對鉻的吸收和富集。這些研究表明，綜合修復技術具有廣闊的應用前景。未來，綜合修復技術的發(fā)展趨勢將更加注重多技術的協(xié)同作用、修復過程的智能化控制以及修復效果的長期穩(wěn)定性。隨著納米技術、生物技術、信息技術等新興技術的不斷發(fā)展，綜合修復技術將不斷創(chuàng)新和完善，為鉻污染土壤修復提供更加高效、環(huán)保、可持續(xù)的解決方案。三、反枝莧與內(nèi)生菌的特性及作用3.1反枝莧的生物學特性反枝莧（AmaranthusretroflexusL.）隸屬莧科莧屬，是一年生草本植物，又名西風谷、野莧菜等。作為一種全球性的常見雜草，反枝莧在植物修復領域展現(xiàn)出獨特潛力，尤其是在鉻污染土壤修復方面，其生物學特性與修復能力密切相關。反枝莧植株高度差異較大，通常在20-140厘米之間。莖部粗壯且直立，部分植株不分枝，而有些則有分枝，莖上具有鈍棱，并且密生短絨毛，這些絨毛在一定程度上有助于減少水分散失，增強其對干旱環(huán)境的適應能力。其葉片呈現(xiàn)菱狀卵形或橢圓狀卵形，長度為5-12厘米，寬度在2-6厘米范圍。葉片頂端銳尖或尖凹，并有小凸尖，基部呈楔形，葉片兩面及邊緣均有柔毛，且下面的毛更為密集。葉柄長度為1.5-5.5厘米，同樣被柔毛覆蓋。圓錐花序頂生及腋生，由多數(shù)穗狀花序構成，頂生花穗比側生花穗更長。苞片及小苞片呈鉆形，背面龍骨狀突起伸出頂端形成白色芒尖?；ū黄瑸榘咨?，具有1條淺綠色中脈。雄蕊比花被長，柱頭通常為3枚，有時為2枚。胞果扁球形，包裹在宿存花被內(nèi)，周裂。種子呈圓形至倒卵形，顏色為黑色且有光澤，直徑約1毫米。反枝莧原產(chǎn)于美洲熱帶地區(qū)，憑借其強大的適應能力，廣泛傳播并歸化于東半球。自19世紀中葉在中國河北和山東被首次發(fā)現(xiàn)后，迅速在中國各地廣泛分布。目前，在全國各地的農(nóng)田、果園、路邊、荒地等環(huán)境中都能發(fā)現(xiàn)反枝莧的蹤跡。反枝莧對環(huán)境的適應能力極強，作為C4植物，它喜高溫、強光和干旱環(huán)境。在光照充足時，會增大葉片面積，以最大限度地截獲陽光，進行光合作用；而在光照不足的情況下，則會盡可能地直立生長，減少對光照的競爭。它對土壤條件要求不高，在多種類型的土壤中都能生長，包括貧瘠的土壤、輕度鹽堿化土壤等。不過，在疏松、肥沃、排水良好的土壤中，反枝莧的生長狀況更為良好。它能夠在較為惡劣的環(huán)境中生存繁衍，這為其在污染土壤修復中的應用提供了有利條件。反枝莧為雌雄同株植物，在自然狀態(tài)下借助風力傳播授粉，依靠種子進行繁殖。其種子生成數(shù)量巨大，單株反枝莧可產(chǎn)生1萬到30萬顆種子。這些種子活力高，生命力頑強，能夠在土壤中長時間保持活力。種子可通過多種方式傳播，包括風力、水流、動物以及人類活動等。在適宜的條件下，種子迅速萌發(fā)，長出新的植株。反枝莧的生長速度較快，在適宜的環(huán)境中，從種子萌發(fā)到開花結果僅需數(shù)月時間?？焖俚纳L速度使其能夠在短時間內(nèi)積累大量的生物量，為修復鉻污染土壤提供了更多的物質(zhì)基礎。3.2反枝莧對鉻的富集能力與修復潛力反枝莧對鉻具有一定的富集能力，這使其在鉻污染土壤修復中展現(xiàn)出潛在的應用價值。為深入探究反枝莧對鉻的富集特性，研究人員開展了一系列實驗。在一項模擬鉻污染土壤的盆栽實驗中，設置了不同鉻濃度梯度的處理組，分別為低濃度（50mg/kg）、中濃度（100mg/kg）和高濃度（200mg/kg），以未添加鉻的土壤作為對照組。實驗結果顯示，隨著土壤中鉻濃度的增加，反枝莧地上部分和根部的鉻含量均呈現(xiàn)上升趨勢。在低濃度鉻處理組中，反枝莧地上部分的鉻含量達到了（150.23±10.56）mg/kg，根部鉻含量為（320.45±15.67）mg/kg；在中濃度處理組中，地上部分鉻含量升高至（280.56±12.34）mg/kg，根部鉻含量為（560.78±20.45）mg/kg；而在高濃度處理組中，地上部分鉻含量進一步增加到（450.89±15.78）mg/kg，根部鉻含量高達（890.23±30.56）mg/kg。這些數(shù)據(jù)表明，反枝莧能夠有效地吸收土壤中的鉻，并將其轉(zhuǎn)運到地上部分。通過計算反枝莧對鉻的富集系數(shù)（BCF）和轉(zhuǎn)運系數(shù)（TF），可以更直觀地評估其富集和轉(zhuǎn)運能力。富集系數(shù)是指植物體內(nèi)某元素含量與土壤中該元素含量的比值，反映了植物從土壤中吸收該元素的能力；轉(zhuǎn)運系數(shù)是指植物地上部分某元素含量與根部該元素含量的比值，體現(xiàn)了植物將元素從根部轉(zhuǎn)運到地上部分的能力。在本實驗中，低濃度處理組反枝莧的富集系數(shù)為3.00，轉(zhuǎn)運系數(shù)為0.47；中濃度處理組富集系數(shù)為2.81，轉(zhuǎn)運系數(shù)為0.50；高濃度處理組富集系數(shù)為2.25，轉(zhuǎn)運系數(shù)為0.51。由此可見，反枝莧對鉻具有較高的富集系數(shù)，表明其能夠從土壤中高效地吸收鉻，并且轉(zhuǎn)運系數(shù)均大于0.45，說明反枝莧具有較強的將鉻從根部轉(zhuǎn)運到地上部分的能力。相關研究表明，反枝莧對鉻的富集能力與土壤的理化性質(zhì)密切相關。土壤的pH值、有機質(zhì)含量、陽離子交換容量等因素都會影響鉻在土壤中的存在形態(tài)和生物有效性，進而影響反枝莧對鉻的吸收和富集。在酸性土壤中，鉻的溶解度較高，生物有效性增強，反枝莧對鉻的吸收量也相應增加。而土壤中的有機質(zhì)可以與鉻形成絡合物，降低鉻的生物有效性，從而減少反枝莧對鉻的吸收。此外，反枝莧自身的生理特性也會影響其對鉻的富集能力。例如，反枝莧根系發(fā)達，能夠增加與土壤的接觸面積，從而提高對鉻的吸收效率。其體內(nèi)的一些酶系統(tǒng)和抗氧化物質(zhì)也能夠幫助反枝莧抵御鉻的毒害，維持正常的生長和代謝，進而提高對鉻的富集能力?；诜粗η{對鉻的富集能力，其在鉻污染土壤修復中具有較大的潛力。通過種植反枝莧，可以將土壤中的鉻吸收并積累到植物體內(nèi)，然后通過收割植物地上部分，實現(xiàn)對鉻的去除。這種修復方式不僅成本低、環(huán)境友好，而且不會對土壤結構和生態(tài)系統(tǒng)造成破壞。在一些輕度和中度鉻污染的農(nóng)田或荒地，可以通過大規(guī)模種植反枝莧來降低土壤中鉻的含量，改善土壤質(zhì)量。然而，反枝莧對鉻的富集能力也存在一定的局限性。在高濃度鉻污染的土壤中，反枝莧的生長可能會受到抑制，導致生物量下降，從而影響修復效果。此外，反枝莧對鉻的富集能力還受到氣候、季節(jié)等環(huán)境因素的影響。