《中國藥典》2015版微生物檢查法修訂情況簡介第一頁，共58頁。歷版藥典微生物檢測方面所取得的進展74年、84年、90年衛(wèi)生部《藥品衛(wèi)生學檢查法》；86年衛(wèi)生部頒布《藥品衛(wèi)生標準》1995年版藥典首次收載微生物限度檢查法2000年版藥典首次收載微生物限度標準2005版＊將按劑型制定限度修訂為按給藥途徑制定限度＊首次收載方法驗證要求＊無菌檢查培養(yǎng)時間與國外接軌2010版＊首次收載培養(yǎng)基適用性檢查要求＊強調(diào)對微生物檢驗過程的驗證及過程控制＊部分品種特別是抗生素品種的無菌檢查法由附錄走入了各論2第二頁，共58頁。修訂背景

歐、美、日等主要藥典均收載了協(xié)調(diào)一致的微生物檢查法和限度標準，由于歷史原因，我國目前的微生物限度檢查體系與國際相比存在差距，這一差距對于目前我國企業(yè)產(chǎn)品出口造成很大的障礙，也對我國的微生物質(zhì)量控制造成很大困惑。3第三頁，共58頁。修訂背景雖然中國目前不是ICH的成員國，而是以觀察員的身份進入，但中國與國外制藥行業(yè)交往日益增多，中國藥品要想進入國際市場，藥品的檢驗方法和標準與ICH保持一致，勢在必行。4第四頁，共58頁。藥品微生物檢驗及控制的挑戰(zhàn)與機遇1醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)展更有具特色的中醫(yī)藥，注射用藥品成為“高風險產(chǎn)品”微生物控制擴及檢查成為高難度工作。一百多年來人們努力提高在“有菌的環(huán)境中”生產(chǎn)“無菌的產(chǎn)品”能力，事實證明這一努力至今充滿挑戰(zhàn)。5第五頁，共58頁。藥品微生物檢驗及控制的挑戰(zhàn)與機遇2醫(yī)藥產(chǎn)品挑戰(zhàn)2006年7月~8月發(fā)生了震驚全國的“欣弗事件”（肺炎克雷伯菌，是污水中常見菌）完達山“刺五加注射液”（陰溝大腸桿菌）2012年10月，美國新英格蘭合成制藥中心生產(chǎn)的注射類固醇霉菌污染，造成數(shù)百人感染真菌炎，至年底統(tǒng)計死亡39。（從50支密封藥瓶中檢測出曲霉菌和突臍蠕孢菌兩種。6第六頁，共58頁。藥品微生物檢驗及控制的挑戰(zhàn)與機遇3藥品微生物污染的反思在醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)展過程中，盡管世界各國付出慘重代價，俏有不慎悲劇仍然可能重演；尊重規(guī)律，科學管理，全過程無縫監(jiān)控，嚴格落實各項管理，驗證、檢查員和分析調(diào)查措施，切實降低無菌藥品的微生物污染風險。7第七頁，共58頁。藥品質(zhì)量體系1安全性有效性可控性微生物8第八頁，共58頁。微生物檢驗與控制參數(shù)放行微生物控制微生物檢驗微生物實驗室技術00S調(diào)查9第九頁，共58頁。中國藥典微生物檢查體系的調(diào)整藥典USP/EP/JP中國藥典2010及之前版本分類依據(jù)按營養(yǎng)條件分按微生物類別分質(zhì)控分類需氣、厭氣菌細菌、真菌檢驗體系真接與培養(yǎng)條件對應選擇培養(yǎng)，或者人為區(qū)分評價簡便宜、嚴謹容易造成漏檢10第十頁，共58頁。中外藥典微生物檢查系統(tǒng)的差異培養(yǎng)基體系的差異使得中國藥典結(jié)果與國外藥典檢測結(jié)果不具有可比性中國藥典培養(yǎng)基體系的靈敏度較國外藥典低。11第十一頁，共58頁。微生物檢查法修訂方案與ICH（USP/EP/JP）全面接軌1檢驗體系的變更2限度標準有“數(shù)量”向“數(shù)量級”轉(zhuǎn)變3控制結(jié)果判斷趨向多樣化4以“00S”代替復試12第十二頁，共58頁。2015版藥典修訂的具體原則檢驗方法與國外藥典進一步協(xié)調(diào)；已有的指導原則實用化，通過科研解決指導原則實用化問題；增加新的指導原則，特別是對與企業(yè)過程控制相關的指導原則。