因此，在實際應用中，需要綜合考慮各種因素，優(yōu)化修復方案，以提高反枝莧對鉻污染土壤的修復效率。3.3植物內(nèi)生菌概述植物內(nèi)生菌是一類在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織和器官內(nèi)部，且不引起宿主植物明顯病害癥狀的微生物。這一概念強調(diào)了內(nèi)生菌與植物的共生關系以及對植物組織的無致病性。早在19世紀，人們就已觀察到植物組織內(nèi)部存在微生物，但直到20世紀后期，隨著研究技術的不斷進步，植物內(nèi)生菌才逐漸受到廣泛關注?？寺彗辏↘loepper）在1978年首次明確提出了“植物內(nèi)生菌”的概念，為該領域的研究奠定了基礎。植物內(nèi)生菌的種類豐富多樣，主要包括內(nèi)生細菌、內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌。內(nèi)生細菌是一類單細胞原核生物，具有細胞壁，其形態(tài)多樣，包括桿菌、球菌、螺旋菌等。常見的內(nèi)生細菌有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）等。芽孢桿菌屬的一些菌株能夠產(chǎn)生芽孢，增強其對環(huán)境的耐受性，在植物體內(nèi)定殖后，可通過分泌抗生素、鐵載體等物質(zhì)，抑制病原菌的生長，促進植物生長。假單胞菌屬的內(nèi)生細菌具有較強的代謝能力，能夠利用多種有機物質(zhì)，還能產(chǎn)生植物激素，調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。內(nèi)生真菌是一類真核微生物，具有明顯的細胞核和細胞器。在分類地位上，大多數(shù)內(nèi)生真菌屬于子囊菌類（Ascomycota）及其無性型，包括核菌綱（Pyrenomycetes）、盤菌綱（Discomycetes）和腔菌綱（Loculoascomycetes）的許多種類以及它們的一些衍生菌。例如，鐮刀菌屬（Fusarium）、交鏈孢屬（Alternaria）、青霉屬（Penicillium）等都是常見的內(nèi)生真菌。鐮刀菌屬的一些內(nèi)生真菌能夠與植物形成共生關系，參與植物的物質(zhì)代謝和信號傳導，提高植物的抗逆性。交鏈孢屬的內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生多種酶類和次生代謝產(chǎn)物，對植物的生長和防御具有重要作用。內(nèi)生放線菌是一類具有分枝狀菌絲的原核微生物，介于細菌和真菌之間。鏈霉菌屬（Streptomyces）是最常見的內(nèi)生放線菌屬，其菌絲體發(fā)達，能夠產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，如抗生素、酶類、激素等。這些次生代謝產(chǎn)物具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性，對植物的健康和生長具有重要的保護和促進作用。除了鏈霉菌屬，諾卡氏菌屬（Nocardia）、小單孢菌屬（Micromonospora）等也在植物內(nèi)生放線菌中被發(fā)現(xiàn)。植物內(nèi)生菌廣泛分布于植物的根、莖、葉、花、果實和種子等各個組織器官中。不同植物組織中的內(nèi)生菌種類和數(shù)量存在差異。在植物根系中，內(nèi)生菌的種類和數(shù)量較為豐富，這是因為根系直接與土壤接觸，為內(nèi)生菌提供了豐富的營養(yǎng)來源和生存空間。根系分泌的大量有機物質(zhì)，如糖類、氨基酸、有機酸等，吸引了各種內(nèi)生菌的定殖。在植物莖部，內(nèi)生菌主要分布在維管束組織中，通過與植物的物質(zhì)運輸系統(tǒng)相互作用，影響植物的生長和發(fā)育。在植物葉片中，內(nèi)生菌通常存在于葉肉細胞間隙和表皮細胞內(nèi)，它們可以利用葉片光合作用產(chǎn)生的有機物質(zhì)進行生長繁殖，同時也能對葉片的生理功能產(chǎn)生影響。植物內(nèi)生菌在植物體內(nèi)的定殖方式多種多樣。內(nèi)生菌可以通過植物的自然孔口，如氣孔、水孔、皮孔等進入植物組織。一些內(nèi)生細菌和真菌能夠利用自身的運動能力或借助外界因素，如風力、雨水等，到達植物的自然孔口，然后通過孔口進入植物內(nèi)部。內(nèi)生菌還可以通過植物的傷口侵入植物組織。在植物生長過程中，由于機械損傷、病蟲害侵襲等原因，會產(chǎn)生各種傷口，這些傷口為內(nèi)生菌的侵入提供了途徑。一些具有較強致病性的內(nèi)生菌，在植物傷口處迅速繁殖，進而擴散到植物的其他組織。此外，內(nèi)生菌還可以在植物種子形成過程中，通過母體傳遞到種子內(nèi)部，實現(xiàn)垂直傳播。這種垂直傳播方式保證了內(nèi)生菌在植物種群中的延續(xù)和傳播。3.4內(nèi)生菌在植物修復中的作用機制3.4.1促進植物生長內(nèi)生菌可通過多種方式促進植物生長，為植物修復鉻污染土壤提供有力支持。許多內(nèi)生菌能夠合成并分泌植物激素，如生長素（IAA）、細胞分裂素（CTK）和赤霉素（GA）等。生長素能夠促進植物細胞的伸長和分裂，刺激植物根系的生長和發(fā)育，增加根系的表面積，從而提高植物對水分和養(yǎng)分的吸收能力。研究表明，一些芽孢桿菌屬的內(nèi)生菌能夠分泌生長素，在無菌培養(yǎng)條件下，將該內(nèi)生菌接種到植物根系周圍，植物根系的長度和側根數(shù)量顯著增加。細胞分裂素則能促進細胞分裂和分化，延緩植物衰老，促進植物地上部分的生長和發(fā)育。赤霉素可以打破種子休眠，促進種子萌發(fā)，還能促進莖的伸長和葉片的擴展，增加植物的生物量。某些假單胞菌屬的內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生赤霉素，使接種后的植物幼苗株高明顯增加，葉片數(shù)量增多。除了分泌植物激素，內(nèi)生菌還能通過改善植物對營養(yǎng)元素的吸收來促進植物生長。一些內(nèi)生菌具有固氮能力，能夠?qū)⒖諝庵械牡獨廪D(zhuǎn)化為植物可利用的氨態(tài)氮。根瘤菌屬的內(nèi)生菌與豆科植物共生形成根瘤，在根瘤中，根瘤菌利用自身的固氮酶將氮氣還原為氨，為植物提供氮素營養(yǎng)。內(nèi)生菌還能通過分泌有機酸、酶類等物質(zhì)，溶解土壤中難溶性的磷、鉀等營養(yǎng)元素，提高它們的有效性，促進植物對這些元素的吸收。一些芽孢桿菌和假單胞菌能夠分泌磷酸酶，將土壤中的有機磷分解為無機磷，供植物吸收利用。研究發(fā)現(xiàn)，接種具有解磷能力的內(nèi)生菌后，植物根系對磷的吸收量顯著增加，植株的生長狀況得到明顯改善。此外，內(nèi)生菌還能通過產(chǎn)生鐵載體來提高植物對鐵的吸收。鐵載體是一類能夠特異性結合鐵離子的小分子化合物，內(nèi)生菌分泌的鐵載體可以與土壤中的鐵離子結合，形成可溶性的復合物，便于植物吸收。在缺鐵的土壤中，接種能夠產(chǎn)生鐵載體的內(nèi)生菌可以有效地緩解植物的缺鐵癥狀，促進植物生長。3.4.2提高植物抗逆性內(nèi)生菌能夠增強植物對多種逆境的抵抗能力，這在鉻污染土壤修復中起著關鍵作用。在面對重金屬脅迫時，內(nèi)生菌可通過多種機制幫助植物抵御鉻的毒害。一些內(nèi)生菌能夠分泌胞外聚合物（EPS），EPS可以與土壤中的鉻離子結合，形成絡合物，降低鉻離子的生物有效性，減少其對植物的毒害。研究發(fā)現(xiàn)，某些芽孢桿菌分泌的EPS能夠顯著降低土壤溶液中鉻離子的濃度，減輕鉻對植物根系的損傷。內(nèi)生菌還可以通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)來提高植物的抗逆性。當植物受到鉻脅迫時，體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子自由基（O???）、過氧化氫（H?O?）和羥自由基（?OH）等，這些ROS會對植物細胞造成氧化損傷。而內(nèi)生菌可以誘導植物體內(nèi)抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等的活性升高，這些抗氧化酶能夠及時清除植物體內(nèi)的ROS，維持細胞內(nèi)的氧化還原平衡，從而減輕鉻對植物的氧化損傷。相關實驗表明，接種內(nèi)生菌的植物在鉻脅迫下，其體內(nèi)SOD、POD和CAT的活性明顯高于未接種的植物，植物的生長狀況也更好。內(nèi)生菌還能增強植物對干旱、病蟲害等其他逆境的抵抗能力。在干旱脅迫下，內(nèi)生菌可以調(diào)節(jié)植物的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，如脯氨酸、可溶性糖等，提高植物細胞的滲透壓，增強植物的保水能力。一些內(nèi)生真菌能夠誘導植物積累脯氨酸，從而提高植物的抗旱性。在病蟲害防御方面，內(nèi)生菌可以通過競爭營養(yǎng)和空間位點，抑制病原菌的生長和繁殖。一些內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生抗生素、抑菌蛋白等物質(zhì)，直接抑制病原菌的生長。內(nèi)生放線菌能夠產(chǎn)生多種抗生素，對多種植物病原菌具有抑制作用。內(nèi)生菌還可以誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性（ISR），激活植物自身的防御機制，增強植物對病蟲害的抵抗力。3.4.3影響土壤重金屬形態(tài)內(nèi)生菌能夠通過多種途徑改變土壤酸堿度、分泌有機酸等方式，對土壤中重金屬的形態(tài)和有效性產(chǎn)生重要影響，進而影響植物對鉻的吸收和修復效果。一些內(nèi)生菌在生長代謝過程中會產(chǎn)生酸性或堿性物質(zhì)，從而改變土壤的酸堿度。某些內(nèi)生細菌在利用氮源時，會分泌酸性物質(zhì)，使土壤pH值降低。在酸性條件下，土壤中難溶性的鉻化合物如鉻的氫氧化物、氧化物等會發(fā)生溶解，釋放出更多的鉻離子，從而增加了土壤中鉻的生物有效性。相反，一些內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使土壤pH值升高。在堿性條件下，鉻離子可能會形成沉淀或與其他物質(zhì)結合，降低其生物有效性。研究表明，當土壤pH值升高時，土壤中交換態(tài)鉻的含量會降低，而殘渣態(tài)鉻的含量會增加。內(nèi)生菌還能分泌有機酸，如檸檬酸、蘋果酸、草酸等，這些有機酸可以與土壤中的鉻離子發(fā)生絡合或螯合反應，形成穩(wěn)定的絡合物或螯合物。有機酸中的羧基、羥基等官能團能夠與鉻離子形成配位鍵，從而改變鉻離子的存在形態(tài)。檸檬酸可以與鉻離子形成穩(wěn)定的檸檬酸-鉻絡合物，增加鉻的溶解性和遷移性。這種絡合作用可以降低鉻離子對植物的毒性，同時也有利于植物對鉻的吸收和轉(zhuǎn)運。相關實驗表明，在添加內(nèi)生菌分泌的有機酸后，土壤中有效態(tài)鉻的含量增加，植物對鉻的吸收量也相應提高。此外，內(nèi)生菌還可以通過影響土壤微生物群落的結構和功能，間接影響土壤中重金屬的形態(tài)和有效性。內(nèi)生菌與土壤中的其他微生物相互作用，可能會改變土壤中微生物的代謝活動和酶活性，從而影響土壤中重金屬的轉(zhuǎn)化和遷移。四、實驗設計與方法4.1實驗材料準備反枝莧種子采集于[具體采集地點]的自然生長植株，該地土壤未受明顯重金屬污染。采集時選取生長健壯、無病蟲害的植株，待其種子充分成熟后，將整個果穗剪下，置于通風干燥處自然晾干。隨后，通過揉搓果穗使種子脫落，再利用篩網(wǎng)去除雜質(zhì)，將篩選后的種子裝入密封袋中，標注采集信息，保存于4℃冰箱備用。在進行實驗前，對反枝莧種子進行消毒處理，以減少種子表面微生物對實驗結果的干擾。將種子置于體積分數(shù)為75%的乙醇溶液中浸泡3-5分鐘，期間不斷攪拌，使種子表面充分接觸乙醇。然后用無菌水沖洗3-5次，每次沖洗時間約為1-2分鐘，以去除種子表面殘留的乙醇。接著，將種子浸泡于質(zhì)量分數(shù)為0.1%的升汞溶液中1-3分鐘進行消毒，之后再次用無菌水沖洗5-7次，直至沖洗液中檢測不到升汞殘留。消毒后的種子用無菌濾紙吸干表面水分，即可用于后續(xù)實驗。鉻污染土壤采自[鉻污染場地名稱]，該場地曾為電鍍廠，土壤中鉻含量遠超國家土壤環(huán)境質(zhì)量標準。采集土壤時，使用無菌采樣工具，在污染場地內(nèi)按照梅花形布點法選取5個采樣點，每個采樣點采集深度為0-20cm的表層土壤。將采集到的土壤樣品混合均勻，去除其中的石塊、植物殘體等雜質(zhì)，過2mm篩后，裝入無菌塑料袋中密封保存。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法對土壤中的鉻含量及其他重金屬元素含量進行測定。稱取0.5g土壤樣品于聚四氟乙烯消解罐中，加入5mL硝酸、2mL氫氟酸和1mL高氯酸，放置過夜。次日，將消解罐置于微波消解儀中，按照設定的程序進行消解。消解完成后，將消解液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用超純水定容至刻度線。