13第十三頁，共58頁。2015版藥典無菌及微生物限度檢查法目標建立統(tǒng)一的質(zhì)量技術要求，保持各方藥典科技水平一致，保證用藥安全、有效。質(zhì)量控制、檢驗技術、檢驗標準等減少國際貿(mào)易的障礙。統(tǒng)一醫(yī)藥產(chǎn)品進入國際市場的技術門檻，促進國際間藥品在同一技術平臺的公平競爭。

14第十四頁，共58頁。2015版藥典無菌及微生物限度檢查法修訂內(nèi)容修訂后的中國藥典微生物檢驗系統(tǒng)成為一個較完備的標準體系，將收載15個左右的微生物檢查法和指導原則。修訂后的中國藥典微生物檢測系統(tǒng)與國外完全一致。對實驗環(huán)境進行了重大修訂。

15第十五頁，共58頁。

目前已基本完成的藥典附錄1、滅菌法2、無菌檢查法3、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法4、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法5、非無菌藥品微生物限度標準6、抑菌效力檢查法7、非無菌藥品微生物限度檢查指導原則8、藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導原則9、藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則10、無菌檢查用隔離系統(tǒng)驗證指導原則11、藥品潔凈實驗室微生物監(jiān)測和控制指導原則16第十六頁，共58頁。2015年版中國藥典微生物限度檢查法修訂非無菌藥品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法非無菌藥品微生物限度檢查：控制菌檢查法非無菌藥品微生物限度標準參照USP35版和EP7.0版對微生物限度檢查法收載形式進行了修訂，將其分為三個附錄：17第十七頁，共58頁。微生物限度檢查法實驗環(huán)境的變化2010年版2015年版應在潔凈度10000級背景下的局部100級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行。應在受控潔凈環(huán)境下（不低于D級）的局部不低于B級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行?？偟脑瓌t：無外源性微生物污染樣品樣品的微生物檢測環(huán)境不低于樣品的生產(chǎn)環(huán)境18第十八頁，共58頁。微生物限度檢查法實驗環(huán)境的變化B級：“靜態(tài)”百級，“動態(tài)”萬級。實驗室布局：活動分區(qū)（不是分房間）實驗室應通過不同的進入通路和隔斷來區(qū)分“潔凈”區(qū)和“陽性”區(qū)，包括更衣、清潔、消毒等。當樣品發(fā)現(xiàn)微生物生長，后續(xù)的工作應轉(zhuǎn)移至“陽性”區(qū)。19第十九頁，共58頁。微生物限度檢查法技術方法適用范圍變化2010年版2015年版系檢查非滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法◆微生物計數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數(shù)◆明確規(guī)定本檢查法不適用于活菌制劑的檢查◆明確規(guī)定本檢查法可采用替代檢查方法，包括自動化檢測方法，但必須證明其替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。嗜溫型微生物最適生長溫度為20℃~44℃（25℃~43℃）金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌最適生長溫度為37℃白色念珠菌、黑曲霉最適生長溫度為28℃20第二十頁，共58頁。微生物限度檢查法試劑和試藥的修訂試劑和試藥中和劑、滅活劑和表面活性劑均應對微生物無毒性，其相互間具有相容性，有利于樣品中微生物均勻分布。稀釋液pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液；pH7.2無菌磷酸鹽緩沖液；pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液（腸溶制劑）；pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液（結(jié)腸溶制劑）；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基★不限于上述稀釋液（如0.9%無菌氯化鈉溶液）21第二十一頁，共58頁。微生物限度檢查計數(shù)法修訂前大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗菌株修訂后銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉22第二十二頁，共58頁。微生物限度檢查計數(shù)法培養(yǎng)基和試驗菌的修訂2010年版2015年版營養(yǎng)瓊脂：

大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌玫瑰紅鈉瓊脂：

白色念珠菌黑曲霉胰酪胨大豆瓊脂：

金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌銅綠假單胞菌白色念珠菌黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂：

白色念珠菌黑曲霉23第二十三頁，共58頁。微生物限度檢查計數(shù)法培養(yǎng)溫度和時間的修訂2010年版2015年版細菌數(shù)營養(yǎng)瓊脂30～35℃3天霉菌及酵母菌數(shù)玫瑰紅鈉瓊脂23～28℃5天需氧菌總數(shù)胰酪胨大豆瓊脂30～35℃3～5天霉菌及酵母菌數(shù)沙氏葡萄糖瓊脂20～25℃5～7天24第二十四頁，共58頁。微生物限度檢查計數(shù)法接種方法的修訂2010年版2015年版1、平皿傾注法2、薄膜過濾法1、平皿法（包括傾注法和涂布法），明確可使用直徑較大的平皿，且培養(yǎng)基的用量應相應增加。2、薄膜過濾法3、最可能數(shù)（Most-Probable-Number,簡稱MPN）。MPN法用于微生物計數(shù)時精密度較差，但對于某些微生物污染量很小的供試品可能是更適合的方法。MPN法僅在供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜計數(shù)方法的情況下使用，且不適用于霉菌計數(shù)。25第二十五頁，共58頁。微生物限度檢查計數(shù)法方法的修訂2010年版2015年版術語變化：計數(shù)方法驗證細菌計數(shù)法:用三種菌種進行驗證菌液加入方式：平皿計數(shù)驗證時菌液和供試液同時加入平皿，加菌量10～100cfu術語變化：計數(shù)方法適用性試驗總需氧菌計數(shù)法:用五種菌種試驗菌液加入方式：菌液加入供試液中，使每ml供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu,且所加菌液的體積不超過供試液體積的1%。26第二十六頁，共58頁。方法適用性案例某板藍根沖劑標準為細菌數(shù)不超過1000cfu/g，某藥檢所細菌結(jié)論1200cfu/g，送中檢院仲裁。合格不合格平皿法（1：10供試液）1ml/皿0.5ml/皿0.2ml/皿計數(shù)結(jié)果cfu/g650910138027第二十七頁，共58頁。微生物限度檢查計數(shù)法檢測項目及結(jié)果判斷的修訂2010年版2015年版細菌數(shù)——營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基霉菌和酵母菌數(shù)——玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基酵母菌數(shù)——酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基需氧菌總數(shù)——生長在胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上所有菌落（包括霉菌和酵母菌）霉菌和酵母菌總數(shù)——指生長在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上的所有菌落（包括細菌菌落數(shù)）?；厥章剩?0%以上回收率：0.5-2（50%-200%）28第二十八頁，共58頁。微生物限度檢查計數(shù)法結(jié)果判斷有計數(shù)干擾情況時的修訂2010年版2015年版若營養(yǎng)瓊脂上生長霉菌與酵母菌、玫瑰紅鈉上生長細菌，則分別點計霉菌和酵母菌、細菌數(shù)。然后將營養(yǎng)瓊脂上霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉上細菌數(shù)與玫瑰紅鈉上霉菌和酵母菌數(shù)或營養(yǎng)瓊脂上細菌數(shù)進行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中菌數(shù)為計數(shù)結(jié)果。若因沙氏葡萄糖瓊脂上生長的細菌使霉菌及酵母菌的計數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素)的沙氏葡萄糖瓊脂或選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂）。29第二十九頁，共58頁。微生物限度檢查計數(shù)法結(jié)果判斷的修訂2010年版2015年版供試品的細菌數(shù)、霉菌數(shù)和酵母菌數(shù)其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，應從同一批樣品中隨機抽樣，獨立復試兩次，以三次結(jié)果的平均值報告菌數(shù)。不再規(guī)定復試要求，通過實驗室調(diào)查回顧分析結(jié)果的準確性。因微生物試驗的特殊性，在實際操作過程中應依據(jù)附錄《藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導原則》對實驗結(jié)果進行充分和全面的評價。30第三十頁，共58頁。微生物限度檢查計數(shù)法結(jié)果判斷增訂內(nèi)容2010年版2015年版無各品種項下要求執(zhí)行的微生物限度標準如下：101cfu可接受的最大限度為20；102cfu可接受的最大限度為200；103cfu可接受的最大限度為2000；依次類推.若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)的檢查結(jié)果均符合該品種項下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。31第三十一頁，共58頁。微生物限度檢查控制菌檢查的修訂2010年版2015年版大腸埃希菌大腸菌群沙門菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌梭菌白色念珠菌大腸埃希菌耐膽鹽革蘭氏陰性桿菌沙門菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌梭菌白色念珠菌32第三十二頁，共58頁。微生物限度檢查控制菌檢查的修訂2010年版2015年版大腸菌群方法驗證用大腸埃希菌進行驗證耐膽鹽革蘭氏陰性桿菌用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌進行方法適用性試驗加菌量：10～100cfu加菌量：不大于100cfu33第三十三頁，共58頁。微生物限度檢查控制菌檢查的修訂2010年版2015年版◆傳統(tǒng)的鑒別試驗為主◆個體形態(tài)、菌體形態(tài)◆生理生化反應◆生態(tài)學特征◆血清學反應◆對噬菌體及抗生素的敏感性◆用傳統(tǒng)的鑒別試驗或采用其它適宜的方法進行鑒別◆分子生物學技術應用（溯源分析）34第三十四頁，共58頁。微生物限度檢查控制菌檢查修訂對替代方法的認可：本檢查法可采用替代的微生物檢查法，包括自動檢測方法，但必須證明替代方法等效于藥典規(guī)定得檢查方法?！略鰞?nèi)容結(jié)果判斷方式：各控制菌項下,生化實驗和“應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗”改為較少的生化實驗或“采用其它適宜方法進一步鑒定”