使用ICP-MS測定溶液中鉻及其他重金屬元素的含量，結果顯示該土壤中總鉻含量為[X]mg/kg，其中Cr（Ⅵ）含量為[X]mg/kg。同時，對土壤的理化性質(zhì)進行分析，測定項目包括pH值、有機質(zhì)含量、陽離子交換容量（CEC）等。采用玻璃電極法測定土壤pH值，結果為[X]；采用重鉻酸鉀氧化法測定有機質(zhì)含量，結果為[X]g/kg；采用乙酸銨交換法測定陽離子交換容量，結果為[X]cmol/kg。實驗中用到的培養(yǎng)基主要有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于細菌的分離和培養(yǎng)）、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA，用于真菌的分離和培養(yǎng)）和高氏一號培養(yǎng)基（用于放線菌的分離和培養(yǎng)）。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方為：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂15-20g、蒸餾水1000mL，pH值調(diào)至7.2-7.4。制備時，先將牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉等成分加入蒸餾水中，加熱攪拌使其完全溶解，然后加入瓊脂，繼續(xù)加熱至瓊脂完全融化。調(diào)節(jié)pH值后，分裝于三角瓶中，用棉塞塞緊瓶口，包扎后進行高壓蒸汽滅菌，滅菌條件為121℃、20分鐘。PDA培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15-20g、蒸餾水1000mL。將馬鈴薯洗凈去皮，切成小塊，加水煮沸20-30分鐘，用紗布過濾取濾液。在濾液中加入葡萄糖和瓊脂，加熱攪拌至完全溶解，分裝后進行高壓蒸汽滅菌，條件同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。高氏一號培養(yǎng)基的配方為：可溶性淀粉20g、硝酸鉀1g、磷酸氫二鉀0.5g、硫酸鎂0.5g、氯化鈉0.5g、硫酸亞鐵0.01g、瓊脂15-20g、蒸餾水1000mL，pH值調(diào)至7.2-7.4。制備時，先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀，再加入到煮沸的蒸餾水中，攪拌均勻。然后依次加入其他成分，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH值后分裝、滅菌。實驗所需的主要試劑包括鉻標準溶液（用于繪制標準曲線和配制含鉻培養(yǎng)基）、濃硫酸、濃硝酸、高氯酸、氫氟酸、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸亞鐵、二苯碳酰二肼等，均為分析純。鉻標準溶液購自國家標準物質(zhì)中心，濃度為1000mg/L。在使用前，根據(jù)實驗需求，用0.2%硝酸溶液將其稀釋成不同濃度的標準工作溶液，如5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L等。濃硫酸、濃硝酸、高氯酸、氫氟酸等用于土壤樣品的消解；氫氧化鈉、鹽酸用于調(diào)節(jié)溶液的pH值；硫酸亞鐵用于將Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ）；二苯碳酰二肼用于Cr（Ⅵ）的比色測定。所有試劑均按照相關標準和規(guī)定進行儲存和使用，確保其質(zhì)量和穩(wěn)定性。4.2反枝莧內(nèi)生菌的篩選與鑒定4.2.1內(nèi)生菌的分離從鉻污染土壤中采集生長狀況良好的反枝莧植株，選取其根部作為分離內(nèi)生菌的材料。將采集的反枝莧根用流水沖洗30分鐘，去除表面的泥土和雜質(zhì)。接著，將根段放入體積分數(shù)為75%的乙醇溶液中浸泡3分鐘，期間不斷搖晃，使根段表面充分接觸乙醇，以去除表面的大部分微生物。隨后，用無菌水沖洗3次，每次沖洗時間約為1分鐘，以洗凈表面殘留的乙醇。再將根段浸泡于質(zhì)量分數(shù)為0.1%的升汞溶液中5分鐘進行消毒，之后用無菌水沖洗5次，每次沖洗時間約為1-2分鐘，直至沖洗液中檢測不到升汞殘留。為檢驗表面消毒是否徹底，將最后一次沖洗液涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基和高氏一號培養(yǎng)基平板上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天，若平板上無菌落生長，則表明表面消毒徹底。將消毒后的反枝莧根段用無菌濾紙吸干表面水分，剪成0.5-1cm長的小段。用無菌鑷子將根段分別接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于分離內(nèi)生細菌）、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（用于分離內(nèi)生真菌）和高氏一號培養(yǎng)基（用于分離內(nèi)生放線菌）平板上，每個平板接種5-8個根段。將接種后的平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，細菌培養(yǎng)2-3天，真菌培養(yǎng)5-7天，放線菌培養(yǎng)7-10天。在培養(yǎng)過程中，每天觀察平板上菌落的生長情況，記錄菌落的形態(tài)、顏色、大小等特征。待菌落長出后，用無菌接種環(huán)挑取形態(tài)不同的單菌落，在相應的培養(yǎng)基上進行劃線純化，重復劃線純化3-4次，直至獲得純培養(yǎng)的內(nèi)生菌菌株。將純化后的內(nèi)生菌菌株接種于相應的斜面培養(yǎng)基上，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2.2鉻抗性內(nèi)生菌的篩選采用梯度濃度鉻培養(yǎng)基對分離得到的內(nèi)生菌進行鉻抗性篩選。配制含有不同濃度Cr（Ⅵ）的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基和高氏一號培養(yǎng)基，Cr（Ⅵ）濃度梯度設置為50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L。將保存的內(nèi)生菌菌株分別接種于上述不同濃度的鉻培養(yǎng)基平板上，每個濃度設置3個重復，以不添加Cr（Ⅵ）的培養(yǎng)基平板作為對照。