——較大變動35第三十五頁，共58頁。1、培養(yǎng)基適用性檢查試驗可用于確定實驗室所使用培養(yǎng)基（包括購置的不同批號的成品培養(yǎng)基、不同批號的脫水培養(yǎng)基干粉、按處方使用不同批次的原材料自行配制培養(yǎng)基等）、制備程序(包括水質(zhì)控制、配制方法、滅菌程序等）、保存條件（溫度、濕度、時間及盛裝培養(yǎng)基的容器條件等）等是否滿足微生物限度檢查用要求。上述任一控制點發(fā)生變化均應重新進行培養(yǎng)基適用性檢查。微生物限度檢查培養(yǎng)基適用性檢查36第三十六頁，共58頁。微生物限度檢查培養(yǎng)基適用性檢查2、當檢驗結(jié)果出現(xiàn)異常或?qū)嶒炇屹|(zhì)量控制需要，也可通過培養(yǎng)基適用性檢查提供一定依據(jù)。在保證配制和滅菌過程無誤的條件下，對照培養(yǎng)基可以不經(jīng)適用性實驗檢查直接用于樣品檢查。37第三十七頁，共58頁。3、不同處方培養(yǎng)基的替代使用不能通過培養(yǎng)基適用性試驗簡單確定。不能使用經(jīng)過對照培養(yǎng)基進行適用性檢查合格的其他培養(yǎng)基作為實驗室自用的“對照培養(yǎng)基”。4、如果沒有特殊規(guī)定，培養(yǎng)基配制采用蒸餾水或純化水均可，但應進行檢測控制，如pH應為5~7.微生物限度檢查培養(yǎng)基適用性檢查38第三十八頁，共58頁。2015版微生物限度標準的修訂◆將2010版中國藥典一、二、三部微生物限度標準項目進行對比、整合?！舨捎靡徊康南薅葮藴薯椖孔鳛楹喜⒑笙薅葮藴实幕A。修訂思路◆與美、歐、日藥典比較，修訂中國藥典的微生物限度標準。◆采用清晰直觀的表格形式，按給藥途徑，分液體、固體性質(zhì)，列出各類藥品的限度標準。39第三十九頁，共58頁。修訂后限度標準的總體結(jié)構及規(guī)定（共9項，4個表）1、制劑通則、品種項下要求無菌的制劑及標示無菌的制劑和原輔料應符合無菌檢查法規(guī)定。2、用于手術、燒傷或嚴重創(chuàng)傷的局部給藥制劑應符合無菌檢查規(guī)定3、非無菌化學藥品及生物制品制劑的微生物限度標準（見表1）4、非無菌不含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標準（見表1）5、非無菌含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標準（見表2）6、非無菌的藥用原料及輔料微生物限度標準（見表3）7、中藥提取物及中藥飲片的微生物限度標準（見表4）8、有兼用途徑的制劑應符合各給藥途徑的標準9、霉變、長螨者以不合格論限度標準40第四十頁，共58頁。標準修訂內(nèi)容（參照歐美藥典標準）1、修訂菌數(shù)標準表達方式：指數(shù)形式10ncfu,最大可接受限度值遵守2倍規(guī)則。—101cfu：可接受的最大限度為20；—102cfu：可接受的最大限度為200；以此類推。2、檢查指標：—需氧菌總數(shù)：TAMC（替代細菌數(shù)）—耐膽鹽的革蘭氏陰性菌（替代大腸菌群）41第四十一頁，共58頁。標準修訂內(nèi)容（修訂后限度標準制定原則及特點）1、基于藥品的給藥途徑及對患者的潛在危害劃分風險等級，制定標準，增加控制項目—齒齦、皮膚、呼吸道吸入制劑—增加原輔料、中藥提取物、中藥飲片的控制2、兼顧國產(chǎn)藥品的生產(chǎn)特點，保留中國藥典對中藥制劑的分類特點—是否含藥材原粉，是否含豆豉神曲—是否接觸完整皮膚黏膜3、貼劑—國外：貼劑規(guī)格統(tǒng)一，以“貼”為單位控制限度—國內(nèi)：貼劑規(guī)格各異，以“10cm2”為單位控制限度42第四十二頁，共58頁。標準執(zhí)行注意事項1、無菌要求—正文或制劑要求無菌及標示無菌的制劑—用于手術、燒傷及嚴重創(chuàng)傷的局部給藥制劑—創(chuàng)傷程度難以判斷的局部給藥制劑，有安全性風險2、沙門菌檢查—檢查對象：口服制劑—特點1：含臟器提取物（不區(qū)分是否為中藥制劑）—特點2：含藥材原粉（之前為動物藥材原粉，不在界定是否為動物藥材）43第四十三頁，共58頁。