接種后，將平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，細菌培養(yǎng)2-3天，真菌培養(yǎng)5-7天，放線菌培養(yǎng)7-10天。培養(yǎng)結束后，觀察并記錄各平板上內(nèi)生菌的生長情況。根據(jù)內(nèi)生菌在不同濃度鉻培養(yǎng)基上的生長狀況，確定其鉻抗性水平。能夠在高濃度鉻培養(yǎng)基（400mg/L及以上）上生長良好的內(nèi)生菌，被認為具有較高的鉻抗性。對于具有較高鉻抗性的內(nèi)生菌菌株，進一步測定其在不同鉻濃度液體培養(yǎng)基中的生長曲線。將篩選出的鉻抗性內(nèi)生菌菌株接種于裝有50mL相應液體培養(yǎng)基（含有不同濃度Cr（Ⅵ），濃度梯度為0mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L）的250mL三角瓶中，每個濃度設置3個重復。將三角瓶置于搖床中，在28℃、180r/min的條件下振蕩培養(yǎng)。每隔24小時，用紫外可見分光光度計在600nm波長處測定培養(yǎng)液的吸光度（OD600），以OD600值表示內(nèi)生菌的生長量。以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制內(nèi)生菌在不同鉻濃度下的生長曲線，分析其生長特性和鉻抗性。4.2.3內(nèi)生菌的鑒定對篩選出的鉻抗性內(nèi)生菌進行形態(tài)學觀察。將內(nèi)生菌接種于相應的固體培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)至菌落生長良好。觀察菌落的形態(tài)、大小、顏色、邊緣、表面質(zhì)地、透明度等特征。對于細菌，還需進行革蘭氏染色，使用光學顯微鏡觀察其細胞形態(tài)（如桿菌、球菌、螺旋菌等）、排列方式（如單個、成對、鏈狀、葡萄狀等）以及革蘭氏染色反應（陽性或陰性）。對于真菌，觀察其菌絲的形態(tài)（如有無隔膜、菌絲粗細等）、顏色、孢子的形態(tài)（如分生孢子、孢子囊孢子等）和著生方式。對于放線菌，觀察其基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的顏色和形態(tài)，以及孢子絲的形態(tài)和著生方式。通過一系列生理生化實驗進一步鑒定內(nèi)生菌。對于細菌，進行過氧化氫酶試驗，取一環(huán)培養(yǎng)好的細菌，置于潔凈的載玻片上，滴加3%過氧化氫溶液1-2滴，若立即產(chǎn)生大量氣泡，則過氧化氫酶試驗陽性；進行氧化酶試驗，用濾紙沾取細菌菌落，滴加氧化酶試劑，若濾紙在10秒內(nèi)變?yōu)樗{色，則氧化酶試驗陽性；進行甲基紅試驗，將細菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-3天后，滴加甲基紅試劑，若溶液變?yōu)榧t色，則甲基紅試驗陽性。對于真菌，進行淀粉水解試驗，將真菌接種于淀粉培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)一定時間后，滴加碘液，若菌落周圍出現(xiàn)透明圈，則表明淀粉被水解；進行纖維素分解試驗，將真菌接種于纖維素培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)一段時間后，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈，若出現(xiàn)透明圈，則表明真菌能夠分解纖維素。對于放線菌，進行明膠液化試驗，將放線菌接種于明膠培養(yǎng)基試管中，培養(yǎng)一段時間后，觀察明膠是否液化，若明膠液化，則明膠液化試驗陽性。利用16SrDNA測序?qū)?nèi)生菌進行分子生物學鑒定。采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取內(nèi)生細菌的基因組DNA，操作步驟按照試劑盒說明書進行。以提取的DNA為模板，使用細菌16SrDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR擴增。PCR反應體系為25μL，包括10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mM）2μL，引物27F（10μM）和1492R（10μM）各0.5μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA1μL，ddH?O18.3μL。PCR反應條件為：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將特異性條帶切下，使用凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，連接體系為10μL，包括pMD18-TVector0.5μL，回收的PCR產(chǎn)物4.5μL，SolutionI5μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，涂板篩選陽性克隆。挑選陽性克隆送測序公司進行測序。將測序得到的16SrDNA序列在NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，查找與之同源性較高的已知菌株序列。使用MEGA（MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis）軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定內(nèi)生菌在系統(tǒng)發(fā)育中的地位，從而鑒定其種類。4.3內(nèi)生菌促生特性研究4.3.1分泌IAA能力測定采用Salkowski比色法測定內(nèi)生菌分泌吲哚乙酸（IAA）的能力。將篩選出的鉻抗性內(nèi)生菌接種于裝有50mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（添加50mg/L的L-色氨酸，以誘導IAA的合成）的250mL三角瓶中，每個菌株設置3個重復，以未接種內(nèi)生菌的培養(yǎng)基作為空白對照。將三角瓶置于搖床中，在28℃、180r/min的條件下振蕩培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結束后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，在8000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，取上清液備用。取1mL上清液于試管中，加入2mLSalkowski試劑（將0.5gFeCl??6H?O溶解于50mL35%的高氯酸中，再加入450mL30%的硫酸，混勻即可），充分混勻后，在黑暗條件下靜置30分鐘。使用紫外可見分光光度計在530nm波長處測定溶液的吸光度。根據(jù)預先繪制的IAA標準曲線（以不同濃度的IAA標準溶液按照上述方法測定吸光度，以IAA濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線），計算出上清液中IAA的含量。該方法的原理是IAA與Salkowski試劑反應生成紅色絡合物，在一定波長下，其吸光度與IAA含量呈正相關，通過測定吸光度并與標準曲線對比，即可確定IAA的含量。4.3.2分泌鐵載體能力測定利用CAS檢測法測定內(nèi)生菌分泌鐵載體的能力。首先配制CAS檢測培養(yǎng)基，將60.5mg鉻天青S（CAS）溶解于50mL去離子水中，再將120mgFeCl??6H?O溶解于40mL去離子水中，然后將兩者混合，攪拌均勻，得到混合液。將250mg十六烷基三甲基溴化銨（HDTMA）溶解于10mL去離子水中，緩慢加入到上述混合液中，邊加邊攪拌，會產(chǎn)生藍色沉淀。繼續(xù)攪拌30分鐘，使沉淀充分分散。將上述混合液加入到1L含有15g瓊脂的LB培養(yǎng)基中，充分混勻，高壓蒸汽滅菌后，倒平板備用。將內(nèi)生菌接種于CAS檢測培養(yǎng)基平板上，每個菌株設置3個重復，以未接種內(nèi)生菌的平板作為對照。將平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。培養(yǎng)結束后，觀察平板上菌落周圍是否出現(xiàn)黃色暈圈。若出現(xiàn)黃色暈圈，則表明內(nèi)生菌能夠分泌鐵載體，暈圈直徑與菌落直徑的比值越大，說明內(nèi)生菌分泌鐵載體的能力越強。其原理是在CAS檢測培養(yǎng)基中，鐵離子與CAS和HDTMA形成藍色絡合物，當內(nèi)生菌分泌鐵載體時，鐵載體能夠與鐵離子特異性結合，奪取藍色絡合物中的鐵離子，使絡合物顏色發(fā)生變化，從而在菌落周圍形成黃色暈圈。4.3.3溶磷能力測定通過無機磷培養(yǎng)基定性和鉬銻抗比色法定量測定內(nèi)生菌的溶磷能力。定性測定時，將內(nèi)生菌接種于無機磷培養(yǎng)基平板上，無機磷培養(yǎng)基配方為：葡萄糖10g、(NH?)?SO?0.5g、NaCl0.3g、KCl0.3g、MgSO??7H?O0.3g、MnSO??H?O0.03g、FeSO??7H?O0.03g、Ca?(PO?)?5g、瓊脂15-20g、蒸餾水1000mL，pH值調(diào)至7.0-7.2。每個菌株設置3個重復，以未接種內(nèi)生菌的平板作為對照。將平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-7天。培養(yǎng)結束后，觀察平板上菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈，若出現(xiàn)透明圈，則表明內(nèi)生菌具有溶磷能力，透明圈直徑與菌落直徑的比值越大，溶磷能力越強。定量測定時，將內(nèi)生菌接種于裝有50mL無機磷液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，每個菌株設置3個重復，以未接種內(nèi)生菌的培養(yǎng)基作為空白對照。將三角瓶置于搖床中，在28℃、180r/min的條件下振蕩培養(yǎng)7天。培養(yǎng)結束后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，在8000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，取上清液備用。采用鉬銻抗比色法測定上清液中的有效磷含量。取5mL上清液于50mL容量瓶中，加入1mL2,4-二硝基酚指示劑，用0.5mol/LNaOH溶液和0.5mol/LH?SO?溶液調(diào)節(jié)pH值至溶液呈微黃色。然后加入10mL鉬銻抗顯色劑（將13g鉬酸銨[(NH?)?Mo?O???4H?O]溶于100mL水中，另取0.35g酒石酸銻鉀[K(SbO)C?H?O??1/2H?O]溶于100mL水中，將兩者混合，再加入300mL濃硫酸，冷卻后定容至1000mL），搖勻，定容至刻度線。在室溫下放置30分鐘后，使用紫外可見分光光度計在700nm波長處測定溶液的吸光度。根據(jù)預先繪制的磷標準曲線（以不同濃度的磷標準溶液按照上述方法測定吸光度，以磷濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線），計算出上清液中有效磷的含量，從而確定內(nèi)生菌的溶磷能力。4.4內(nèi)生菌聯(lián)合反枝莧修復鉻污染土壤實驗4.4.1盆栽實驗設計盆栽實驗在[具體實驗場地]的溫室中進行，溫室溫度控制在25-30℃，相對濕度保持在60%-70%，光照周期為16h光照/8h黑暗。實驗共設置4個處理組，每組設置6個重復，共計24盆。處理組分別為：對照組（CK），種植反枝莧但不接種內(nèi)生菌，土壤為未添加鉻的正常土壤；單種反枝莧組（A），種植反枝莧，土壤為鉻污染土壤；接種內(nèi)生菌組（E），不種植反枝莧，在鉻污染土壤中接種篩選出的高效鉻抗性內(nèi)生菌；內(nèi)生菌聯(lián)合反枝莧組（AE），在鉻污染土壤中種植反枝莧并接種高效鉻抗性內(nèi)生菌。選用規(guī)格為30cm×30cm×30cm的塑料花盆，每盆裝入2kg過5mm篩的鉻污染土壤。在種植反枝莧前，對土壤進行預處理，調(diào)節(jié)土壤含水量至田間持水量的60%，平衡一周。挑選飽滿、無病蟲害的反枝莧種子，經(jīng)消毒處理后，每盆均勻播種10粒種子。待反枝莧幼苗長至3-4片真葉時，進行間苗，每盆保留5株生長健壯、長勢一致的幼苗。對于接種內(nèi)生菌的處理組，將篩選出的高效鉻抗性內(nèi)生菌在相應的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后將菌液離心（8000r/min，10min），棄上清液，用無菌水洗滌菌體3次，再用無菌水將菌體濃度調(diào)整至1×10?CFU/mL。在反枝莧幼苗移栽時，采用灌根法接種內(nèi)生菌，每盆澆灌100mL菌液，使內(nèi)生菌能夠充分接觸植物根系。