標準執(zhí)行注意事項3、微生物限度標準102cfu≠100cfu,最大可接受限度為200，對結(jié)果判斷有影響。樣品標準(cfu/g)結(jié)論結(jié)果1結(jié)果2結(jié)果3樣品1霉菌及酵母菌數(shù)100合格~不合格8090160TYMC102合格樣品2細菌數(shù)1000不合格130015001100TAMC103合格44第四十四頁，共58頁。標準執(zhí)行注意事項標準修訂后，結(jié)果由不合格→合格—基于數(shù)據(jù)分析和風險評估制定標準—基于微生物計數(shù)結(jié)果的可變性（精密度），非類似化學檢驗結(jié)果1）盡管未超過標準規(guī)定，但是有風險；2）累計數(shù)據(jù)，建立風險評估體系。45第四十五頁，共58頁。標準執(zhí)行注意事項操作：稱量誤差、稀釋誤差、平皿誤差、培養(yǎng)基誤差等生產(chǎn)：樣品污染的不均勻性原輔料：本身是否能促進微生物增長46第四十六頁，共58頁。標準執(zhí)行注意事項4、方法的變化TSA和需氧菌總數(shù)，營養(yǎng)瓊脂和細菌總數(shù)?！獦藴氏薅确艑挘桥囵B(yǎng)基的營養(yǎng)能力增加，促生長能力增加了?！柩蹙倲?shù)：細菌和真菌均需要合并計數(shù)（真菌也屬需氧菌）。培養(yǎng)基考察對象胨牛肉浸粉氯化鈉瓊脂TSA需氧菌總數(shù)20.0g(15g胰酪胨，5g大豆胨）/(大豆木瓜蛋白酶水解物5g)5g15g營養(yǎng)瓊脂細菌10g3g5g14g47第四十七頁，共58頁。營養(yǎng)瓊脂與胰酪大豆胨培養(yǎng)基測定結(jié)果比較——六味地黃丸（cfu/g)培養(yǎng)基樣品1樣品2樣品3樣品4樣品5TSA11600904500110＜10營養(yǎng)瓊脂5600＜1011010＜1048第四十八頁，共58頁。方法變化控制菌檢查過程：使用無選擇性增菌培養(yǎng)基培養(yǎng)，可以使受損的微生物得到修復，提高檢出率。增菌培養(yǎng)選擇性增菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基

TSB麥康凱肉湯(大腸）RV肉湯（沙門）麥康凱瓊脂VRBGXLD營養(yǎng)肉湯BL乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基49第四十九頁，共58頁。制藥用水微生物檢驗方法的修訂A方法：現(xiàn)行版中國藥典方法B方法：美國藥典推薦方法

TSA、30～35℃、72hC方法：歐洲藥典方法

R2A、30～35℃、120h（目前藥典會網(wǎng)站公布的方法）50第五十頁，共58頁。R2A瓊脂培養(yǎng)基處方及制備酵母浸出粉0.5g蛋白胨0.5g酪蛋白水解物0.5g葡萄糖0.5g

可溶性淀粉0.5g磷酸二氫鉀0.3g無水硫酸鎂0.024g丙酮酸鈉0.3g瓊脂15g

純化水1000ml除葡萄糖、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使加熱后在25℃的pH值為7.2±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。R2A瓊脂培養(yǎng)基適用性檢查試驗照通則1105中“計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查”的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基的適用性