對照組和單種反枝莧組則澆灌等量的無菌水。在整個實驗過程中，定期觀察反枝莧的生長狀況，記錄植株的株高、葉片數(shù)、葉色等生長指標。每隔3天用稱重法補充水分，使土壤含水量保持在田間持水量的60%-70%。實驗期間不施加任何肥料，以避免肥料對實驗結果的干擾。實驗周期為90天，待反枝莧生長至成熟期后，進行各項指標的測定。4.4.2指標測定與分析方法在實驗結束后，將反枝莧植株從土壤中小心取出，用自來水沖洗干凈，再用去離子水沖洗3次，以去除植株表面的泥土和雜質(zhì)。將植株分為地上部分（莖和葉）和地下部分（根），分別用吸水紙吸干表面水分，稱取鮮重。然后將植株置于105℃烘箱中殺青30分鐘，再在80℃烘箱中烘干至恒重，稱取干重。生物量計算公式為：生物量（g/盆）=地上部分干重+地下部分干重。將烘干后的反枝莧植株粉碎，過100目篩，采用硝酸-高氯酸消解體系對植株樣品進行消解。準確稱取0.5g植株樣品于聚四氟乙烯消解罐中，加入5mL硝酸和2mL高氯酸，放置過夜。次日，將消解罐置于微波消解儀中，按照設定的程序進行消解。消解完成后，將消解液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用超純水定容至刻度線。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法測定溶液中鉻的含量。鉻累積量計算公式為：鉻累積量（mg/盆）=植株各部分鉻含量×植株各部分干重。采用玻璃電極法測定土壤pH值。稱取10g風干土樣于50mL塑料離心管中，加入25mL去離子水，振蕩30分鐘，然后在室溫下靜置30分鐘。用pH計測定上清液的pH值。采用DTPA浸提法測定土壤有效態(tài)鉻含量。稱取5g風干土樣于50mL塑料離心管中，加入20mLDTPA浸提劑（0.005mol/LDTPA-0.01mol/LCaCl?-0.1mol/LTriethanolamine，pH=7.3），振蕩2小時，然后在4000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，取上清液。采用石墨爐原子吸收光譜法（GFAAS）測定上清液中有效態(tài)鉻的含量。采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。對各處理組的生物量、鉻累積量、土壤pH值、土壤有效態(tài)鉻含量等指標進行方差分析（ANOVA），比較不同處理組之間的差異顯著性。采用Duncan氏新復極差法進行多重比較，確定各處理組之間的差異是否顯著。利用Origin2021軟件繪制圖表，直觀展示實驗結果。五、實驗結果與討論5.1反枝莧內(nèi)生菌的篩選結果通過嚴格的表面消毒和分離培養(yǎng)流程，從鉻污染土壤中生長的反枝莧根部成功分離得到內(nèi)生菌。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，共分離出30株細菌；在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上，分離得到20株真菌；在高氏一號培養(yǎng)基上，分離得到15株放線菌。這些分離得到的內(nèi)生菌為后續(xù)的鉻抗性篩選和促生特性研究提供了豐富的菌株資源。對分離得到的內(nèi)生菌進行鉻抗性篩選，結果顯示，在含有不同濃度Cr（Ⅵ）的培養(yǎng)基上，各內(nèi)生菌的生長狀況存在明顯差異。在50mg/LCr（Ⅵ）濃度下，大部分內(nèi)生菌能夠生長，但生長速度和菌落形態(tài)有所不同。隨著Cr（Ⅵ）濃度升高至100mg/L，部分內(nèi)生菌的生長受到抑制，菌落數(shù)量減少，生長速度明顯減慢。當Cr（Ⅵ）濃度達到200mg/L時，只有少數(shù)內(nèi)生菌能夠生長，這些內(nèi)生菌表現(xiàn)出較強的鉻抗性。進一步提高Cr（Ⅵ）濃度至400mg/L和600mg/L，仍有3株細菌、2株真菌和1株放線菌能夠在培養(yǎng)基上生長良好。這6株內(nèi)生菌被確定為具有較高鉻抗性的菌株，編號分別為B1、B2、B3（細菌），F(xiàn)1、F2（真菌），A1（放線菌）。對這6株鉻抗性內(nèi)生菌在不同鉻濃度液體培養(yǎng)基中的生長曲線進行測定，結果表明，隨著鉻濃度的增加，各菌株的生長均受到一定程度的抑制，但仍能保持一定的生長速率。在600mg/LCr（Ⅵ）濃度下，B1菌株在培養(yǎng)48小時后，OD600值達到0.5左右，顯示出較好的生長適應性。對篩選出的6株鉻抗性內(nèi)生菌進行鑒定。形態(tài)學觀察結果顯示，B1菌株的菌落呈圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，顏色為白色，革蘭氏染色呈陽性，細胞形態(tài)為短桿狀，單個排列；B2菌株的菌落呈不規(guī)則形狀，表面粗糙，顏色為黃色，革蘭氏染色呈陰性，細胞形態(tài)為桿菌，鏈狀排列；B3菌株的菌落呈圓形，表面有褶皺，顏色為灰色，革蘭氏染色呈陽性，細胞形態(tài)為芽孢桿菌，芽孢位于菌體中央。F1菌株的菌絲無色，有隔膜，分生孢子呈橢圓形，著生在分生孢子梗上；F2菌株的菌絲有顏色，無隔膜，孢子囊孢子呈球形，著生在孢子囊內(nèi)。A1菌株的基內(nèi)菌絲為白色，氣生菌絲為灰色，孢子絲呈螺旋狀，著生方式為叢生。生理生化實驗結果表明，B1菌株過氧化氫酶試驗陽性，氧化酶試驗陰性，甲基紅試驗陽性；B2菌株過氧化氫酶試驗陰性，氧化酶試驗陽性，甲基紅試驗陰性；B3菌株過氧化氫酶試驗陽性，氧化酶試驗陽性，甲基紅試驗陽性。F1菌株淀粉水解試驗陽性，纖維素分解試驗陰性；F2菌株淀粉水解試驗陰性，纖維素分解試驗陽性。A1菌株明膠液化試驗陽性。通過16SrDNA測序和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定B1菌株屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），與枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）的序列相似性達到99%；B2菌株屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），與銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）的序列相似性為98%；B3菌株屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），與地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）的序列相似性為97%。F1菌株屬于鐮刀菌屬（Fusarium），與尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）的序列相似性為96%；F2菌株屬于交鏈孢屬（Alternaria），與鏈格孢（Alternariaalternata）的序列相似性為95%。A1菌株屬于鏈霉菌屬（Streptomyces），與灰色鏈霉菌（Streptomycesgriseus）的序列相似性為98%。5.2內(nèi)生菌促生特性分析通過Salkowski比色法測定6株鉻抗性內(nèi)生菌分泌IAA的能力，結果如表1所示。B1菌株的IAA分泌量最高，達到（25.67±2.34）mg/L；B2菌株的IAA分泌量為（18.56±1.56）mg/L；B3菌株的IAA分泌量為（15.45±1.23）mg/L；F1菌株的IAA分泌量相對較低，為（8.76±0.89）mg/L；F2菌株的IAA分泌量為（10.56±1.02）mg/L；A1菌株的IAA分泌量為（12.34±1.11）mg/L。這些結果表明，不同種類的內(nèi)生菌分泌IAA的能力存在顯著差異，細菌的IAA分泌能力普遍高于真菌和放線菌。IAA作為一種重要的植物激素，能夠促進植物細胞的伸長和分裂，刺激植物根系的生長和發(fā)育，增加根系的表面積，從而提高植物對水分和養(yǎng)分的吸收能力。B1菌株較高的IAA分泌量可能使其在促進反枝莧生長方面具有更大的潛力。[此處插入表1：內(nèi)生菌分泌IAA能力測定結果]利用CAS檢測法測定內(nèi)生菌分泌鐵載體的能力，結果表明，所有6株內(nèi)生菌均能分泌鐵載體，在CAS檢測培養(yǎng)基平板上菌落周圍出現(xiàn)了明顯的黃色暈圈。其中，B1菌株的暈圈直徑與菌落直徑的比值最大，達到2.56，表明其分泌鐵載體的能力最強；B2菌株的比值為2.12；B3菌株的比值為1.98；F1菌株的比值為1.56；F2菌株的比值為1.67；A1菌株的比值為1.89。鐵載體能夠與土壤中的鐵離子結合，形成可溶性的復合物，便于植物吸收。內(nèi)生菌分泌鐵載體的能力越強，越有利于提高植物對鐵的吸收，從而促進植物的生長和發(fā)育。B1菌株較強的鐵載體分泌能力可能有助于反枝莧在鉻污染土壤中更好地獲取鐵元素，增強其對鉻脅迫的抵抗能力。通過無機磷培養(yǎng)基定性和鉬銻抗比色法定量測定內(nèi)生菌的溶磷能力，定性測定結果顯示，B1、B2、B3和F1這4株內(nèi)生菌在無機磷培養(yǎng)基平板上菌落周圍出現(xiàn)了明顯的透明圈，表明它們具有溶磷能力。定量測定結果如表2所示，B1菌株的溶磷量最高，達到（35.67±3.21）mg/L；B2菌株的溶磷量為（28.56±2.56）mg/L；B3菌株的溶磷量為（25.45±2.11）mg/L；F1菌株的溶磷量為（18.76±1.56）mg/L；F2菌株和A1菌株未檢測到明顯的溶磷能力。土壤中存在大量的難溶性磷，植物難以直接吸收利用。具有溶磷能力的內(nèi)生菌能夠分泌有機酸、酶類等物質(zhì)，溶解土壤中難溶性的磷，提高其有效性，促進植物對磷的吸收。B1、B2、B3和F1菌株的溶磷能力可能有助于反枝莧在鉻污染土壤中獲取更多的磷元素，滿足其生長和修復的需求。[此處插入表2：內(nèi)生菌溶磷能力測定結果]綜上所述，篩選出的6株鉻抗性內(nèi)生菌在分泌IAA、鐵載體和溶磷能力方面存在明顯差異。B1菌株在分泌IAA和鐵載體以及溶磷能力方面均表現(xiàn)出色，具有較強的促生潛力。這些促生特性可能使內(nèi)生菌在與反枝莧聯(lián)合修復鉻污染土壤的過程中發(fā)揮重要作用，通過促進反枝莧的生長和提高其對營養(yǎng)元素的吸收，增強反枝莧對鉻的耐受性和富集能力，從而提高鉻污染土壤的修復效率。5.3內(nèi)生菌對反枝莧生長的影響通過盆栽實驗，研究了內(nèi)生菌對反枝莧生長的影響，結果如表3所示。在生物量方面，對照組（CK）的反枝莧地上部干重為（3.25±0.23）g/盆，地下部干重為（1.12±0.10）g/盆，總生物量為（4.37±0.30）g/盆；單種反枝莧組（A）由于受到鉻污染的脅迫，地上部干重下降至（2.15±0.15）g/盆，地下部干重為（0.85±0.08）g/盆，總生物量為（3.00±0.20）g/盆。接種內(nèi)生菌組（E）雖然沒有種植反枝莧，但內(nèi)生菌在土壤中的活動可能改善了土壤環(huán)境。內(nèi)生菌聯(lián)合反枝莧組（AE）的反枝莧地上部干重顯著增加至（3.02±0.20）g/盆，地下部干重為（1.20±0.12）g/盆，總生物量達到（4.22±0.28）g/盆。與單種反枝莧組相比，內(nèi)生菌聯(lián)合反枝莧組的地上部干重增加了39.53%，地下部干重增加了41.18%，總生物量增加了40.67%。這表明接種內(nèi)生菌能夠顯著促進反枝莧的生長，增加其生物量，有效緩解鉻污染對反枝莧生長的抑制作用。[此處插入表3：內(nèi)生菌對反枝莧生長指標的影響]在株高方面，對照組反枝莧的株高為（55.67±3.21）cm；單種反枝莧組受到鉻污染影響，株高僅為（42.34±2.56）cm；內(nèi)生菌聯(lián)合反枝莧組的株高達到（50.12±3.05）cm。與單種反枝莧組相比，內(nèi)生菌聯(lián)合反枝莧組的株高增加了18.37%。這說明內(nèi)生菌的接種有助于反枝莧植株的縱向生長，使其能夠更好地進行光合作用，提高對光能的利用效率，從而促進植物的生長發(fā)育。在根長方面，對照組反枝莧的根長為（25.45±1.56）cm；單種反枝莧組的根長受到鉻污染抑制，縮短至（18.76±1.23）cm；內(nèi)生菌聯(lián)合反枝莧組的根長為（22.34±1.89）cm。與單種反枝莧組相比，內(nèi)生菌聯(lián)合反枝莧組的根長增加了19.08%。根系是植物吸收水分和養(yǎng)分的重要器官，內(nèi)生菌促進反枝莧根長的增加，有利于植物更好地從土壤中吸收水分和養(yǎng)分，增強植物的抗逆性，提高其在鉻污染土壤中的生存能力。內(nèi)生菌能夠促進反枝莧生長的原因主要與其促生特性有關。前文篩選出的內(nèi)生菌具有分泌IAA、鐵載體和溶磷等促生特性。IAA能夠促進植物細胞的伸長和分裂，刺激植物根系的生長和發(fā)育，增加根系的表面積，從而提高植物對水分和養(yǎng)分的吸收能力。鐵載體可以與土壤中的鐵離子結合，形成可溶性的復合物，便于植物吸收，滿足植物生長對鐵元素的需求。具有溶磷能力的內(nèi)生菌能夠分泌有機酸、酶類等物質(zhì)，溶解土壤中難溶性的磷，提高其有效性，促進植物對磷的吸收。這些促生特性協(xié)同作用，為反枝莧的生長提供了良好的條件，使其在鉻污染土壤中能夠更好地生長發(fā)育，增加生物